抑制人RabJ基因表達的反義寡核苷酸序列及其應用的制作方法

專利名稱：抑制人RabJ基因表達的反義寡核苷酸序列及其應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術和醫學領域。本發明涉及針對新型癌基因樣分子RabJ的反義寡核苷酸。具體而言，本發明具體涉及一組針對癌基因樣分子RabJ的表達及功能的反義寡核苷酸序列，該反義寡核苷酸序列具有靶向性抗腫瘤細胞RabJ基因表達及功能、抑制腫瘤細胞生長和抑制腫瘤細胞致瘤性的功能，從而起到治療腫瘤的作用。本發明還涉及含有該反義寡核苷酸的藥物組合物，并公開了將該反義寡核苷酸藥物用于疾病治療的方法，特別是在惡性腫瘤的治療中的用途。
背景技術：
小G蛋白(small G proteins)是指分子量約20-30kDa的單亞基G蛋白1-5。目前隨著人類基因組計劃的完成，該類蛋白質的成員已經發現有一百多種，其共有的特征是可以結合三磷酸鳥苷(GTP)和二磷酸鳥苷(GDP)，并且能夠水解GTPγ位磷酸成為GDP(即GTP酶活性，GTPase activity)(Wittinghofer和Pai，Trends Biochem Sci.1991，16382-387；Polakis和McCormick，J Biol Chem.1993，2689157-9160；Moodie等，Oncogene.1995，11447-454；Marshall，Trends Biochem Sci.1993，18250-254)。小G蛋白在調控細胞生長、增殖、分化、遷移，以及細胞內蛋白轉運等基礎生命活動中發揮非常重要的作用。
小G蛋白的功能異常可以引起眾多的病理現象和疾病的發生，其中Ras和腫瘤發生以及其在細胞增殖調控中的作用尤為受到關注。在幾乎所有類型的腫瘤細胞或者腫瘤組織中，都有H-Ras、K-Ras或者N-Ras基因的突變，而且在腫瘤發生突變的基因中，Ras突變的幾率最高(Bos，Cancer Res.1989；494682-4689)。
Rab(大鼠腦Ras樣蛋白，Ras-like protein in rat brain)是一類屬于Ras超家族的小分子量GTPase，其基本生化特征是可以結合GTP/GDP并水解GTP(Simons和Zerial，Neuron.1993，11789-799；Takai等，Physiol Rev.2001，81153-208；Martinez和Goud，Biochim Biophys Acta.1998；1404101-112；Stenmark和Olkkonen，Genome Biol.2001，2REVIEWS3007)。Rab蛋白及其調控蛋白和效應蛋白的異常也可以引起疾病的發生，如某些出血和色素沉著異常的疾病(Griscelli綜合征)、抑郁癥、Charcot-Marie-Tooth神經癥、腎臟疾病(腎小管硬化)、失明(無脈絡膜癥)等疾病均與Rab相關蛋白的功能異常相關；在血管、肺、甲狀腺疾病的某些病理過程中往往伴隨Rab蛋白的高表達(Seabra等，Trends Mol Med.2002，823-30)。
在Griscelli綜合征(一種由色素轉運異常引起的伴隨色素沉著和T淋巴細胞殺傷功能異常的疾病)的研究中發現，Rab27a的突變是該疾病發生的遺傳學病因(Menasche等，Blood.2003，1012736-2742；Bahadoran等，J BiolChem.2003；27811386-11392；Barral等，J Clin Inyest.2002，110247-257)。Rab7蛋白的異常可以造成脂蛋白的代謝異常，引起高脂血癥和血管性疾病；一些胞內細菌，如結核桿菌，可以通過抑制Rab7的功能達到感染宿主和致病的目的(Runz等，J Neurosci.2002，221679-1689；Kim等，Biochem Biophys Res Commun.2000，293375-382；Choudhury等，J ClinInvest.2002，1091541-1550；Via等，J Biol Chem.1997，27213326-13331；Clemens等，Infect Immun.2000，685154-5166；Rupper等，J Cell Sci.2001，1142449-2460)。
早先的研究認為，Rab蛋白與腫瘤發生的關系不是很密切，但是目前的研究提示Rab蛋白可能參與腫瘤的發生。首先，在某些腫瘤細胞或腫瘤類型中發現有Rab蛋白的表達異常。Rab25在前列腺癌中表達比較高，而且其表達水平與前列腺癌的分化、臨床分期等密切相關(He等，6ene Expr.2002，10231-242)；Rab38在黑色素瘤細胞系內的表達也明顯升高(Jager等，CancerRes.2000，603584-3591；Loftus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2000，994471-4476)；Rab3在垂體腺癌中的表達也很高(Culine等，Cancer.1992，702552-2556)；在造血系腫瘤和實體瘤病人外周血單個核細胞中，Rab2的表達明顯增高；在小鼠腎上腺癌和小鼠肺癌中，Rab2的表達也表現為異常(Culine等，Cancer Res.1992，523083-3088)。其次，在腫瘤中發現有Rab基因的缺失突變。在惡性橫紋肌肉瘤中發現有染色體1622q11.2區域的缺失，該區域包含Rab36的編碼區(Mori等，Biochem Biophys Res Commun.1999，254594-600；Zhou等，Gene.2000，241133-141)。另外，在腫瘤中也有Rab調控蛋白的異常。在神經母細胞瘤和造血系腫瘤中，一個Rab蛋白的調控蛋白RabGDI的表達升高明顯。PRC17(前列腺癌基因17，prostate cancer gene 17)是一個RabGTP酶活化蛋白(GTPase activating protein，GAP)，它可調控Rab5蛋白的GTP水解，其在前列腺癌中的表達增高，從而影響腫瘤的生長特性(Pei等，Cancer Res.2002，625420-5424)。
人RabJ是來源于健康成年人外周血單核細胞來源的樹突狀細胞一個新的小G蛋白家族成員，其特征是在其蛋白質組成中包含三類功能域N端(1-18氨基酸)和中間(210-216氨基酸)的核定位信號(nuclear localization signal，NLS)、中間的Rab樣功能域(19-209氨基酸)和C端的J功能域(217-273氨基酸)，并與Ras家族分子有較高同源性。三類功能域分別介導RabJ的核定位；與細胞外信號調控激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK1/2)激酶(ERK kinase，MEK1/2)、蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)的P85亞基、P53亞基相互作用；與HSC70和Raf(Ras相關因子，Ras-associated factor)相互作用等功能。RabJ的核苷酸序列和氨基酸序列以及制法公開于中國專利申請CN01126826.3中。
反義藥物又稱反義寡核苷酸藥物，是指作為藥物使用的，長度為10-30個堿基的人工合成DNA分子及其類似物。根據核苷酸雜交原理，反義藥物能與特定的基因雜交，在基因水平上干擾致病蛋白質的產生過程。蛋白質在人體代謝過程中扮演重要角色，大多數疾病都是由于蛋白質異常引起的，無論腫瘤、心血管疾病或傳染性疾病，傳統藥物主要直接作用于致病蛋白質本身，而反義藥物則作用于產生蛋白質的基因，因此可廣泛應用于各種疾病的治療，比傳統藥物更具選擇性，而且具有高效低毒、用量少等特點。數年前，由于反義藥物合成價格昂貴，使該類藥物難以進行廣泛的臨床試驗。近年來，由于合成技術的改進和合成儀器的研制成功，反義藥物的成本已大為降低，從而加速了反義藥物的研究與開發。
從藥動學角度而言，由于體內各器官組織存在核酸酶，因此天然的寡核苷酸進入體內極易被分解失活，故反義藥物多以修飾寡核苷酸為主，以增強其抗核酸酶降解的作用。寡核苷酸的修飾方法有多種，常用硫代寡核苷酸，因為此類反義藥物具有良好的水溶性，易大量合成，能滿足臨床所需。采用皮下、肌肉和靜脈注射方法給藥，除腦組織外，硫代寡核苷酸可分布于各器官和組織中，其能與血漿蛋白結合，但親和力較低，主要從尿中排出。
反義基因治療依據堿基互補原理，應用能與目的基因或其mRNA互補的核酸，通過空間阻遏作用，誘導RNA酶H(RNase H)活性或與目的DNA雙股螺旋形成三聚體(triple helix)，在基因復制、轉錄、剪接、mRNA轉運及翻譯水平上，抑制蛋白質合成的特性、抑制癌基因的表達、抑制生長因子的分泌或封閉其受體，從而阻斷癌細胞內的異常信號傳導及自分泌和旁分泌環路，使癌細胞進入正常化軌道或引起癌細胞凋亡。
反義核酸包括反義核糖核酸(antisence RNA)、核糖酶(ribozyme)和反義寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides，AONs)三類。通過對反義寡核苷酸藥物的開發和研究，目前已有17種反義寡核苷酸藥物進入臨床試驗。其中Vitravene是1998年經FDA批準進入市場的反義藥物，其分子結構的兩端有一個修飾帽，從而增強了其穩定性。該藥物抗病毒作用較強，用于治療巨細胞病毒性視網膜炎和艾滋病并發巨細胞視網膜炎。不良反應有虹膜炎、玻璃體炎，發生率為25％，用糖皮質激素治療可緩解或消除其炎性反應。
為使AON順利進入靶細胞發揮治療作用，靶向性轉運至關重要。直接注射存在諸多問題，如AON易降解、細胞攝取率不高、非特異性結合降低AON的藥效以及對mRNA的非特異性阻斷等。為此，人們試用以下方法改善靶向性轉運(1)將AON與轉鐵蛋白/多聚L-賴氨酸復合物連接，以增強其生物效應；(2)將AON與帶正電荷的脂類形成復合物，以克服磷酸骨架負電荷所致的穿越細胞膜的困難；(3)用脂質體包裹AON后介導進入細胞，既有利于大分子的順利進入又免受細胞外各種酶的水解作用；(4)將AON與膽固醇結合，使其胞漿保持時間增加10倍；(5)用免疫脂質體轉運AON可使其特異性轉運至靶組織和靶細胞；(6)將AON體外轉染給轉載細胞(如成纖維細胞)也可較好地將AON載入靶細胞內；(7)電打孔(electroporation)，即借助于電流將AON導入靶細胞。
近年來，雖然在臨床試驗還是應用中，反義藥物在治療某些腫瘤和病毒性感染方面取得了一些進展，但是所取得的結果尚不十分令人滿意。因此，本領域迫切需要進一步開發可有效抑制腫瘤的反義藥物。

發明內容
本發明的目的就是提供一種可有效抑制腫瘤的反義寡核苷酸，所述的反義特異性地在mRNA水平靶向癌基因樣分子RabJ基因，對表達RabJ的腫瘤細胞的生物學行為進行干預，從而有效抑制RabJ的表達，達到抗腫瘤效果。
在本發明的第一方面中，提供了一種反義寡核苷酸，所述的反義寡核苷酸與人RabJ基因mRNA反向互補，其長度為18-25bp，并且所述的反義寡核苷酸可使HeLa細胞的生長降低50％以上。
在另一優選例中，所述的反義寡核苷酸結合于RabJ的以下區域的對應的核苷酸序列核定位信號、Rab功能域、J功能域、或其組合。
在另一優選例中，所述的反義寡核苷酸含有選自SEQ ID NO5-8所示的核苷酸序列。
更佳地，所述的反義寡核苷酸選自下組AON-RabJ15’-CTTCCGCTTCGGCATGTTGG-3’；AON-RabJ25’-CTGCCAGCCACGCATCAAGG-3’；AON-RabJ35’-CTCCCAGCATGTCCCAACTG-3’；AON-RabJ45’-CAGGAGGGCTGTCCGAGCAT-3’。
在另一優選例中，所述的反義寡核苷酸中具有經修飾的核苷酸，所述的修飾方式選自下組硫代修飾、甲基化修飾、磷酸硫代修飾、或其組合。
在另一優選例中，所述的經修飾的核苷酸是全鏈經磷酸硫代修飾的核苷酸。
本發明的第二方面，還涉及一種組合物，其含有0.001-99.99wt％如前所述的反義寡核苷酸以及可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
較佳地，所述的組合物是藥物組合物，并且所述的載體、稀釋劑或賦形劑是藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明的第三方面，提供了如前所述的反義寡核苷酸的用途，它被用于制備抑制腫瘤細胞生長組合物或治療腫瘤的藥物組合物。更佳地，所述的腫瘤細胞或腫瘤表達RabJ蛋白，并且選自下組子宮頸癌、乳腺癌、結腸癌。


圖1RabJ反義寡核苷酸瞬時表達后，RabJ在mRNA水平的表達分析；圖2RabJ反義寡核苷酸瞬時表達后，RabJ在蛋白水平的表達分析；圖3RabJ反義寡核苷酸瞬時表達后，其對腫瘤細胞生長的抑制；圖4RabJ反義寡核苷酸瞬時表達后，其對腫瘤細胞體外致瘤活性的抑制；圖5瘤體內注射RabJ反義寡核苷酸后，其對體內腫瘤細胞生長的抑制；圖6瘤體內注射RabJ反義寡核苷酸后，其對腫瘤細胞分化的促進。圖6A為野生型HeLa腫瘤；圖6B為SON-RabJ1；圖6C為SON-RabJ4；圖6D-6F為AON-RabJ1；圖6G-6I為AON-RabJ4。其中箭頭表示纖維狀結締組織插入；小星號表示鱗狀分化；大星號表示壞死區域；花型圖案表示空泡狀結構。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，發現腫瘤細胞內RabJ的表達往往升高，抑制RabJ的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖和體內外的致瘤活性。本發明人還進一步合成和測試了多種RabJ的反義寡核苷酸，篩選出了可強烈抑制RabJ的表達進而抑制腫瘤細胞的增殖和體內外的致瘤性的反義序列。在此基礎上完成了本發明。
具體地，本發明人的研究表明，RabJ在睪丸組織中主要分布于初級和次級精母細胞(spermatocyte)、早期精子細胞中(spermatids)，在間質細胞和支持細胞中無表達，與細胞周期蛋白cyclin A和cyclin D1在小鼠睪丸中的表達模式類似，提示RabJ可能與細胞周期調控相關。
在NIH3T3細胞系內，RabJ的過表達可以促進細胞周期蛋白表達、促進細胞增殖、推動細胞周期進展，且可促進該細胞系在軟瓊脂上形成克隆，并在裸鼠體內也可以形成成纖維肉瘤，提示其可能是一個癌基因樣的小G蛋白。
本發明的研究還發現，在腫瘤細胞內RabJ的表達往往升高，抑制RabJ的表達可以抑制腫瘤細胞的增殖和體內外的致瘤活性。由于RabJ可以和多種蛋白形成復合體，因此用激酶抑制劑抑制各個激酶的活性，發現MEK/ERK抑制劑可以完全抑制RabJ的體外致瘤能力，提示ERK1/2依賴的信號傳導機制可能是RabJ的致瘤機理。
共聚焦顯微鏡的試驗結果還提示，RabJ是一個MEK1/2的核錨著蛋白，通過增加細胞核的磷酸化MEK1/2的水平，在胞核局部形成ERK1/2的持續活化，引起腫瘤的發生。
因此，本發明人的研究表明，RabJ作為小G蛋白家族成員，在細胞周期調控、細胞增殖、腫瘤發生等過程中發揮重要的作用，其機理可能是通過核錨著磷酸化的MEK1/2促進ERK1/2介導的效應，促進細胞增殖和腫瘤的發生。因此，RabJ是一個癌基因樣的小G蛋白，在臨床腫瘤的診斷和治療中可作為潛在的候選靶標。
活性成分在本發明中，活性成分是RabJ反義寡核苷酸。如本文所用，術語“活性成分”指這樣的RabJ反義寡核苷酸所述的寡核苷酸與人RabJ基因mRNA反向互補，其長度宜為18-25bp，并且所述的反義寡核苷酸可使HeLa細胞的生長降低50％以上(如50％-90％或更高)。
RabJ的cDNA序列如SEQ ID NO19所示，編碼RabJ蛋白質(如SEQ ID NO20所示)。SEQ ID NO19全長為1787bp，包括24bp的5’端非編碼區和316bp的3’端非編碼區，編碼含273個氨基酸的多肽。
如本文所用，“反義寡核苷酸”指為反義的核苷酸寡聚物。反義寡核苷酸通過堿基互補(A-T，A-U和G-C)配對與雙鏈DNA形成三鏈(反基因)，或與單鏈RNA形成雜交雙鏈(反義)，從而阻斷基因的復制、轉錄或轉錄后mRNA的加工和翻譯。同時，雙鏈RNA能被細胞內的核糖核酸酶H(RNase H)所降解，從而更有效地阻斷靶基因的表達。由于反義核苷酸只能與反向互補的靶序列結合，具有專一性高，副作用小的特點。
優選的反義寡核苷酸結合于RabJ的以下區域的對應的核苷酸序列核定位信號(NLS，1-18位氨基酸)、Rab功能域(19-200位氨基酸)、J功能域(201-273位氨基酸)、或其組合。
在本發明的一個實施例中，所述的反義寡核苷酸選自下組AON-RabJ15’-CTTCCGCTTCGGCATGTTGG-3’；AON-RabJ25’-CTGCCAGCCACGCATCAAGG-3’；AON-RabJ35’-CTCCCAGCATGTCCCAACTG-3’；AON-RabJ45’-CAGGAGGGCTGTCCGAGCAT-3’。
其中，AON-RabJ1和AON-RabJ2對應于RabJ核定位信號(NLS，1-18位氨基酸)；AON-RabJ3對應于RabJ的Rab功能域(19-200位氨基酸)；AON-RabJ4對應于RabJ的J功能域(201-273位氨基酸)。
核苷酸的各種修飾方式是本領域的熟練技術人員知曉的。通過核苷酸的修飾，可進一步提高反義寡核苷酸的穩定性和/或反義寡核苷酸藥物的效率。因此本發明還包括包含各種的核苷酸修飾形式，代表性的修飾形式例子包括但不限于硫代修飾、甲基化修飾、磷酸硫代修飾、或其組合。
本發明的RabJ反義寡核苷酸能有效抑制RabJ的表達，從而抑制腫瘤細胞的增殖。具體地，本發明的RabJ反義寡核苷酸在mRNA水平針對RabJ基因，對陽性表達RabJ的腫瘤細胞的生物學行為進行逆轉。實驗證明(1)抑制RabJ的表達可抑制腫瘤細胞的增殖；(2)體內抑制RabJ的表達可抑制腫瘤細胞的體外致瘤性；(3)抑制RabJ的表達可抑制腫瘤細胞體內的生長；(4)抑制RabJ的表達可促進腫瘤細胞發生分化。
藥物組合物及給藥方法本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量(如0.001-99wt％)的本發明的RabJ反義寡核苷酸以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的RabJ反義寡核苷酸施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約1微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約5毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
在制備藥物組合物時，通常，可將這些本發明的反義寡核苷酸配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)瘤內、肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
優選的本發明的反義寡核苷酸藥物的給藥途徑包括但不限于(1)直接裸DNA注射法；(2)將AON與轉鐵蛋白/多聚L-賴氨酸復合物連接；(3)將AON與帶正電荷的脂類形成復合物；(4)用脂質體包裹AON后介導進入細胞；(5)將AON與膽固醇結合；(6)用免疫脂質體轉運AON；(7)將AON體外轉染給轉載細胞(如成纖維細胞)；(8)電打孔(electroporation)，即借助于電流將AON導入靶細胞等。
此外，本發明的反義寡核苷酸可單獨直接用于疾病治療，還可與其他治療劑聯用，如TNF-α、TGF-β、IFN-α、Angiostatin、Endostatin、甘磷酰芥、血卟啉、石蒜堿內銨鹽、鴉膽子乳、足葉乙甙(即依托泊甙)、脫水衛矛醇、阿霉素、三苯氧胺、5-氟尿嘧啶、去甲斑螯素、雙呋喃氟尿嘧啶、葫蘆素、三尖杉酯堿、冬凌草乙素、馬藺子甲素、云芝糖肽、阿糖胞苷、卡波鉑、紫杉醇、香菇多糖、氟他胺、異環磷酰胺、烏苯美司、醋酸亮丙瑞林、脫氧氟尿苷、洛波鉑、依林諾特肯、來屈唑和替尼泊甙等。
本發明的主要優點在于(a)本發明針對RabJ基因不同靶位點所設計的4個反義寡核苷酸序列，可有效抑制癌基因樣分子RabJ的表達，從而用于癌癥治療；(b)本發明的反義寡核苷酸可以單獨使用或幾個反義寡核苷酸聯合，還可以與其它藥物和治療手段聯合，用于惡性腫瘤的治療。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例通用方法和材料(a)寡核苷酸RabJ反義寡核苷酸的序列如下所示AON-RabJ15’-CTTCCGCTTCGGCATGTTGG-3’(+7-+26)(SEQ ID NO5)；AON-RabJ25’-CTGCCAGCCACGCATCAAGG-3’(+318-+337)(SEQ 1D No.6)；AON-RabJ35’-CTCCCAGCATGTCCCAACTG-3’(+651-+670)(SEQ ID NO7)；AON-RabJ45’-CAGGAGGGCTGTCCGAGCAT-3’(+788-+807)(SEQ ID NO8)。
作為陰性對照的寡核苷酸序列如下AON-RabJ1neg (+7-+26 AON序列陰性對照)(SEQ ID NO9)AON-RabJ2neg (+318-+337 AON序列陰性對照)(SEQ ID No.10)
AON-RabJ3neg (+651-+670 AON序列陰性對照)(SEQ ID NO11)AON-RabJ4neg (+788-+807 AON序列陰性對照)(SEQ ID NO12)(b)細胞系HeLa細胞系ATCCCCL-2(購自ATCC)，這是一種陽性表達RabJ的宮頸癌腫瘤細胞系。
MCF-7細胞系ATCCHTB-22(購自ATCC)，這是一種陽性表達RabJ的乳腺癌腫瘤細胞系。
SW480細胞系ATCCCCL-28(購自ATCC)，這是一種陽性表達RabJ的結腸癌腫瘤細胞系。
細胞的培養和處理方法如下細胞接種于含10％的小牛血清的RPMI1640(Invitrogen公司)培養液，置于37攝氏度、體積分數為5％的CO2培養箱中常規培養，實驗前無藥培養兩周。分別將磷酸硫代修飾的SON-RabJ1(SEQID NO1)、SON-RabJ2(SEQ ID NO2)、SON-RabJ3(SEQ ID NO3)、SON-RabJ4(SEQID NO4)、AON-RabJ1(SEQ ID NO5)、AON-RabJ2(SEQ ID NO6)、AON-RabJ3(SEQID NO7)、AON-RabJ4(SEQ ID NO8)和相應的陰性對照AON-RabJ1neg(SEQ IDNO9)、AON-RabJ1neg(SEQ ID NO10)、AON-RabJ1neg(SEQ ID NO11)和AON-RabJneg(SEQ ID NO12)以1μmol的終濃度與LipofectAMINE(InvitroGen公司)加入細胞培養液，于孵育24-48h后收獲細胞進行檢測。
實施例1RabJ反義寡核苷酸瞬時表達后RabJ在mRNA和蛋白水平的表達分析將磷酸硫代修飾的正向序列SON-RabJ1(SEQ ID NO1)、SON-RabJ2(SEQ IDNO2)、SON-RabJ3(SEQ ID NO3)、SON-RabJ4(SEQ ID NO4)、反義寡核苷酉麥AON-RabJ1(SEQ ID NO5)、AON-RabJ2(SEQ ID NO6)、AON-RabJ3(SEQ IDNO7)、AON-RabJ4(SEQ ID NO8)和相應的陰性對照AON-RabJ1neg(SEQ ID NO9)、AON-RabJ1neg(SEQ ID NO10)、AON-RabJ1neg(SEQ ID NO11)和AON-RabJneg(SEQ ID NO12)(由上海生工生物工程公司合成)，以1μmol的終濃度與轉染試劑LipofectAMINE(Invitrogen公司)加入HeLa宮頸癌細胞培養液中，于孵育后24-48h收獲細胞進行檢測。
本實施例從mRNA和蛋白質水平二個層次來檢測反義寡核苷酸對癌基因樣分子RabJ基因表達的抑制。
(a)TaqMan定量RT-PCR方法檢測mRNA方法如下(1)逆轉錄按TRIzol總RNA提抽試劑盒提取總RNA。電泳鑒定RNA的質量，并以紫外光分光光度計定量。取總RNA2.5μg，加入50μl逆轉錄反應體系，用SuperScriptTMII逆轉錄置試劑盒(購自于Invitrogen公司)，按說明書操作進行逆轉錄。
(2)PCR擴增PCR反應體系按常規(試劑購自Invitrogen公司)。
所使用的RabJ特異性引物為5’-GGA GTC AAA CCT GGG GCC TCA AG-3’(上游，SEQ ID NO13)和5’-CAG GAG GGC TGT CCG AGC ATT C-3’(下游，SEQ IDNO14)；所使用的RabJ特異性探針為5’FAM-GTA GCA CCT GGC AGT GAA GATG-3’TAMRA(SEQ ID NO15)；所使用的β-actin特異性引物為5’-TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT AC6A-3’(上游，SEQ ID NO16)和5’-CAG CGG AAC CGC TCA TTG CCA ATG G-3’(下游，SEQ ID NO17)；所使用的β-actin特異性探針為5’FAM-ATG CCC TCC CCC ATG CCA TCCTGC GT-3’TAMRA(SEQ ID NO18)。
循環條件94℃變性45秒，58℃退火1分鐘，72℃延伸1分鐘，最后延伸10分鐘。
(3)PCR產物定量動態測定熒光強度，以RabJ和β-actin的熒光強度的比值來表示RabJmRNA的水平。
(b)Western blot技術檢測RabJ蛋白的表達水平收集48h的各組細胞，制備細胞裂解液，用RabJ多抗(按CN01126826.3中實施例6的方法制備)進行Western blot檢測。
結果RabJ反義寡核苷酸(SEQ ID NO5-8)能夠明顯抑制HeLa腫瘤細胞中RabJ的mRNA(見圖1)和蛋白質表達(見圖2)。其相應的正向序列(SEQ ID NO1-4)以及陰性對照(SEQ ID NO9-12)對RabJ的mRNA(見圖1)和蛋白質表達沒有影響。
實施例2RabJ反義寡核苷酸瞬時表達后對腫瘤細胞的生長抑制本實施例采用了[3H]-胸腺嘧啶摻入法。
RabJ反義寡核苷酸瞬時表達48小時后，將HeLa、MCF-7以及SW480細胞以5×104個/孔的細胞密度接種于24孔培養板(Falcon)中，每種細胞接種三孔。培養6h后，在無血清培養基中繼續培養24-48h，在最后4h，于每孔中加入0.5μCi(1Ci＝37GBq)的[3H]-胸腺嘧啶。然后，用PBS洗三遍，將細胞懸浮于含1％Triton X-100的PBS中，用玻璃纖維濾膜收集，用液閃儀測定放射性。或者在血清饑餓24h后，加入含10％FCS的正常培養基，繼續培養24h，最后4h加入[3H]-胸腺嘧啶，然后進行放射測定。
結果顯示，RabJ反義寡核苷酸(SEQ ID NO5-8)能夠明顯抑制HeLa、MCF-7以及SW480腫瘤細胞體外的生長能力。其中對HeLa的抑制效果見圖3。
實施例3RabJ反義寡核苷酸瞬時表達后對腫瘤細胞體外致瘤活性的抑制本實施例采用了軟瓊脂克隆形成法。將混懸于0.5％軟瓊脂的5×104RabJ反義寡核苷酸瞬時表達后的HeLa細胞接種于底層含1％軟瓊脂的6孔板中，以檢測細胞接觸非依賴生長的能力。培養3周后，光鏡下觀察，細胞數多于50個的克隆記為陽性。
結果顯示，RabJ反義寡核苷酸(SEQ ID NO5-8)能夠明顯抑制HeLa腫瘤細胞體外在軟瓊脂上的克隆形成能力(見圖4)。
實施例4瘤體內注射RabJ反義寡核苷酸對腫瘤細胞體內生長速率的抑制將1×106個HeLa細胞皮下注射到Balb/C裸鼠(購自上海必凱實驗動物公司)的右下側腹部(每種RabJ反義寡核苷酸的實驗組和對照組各5只裸鼠，聯用試驗組為2只)，4周后，向瘤體內注射RabJ反義寡核苷酸(20μg/20μl 0.9％NaCl/小鼠)(SEQ ID NO5、6、7、8或聯用SEQ ID NO5和6)，觀察腫瘤生長速度。
結果顯示，當HeLa野生型細胞在裸鼠體內形成腫瘤后，瘤體內連續注射RabJ反義寡核苷酸可顯著抑制HeLa腫瘤的生長速率，提示RabJ反義寡核苷酸(SEQ ID NO5-8)對體內腫瘤具有治療作用，其中AON-RabJ1反義寡核苷酸的試驗結果如圖5所示。
另外，聯用AON-RabJ1和AON-RabJ2(各20μg/20μl 0.9％NaCl/小鼠)時的腫瘤體積比單用AON-RabJ1或AON-RabJ2時的腫瘤體積更小。這表明，聯用RabJ反義寡核苷酸可獲得更好的抑制效果。
實施例5瘤體內注射RabJ反義寡核苷酸對體內HeLa細胞分化的促進將1×106個HeLa細胞皮下注射到Balb/C裸鼠的右下側腹部，4周后，向瘤體內注射RabJ反義寡核苷酸(20μg/20μl 0.9％NaCl/小鼠)，4周后取腫瘤標本進行HE染色。
結果顯示，RabJ反義寡核苷酸作用后的HeLa細胞發生分化，形成由鱗狀上皮細胞組成的癌巢，并發生纖維組織樣結締組織的插入、空泡細胞的產生和大面積細胞死亡的現象，提示了HeLa腫瘤組織的成熟分化(見圖6)。這表明RabJ反義寡核苷酸對體內腫瘤具有分化促進作用，從而產生腫瘤治療效果。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國人民解放軍第二軍醫大學<120>抑制人RabJ基因表達的反義寡核苷酸序列及其應用<130>057872<160>20<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>1ccaacatgcc gaagcggaag 20<210>2<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>2ccttgatgcg tggctggcag 20<210>3<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>3cagttgggac atgctgggag 20<210>4<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>4atgctcggac agccctcctg 20<210>5<211>20
<212>DNA<213>寡核苷酸<400>5cttccgcttc ggcatgttgg20<210>6<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>6ctgccagcca cgcatcaagg20<210>7<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>7ctcccagcat gtcccaactg20<210>8<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>8caggagggct gtccgagcat20<210>9<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>9ctagcgcttc cgcatgatgg20<210>10<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>10ctggcagcca ggcatctacg20
<210>11<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>11ctcgcagcat gtcgcatgtg 20<210>12<211>20<212>DNA<213>寡核苷酸<400>12cacgacgcct gtgcgagcat 20<210>13<211>23<212>DNA<213>寡核苷酸<400>13ggagtcaaac ctggggcctc aag 23<210>14<211>22<212>DNA<213>寡核苷酸<400>14caggagggct gtccgagcat tc22<210>15<211>22<212>DNA<213>寡核苷酸<400>15gtagcacctg gcagtgaaga tg22<210>16<211>25<212>DNA
<213>寡核苷酸<400>16tcacccacac tgtgcccatc tacga 25<210>17<211>25<212>DNA<213>寡核苷酸<400>17cagcggaacc gctcattgcc aatgg 25<210>18<211>26<212>DNA<213>寡核苷酸<400>18atgccctccc ccatgccatc ctgcgt 26<210>19<211>1787<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(25)..(843)<223>
<400>19caagcttatg catgcggccg ctga atg gag gcc aac atg ccg aag cgg aag 51Met Glu Ala Asn Met Pro Lys Arg Lys1 5gag ccc ggc agg tct ctc cgc atc aaa gtc atc tcc atg ggc aac gcc 99Glu Pro Gly Arg Ser Leu Arg Ile Lys Val Ile Ser Met Gly Asn Ala10 15 20 25gaa gtg ggg aaa agc tgt att ata aag cga tac tgt gag aaa aga ttc147Glu Val Gly Lys Ser Cys Ile Ile Lys Arg Tyr Cys Glu Lys Arg Phe30 35 40gtg tct aaa tac ctg gca aca att gga att gac tat gga gtc aca aag195Val Ser Lys Tyr Leu Ala Thr Ile Gly Ile Asp Tyr Gly Val Thr Lys
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權利要求
1.一種反義寡核苷酸，其特征在于，所述的反義寡核苷酸與人RabJ基因mRNA反向互補，并且其長度為18-25bp，并且所述的反義寡核苷酸可使HeLa細胞的生長降低50％以上。
2.如權利要求1所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述的反義寡核苷酸結合于RabJ的以下區域的對應的核苷酸序列核定位信號、Rab功能域、J功能域、或其組合。
3.如權利要求1所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述的反義寡核苷酸含有選自SEQ ID NO5-8所示的核苷酸序列。
4.如權利要求1所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述的反義寡核苷酸選自下組AON-RabJ15’-CTTCCGCTTCGGCATGTTGG-3’；AON-RabJ25’-CTGCCAGCCACGCATCAAGG-3’；AON-RabJ35’-CTCCCAGCATGTCCCAACTG-3’；AON-RabJ45’-CAGGAGGGCTGTCCGAGCAT-3’。
5.如權利要求1-4中任一所述的反義寡核苷酸，其特征在于，所述的反義寡核苷酸中具有經修飾的核苷酸，所述的修飾方式選自下組硫代修飾、甲基化修飾、磷酸硫代修飾、或其組合。
6.如權利要求5所述的反義寡核苷酸，其特征在于，其特征在于，所述的經修飾的核苷酸是全鏈經磷酸硫代修飾的核苷酸。
7.一種組合物，其特征在于，其含有0.001-99.99wt％權利要求1-6中任一項所述的反義寡核苷酸以及可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
8.如權利要求7所述的組合物，其特征在于，所述的組合物是藥物組合物，并且所述的載體、稀釋劑或賦形劑是藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
9.權利要求1所述的反義寡核苷酸的用途，其特征在于，用于制備抑制腫瘤細胞生長組合物或治療腫瘤的藥物組合物。
10.如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述的腫瘤細胞或腫瘤表達RabJ蛋白，并且選自下組子宮頸癌、乳腺癌、結腸癌。
全文摘要
本發明提供了一種針對癌基因樣分子RabJ的反義寡核苷酸。具體而言，本發明涉及一種針對癌基因樣分子RabJ的表達及功能的反義寡核苷酸序列，該反義寡核苷酸序列具有靶向性抗腫瘤細胞RabJ基因表達及功能、抑制腫瘤細胞生長和抑制腫瘤細胞致瘤性的功能，從而起到治療腫瘤的作用。本發明還涉及含有該反義寡核苷酸的藥物組合物，并公開了將該反義寡核苷酸藥物用于疾病治療的方法，特別是其在惡性腫瘤治療中的用途。
文檔編號A61P35/00GK1948482SQ20051003042
公開日2007年4月18日 申請日期2005年10月12日 優先權日2005年10月12日
發明者陳濤涌, 李楠, 萬濤, 曹雪濤 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學