糖尿病性心血管病變相關基因及其用途的制作方法

專利名稱：糖尿病性心血管病變相關基因及其用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于生物技術領域，具體地說，本發明涉及新的編碼大鼠糖尿病性心血管病變相關蛋白RDCR3(Rat Diabetic Cardiomyopathy Related gene 3，大鼠糖尿病性心血管病變相關基因3)的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。
背景技術：
2型糖尿病性心血管病變不僅是患者的主要死因，也較一般人群發生率高、發展進程快、病情重，加強其發病機理的研究十分必要。
雖然人們已認識到發病過程中蛋白質非酶糖化、自由基產生過多、多元醇代謝亢進、脂蛋白的多態性、細胞因子和生長因子多種介質等的相互作用，但這方面的研究進展甚微，主要有兩方面的原因，一是臨床上心臟及血管標本取材困難；二是受研究方法學的限制。
疾病的發生、發展無不源于相互作用的相關基因尤其它們早期表達的差異，但迄今為止對于糖尿病性心血管病變相關基因早期的差異表達及其網絡調控研究幾乎處于空白。隨著人類基因組草圖的完善，以及生物信息學的迅速發展，用整體、動態的觀點去探索疾病的發生機理勢在必行，揭示疾病早期相關基因表達譜的變化不僅是生命科學研究的一個重要方向，對于指導下一步的臨床研究也具有重要意義。
然而，迄今為止人們對與糖尿病性心血管病變相關基因還知之甚少，因此，本領域迫切需要尋找和開發新的糖尿病性心血管病變相關基因及其編碼蛋白。

發明內容
本發明的目的是提供一種新的糖尿病性心血管病變相關蛋白RDCR3蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途。
在本發明的第一方面，提供一種分離的RDCR3多肽，它包括具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；
(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進心肌誘導分化功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發明的第二方面，提供編碼分離的這些多肽的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％相同性(a)編碼上述大鼠RDCR3多肽的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中166-798位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1219位的序列的序列。
在本發明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發明的第四方面，提供了制備具有RDCR3蛋白活性的多肽的方法，該方法包含(a)在適合表達RDCR3蛋白的條件下，培養上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養物中分離出具有RDCR3蛋白活性的多肽。
在本發明的第五方面，提供了與上述的RDCR3多肽特異性結合的抗體。
在本發明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗RDCR3多肽活性的化合物，以及抑制RDCR3多肽的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。較佳地，該化合物是RDCR3多肽的編碼序列或其片段的反義序列。
在本發明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在RDCR3蛋白的方法，它包括將樣品與RDCR3蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在RDCR3蛋白。
在本發明的第八方面，提供了一種檢測與RDCR3多肽異常表達相關的疾病或疾病易感性的方法，該方法包括檢測編碼所述多肽的核酸序列中是否存在突變。
在本發明的第九方面，提供了本發明多肽和編碼序列的用途。例如本發明多肽可被用于篩選促進RDCR3多肽活性的激動劑，或者篩選抑制RDCR3多肽活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發明的RDCR3蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發明的第十方面，提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量(如0.01-99.99wt％)的本發明的RDCR3多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體。這些藥物組合物可治療糖尿病性心血管病變等病癥。
在本發明的第十一方面，提供了一種篩選影響RDCR3蛋白表達的物質的方法，包括步驟(a)在測試物質存在下，培養大鼠心肌細胞作為測試組，并且在無測試物質存在下，培養大鼠心肌細胞作為對照組；(b)測定測試組和對照組中RDCR3蛋白的表達情況，其中如果測試組中RDCR3蛋白的表達量顯著高于對照組就表明該測試物質是促進RDCR3蛋白表達的物質，如果測試組中RDCR3蛋白的表達量顯著低于對照組就表明該測試物質是抑制RDCR3蛋白表達的物質。
較佳地，步驟(b)是通過RT-PCR法或ELISA法檢測RDCR3蛋白表達情況。
本發明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發明的具體實施方案，而不用于限定由權利要求書所界定的本圖1是表達載體pGEX-4T-1-RDCR3的構建示意圖。
圖2顯示了RDCR3的滴定曲線及等電點。
圖3A顯示了對RDCR3二級結構的預測分析結果，其中H表示螺旋，E表示strand，-表示無預測)圖3B顯示了對RDCR3二級結構的預測分析結果，其中采用Chou&Fasman和Garnier-Osguthorpe-Robson法來預測螺旋和轉角。
圖4顯示了RDCR3不同組織中的差異表達情況。泳道1-11分別是下丘腦、垂體、肺、脾、胰臟、脂肪、腎上腺、腎、肝、主動脈、心臟、骨骼肌圖5RDCR3的mRNA在不同組織中的分布圖6顯示了RDCR3編碼區的PCR擴增結果，其中擴增片段為650bp圖7顯示GST-RDCR3表達和純化的SDS-PAGE分析結果。其中各泳道如下泳道1.分子量標準品(103道爾頓)97.4，66.2，43，31，20.1，(14.4)；泳道2.在IPTG誘導前的細菌蛋白；泳道3.在IPTG誘導后的細菌總蛋白；泳道4.誘導蛋白的上清液；泳道5.誘導蛋白的沉淀物；泳道6.用親和層析純化的GST-RDCR3。
圖8顯示了重組GST-RDCR3蛋白的Western印跡分析結果，表明分子量約為50Kda。
圖9顯示了的基因組序列，其中省略號處為基因組未測通部分，下劃線處為外顯子部分。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，首先從建立2型糖尿病性心血管病變的大鼠模型入手，以熒光標記的mRNA差異顯示技術篩選出病變早期差異表達基因RDCR3(RatDiabetic Cardiomyopathy Related Gene 3)，并應用生物信息學分析該相關基因及其蛋白的結構和功能，并用試驗驗證了RDCR3的確是一種與2型糖尿病性心血管病變相關的蛋白。在此基礎上完成了本發明。
具體地，本發明人成功建立了2型糖尿病性心血管病變大鼠模型并對其進行系統分析。2月齡SD大鼠高熱量飲食喂養2個月后給予小劑量STZ(15mg/kg)建立2型糖尿病模型，模型建立后半個月、1.5-2個月、6個月取大鼠心肌電鏡觀察及胰島素-葡萄糖耐量試驗、胰島免疫組化和其它糖代謝相關指標的檢測，并與大、小劑量STZ、單純高熱量飲食等各組大鼠相應指標比較。各項指標說明，該模型具有外周胰島素抵抗和胰島功能僅輕微受損等特征，超微結構觀察證實心肌病變隨著病程延長而加重。
本發明的2型糖尿病性心血管病變模型的主要特點在于①與人類普通2型糖尿病的發生、發展過程相似。
②STZ用量小，而低劑量的STZ應用能最大限度地避免其胰腺外非選擇性的作用。
③該模型動物無需治療生命即能維持較長時間，可用于2型糖尿病慢性并發癥的相關研究。
④2型糖尿病模型建立后，心肌包括線粒體的數量和質量、細胞間質在內的超微結構先后發生改變，同時也觀察到電鏡下主動脈內皮損傷和平滑肌增殖等。由于這種接近人類普通2型糖尿病模型的大鼠具備多個罹患心血管疾病的危險因素高血糖、高血脂、高胰島素血癥，并隨著病程逐漸出現人類心血管病變的特征性改變，從而為糖尿病這種特定狀態下心血管系統病變相關基因的篩選奠定了基礎。
基于糖尿病性心血管病變模型，本發明人應用熒光標記的DDRT-PCR技術篩選相關基因。具體地，在2型糖尿病大鼠模型建立后半個月，抽提大鼠心肌總RNA進行熒光標記的mRNA差異顯示分析，Northern印跡及半定量RT-PCR證實候選基因的差異表達。從5000多個條帶中選擇分離并克隆得到63個差異表達的序列，其中已知基因32個，已知EST 10個，新EST 21個，新基因若干。一種新的糖尿病性心血管病變相關基因是RDCR3，該基因在心血管病變的心肌中表達上調。
運用相同組織mRNA進行Norhern驗證，和組織表達譜研究，進一步證明了DD-PCR的結果。另外，新生鼠原代心肌細胞培養，進行高糖和低糖培養干預實驗。運用RT-PCR技術證實高糖情況下RDCR3基因的表達高于低糖(p＜0.05)。這表明，RDCR3可以作為早期診斷或輔助診斷糖尿病性心血管病變的一個標志物。
在本發明中，術語“RDCR3蛋白”、“RDCR3多肽”或“糖尿病性心血管病變相關蛋白RDCR3”可互換使用，都指具有大鼠糖尿病性心血管病變相關蛋白RDCR3氨基酸序列(SEQID NO2)的蛋白或多肽。應理解，該術語還包括其他哺乳動物中的同源蛋白，例如人的RDCR3蛋白。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的糖尿病性心血管病變相關蛋白RDCR3。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環境中分離出來(如果是天然的物質，原始環境即是天然環境)。如活體細胞內的天然狀態下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的RDCR3蛋白或多肽”是指RDCR3多肽基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化RDCR3蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。RDCR3多肽的純度能用氨基酸序列分析。
本發明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優選重組多肽。本發明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據重組生產方案所用的宿主，本發明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發明還包括大鼠RDCR3蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發明的天然大鼠RDCR3蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發明中，術語“RDCR3多肽”指具有RDCR3蛋白活性的SEQ ID NO2序列的多肽。該術語還包括具有與大鼠RDCR3蛋白相同功能的、SEQ ID NO2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括RDCR3蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與RDCR3 DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗RDCR3多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發明還提供了其他多肽，如包含RDCR3多肽或其片段的融合蛋白(如GST融合蛋白)。除了幾乎全長的多肽外，本發明還包括了RDCR3多肽的可溶性片段。通常，該片段具有RDCR3多肽序列的至少約10個連續氨基酸，通常至少約30個連續氨基酸，較佳地至少約50個連續氨基酸，更佳地至少約80個連續氨基酸，最佳地至少約100個連續氨基酸。
發明還提供RDCR3蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然大鼠RDCR3多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優化了溶解性能的多肽。
在本發明中，“RDCR3蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表1進行氨基酸替換而產生。
表1

本發明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQID NO1所示的編碼區序列有差別的核酸序列。
在本發明中，術語“RDCR3蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有RDCR3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO1中第166-798位核苷酸序列及其簡并序列。該術語還包括能在中度嚴緊條件下，更佳的在高度嚴緊條件下與SEQ ID NO1中從核苷酸第166-798位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術語還包括與SEQ ID NO1中從核苷酸第166-798位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術語還包括能編碼具有與天然的RDCR3相同功能的蛋白的、SEQ ID NO1中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(通常為1-90個，較佳地1-60個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數個(通常為60個以內，較佳地為30個以內，更佳地為10個以內，最佳地為5個以內)核苷酸。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發生的等位變異體或非天然發生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發明特別涉及在嚴格條件下與本發明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼RDCR3蛋白的多聚核苷酸。
本發明中的多肽和多核苷酸優選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發明的RDCR3核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據本發明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發明蛋白序列中。
應用PCR技術擴增DNA/RNA的方法(Saiki，et al.Science 1985；2301350-1354)被優選用于獲得本發明的基因。特別是很難從文庫中得到全長的cDNA時，可優選使用RACE法(RACE-cDNA末端快速擴增法)，用于PCR的引物可根據本文所公開的本發明的序列信息適當地選擇，并可用常規方法合成。可用常規方法如通過凝膠電泳分離和純化擴增的DNA/RNA片段。
本發明也涉及包含本發明的多核苷酸的載體，以及用本發明的載體或RDCR3蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發明所述多肽的方法。
通過常規的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的RDCR3多肽。一般來說有以下步驟(1).用本發明的編碼大鼠RDCR3多肽的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養基中培養的宿主細胞；(3).從培養基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發明中，RDCR3多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒如腺病毒、逆轉錄病毒或其他載體。在本發明中適用的載體包括但不限于在細菌中表達的基于T7的表達載體(Rosenberg，et al.Gene，1987，56125)；在哺乳動物細胞中表達的pMSXND表達載體(Lee and Nathans，J Bio Chem.2633521，1988)和在昆蟲細胞中表達的來源于桿狀病毒的載體。總之，只要能在宿主體內復制和穩定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含RDCR3編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，cold Spring HarborLaboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。這些啟動子的代表性例子有大腸桿菌的lac或trp啟動子；λ噬菌體PL啟動子；真核啟動子包括CMV立即早期啟動子、HSV胸苷激酶啟動子、早期和晚期SV40啟動子、反轉錄病毒的LTRs和其他一些已知的可控制基因在原核或真核細胞或其病毒中表達的啟動子。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當的宿主細胞，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如哺乳動物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細菌細胞；真菌細胞如酵母；植物細胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細胞；CHO、COS、293細胞、或Bowes黑素瘤細胞的動物細胞等。
本發明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。可舉的例子包括在復制起始點晚期一側的100到270個堿基對的SV40增強子、在復制起始點晚期一側的多瘤增強子以及腺病毒增強子等。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態細胞可在指數生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。
獲得的轉化子可以用常規方法培養，表達本發明的基因所編碼的多肽。根據所用的宿主細胞，培養中所用的培養基可選自各種常規培養基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養。當宿主細胞生長到適當的細胞密度后，用合適的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的RDCR3蛋白或多肽有多方面的用途。這些用途包括(但不限于)直接做為藥物治療RDCR3蛋白功能低下或喪失所致的疾病，和用于篩選促進或對抗RDCR3蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組RDCR3蛋白篩選多肽庫可用于尋找有治療價值的能抑制或刺激RDCR3蛋白功能的多肽分子。由于RDCR3在高糖條件下表達上調，因此預期可以抑制或減少RDCR3表達的物質是治療糖尿病性心血管病變的潛在候選物。
另一方面，本發明還包括對RDCR3 DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結合于RDCR3基因產物或片段。較佳地，指那些能與RDCR3基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發明中抗體包括那些能夠結合并抑制RDCR3蛋白的分子，也包括那些并不影響RDCR3蛋白功能的抗體。本發明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的RDCR3基因產物結合的抗體。
本發明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子(Ladner等人，美國專利No.4,946,778)；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。
本發明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的RDCR3基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達RDCR3蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。本發明的抗體也可以是單克隆抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備(見Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies andT Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。本發明的抗體包括能阻斷RDCR3蛋白功能的抗體以及不影響RDCR3蛋白功能的抗體。本發明的各類抗體可以利用RDCR3基因產物的片段或功能區，通過常規免疫技術獲得。這些片段或功能區可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與RDCR3基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗RDCR3蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的RDCR3蛋白。
本發明中的抗體可用于治療或預防與RDCR3蛋白相關的疾病。給予適當劑量的抗體可以刺激或阻斷RDCR3蛋白的產生或活性。
抗體也可用于設計成針對體內某一特殊部位的免疫毒素。如大鼠RDCR3蛋白高親和性的單克隆抗體可與細菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，紅豆堿等)共價結合。一種通常的方法是用巰基交聯劑如SPDP，攻擊抗體的氨基，通過二硫鍵的交換，將毒素結合于抗體上，這種雜交抗體可用于殺滅大鼠RDCR3蛋白陽性的細胞。
多克隆抗體的生產可用大鼠RDCR3蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
利用本發明蛋白，通過各種常規篩選方法，可篩選出與RDCR3蛋白發生相互作用的物質，如受體、抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發明蛋白及其抗體、抑制劑、激動劑、拮抗劑或受體等，當在治療上進行施用(給藥)時，可提供不同的效果。通常，可將這些物質配制于無毒的、惰性的和藥學上可接受的水性載體介質中，其中pH通常約為5-8，較佳地pH約為6-8，盡管pH值可隨被配制物質的性質以及待治療的病癥而有所變化。配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、或局部給藥。
本發明的多肽可直接用于疾病治療，例如，用于糖尿病性心血管病變方面的治療。在使用本發明RDCR3蛋白時，還可同時使用其他治療糖尿病性心血管病變的治療劑。
本發明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發明RDCR3多肽或其激動劑、拮抗劑以及藥學上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應與給藥方式相匹配。本發明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規方法進行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規方法進行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造。活性成分的給藥量是治療有效量，例如每天約1微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的RDCR3蛋白或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約10微克/千克體重，而且在大多數情況下不超過約8毫克/千克體重，較佳地該劑量是約10微克/千克體重-約1毫克/千克體重。當然，具體劑量還應考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫師技能范圍之內的。
大鼠RDCR3蛋白的多聚核苷酸也可用于多種治療目的。基因治療技術可用于治療由于RDCR3蛋白的無表達或異常/無活性的RDCR3蛋白的表達所致的細胞增殖、發育或代謝異常。重組的基因治療載體(如病毒載體)可設計成表達變異的RDCR3蛋白，以抑制內源性的RDCR3蛋白活性。來源于病毒的表達載體如逆轉錄病毒、腺病毒、腺病毒相關病毒、單純皰疹病毒、細小病毒等可用于將RDCR3基因轉移至細胞內。構建攜帶RDCR3基因的重組病毒載體的方法可見于已有文獻(Sambrook，et al.)。另外重組大鼠RDCR3基因可包裝到脂質體中，然后再轉移至細胞內。
抑制大鼠RDCR3 mRNA的寡聚核苷酸(包括反義RNA和DNA)以及核酶也在本發明的范圍之內。核酶是一種能特異性分解特定RNA的酶樣RNA分子，其作用機制是核酶分子與互補的靶RNA特異性雜交后進行核酸內切作用。反義的RNA和DNA及核酶可用已有的任何RNA或DNA合成技術獲得，如固相磷酸酰胺化學合成法合成寡核苷酸的技術已廣泛應用。反義RNA分子可通過編碼該RNA的DNA序列在體外或體內轉錄獲得。這種DNA序列已整合到載體的RNA聚合酶啟動子的下游。為了增加核酸分子的穩定性，可用多種方法對其進行修飾，如增加兩側的序列長度，核糖核苷之間的連接應用磷酸硫酯鍵或肽鍵而非磷酸二酯鍵。
多聚核苷酸導入組織或細胞內的方法包括將多聚核苷酸直接注入到體內組織中；或在體外通過載體(如病毒、噬菌體或質粒等)先將多聚核苷酸導入細胞中，再將細胞移植到體內等。
能與大鼠RDCR3蛋白結合的多肽分子可通過篩選由各種可能組合的氨基酸結合于固相物組成的隨機多肽庫而獲得。篩選時，必須對大鼠RDCR3蛋白分子進行標記。
本發明還涉及定量和定位檢測RDCR3蛋白水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的RDCR3蛋白水平，可以用于輔助診斷RDCR3蛋白起作用的疾病(如糖尿病性心血管病變)。
一種檢測檢測樣品中是否存在RDCR3蛋白的方法是利用RDCR3蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與RDCR3蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在RDCR3蛋白。
RDCR3蛋白的多聚核苷酸可用于RDCR3蛋白相關疾病的診斷和治療。在診斷方面，RDCR3蛋白的多聚核苷酸可用于檢測RDCR3蛋白的表達與否或在疾病狀態下RDCR3蛋白的異常表達。如RDCR3 DNA序列可用于對活檢標本的雜交以判斷RDCR3蛋白的表達異常。雜交技術包括Southern印跡法，Northern印跡法、原位雜交等。這些技術方法都是公開的成熟技術，相關的試劑盒都可從商業途徑得到。本發明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析和基因診斷。用RDCR3蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測RDCR3蛋白的轉錄產物。
檢測RDCR3基因的突變也可用于診斷RDCR3蛋白相關的疾病。RDCR3蛋白突變的形式包括與正常野生型RDCR3 DNA序列相比的點突變、易位、缺失、重組和其它任何異常等。可用已有的技術如Southern印跡法、DNA序列分析、PCR和原位雜交檢測突變。另外，突變有可能影響蛋白的表達，因此用Northern印跡法、Western印跡法可間接判斷基因有無突變。
在本發明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。本發明的多核苷酸是從大鼠2型糖尿病的心肌細胞中克隆獲得的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1219個堿基，其開放讀框位于166-798位，編碼全長為211個氨基酸的大鼠RDCR3蛋白(SEQ ID NO2)。
可為治療糖尿病性心血管病變等疾病提供新的治療途徑，因而具有巨大的應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1、制備糖尿病大鼠模型1.1動物和材料清潔級雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠100只，2月齡，體重(250±20)g，購自BK公司提供，動物合格證號滬動152；STZ(鏈脲佐菌素)購自Sigma公司提供；血糖、甘油三酯、膽固醇等生化檢測試劑盒購自名典生物工程有限公司；中性單峰純胰島素購自萬邦生化制藥有限公司；胰島素一抗及相關免疫組化試劑購自邁新公司；大鼠專用胰島素放免試劑盒購自Linco公司。
飲食成分普通飼料平均熱量3.9cal/g，其中碳水化合物占60％，蛋白質占22％，脂肪占10％(豆油為主)，包括纖維素在內的其他成分占8％；高脂飼料平均熱量5.1cal/g，其中碳水化合物占50％，蛋白質占13％，脂肪占30％(動物油脂為主)，包括纖維素在內的其他成分占7％。
1.2預實驗。
確定各組STZ的劑量、高脂飲食后STZ干預時間。
1.3動物分組。
大鼠隨機(按隨機排列表法)分為A-F共6組，A、E每組20只，其余每組15只。每日光照12h，自由飲水進食。
A組正常對照組，普通飼料喂養后2個月大鼠一次性尾靜脈注射pH4.5，0.1mol/L檸檬酸緩沖液0.5mL(同以下注射液量)，。B組小劑量STZ組即15mg/kg STZ組，普通飼料喂養后2個月大鼠STZ15mg/kg一次性尾靜脈注射(STZ溶于0.1mol/L檸檬酸緩沖液中，pH4.5)。C組大劑量STZ組即50mg/kg STZ組，普通飼料喂養后2個月大鼠STZ50mg/kg一次性尾靜脈注射。D組高脂組，高脂飼料喂養后2個月的大鼠一次性尾靜脈注射檸檬酸緩沖液。E組高脂喂養2個月后15mg/kg STZ組，大鼠高脂飼料喂養2個月后一次性尾靜脈注射STZ15mg/kg。F組高脂喂養一個月后15mg/kg STZ組，普通飼料和高脂先后喂養一個月后大鼠一次性尾靜脈注射STZ15mg/kg。尾靜脈注射后A、B、C組繼續普通飼料喂養，D、E、F組繼續高脂飼料喂養。
1.4標本采集及檢測。
1.4.1動態觀察大鼠體重、飲水量、食量。
1.4.2STZ或檸檬酸緩沖液尾靜脈注射后2天(即大鼠喂養至4月齡)的標本采集。A-F組大鼠分別進行空腹狀態下(禁食8h，以下同)尾靜脈采血，測其血糖、血脂水平。
1.4.3STZ注射后2個月(即大鼠喂養至6月齡)A-F組的標本采集及相關糖代謝分析。
14.3.1分別測定空腹狀態下血中葡萄糖、甘油三酯、膽固醇、胰島素含量。
1.4.3.2通過葡萄糖-胰島素耐量試驗測胰島素敏感性。
方法如下大鼠禁食8h后苯巴比妥鈉50mg/kg腹腔注射，行股靜脈、股動脈插管。繼股靜脈注射葡萄糖0.7g/kg后注射胰島素0.175U/kg，于0，2，4，6，8，10，20，30min股動脈抽血0.3ml，分離血清檢測血糖值，胰島素敏感性以10min內血糖下降速度來衡量，對數線性回歸(Loglinear regression)程序計算，以擬合曲線的平均斜率K值表示。
1.4.3.3測定上述指標后，每組大鼠各5只，斷頭處死，迅速取胰腺、心臟、主動脈，一部分液氮保存，一部分備病理檢查(包括本部分大鼠的形態學分析)。另外，留取A組大鼠全身不同組織液氮保存以備基因組織分布表達譜分析。
1.4.3.4胰腺的病理學觀察。胰腺用10％中性甲醛溶液固定，常規包埋，5μm切片，免疫組化采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶法，經由過氧化酶阻斷、正常非免疫動物血清封閉、目的抗體濕盒內4℃過夜、生物素二抗標記、鏈親和素-過氧化物酶孵育、DAB顯色、蘇木素復染、鹽酸酒精分色、脫水、二甲苯透明，中型樹膠封片等步驟，詳見試劑手冊。采用多媒體彩色病理圖像分析系統(KS400)，在分辨率、對比度、亮度等相同條件下測胰島Ins免疫組化染色陽性部分的平均吸光度。
1.5大鼠心血管系統形態學觀察。
1.5.1A、C、D、E各組大鼠喂養至4.5、5.5-6、10月齡即C、D大鼠糖尿病模型建立后半個月、1.5-2個月、6個月，分別斷頭處死，迅速分離心臟組織(心尖部)、主動脈置液氮保存，并各留取適當大小置10％中性甲醛溶液固定以備HE染色光鏡觀察、1mm×1mm組織塊置4℃預冷的戊二醛固定液以備電鏡觀察。
1.5.2透射電鏡標本的制備。經2％戊二醛和1％鋨酸雙固定，乙醇逐級脫水，環氧丙烷兩次置換，環氧樹脂618包埋液包埋浸透，LKB機切片，鹽酸鉛染，HITACHI，H-500透射電鏡觀察。
1.5.3掃描電鏡標本的制備。經2％戊二醛和1％鋨酸雙固定，乙醇和醋酸乙戊酯逐級脫水，HCP-2臨界點干燥，BAL-TEC離子濺射，PHILIPS，XL30 ESEM掃描電鏡觀察。
1.6數據處理。測定指標采用均數±標準差(x±s)表示，組間比較采用方差分析。數據由SPSS(10.0)統計軟件包進行處理并制圖，以P＜0.05為有顯著性意義。
實施例2大鼠2型糖尿病早期心肌病變相關基因篩選2.1材料2.1.1主要儀器設備Genomyx LRS熒光差異顯示分析系統(Beckman)，該系統包括(1)Genomyx LR電泳儀，含自動干膠裝置(2)Genomyx SC掃描儀(3)分析軟件系統包括Acquire SC，Clarity SC，Extend LRS，Virtual Grid System等(4)切膠工作站。分光光度儀(Beckman DU650)，9700型PCR儀(PE)，Fluor-sTMmultilmager凝膠圖像分析儀(Bia-RAD)，低溫高速離心機(Beckman)，雜交爐(Robbins Scientific 2000)。
2.1.2主要試劑HIEROGLPH mRNA Profile試劑盒(Beckman)包括(1)12個3’端未標記熒光的T7(dT12)錨定引物(Anchored Primer，AP)(2)20個5′M13r隨機引物(Arbitrary Primer，ARP)。Fluoro-DDRT-PCR試劑盒(Beckman)包括(1)12個含與上述錨定引物相應的四甲基羅丹明(TMR)標記引物(2)dNTP混合物(3)TMR標記的DNA分子量標記(4)fluoro-DD上樣緩沖液。
TRIZOL總RNA抽提試劑為Gibco-BRL公司產品；不含RNA酶的DNA酶I為Promega公司產品；pMD18-T Vector、DNA Markers2000、Ex Taq酶及RT-PCR Kit(該試劑盒包括AMV逆轉錄酶、RNA酶抑制劑、Oligo(dT)-Adaptor引物，10×RNA PCR緩沖液，MgCl2等)為TaKaRa公司產品；柱離心瓊脂糖凝膠回收試劑盒、PCR產物純化試劑盒及柱離心質粒微量回收試劑盒為Qiagen公司產品；GST Purification Kit購自PIERCE公司；T4 DNA連接酶、限制性內切酶BamH I、Xho I、中分子量標準蛋白質購自Promega公司；Exp TaqDNA聚合酶、DNA Marker2000、IPTG購自TaKaRa公司，羊抗人GST多克隆抗血清為Phamacia公司產品；HRP二抗為華美生物工程公司產品；聯苯二胺(DAB)顯色劑為邁新公司產品。
2.1.3質粒和菌種GST蛋白融合表達質粒pGEX4T-1為Phamacia公司產品；常規的大腸桿菌DH5α(E.coli DH5α)及BL21(E.coli BL21)購自北京博大泰克。
2.1.4動物同實施例1。
2.2方法2.2.1動物分組及標本采集。
大鼠分組同實施例1糖尿病大鼠模型制備。
DD-PCR分析的標本來自本研究第一部分液氮保存的組織。E組(2型糖尿病模型組)建模后半個月所取的心肌、主動脈組織，分別以A組相應組織為對照。免疫組化標本來自來自正常對照及E組模型建立后0.5、2和6個月的心肌組織。
2.2.2樣品總RNA的提取。
組織搗碎后置TRIZOL液中徹底勻漿，加入氯仿、異丙醇分離RNA，乙醇洗滌沉淀，DEPC水溶解，-20℃保存備用。具體按試劑手冊操作。
2.2.3不含RNA酶的DNA酶處理以去除少量基因組DNA，10×PCR緩沖液 5.0μl50mmol/L MgCl21.5μlRNasin50uDNA酶I(RNase-Free)45u總RNA 20μg加DEPC處理過的雙蒸水至50μl
混勻→37℃，30min→加DEPC處理過的雙蒸水至500μl→酚/氯仿抽提后溶解于20μlDEPC水中。
2.2.4采用比色法和電泳法鑒定總RNA的質量。
2.2.4.1比色法上述RNA溶液稀釋100倍后于260nm和280nm波長處測吸光度(A)，分析RNA濃度和A260/A280比值。RNA的定量根據下列公式求出其濃度。
RNA溶液的濃度(μg/ml)＝A260×40×稀釋倍數。
2.2.4.2電泳法2.2.4.2.1凝膠的制備稱取瓊脂糖1.2g，加入5×甲醛凝膠電泳緩沖液12ml，DEPC處理過的雙蒸水37.3ml，加熱溶解。待溶液冷卻至60℃時加入12.3mol/L的甲醛貯存液10.7ml，10mg/ml的溴乙錠3.0μl，混勻，于室溫中靜置0.5h使凝膠凝固。
2.2.4.2.2樣品的制備及電泳。在一滅菌的Eppendorf管中加入下述各成分混勻后65℃溫育15min后迅速置于冰浴中，加2μl滅菌的并經EDPC處理的10×甲醛凝膠上樣緩沖液，混勻。凝膠預電泳5min(5V/cm)后上樣。在1×甲醛凝膠電泳緩沖液中以4V/cm的場強電泳。紫外燈下觀察電泳結果。
RNA樣品 4.5μl5×甲醛凝膠電泳緩沖液2.0μl甲醛 3.5μl甲酰胺 10.0μl2.2.5樣品RNA的DDRT-PCR反應。
各組RNA樣品以T7(dt12)AP作為3’端引物，進行逆轉錄反應，反應體系20μl25mmol/L MgCl24μl，10×PCR緩沖液2μl，250μM dNTP混合物2μl，RNase抑制劑0.5μl，0.25U/μl反轉錄酶1μl，T7(dt12)AP各4μl，Total RNA 0.8ug，剩余容積以H2O補足。反應條件如下42℃30min，50℃30min，70℃15min，反應結束后4℃保存。以M13rARP為隨機引物，TMR-T7(dt12)AP為錨定引物，對各組cDNA產物進行PCR擴增。反應體系10μl10×PCR緩沖液1.0μl，25mM MgCl21.5μl，250mM dNTPs 2.0μl，M13r-ARP各1.75μl，TMR-T7(dt12)AP各0.7μl，RT mix 1.0μl，EX Taq酶0.1μl，H2O1.95μl。條件如下(1)95℃2min(2)4個循環92℃15s，50℃30s，72℃2min(3)30個循環92℃15s，60℃30s，72℃2min(4)72℃7min(5)4℃保存。
2.2.6DD-PCR電泳流程2.2.6.1蒸餾水反復沖洗玻璃板、墊片和梳子。將無切跡玻璃板的內面用4mol/LNaOH處理，將有切跡玻璃板的內面用Glass Shield硅化，隨后用乙醇處理，自然晾干。將無切跡玻璃板的內面朝上置灌膠工作臺上，墊片緊貼于玻板的兩側，將另一塊玻板的處理面朝下覆蓋在上述玻璃板上。在70ml 5.6％變性HR-1000膠中加入560μl新鮮制備的10％APS和56μl TEMED，水平灌膠，并將梳子的水平一側插入凝膠內，玻板的兩邊用夾子固定，使膠充分聚合。
2.2.6.2在200μl薄壁管中加入4.0μl DD-PCR產物和1.5μl上樣緩沖液，95℃變性2min，迅速置于冰內。上樣前，將膠放在掃描儀上預掃描，以減少背景干擾。
2.2.6.3DD-PCR電泳條件如下電壓3000V，時間5h。
1.2.6.4電泳結束后，打開Acquire SC程序并啟動掃描儀，相關分析軟件進行差異條帶的定位。
2.2.6.5將膠板從掃描儀取下，移走有切跡的玻璃板，干膠并用蒸餾水沖洗15min，反復操作3次。割膠工作臺上操作，差異條帶浸泡于50μl TE中，37℃溫育1h。切割完畢后將玻璃板放入掃描儀重新掃描，檢測割膠的準確性。
2.2.7差異條帶的再擴增，通用引物為T7 promoter(22-mer)，5’gtaatacgactcactatagggc 3’(SEQ ID NO3)M13 reverse(24-mer)，5’agcggataacaatttcacacagga 3’(SEQ ID NO4)其它PCR條件同DD-PCR過程。
反應結束后，用2％瓊脂糖凝膠電泳，檢測擴增出的特異條帶。
2.2.8割膠和膠回收(Qiagen)按實際手冊說明進行每100g瓊脂糖凝膠加入300μl比例加入S1液，置55℃水浴10min每2min顛倒混勻一次；加入1/3 S1液體積的異丙醇，混勻，55℃溫浴1min；將溶化后的Agarose液移入吸附柱，W1液反復沖洗；在吸附膜中央加入30μl T1液后高速離心1min；過柱液-20℃保存。
2.2.7RDCR3的組織分布。
以GAPDH作為內參照，PCR產物經2％瓊脂糖凝膠電泳及輝度掃描初步預測RDCR3在不同組織中表達的差異。
RDCR3-p15’GGACCAGCACTGGGAGAATA3’(SEQ ID NO5)，RDCR3-p25’CGGCTCATGAGGTACAATGA3’(SEQ ID NO6)；GAPDH-p15’ATGATTCTACCCACGGCAAG3’(SEQ ID NO7)，GAPDH-p25’TTCAGCTCTGGGATGACCTT3’(SEQ ID NO8)。
PCR產物RDCR3為605bp，GAPDH為529bp。25μl反應體系如下10×PCR緩沖液2.5μl，25mM MgCl22μl，2.5μM dNTPs 2μl，引物RDCR3各1.5μl、GAPDH各0.5μl，RT mix 1.5μl，EX Taq酶0.2μL，H2O12.8μl。經1cycles95℃反應3min；28cycles94℃變性反應45sec，56℃退火反應45sec，72℃延伸反應1min；1cycle72℃反應7min，4℃保存。
2.2.8RDCR3基因在大腸桿菌中的融合表達2.2.8.1RDCR3序列的PCR擴增按RDCR3序列(Genebank登錄號AY095481)設計并合成引物，上游引物PG15’-cgGGATCCATTGTGGACTACAAGGCAT-3’(SEQ ID NO9)，引入BamH I酶切位；下游引物PG2
5’-ccgCTCGAGTCAGTCCCATGGGACCT-3’(SEQ ID NO10)，引入Xho I酶切位，擴增可獲得633bp的RDCR3序列，編碼211個氨基酸；按文獻設計5’端pGEX-4T-1(869-891)測序引物5’-GGGCTGGCAAGCCACCTTTGGTG-3’(SEQ ID NO11)。
反應參數為94℃2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，28個循環；最后72℃7min。反應體系如下將抽提的大鼠心肌組織總mRNA經反轉錄后得到的cDNA作為模板約0.1μg，Exp Taq酶1.5μl，PG1 50pmol，PG2 50pmol，dNTP終濃度200μmol/L，Mg2+終濃度1.5mM，10×Buffer 5μl，加H2O至50μl。
2.2.8.2重組質粒pGEX-4T-RDCR3的構建，見圖1。
2.2.8.3差異片斷的亞克隆2.2.8.4連接反應16℃過夜按生產商的說明書，將PCR擴增獲得的DNA片段與PMD 18-T載體(購自TAKARA公司)在16℃連接過夜。
2.2.8.5轉化2.2.8.6感受態細菌的制備無鉑絲蘸取-70℃凍存的E.coli(DH52)，在LB平板上劃線接種，平板置于37℃ 16h；挑取單菌落置于5ml LB培養基中，37℃振搖16h；取1ml上述培養液接種到一含有50mlLB培養基的燒瓶中，37℃振搖培養3h，測A600，待其值達到0.3-0.4時將燒瓶取出，立即置冰浴10min；在無菌條件下將細菌轉移到一消毒過的預冷的50ml離心管；4℃4000rpm離心10min，棄去上培養液，將離心管倒立于濾紙上1min使培養液流盡；向離心管中加入10ml預冷的0.1mol/LCaCl2溶液，重懸沉淀的菌體，置冰浴30min；4℃ 4000rpm離心10min，棄去上清液，將離心管倒立于濾紙上1min；加入2ml預冷的0.1mol/L CaCl2溶液，輕輕重懸菌體；將上述菌體置于4℃冰箱中12～24h，然后分裝保存于15％的甘油中-20℃備用。
2.2.8.7質粒的轉化連接產物5μl+感受態細菌200μl→冰浴30min→42℃水浴90s→加入800μlLB培養基，混勻→37℃振搖90min(120rpm)→將菌液接種于含有10μg/ml氨芐青霉素及IPTG/X-Gal的LB培養板上→培養板于37℃正放30min→37℃倒放20h→挑取白色菌斑，接種于5ml含有10μg/ml氨芐青霉素的LB培養基中→37℃振搖(120rpm)將PCR產物用BamH I和Xho I雙酶切獲得RDCR3，定向插入載體pGEX-4T-1的MCS。用BamH I和Xho I雙酶切鑒定，選取酶切鑒定的質粒送DNA測序。
2.2.8.8GST-RDCR3融合蛋白的表達純化按PIERCE公司和Phamacia公司產品手冊所述，對GST融合蛋白進行親和純化。
2.2.8.9.1表達鑒定及條件優化(1)將篩選獲得的重組質粒轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，挑取新鮮單個菌落于5ml2×YT液(含100μg/ml Amp)中，37℃ 200rpm振搖過夜；(2)將飽和菌液以1∶100比例轉接于5ml 2×YT液中，37℃振搖培養3-4h至A6000.5；(3)加入IPTG至終濃度為300μM，37℃，250rpm下繼續培養4h。4℃、7000g離心收集菌體沉淀，細菌裂解液破碎，按誘導前全菌、誘導后全菌、上清、沉淀進行SDS-PAGE。電泳膠的配制底層使用12％分離膠(10ml含30％聚丙烯胺4ml、1.5mM Tris(pH 8.8)2.5ml、10％SDS 0.1ml、10％過硫酸胺0.1ml、TEMED 4μl、ddH2O 0.1ml)，灌注適當高度后，覆蓋一層飽和正丁醇，膠聚合后ddH2O洗數次，吸干；配制5％成層膠(2ml含30％聚丙烯胺0.33ml、1.0mM Tris(pH 6.8)0.25ml、10％SDS 0.02ml、10％過硫酸胺0.02ml、TEMED 1μl、ddH2O 1.4ml)，聚合后拔出梳子，電泳緩沖液沖洗上樣孔。蛋白樣品與2×SDS凝膠加樣緩沖液等體積混勻，置100℃5min后上樣，于4℃，100V恒壓在1×Tris-甘氨酸緩沖液中電泳0.5h后，將電壓改為150V至結束。
(4)電泳結束后取出凝膠，考馬斯亮蘭染色，脫色。根據電泳結果，取表達最佳的單個克隆接入3ml 2×YT/Amp培養液中，37℃，250rpm培養4-5h至A6001.5，加入終濃度為15％的甘油，混勻后分裝于0.5ml離心管，-70℃保存。
(5)取上述菌落，同法進行表達分析，分別在33℃、35℃、37℃三個溫度段，IPTG誘導后繼續培養4、6、8h，取少量樣品，制備電泳樣品，按全菌、上清、沉淀進行SDS-PAGE。選擇最佳表達條件(包括可溶性及表達產量)。
2.2.8.9.2.原核表達及融合蛋白的純化(1)取10ul復融的甘油菌種接入10ml 2×YT培養液于100ml三角瓶中，30℃、250rpm，振蕩培養過夜；(2)按2％比例接種入250ml的2×YT培養基中，37℃培養至A600為0.5時，加入IPTG至終濃度0.3mM；(3)改35℃繼續培養4h后收獲菌體，7000rpm離心10min沉淀菌體；(4)將菌體重懸于細菌裂解液10ml中直至液相均一，室溫下輕微振蕩10min。
(5)將裂解液14000rpm離心15min，菌液上清加入1mL固化谷胱苷肽樹脂室溫震蕩10min，2500rpm離心10min；(6)棄上清，加入0.25ml洗滌緩沖液重懸樹脂，將其移入B-PERTM純化柱中，10000rpm離心2min；(7)加入0.5ml洗滌緩沖液，孵育5min，10000rpm離心2min；(8)另取0.5ml洗滌緩沖液，配制洗脫緩沖液(含還原型谷胱苷肽15mg)；(9)將洗脫液加入B-PERTM純化柱，孵育5min，10000rpm離心2min；收集離心洗脫液，其中含有表達產物GST-RDCR3。取10ul樣品與誘導前、誘導后全菌樣品進行SDS-PAGE，灰度掃描分析目的蛋白并計算其在總蛋白中的含量。
2.2.9.表達產物的免疫印跡鑒定2.2.9.1.融合蛋白GST-RDCR3進行SDS-PAGE。
2.2.9.2.轉膜電泳完畢，取下凝膠，切一張和凝膠等大的硝酸纖維素膜(NC膜)和2張Whatman3MM濾紙，按濾紙、凝膠、NC膜、方向排好，排除各層氣泡，前后端用海棉和多孔有機玻璃板加緊，置電轉移槽中。在轉移緩沖液中恒壓100V，電轉移1.5h，SDS-PAGE分離后的凝膠中蛋白電轉移至硝酸纖維素膜。
2.2.9.3.免疫印跡實驗(1)將NC膜放入可熱密封塑料袋，加5ml封閉液(TTBS，0.1％(v/v)Tween20，100mM Tris.Cl(pH 7.5)，0.9％(w/v)NaCl)，室溫置搖床1h；(2)將NC膜放入用封閉液以1∶1000稀釋的羊抗人GST多克隆抗血清中[12]，37℃孵育1h；(3)TTBS緩沖液洗膜，5min×3次；(4)將NC膜移入用TTBS以1∶1000稀釋的IgG-HRP二抗中，37℃孵育1h；(5)TBS洗膜，5min×3次；(6)置DAB(50mg DAB/100ml PBS緩沖液+10ul 30％H2O2)中顯色；(7)條帶顯示清楚后自來水沖洗，終止反應。
結果1、基因基本信息獲得的序列RDCR3經nr數據庫進行查詢、尋找ORF、進行全長cDNA的識別及染色體定位。
新基因RDCR3全長1219bp，GenBank登錄號為AY095481，序列如SEQ ID NO1所示，其中ORF位于166-798位。
與2001年底公布的大鼠部分基因序列(長104429bp)98％同源，該基因跨度至少＞40kb，包含6個外顯子，5個內含子，部分比較結果見圖9所示。由于大鼠基因組草圖尚未竣工，無法進一步染色體的精確定位。
RDCR3 cDNA序列所編碼的211個氨基酸蛋白，命名為RDCR3(Rat DiabeticCardiomyopathy Related Gene 3)。序列如下MIVDYKAFIP NGPSPGSRVL TILEQIPGMV VVADKTAELY KTTYWASYNI PYFESVFNPS 60GLQALVAQYG DWFSYTRNPR AKIFQRDQSL VEDVDTMVRL MRYNDFLHDP PSLCEACSPK 120PNAENAISAR SDLNPANGSY PFQALRQRAH GGIDVKVTSV ALAKYMSMLA ASGPTWDQLP 180PFQWSKSPFH NMLHMSQPDL WMFSPVKVPW D 2112對蛋白質的結構和功能分析2.1同源性分析與RDCR3蛋白同源性相對高的蛋白是lysosomal/endosomal membrane protein p67(溶酶體/內體膜蛋白p67，來自錐蟲，同源性37％)，和serine/threonine kinase(絲氨酸/蘇氨酸，來自Arabidopsis thaliana，同源性27％)。
2.2理化特性分析RDCR3的211個氨基酸中含有73個疏水性氨基酸、59個極性氨基酸及53個帶電氨基酸。RDCR3分子量為23827.26m.w，等電點為6.74(圖2)。
2.3結構域及基序的功能預測。
2.3.1Spscan預測RDCR3蛋白無跨膜結構域及信號肽，因此它屬于膜蛋白或分泌蛋白的可能性不大，很有可能是一種胞漿蛋白。
2.3.2結構域的檢索。發現RDCR3蛋白含Rhodopsin-like GPCR超家族特征結構域，在下列序列中以下劃線標示。
MIVDYKAFIP NGPSPGSRVL TILEQIPGMVVVADKTAELY KTTYWASYNI PYFESVFNPS60GLQALVAQYGDWFSYTRNPR AKIFQRDQSL VEDVDTMVRL MRYNDFLHDP PSLCEACSPK 120PNAENAISAR SDLNPANGSY PFQALRQRAH GGIDVKVTSV ALAKYMSMLA ASGPTWDQLP180PFQWSKSPFH NMLHMSQPDL WMFSPVKVPW D 211(SEQ ID NO2)2.3.3基序分析結果表明存在以下基序

2.3.4蛋白修飾位點DCR-3有多個蛋白修飾位點1個N-糖基化位點、2個蛋白激酶C磷酸化位點、2個酪蛋白激酶II磷酸化位點。
N-糖基化位點符合N[^P][ST][^P]模式，具體序列為SEQ ID NO2中137-140位的NGSY蛋白激酶C磷酸化位點符合[ST].[RK]模式，具體序列為SEQ ID NO2中第118-120為的SPK和第128-130位的SAR。
酪蛋白激酶II磷酸化位點符合[ST].{2}[DE]模式，具體序列為SEQ ID NO2中第21-24位的TILE、第89-92位的SLVE、第112-115位的SLCE、第196-199位的SQPD。
2.4蛋白質二級結構2.4.1RDCR3蛋白可能出現的α、β及混合型蛋白結構域的比例分別為10.4％、19.9％和69.7％。根據α型％H＞45、％E＜5；β型％H＜5、％E＞45；α-β型％H＞30、％E＞20；其余為混合型的標準，RDCR3應屬于一種混合型蛋白。見圖3A和3B。
2.4.2二級結構的免疫原性分析將編碼RDCR3的N端第1個殘基定義為1，以此類推，C末端的殘基為211。親水性、表面可及性、可塑性及抗原指數結果如下RDCR3的親水性區域主要有1-18，36-52，70-92，99-109，117-153，173-198等。
可及性較高的區域有12-17，35-45，74-89，101-106，119-124，145-151，175-180，183-189等。
可塑性較高的主要區域有9-19，75-81，84-94，117-124，129-139，171-181等。
可能的蛋白質抗原表位區域12-20，75-99，102-114，117-140，145-159，173-191等。
3.RDCR3的組織分布以GAPDH為內標，半定量RT-PCR初步預測RDCR3在正常大鼠不同組織中的分布。2％瓊脂糖凝膠電泳見圖4。
經3次半定量RT-PCR及輝度掃描，以目的基因與內標GAPDH產物輝度比值×10表示表達豐度，柱型圖表示，圖5。
4.PCR產物的克隆及重組子鑒定通過PCR獲得了650bp的RDCR3特異帶(圖6)，回收的PCR產物與pGEX-4T-1載體的連接產物轉化感受態菌，在LB平板上篩選轉化子，用BamH I、Xho I雙酶切鑒定，獲得預期大小的DNA片段。DNA測序進一步證實克隆片段確實為RDCR3序列且無發生堿基突變。
5.RDCR3蛋白在大腸桿菌中的表達pGEX-4T-1載體編碼產生26kDa的GST蛋白，外源基因以融合蛋白形式表達。攜有RDCR3融合表達質粒pGEX-4T-1-RDCR3在宿主菌E.coli BL21經IPTG誘導后，菌體裂解物進行SDS-PAGE電泳，結果顯示攜有重組表達質粒的工程菌在約50kD(GST-RDCR3)位置處有一特異條帶。薄層掃描顯示表達量約占菌體總蛋白的30％(圖7)。表達產物約50％存在上清液中，經GST親和層析后得到純化的GST-RDCR3。
6.Western印跡分析結果如圖8所示，表明得到單一帶GST標簽的RDCR3融合蛋白。
實施例3RDCR3在高糖培養條件下的表達高于低糖培養條件在本實施例中，對新生鼠原代心肌細胞，在高糖(濃度25mmol/l)和低糖(5.6mmol/l)條件下，于DMEM培養基中進行培養干預實驗。在培養4天后，抽提心肌細胞的總mRNA，用SEQ ID NO5和6所示的引物，進行常規RT-PCR檢測RDCR3的表達量。
結果表明，在高糖情況下，RDCR3基因的表達高于低糖(p＜0.05)實施例4抗RDCR3蛋白抗體的產生將實施例1中獲得的重組大鼠RDCR3蛋白用來免疫動物以產生抗體，具體方法如下。重組分子用層析法進行分離后備用。也可用SDS-PAGE凝膠電泳法進行分離，將電泳條帶從凝膠中切下，并用等體積的完全Freund’s佐劑乳化。用50-100μg/0.2ml乳化過的蛋白，對小鼠進行腹膜內注射。14天后，用非完全Freund’s佐劑乳化的同樣抗原，對小鼠以50-100μg/0.2ml的劑量進行腹膜內注射以加強免疫。每隔14天進行一次加強免疫，至少進行三次。獲得的抗血清的特異反應活性用它在體外沉淀大鼠RDCR3蛋白基因翻譯產物的能力加以評估。
結果發現，抗體可特異性地與本發明蛋白發生結合。
實施例5篩選影響RDCR3蛋白表達的物質在本實施例中，重復實施例3的培養，不同點在高糖條件下，在培養液中加入0.001mg/L、0.01mg/L黃連素，作為測試組。另外，在無黃連素存在下，培養大鼠心肌細胞作為對照組；在培養3天，用RT-PCR法測定測試組和對照組中RDCR3蛋白的表達情況，結果顯示，測試組中RDCR3蛋白的表達量低于對照組，這表明黃連素是抑制RDCR3蛋白表達的物質。
實施例6RDCR3在成心肌細胞誘導分化中的表達變化在本實施例中，大鼠成心肌細胞H9c2細胞株(購自ATCC，編號CRL-1446)在低糖DMEM 10％胎牛血清中(5.6mmol/l)中培養近融合時，降低血清濃度為1％加終濃度為10nM的全反式維甲酸(Sigma公司)，誘導七天，分別研究第1，3，5，7天的RDCR3和心肌細胞成熟的特異標志物LCAD和ANF的表達情況。
結果顯示，隨著ANF和LCAD表達增高，RDCR3表達也逐日增高。說明RDCR3在促進心肌誘導分化中起一定作用。可促使心肌功能衰竭情況下心肌的自我修復的代償功能的發揮。
討論序列的生物信息分析是從理論邁向實驗或臨床研究的重要部分，如果想對感興趣的基因投入研究，那么基于生物信息學獲得盡可能多的關于該基因的信息就十分必要，往往能對后繼的工作起到事半功倍的效果。本研究應用生物信息學技術對RDCR3的結構/功能進行一系列分析，以期對進一步的研究工作提供有益的參考。
(a)新序列的同源性分析蛋白的不同部位其進化速率可能不同，功能重要的部分如酶的活性位點進化得慢，在不同序列中保守性好。因此在遠緣的序列中有可能發現某種共同的保守序列片段，從而揭示某種結構或功能聯系。RDCR3與低等動物內體/溶酶體膜蛋白、絲氨酸/蘇氨酸具一定同源性。內體/溶酶體在外源性抗原的加工和遞呈中發揮作用，這一過程的順利進行都需要內體/溶酶體膜蛋白發揮信號轉導作用Bonnerot C，Briken V，Amigorena S.Immunol Lett.1997，571；Hunziker W，Geuze HJ.Bioassays.1996，18379。尤為引人注目的是RDCR3與內體/溶酶體膜蛋白均含視紫質樣GPCRs(Rhodopsin-like GPCRsuperfamily signature)結構域，后者是一種包括激素、神經遞質和光受體在內的作用廣泛的蛋白質亞家族，通過與鳥嘌呤核苷酸結合蛋白相互作用轉導細胞外信號，與分泌素樣GPCRs、cAMP受體同屬G蛋白耦聯受體(GPCRs)的蛋白大家族，發揮一系列涉及自分泌、旁分泌和內分泌過程的功能。這提示RDCR3蛋白功能與信號轉導、激酶密切相關。
另外在蛋白質的基序檢索中，發現RDCR3與乳清酸核苷5’-磷酸脫羧酶、激酶P85調節亞單位信號、高絲氨酸激酶信號、脂質-A-二糖合成酶、DAHP合成酶2以及TASK K+通道信號有著類似的基序。這些基序的發現，與預測得到的RDCR3多個磷酸化及糖基化修飾位點不謀而合，該蛋白可能接受多種信號的調控。
RDCR3在組織中分布廣泛，但mRNA水平在主動脈及心臟、骨骼肌中的表達較低，似乎與這三種組織富含平滑肌細胞有關。RDCR3在糖尿病性主動脈病變早期中的表達上調，這在高糖或高脂所導致細胞結構和功能變化的多通路改變中究竟處于哪一環節，有待進一步探討。
(b)二級結構預測在蛋白的二級結構預測中，親水性反映了殘基從水相轉移到非極性相的自由能變化，親水性殘基傾向于暴露在蛋白質表面。但是，親水性部位與抗原表位并無很好的一致性，而且通常僅曲線的較高峰預測的抗原表位才相對可靠。可及性指蛋白抗原中殘基被溶劑分子接觸的可能性，它反映了蛋白抗原內、外各層各殘基的分布組成。可塑性指蛋白抗原構象不是剛性不變的，其多肽骨架有一定程度的活動性，由于蛋白質的環區往往具有較大的自由度，用此方法預測的抗原表位多落于環區。二級結構預測也認為β轉角結構為凸出結構，多出現在蛋白抗原表面，利于與抗體嵌合，較可能成為抗原表位。抗原指數系綜合了親水性、表面可及性、可塑性及二級結構預測的線性組合，對于推測RDCR3蛋白質的抗原表位較有價值，最常采用的方案為Jamson-Wolf方案，采用以下公式進行計算抗原指數(A)＝0.3親水性值(H)+0.15表面特性值(S)+0.15可塑性值(F)+0.2(Chou&Fasman值+Garnier-Osguthorpe-Robson值)Webster DM.Protein structure predictionmethods andprotocols.New Jersey.USA.Humana Press Inc.2001；來魯華編著.蛋白質的結構預測與分子設計.第一版，北京北京大學出版社.1993。可見，抗原指數較其它算法有一定的優勢。根據RDCR3抗原表位的預測，其抗原表位分部均勻，因此可以考慮全長表達該蛋白。
(c)蛋白表達谷胱甘肽S-轉移酶(GST)融合表達載體pGEX-4T-1用于高效表達與GST融合的目的蛋白。菌體裂解物中的融合蛋白可通過親和柱中的谷胱甘肽親和純化。蛋白的洗脫條件比較溫和，較大限度地避免對蛋白的抗原性和生物活性造成不利的影響。本研究通過IPTG誘導的GST融合表達和親和層析純化得到了高純度的分子量為50KDa的GST-RDCR3融合蛋白。由于pGEX-4T-1是一種融合表達載體，載體本身表達26KDa的融合蛋白氨基端部分，故本實驗插入片段實際編碼24KDa的重組蛋白，與RDCR3分子量的理論值相吻合。真核生物基因以融合蛋白形式在大腸桿菌中表達具有以下優點Hockney RC.Recent development in heterologousprotein production in Escherichia coli.Trends in Biotech.1994，12456；Hering TM，Kollar J，Huynh TD，et al.Purification and characterization of decorin core proteinexpressed in Escherichia coli as a maltose-binding protein fusion.Anal Biochem.1996.240981.由于轉錄和翻譯過程起始所需的RNA聚合酶結合部位(即啟動子)及核糖體結合位點(SD序列)由質粒提供，因而融合蛋白通常得到高效表達；2.融合蛋白部分序列由原核細胞基因編碼，可保護重組蛋白不被細菌蛋白酶降解破壞，使其比天然外源蛋白更穩定；3.表達出的融合蛋白以可溶性形式穩定存在于細菌胞漿中，有利于蛋白肽鏈的正確折疊，保持其構象及生物學功能；4.可通過已商品化的親和層析純化系統(如Amylose Resin、谷胱甘肽Sepharose等)方便地獲得高純度的非變性目的蛋白，可用于免疫動物及建立免疫學診斷方法。
本發明采用GST融合蛋白系統成功地制備并純化新基因RDCR3表達的蛋白，為今后深入研究RDCR3的結構與功能相互作用的機理以及免疫學測定提供條件。也為治療糖尿病性心血管病變藥物篩選提供新的靶點。例如，可以將候選物質添加到高糖條件下培養的心肌細胞培養物中，觀察其對RDCR3表達影響。
目前不斷新開發的糖尿病治療藥物的療效中都會有提及對糖尿病慢性并發癥的作用比如對于磺脲類藥物可能作用于心肌上類似胰島細胞的鉀離子通道而影響糖尿病患者的心臟功能，而噻唑皖二酮類又可能參與心肌的保護機制，任何與糖尿病性心血管病變相關的基因都可以作為糖尿病治療藥物對患者心臟影響的篩選指標。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海市內分泌代謝病研究所<120>糖尿病性心血管病變相關基因及其用途<130>050053<160>11<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1219<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>CDS<222>(166)..(798)<223>
<400>1accactgtcg gcaacaagaa cccagcgctg tggaagtacg tgcaacccca gggctgtgtg 60ctggagtgga ttcgaaacat tgtggccaac cgcctggcct tggatggggc cacctgggca120gatgtcttca ggcggttcaa tagtggcacg tataataacc agtgg atg att gtg gac177Met Ile Val Asp1tac aag gca ttc atc ccc aat ggg ccc agc cct gga agc cgg gtg ctc 225Tyr Lys Ala Phe Ile Pro Asn Gly Pro Ser Pro Gly Ser Arg Val Leu5 10 15 20acc atc cta gaa cag atc ccg ggc atg gtg gtg gtg gcg gac aag act 273Thr Ile Leu Glu Gln Ile Pro Gly Met Val Val Val Ala Asp Lys Thr25 30 35gca gag ctc tac aag acg acc tac tgg gct agc tac aac atc ccg tac 321Ala Glu Leu Tyr Lys Thr Thr Tyr Trp Ala Ser Tyr Asn Ile Pro Tyr40 45 50ttt gag agt gtt ttc aac cct agt ggt ctg cag gcc ctg gta gcc cag 369Phe Glu Ser Val Phe Asn Pro Ser Gly Leu Gln Ala Leu Val Ala Gln55 60 65tac gga gat tgg ttc tcc tac acc agg aac cct cga gcc aag atc ttc 417Tyr Gly Asp Trp Phe Ser Tyr Thr Arg Asn Pro Arg Ala Lys Ile Phe70 75 80cag agg gac caa tca cta gtg gag gac gta gac acc atg gtc cgg ctc 465Gln Arg Asp Gln Ser Leu Val Glu Asp Val Asp Thr Met Val Arg Leu85 90 95 100atg agg tac aat gac ttc ctt cat gac cct ccg tcg ttg tgt gag gcc 513Met Arg Tyr Asn Asp Phe Leu His Asp Pro Pro Ser Leu Cys Glu Ala105 110 115tgc agc ccg aag ccc aac gca gag aac gcc atc tct gcc cgc tct gat 561Cys Ser Pro Lys Pro Asn Ala Glu Asn Ala Ile Ser Ala Arg Ser Asp120 125 130ctc aac cct gct aat ggc tcc tac cca ttt cag gcc ctg cgt cag cgc 609Leu Asn Pro Ala Asn Gly Ser Tyr Pro Phe Gln Ala Leu Arg Gln Arg135 140 145gcc cat ggc ggc att gat gtg aag gtg acc agc gtt gcg ctg gct aag 657Ala His Gly Gly Ile Asp Val Lys Val Thr Ser Val Ala Leu Ala Lys150 155 160tac atg agc atg ctg gca gcc agt ggc ccc acg tgg gac caa ttg cca 705Tyr Met Ser Met Leu Ala Ala Ser Gly Pro Thr Trp Asp Gln Leu Pro165 170 175 180
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1.一種分離的RDCR3多肽，其特征在于，該多肽選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有促進心肌誘導分化功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它選自下組(a)編碼如權利要求1所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中166-798位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1219位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養物中分離出RDCR3蛋白多肽。
9.一種檢測樣品中是否存在RDCR3蛋白的方法，其特征在于，包括將樣品與RDCR3蛋白特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在RDCR3蛋白。
10.一種組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權利要求1所述的多肽或其拮抗劑或激動劑以及藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明提供了一種新的糖尿病性心血管病變相關蛋白－RDCR3(Rat Diabetic Cardiomyopathy Related Gene 3)蛋白，編碼RDCR3蛋白的多核苷酸和經重組技術產生這種RDCR3蛋白的方法。本發明還公開了編碼這種RDCR3蛋白的多核苷酸的用途。RDCR3蛋白具有Laminin A結構域，與心臟發育及心肌病發病相關。
文檔編號A61K38/17GK1916022SQ20051002893
公開日2007年2月21日 申請日期2005年8月19日 優先權日2005年8月19日
發明者羅敏 申請人:上海市內分泌代謝病研究所