專利名稱：腫瘤(癌癥)的基因綜合治療方法
技術領域：
本發明涉及癌癥(惡性腫瘤)的基因治療方法。對于惡性腫瘤，過去一直延用傳統的綜合性方法，且已取很大的成功經驗。隨著新世紀的到來，生命科學的迅速發展以及相關學科的交叉滲透，腫瘤基因治療已成為腫瘤生物治療領域研究的熱門話題，已被廣大學者所接受，在腫瘤綜合治療中漸露它的鋒利頭角。特別是近些年來，世界各國將基因治療的方法從實驗室研究(基礎研究)推進到臨床試驗階段。由于癌癥是一種多基因改變的疾病，本發明采用綜合治療的新方法，將不同的治療基因包括腫瘤抑制基因、腫瘤轉移抑制基因、增強人體免疫能力的基因、殺死腫瘤細胞基因、增強抗癌藥物耐藥性的基因、反義核苷或細胞因子基因等進行科學的組合搭配，從不同方位對癌癥實施綜合性基因治療，以求徹底治愈癌癥惡患。
背景技術：
惡性腫瘤統稱為癌癥，它不同于良性腫瘤的最主要特征是能侵襲周圍組織，疾病晚期癌細胞發生遠端轉移，破壞被侵襲的器官，最終耗盡人體的生命體能，導致機體衰亡。惡性腫瘤(癌癥)幾乎在所有類型的細胞中均可發生。從組織學分析，癌癥的起源可分為三種起源于上皮細胞，大部分癌癥屬此類；淋巴瘤起源于脾和淋巴結等的淋巴細胞；肉瘤起源于間葉組織和結締組織、骨和肌肉等。人類對惡性腫瘤發生機理的認識經歷了漫長曲折的過程，各類學說眾說紛紜，隨著生命科學和各門學科迅速發展和交叉滲透，特別是人類對腫瘤細胞的分子遺傳學，腫瘤分子病理生理學和功能基因組學的研究不斷深入，已認識到原癌基因的得能和腫瘤抑制基因的失能，以及腫瘤轉移抑制基因的失能和人體免疫功能的改變和細胞因子的失得能等，在癌癥變化過程中起著中心的生物學作用。另外，近些年來，在載體的構建，外源基因的表達調控使人體內應用的安全性和靶向性的研究取得了很大的進展，為惡性腫瘤生物治療起了很大的推動作用。因此，癌癥的療法從傳統的綜合性治療(手術、放療、化療)，已發展成為腫瘤的第四大療法一腫瘤的基因治療，腫瘤的基因治療已成為新世紀生命科學中的耀眼之星。本發明的基因綜合治療方法在上述等生命科學技術的發展基礎上提出來的，根據惡性腫瘤的發生機制是由于多基因功能失調所致，因此，用多基因、多方位對癌癥進步綜合性治療，比單一的癌癥治療更科學，臨床意義更大。動物實驗的研究證實，癌癥多基因的綜合治療比單一的基因臨床療效更好。由于癌癥的發病機制是多基因失調而致，癌癥基因綜合治療的重組治療基因的搭配，可以是全部有治療作用的基因參與篩選，也可以是針對性，對不同類型、不同部位的癌癥，基因綜合治療的實施方案也不一樣，重組的治療基因搭配的配方也不同。本發明采用三組治療基因的搭配是RhoGDI2、MAD-7和MUS81基因，分別從增強腫瘤轉移抑制功能、增強和提高機體免疫能力和直接殺死癌細胞三個方面來攻克癌癥。動物實驗的研究結果證明，綜合性基因療法比單一癌癥基因治療的療效更好(抑制腫瘤生長，抑制腫瘤轉移)，腫瘤模型動物的生存率更長，生活質量更好，顯示它的應用價值和對癌癥治療的臨床意義。
發明概述本發明是一種創新性的基因治療方法。由于人類惡性腫瘤(癌癥)的發病機理是多基因的平衡失調所致，從理論來說，為了更有效的達到治愈惡性腫瘤，癌癥的基因治療應該依照此理論進一步多基因平衡失調的綜合治療。此理論乃本發明的實施癌癥基因綜合治療的依據，經動物實驗的研究結果來分析，惡性腫瘤的基因綜合治療比單一基因的腫瘤基因治療更有效，充分顯示了本發明對惡性腫瘤治療的臨床意義。
本發明的實驗方案中，篩選出的治療基因，進行科學有效的搭配組合，依照不同癌癥發生的部位，器官及系統不相同，治療基因的組合不盡相同。根據第3條權利要求基因綜合治療的治療基因組合，是質粒DNA、RNA分子、病毒載體、非病毒載體、干細胞(攜帶治療基因)的單獨或相互搭配組合，來實施惡性腫瘤的基因綜合治療，以求達到改善目前惡性腫瘤治療效果不佳的狀況，治愈癌癥這一惡患。
發明詳述腫瘤發生與年齡的分布，以及環境、飲食習慣和職業所表現的不同特征有關，實驗研究表明癌癥是一個多階段、多因素參與的過程，同時大多數腫瘤又是單細胞起源，這就意味著在啟動癌變的細胞克隆中，不斷分裂的子代細胞多次發生了遺傳學和表遺傳學改變。由此產生的表型成為選擇的對象，隨之細胞的惡性程度逐步提高，最終成為轉移性癌。這些對癌變過程有著原發和關鍵效應的基因改變，以一定的時間順序發生，這就構成癌變或癌的遺傳學途徑。近來學者們大多認同癌癥變化途徑與癌基因的獲能(激活、活化)和抑癌基因及癌癥轉移抑制基因的失能(失活、表達下降甚至不表達)有關，到目前為止，已發現癌基因超過100多種，腫瘤抑制基因和腫瘤轉移抑制基因已超過30多種。細胞的正常生長和分化的控制，是通過生長因子和細胞因子與膜表面受體的相互作用，進而誘發一系列信號轉導，最終在核內引起相應基因的活化或抑制來實現。原癌基因的產物還是在這些途徑的關鍵步驟上發揮作用，如細胞外的生長因子、細胞因子、跨膜的生長因子受體、從細胞質間向核內傳遞信號的各類蛋白，以及在核內作為轉錄因子和調控DNA復制的蛋白質等。從實驗研究的結果中分析，癌基因粗略分成兩種類型第一類癌基因能使細胞避免衰老和凋亡，起到永生化基因的作用；第二類癌基因能降低對生長因子的要求，誘發細胞形態的改變，使細胞增殖失調，持續生長并能轉移。
癌變途徑的失能遺傳學的發生，是關系到腫瘤抑制基因的功能失活(失能)，20世紀60年代在體細胞雜交試驗中發現，癌細胞的惡性特征對正常細胞的表型為隱性。在小兒視網膜母細胞瘤的流行病研究表明，這類腫瘤的發生有遺傳和散發兩種形式。根據診斷年齡分布的特點，Knudson提出了′兩次擊中′的理論。接著Comings進一步提出′兩次擊中′的是一個基因的等位基因，也就是說該突變基因是隱性的。后來的一系列研究證明，視網膜母細胞瘤的發生是位于13號染色體上的一對RBI等位基因，由于基因突變，染色體丟失，體細胞染色體重組或DNA甲基化等異常改變，引起RBI基因功能丟失(失能)的結果，RBI基因是腫瘤抑制基因在癌變途徑中失能遺傳學事件的原型，這一事件進一步促進了這一領域的研究。在家族性癌綜合癥應用連鎖分析和定位克隆技術，已發現30多種腫瘤抑制基因。總體上決定腫瘤遺傳易感性的失能遺傳學事例遠多于得能的遺傳學事例，這可能是由于腫瘤抑制基因的作用是隱性的，當一個腫瘤抑制基因失能后，剩下的一個正常等位基因仍可能維持發育過程，這十年來對家族性癌癥綜合治療進行深入的研究，發現和鑒定了30多種與癌相關基因，其中大多數是腫瘤抑制基因。許多學者將腫瘤抑制基因分為兩組把關基因(Gate Keeper)和管護基因(Caretaker)，把關基因關系到細胞周期，細胞凋亡和DNA復制的調控，它們通過抑制增殖或促進細胞凋亡，直接控制腫瘤的發生和演進，它們的失能是癌變遺傳學途徑的事件，是癌的限速因子，一旦把關基因失能將啟動癌癥演進。管護基因關系到DNA修復和維護基因組的完整性，它們的失能并不直接作用于癌變遺傳學途徑，而是導致遺傳學的不穩定，使把關基因、原癌基因等癌相關基因的突變增加，進而促進腫瘤的發生和演進。管護基因的產物具有識別、切除和修復DNA錯配和各類損傷等能力，以維護基因組的完整性。
此外，研究者發現除了上述兩類基因的得失能異常導致癌癥的發生外，與另一類腫瘤轉移抑制基因的失能密切相關，且這類基因的失能是癌癥導致死亡的關鍵所至，至今已有多種腫瘤轉移抑制基因被發現。如果說腫瘤抑制基因主要是抑制腫瘤細胞的惡性表型；而腫瘤轉移抑制基因主要是抑制腫瘤細胞的轉移表型。近年來有一些腫瘤轉移抑制基因文獻報道1988年美國國立癌癥研究院(NCI)Steeg等發現，在7株具有不同轉移能力的鼠K-1735黑色素癌細胞中，有一段基因其mRNA水平與腫瘤細胞的轉移呈負相關，并且在低轉移的癌細胞株中mRNA水平高出高轉移細胞10倍之多，他們把這一基因暫定為NM23，原來在嚙齒類動物腫瘤轉移模型細胞轉染實驗中，也證明了NM23 mRNA水平與轉移抑制表型密切相關，進一步的研究發現，人類基因組中有兩個亞型NM23基因，分別表示NM23-H1，和NM23-H2，NM23-H1基因定位于17號染色體著絲點附近，約P″--Q″間，研究表明NM23-H1和NM23-H2不僅為兩個完全不同的基因，而且分別受兩個獨立的調控系統調節，其中NM23-H1的mRNA水平似乎與腫瘤細胞轉移關系更為密切。后來研究者相繼發現了不同的腫瘤轉移抑制基因，如Timp-1和Timp-2，在動物實驗中，通過靜脈輸注重組Timp-1，發現實驗動物體內惡性腫瘤轉移受到抑制。1995年Dong等從前列腺癌雜交細胞AT6.1的第11號染色體中分離到特異性抑制前列腺癌轉移基因，命名為Kail，后來第四軍醫大學西京醫院婦產科醫師宗暉等發現Kail基因的失能與惡性卵巢癌的發生和轉移密切相關，他們采用脂質體介導Kail cDNA轉染高轉移性人卵巢癌細胞系HO-8910PM，發現蛋白的表達水平有顯著差異。
近來，麻省理工學院懷德海研究所的Robert Weinbery用芯片技術來分析轉移老鼠乳腺癌細胞的基因表現，從中找到一個重要的轉錄因子-TWIST，這個轉錄因子在胚胎發育過程中，背負著引發細胞移動，以及組織重組的任務，而類似的細胞移動和組織重組情況在腫瘤轉移的時候也會發生。他們發現會使由鈣粘附素E所調控的細胞粘附作用失效，以及產生上皮細胞上皮一間隙轉化，而且被阻斷了Twist表現的癌細胞其轉移程度會降低，在人類乳腺癌中侵潤性小葉癌中，也觀察到Twist抑制了鈣粘附素E的表現。另外，其他科學家們也在不同的實驗研究中發現諸多基因與腫瘤轉移抑制功能密切相關，如PRL-3的酵素基因不在正常細胞表達，而在轉移癌細胞中大量表達，以及發現WDNM1基因的mRNA表達是轉移性乳腺癌細胞株DMBA-8的20倍，隨后克隆出的第二株WDNM2基因其表達水平與腫瘤轉移呈負相關。
Dr.Theodorecu D和同事們在膀胱癌細胞T24和T24T的實驗中發現RhoGDI2基因與腫瘤細胞轉移高度相關，惡性程度不同，膀胱癌中RhoGD12的mRNA和蛋白質的表達亦不相同，呈負相關。本公司在實驗研究和對臨床惡性腫瘤病人的檢測中，發現了RhoGDI2基因與腫瘤轉移非常密切，經600多例正常人群和各種不同臨床惡性腫瘤體轉移的550多例病人的血液標本。經原位雜交方法測定RhoGDI2基因水平，發現正常人群RhoGDI2的表達大約在40-50％左右，與各種腫瘤體轉移病人在10％水平，大部分病人RhoGDI2基因不表達，充分說明大部分病人RhoGDI2基因失能，研究的結果表明，RhoGDI2表達水平不僅與膀胱癌有關，與其它各種惡性腫瘤也密切相關。因此，斷定RhoGDI2在人類癌癥的發生發展中扮演了一個重要的角色。本發明的詳述部分花大量筆墨來論述腫瘤轉移的相關議題。主要原因是癌癥最終死亡均是由于腫瘤的轉移造成的，而且這一問題到目前為止仍無能為力。要攻克惡性腫瘤，一定要徹底解決腫瘤轉移的迷團，才能使腫瘤的治療上一新臺階。癌癥的發生、演進導致最后轉移，直至耗盡病人機體的能量而死亡。癌癥的發病機理可以用上面論述的相關發病機制進行評述分析。由于多基因的協調失靈，加上機體的免疫能力下降及其它因素改變，產生腫瘤細胞惡變，一旦細胞產生惡變，形成惡性腫瘤后，它就能突破由膠原等組成的基底膜的屏障，開始向血道，淋巴道以及周邊組織進行侵潤性發展，直致向遠處轉移，而導致機體的生命終止。
自從一九九一年美國的Andson教授首先利用基因重組技術進行首例基因治療，它采用腺病毒作載體，對ADA的病人進行嘗試性基因治療。并獲得成功。我國在一九九一年由復旦大學教授薜京倫主持的科題組，采用相同的方法對凝血因子缺乏的病人進行基因治療，亦獲得成功。目前該項目已獲準進入一期臨床試驗。近十年來，生命科學和相關前沿治療學科的交叉發展，相互滲透，基因治療的方向已從針對單一基因的遺傳病，發展到針對多基因失調的腫瘤、血液系統疾病、神經系統疾病、免疫性疾病和艾滋病等。不管在目的基因的選擇、載體的高效表達轉錄、安全性，以及療效等方面均有了很大的進步。基因治療發展十分迅速，目前世界上已批準進入臨床試驗的項目已達600個之多，大部分是針對腫瘤的基因治療，我國亦批準P53的基因藥物進入一期的臨床試驗，本發明的基因綜合治療是建立在惡性腫瘤發生、演進的病理基礎上的，這一創新性方法在動物實驗研究中得到驗證。
基因綜合治療和單一基因治療的方法進行比較，前者有明顯治療效果，不管在腫瘤腫塊消退、抑制腫瘤發生及抑制腫瘤轉移方面和提高生存率等均有明顯統計學意義。癌癥的發生機制是多基因綜合失調所致，但腫瘤的類型及發生的部位不同，其發病過程和機理各不相同。因此，各種不同的腫瘤在選擇治療基因時，各種搭配組合也不相同，從組織學角度來分析，腫瘤發生的來源不同(內胚層和外胚層)，腫瘤的分化演變，基因失調的機制不同。所以本發明提出治療基因的組合要依照病理學的基礎，科學的、有目的進行治療基因的搭配組合。由于腫瘤轉移是生命終結的關鍵因素，在篩選治療基因時不能忽略這方面的重要性，每個搭配組合應讓腫瘤轉移抑制基因參與。本發明篩選的三組治療基因RhoGDI2是屬于腫瘤轉移抑制基因，它可以有效地抑制惡性腫瘤的轉移；MAD-7是有雙重功能的治療基因，它的原型是白細胞介素24，能提高和增強免疫能力，能增加機體T細胞的殺傷能力，另外它亦有直接殺死腫瘤細胞的能力；MUS81是一個強有力的殺癌基因，在細胞系和動物實驗中表明，當它存在二個拷貝時，具有很大殺癌能力。這三組基因均是人類同源基因。RhoGDI2基因位于染色體12P.3上，基因序列全長為605bp，用EcoR1，XhoI裝在AAV-2載體中；MAD-7基因位于染色體1Q32位置上，基因序列全長620bp，用BamHI，XhoI裝在AAV-2載體中；MUS81基因位于染色體11Q13位點上，基因序列全長工1656bp，用EcoR1 xBaI裝在AAV-2載體中。本發明中RhoGDI2、MUS81、MAD-7核苷酸序列可插入到重組表達載體中，重組表達載體中涉及本領域熟知的質粒、病毒和非病毒載體，也包括納米材料組成的各種載體和干細胞。通過上述三組目的基因的遺傳學序列的插入和操作，上述表達載體含啟動子序列，其有利宿主插入的遺傳序列有效轉錄，表達載體通常含復制起點、啟動子和允許作轉化細胞表型選擇的特殊基因。本發明適用的載體，不局限于在細菌中的表達，也包括哺乳動物細胞和其它細胞表達。本發明的載體亦負擔在實驗性生產和工業化生產任務。重組的治療基因在實驗中，按照GLP的要求進行產品形式合成生產，保存低溫條件中，用5％甘露醇保存液。將來臨床用的治療基因產品將嚴格按照GMP的生產要求進行生產。
動物實驗中，采用兩種方法進行療效觀察，單一基因組比多基因組療效差，質粒DNA組比重組在AAV-2載體的治療基因療效差，單一rAAV重組體比三組重組體同時注射療效差，充分說明基因綜合治療的臨床意義非常重大。
本發明中的產品包裝及產品保存作了描述，質粒DNA以水、粉劑合裝或分裝，存放于4℃或-20℃低溫條件，重組在AAV-2中的治療基因產品，以水、粉劑合裝或分裝，存放于4℃或-20℃低溫條件，(干細胞載體產品，水劑應保存在-80℃-180℃)。
根據權利要求書的要求，本發明的基因導入方法，導入對象均已作了描述。動物實驗中，我們有目的嘗試過基因的導入方法(給藥途徑)，經注射LacZ(半乳糖氨胱酸酶)的方法，觀察經靜脈和肌肉注射的基因在動物體內表達內表達分布情況，靜脈注射LacZ后，肝、脾、心、腦、腎等器官表達率不盡相同。實驗結果的啟發是，不同類型的腫瘤、不同部位的腫瘤、不同系統的腫瘤，給藥途徑的選擇不同，例如全身性腫瘤，血液系統惡性腫瘤，采用靜脈注射方法最佳；呼吸系統惡性腫瘤，采用呼吸道吸入給藥方法最優；表層腫瘤為局部注射直接注射到腫瘤組織或表面皮膚給藥。導入方法為了治療效果更顯著。
權利要求
1.本發明權利要求選用幾組重組的癌癥治療基因來綜合治療癌癥(惡性腫瘤)，本發明的權利要求以腫瘤轉移抑制基因、增強機體免疫能力的基因、直接殺滅細胞的基因，反義核苷和其它腫瘤抑制基因、腫瘤轉移抑制基因、免疫抑制功能基因、增強抗癌藥物敏感性的基因或細胞因子基因的參與組合搭配，組合成新的綜合基因治療方案。本發明試選的三組重組基因(RhoGDI2；MAD-7；MUS81)，來殺死癌細胞，以增強免疫能力和抑制腫瘤轉移三方面同時實施對癌癥的綜合基因治療。動物實驗研究已證明基因綜合治療的方法，比單一的基因治療療效有顯著的差異，表明該發明對癌癥的治療有非常重要的臨床意義。
2.權利要求基因綜合治療的基因重組和導入及轉染方式包括質粒DNA和RNA分子；重組在病毒載體中的重組體(rAV，rAAV等)；重組在其它非病毒載體，如納米材料載體、脂質體等；人同體或異體干細胞(攜帶治療基因)。
3.權利要求基因綜合治療的治療基因組合，是質粒DNA、RNA分子、病毒載體、非病毒載體、干細胞(攜帶治療基因)的單獨或相互搭配組合。
4.權利要求基因綜合治療，除核酸形式外，也包括其下游有治療意義的相關蛋白質。
5.權利要求綜合治療的基因藥物產品的包裝單一產品的粉、水劑或膠囊(-20℃，-180℃或4℃保存，根據載體的性質而定)；幾組產品的水劑或膠囊在一起(-20℃，-180℃或4℃保存)的粉、水劑或膠囊(干細胞載體產品，水劑應保存在-80℃至此-180℃)。
6.權利要求基因綜合治療的基因藥物的病人給藥途徑包括肌肉、動靜脈、局部注射；口服給藥(腸道給藥)；鼻腔粘膜、呼吸道吸入藥；器官灌流；皮下包埋以及表皮給藥。
7.權利要求基因綜合治療的治療基因，重組在表達載體中的治療基因，被導入離體受試者細胞中，然后重導入受試者體內。
8.權利要求基因綜合治療的治療基因，重組在表達載體中的治療基因，直接導入受試者細胞中。
9.權利要求基因綜合治療方法的受試者是人。
全文摘要
本發明提供了一種癌癥治療的全新方法。該方法是根據癌癥患者病理過程的不同表現和癌癥發生的分子機制的不同變化，特別是癌癥發病是由于多基因綜合失調機制所致。用本發明提供的方法進行科學篩選，將不同治療基因進行科學搭配組合，有目的對不同癌癥患者實施不同組合的基因綜合治療方案。本發明試選三組重組的人類基因RhoGDI2－腫瘤轉移抑制基因；Mad－7是雙重作用功能的抗癌基因，既可以通過增強機體免疫力來殺死癌細胞，又可以直接殺死癌細胞；Mus81是一種強有力地殺死癌細胞基因。用這三組基因來殺死癌細胞，以增強免疫能力和抑制腫瘤轉移三方面同時實施對癌癥的綜合基因治療。動物實驗研究已證明用基因綜合治療的方法，比單一的基因治療療效有顯著的差異，表明該發明對癌癥的治療有非常重要的臨床意義。
文檔編號A61P35/00GK1872345SQ20051002634
公開日2006年12月6日 申請日期2005年6月1日 優先權日2005年6月1日
發明者張云福, 裘建英, 董西銀 申請人:上海二醫新生基因科技有限公司