專利名稱：禽傳染性鼻炎疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種疫苗的制備方法，具體地說，是一種禽傳染性鼻炎疫苗的制備方法。屬于生物工程領域。
背景技術：
雞傳染性鼻炎是雞的一種呼吸道疾病，是當前危害養雞業發展的重要傳染病之一，其病由副雞嗜血桿菌引起。副雞嗜血桿菌CVCC258和CVCC269是《中國菌種目錄》在編菌種(英文版，1992年10月機械工業出版社出版，中國微生物菌種保藏管理委員會編著)，中國獸醫微生物保藏中心作為中國微生物菌種保藏管理委員會下設機構保證常年為國內外教學、科研、生產單位提供《中國菌種目錄》中的微生物，列入《中國菌種目錄》的微生物將長期保存，一直對外供應，公眾能從中國獸醫微生物保藏中心買到的微生物菌種(CVCC中國獸醫微生物保藏中心，該中心20多年來為生產、科研、教學提供了6萬多株各類獸醫微生物菌種)。副雞嗜血桿菌CVCC258和CVCC269是禽傳染性鼻炎的病源。CVCC258是1984年從發病雞中分離，血清型C型；CVCC269是從發病雞中分離，血清型A型。目前，繁殖副雞嗜血桿菌用的培養基一般使用固體的巧克力培養基，也有使用心腦浸湯、雞胚或細胞培養，該菌是一種需要有V因子才能在體外生長的微生物。該病病程較長，雖然抗菌藥物能控制本病，但治療期間仍有死亡，停藥后極易復發，而且不能消除帶菌狀態，因此疫苗的應用仍十分必要。目前滅活疫苗主要為油乳劑苗和氫氧化鋁疫苗。疫苗注射后14天才能產生堅強免疫力；近期平均保護率可達80％。
經對現有技術的文獻檢索發現，張知良等人在《中國禽業導刊》1998年14卷6期上發表的“雞傳染性鼻炎油乳劑滅活疫苗的研究”一文中，將雞傳染性鼻炎A型和C型菌株接種自制的雞肉湯(雞血清、血紅素)和瓊脂培養基，用甲醛滅活，選擇礦物油制備成油乳劑疫苗。該苗免疫期內的攻毒保護率為84％-91.6％。該苗制備過程中培養液中菌體含量低，以至于免疫后攻毒保護率較低。
發明內容
本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供一種禽傳染性鼻炎疫苗的制備方法，使其提供副作用小、免疫力強、免疫期長的疫苗。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括以下步驟1)將副雞嗜血桿菌CVCC258和CVCC269復蘇后連續傳代接種雞胚，分離鑒定細菌作菌種；2)將副雞嗜血桿菌通過雞肉湯裂解血液體培養基增殖細菌，使培養物的含菌量高達1011CFU/ml(CFU為菌落形成單位)；3)菌體滅活后，按水相總量5％加入鹽酸左旋咪唑和按水相總量20％加入亞硒酸鈉維生素E注射液；4)在高壓乳化泵中將水相與油相按1∶1比例混合乳化，即成雞傳染性鼻炎疫苗，每0.5ml含菌體1億。
所述的副雞嗜血桿菌，是標準菌株，血清型為A型和C型。
所述的的雞肉湯裂解血液體培養基，是指取雞胸肌肉100克，洗凈絞碎，加入800毫升蒸餾水，煮沸10分鐘，過濾去除肉渣，將雞肉湯調整容量至900毫升，在無菌的條件下，取綿羊血(或雞血)100毫升，放入-40℃冰箱凍融3次即成裂解血，在900毫升雞肉湯中加入蛋白胨5克，酵母浸膏2克，葡萄糖5克，氯化鈉10克，溶解后調pH值為7.4，在高壓滅菌器中121℃滅菌20分鐘，冷卻后加入無菌動物裂解血100毫升，即成雞肉湯裂解血液體培養基。
本發明的基本原理是，左旋咪唑和硒在免疫調節上有重要作用，能提高免疫原的抗體效價。在本苗中同時加入左旋咪唑和亞硒酸鈉維生素E，通過提高機體的細胞免疫功能，激活輔助性T細胞，產生B細胞活化因子，協助B細胞產生抗體，依靠細胞免疫和體液免疫，使機體在免疫早期產生高滴度抗體。
本發明采用標準的副雞嗜血桿菌，經液體培養基培養，滅活后加入免疫增強劑鹽酸左旋咪唑和亞硒酸鈉維生素E，制成油乳劑疫苗。疫苗免疫雞后7天產生堅強免疫力，免疫期6個月，免疫期內攻毒保護率100％。疫苗免疫后，雞群副作用小、免疫產生時間早、免疫力強、免疫期長。本疫苗適用于各養禽場，安全可靠。
具體實施例方式
實施例1副雞嗜血桿菌標準株A或C復蘇后作為菌種，接種于液體培養基培養36小時后，加入福爾馬林液使含量達0.5％。搖勻后37℃滅活18小時。在菌體滅活前，按部頒標準進行培養物細菌總數測定，含菌量一般為1010-11CFU/ml。取滅活菌液接種于巧克力培養基培養48小時，無細菌生長時備用。在滅菌液中加入無菌4％吐溫-80，按5％加入無菌鹽酸左旋咪唑，20％加入亞硒酸鈉維生素E注射液，調pH7.0為水相；在10號白油中加入6％司本-80，再加入2％硬脂酸鋁，滅菌后為油相。在高壓乳化泵中將水相與油相按1∶1比例混合乳化，即成雞傳染性鼻炎疫苗，每0.5ml含菌體1億。
該疫苗經性狀測定和安全性試驗表明，為油包水類型，穩定性良好，粘度適中，安全可靠。該疫苗在20℃保存3個月，4℃保存6個月不出現分層。試驗雞接種本疫苗后7天產生堅強的免疫力，免疫期6個月，免疫期內的攻毒保護率為100％。
實施例2副雞嗜血桿菌標準菌株血清型A和C型接種于液體培養基培養36小時后，加入福爾馬林液使含量達0.5％。搖勻后37℃滅活18小時。取滅活菌液接種于巧克力培養基培養48小時，無細菌生長時備用。在滅菌液中加入無菌4％吐溫-80，按5％加入無菌鹽酸左旋咪唑，20％加入亞硒酸鈉維生素E注射液，調pH7.0為水相；在10號白油中加入6％司本-80，再加入2％硬脂酸鋁，滅菌后為油相。在高壓乳化泵中將水相與油相按1∶1比例混合乳化，即成雞傳染性鼻炎疫苗，每0.5ml含菌體1億。
本苗適用于各養禽場對禽類的免疫接種，安全可靠。疫苗免疫雞后7天產生堅強免疫力，免疫期6個月，免疫期內攻毒保護率100％。
權利要求
1.一種禽傳染性鼻炎疫苗的制備方法，其特征在于，具體步驟如下1)將副雞嗜血桿菌CVCC258和CVCC269復蘇后連續3次傳代接種11日齡雞胚，分離鑒定細菌作菌種；2)將菌種通過雞肉湯裂解血液體培養基增殖細菌，使培養物的含菌量高達1011CFU/ml；3)菌體滅活后，加入鹽酸左旋咪唑和亞硒酸鈉維生素E注射液，制成油乳劑苗；4)在高壓乳化泵中將水相與油相混合乳化，即成雞傳染性鼻炎疫苗。
2.根據權利要求1所述的禽傳染性鼻炎疫苗的制備方法，其特征是，所述的的雞肉湯裂解血液體培養基，是指取雞胸肌肉100克，洗凈絞碎，加入800毫升蒸餾水，煮沸10分鐘，過濾去除肉渣，將雞肉湯調整容量至900毫升，在無菌的條件下，取綿羊血或雞血100毫升，放入-40℃冰箱凍融3次即成裂解血，在900毫升雞肉湯中加入蛋白胨5克，酵母浸膏2克，葡萄糖5克，氯化鈉10克，溶解后調pH值為7.4，在高壓滅菌器中121℃滅菌20分鐘，冷卻后加入無菌動物裂解血100毫升，即成雞肉湯裂解血液體培養基。
3.根據權利要求1所述的禽傳染性鼻炎疫苗的制備方法，其特征是，所述的副雞嗜血桿菌，是標準菌株，CVCC269血清型為A型，CVCC258為C型。
4.根據權利要求1所述的禽傳染性鼻炎疫苗的制備方法，其特征是，所述的鹽酸左旋咪唑的濃度是按水相總量5％，所述的亞硒酸鈉維生素E注射液的濃度是按水相總量20％。
5.根據權利要求1所述的禽傳染性鼻炎疫苗的制備方法，其特征是，所述的水相與油相的比例是1∶1。
6.根據權利要求1所述的禽傳染性鼻炎疫苗的制備方法，其特征是，所述的雞傳染性鼻炎疫苗所含抗原量是每0.5ml含菌體1億。
全文摘要
一種生物工程領域的禽傳染性鼻炎疫苗的制備方法，包括以下步驟1)將副雞嗜血桿菌CVCC258和CVCC269復蘇后連續傳代接種雞胚，分離鑒定細菌作菌種；2)將菌種通過液體培養基增殖細菌，使培養物的含菌量高達10
文檔編號A61P11/00GK1724069SQ20051002733
公開日2006年1月25日 申請日期2005年6月30日 優先權日2005年6月30日
發明者劉永德, 葉陳梁, 吳祖立, 汪毅 申請人:上海交通大學