專利名稱：人異體間質干細胞(攜帶治療基因)的基因治療方法
技術領域：
本發明屬于干細胞基因工程和基因治療領域，具體涉及人異體間質干細胞(攜帶治療基因)作為基因治療的靶細胞和載體，對人類的遺傳性疾病和后天獲得性疾病進行基因治療，治愈人類的各種難治性疾病。
背景技術：
干細胞技術自從1998年科學家發現干細胞的多分化潛能后，干細胞的研究與應用在美國的《科學》雜志的1999年世界十大科學成果中名列榜首，2000年再度入選世界十大科技進展。科學家們發現，“取自人胚胎，胎盤，臍血或骨髓的干細胞可培育不同的人體細胞，組織或器官。這有望成為移植器官新的材料來源和細胞治療的基礎。”除此之外，人體的干細胞有許多種類，由于它們的組織來源不同和自身生物學特性不一樣，許多實驗室和臨床治療組，用它們來做基因治療的靶細胞，讓它們攜帶治療基因在人體的病變器官進行治療性的目的基因表達。實驗研究已證實有非常重要的臨床治療意義。這將有望在21世紀人們利用干細胞這一生物學特性，結合基因治療方法，攻克人類某些重大疾病，如癌癥，心腦血管疾病，老年性疾病，內分泌和自身免疫性疾病等。
隨著生命科學的迅猛發展，相關學科的相互交叉滲透，使得干細胞的基因工程學方面有了突破性進展，特別是干細胞的分離，純化，培養擴增，性能研究，誘導分化等取得長足的進步。干細胞是具有自我更新，高度增殖和多向分化潛能的細胞群體，干細胞可通過細胞分裂維持自身細胞群的大小，同時又可以進一步分化成為各種不同的組織細胞，從而構成機體的各種復雜的組織器官。隨著干細胞基因工程和技術的發展，以及干細胞自身具有的特性，人們能在體外大規模擴增某些干細胞，有望利用干細胞來治療人類各種疾病，特別是基因治療浪潮掀起，給干細胞基因工程帶來了前所未有的發展勢頭。尤其是來自骨髓和臍帶或胎盤的間質干細胞(Mesenchymal Stem Cell，MSC)是中胚層來源的具有多向分化潛能的干細胞，主要存在于全身結締組織和器官間質中，以骨髓組織中含量最豐富，胎兒臍血亦可分離得到。間質干細胞具有向骨細胞，軟骨細胞，肌腱細胞，肌細胞，神經細胞，脂肪細胞和造血支持間質細胞等分化的能力。同所有的干細胞一樣，骨髓間質干細胞也具有自我更新能力和多向分化潛能，它雖然僅占骨髓單核細胞的0.001％-0.01％，卻有驚人的增殖能力和強大的自我更新能力，間質干細胞還具有以下的特點和優勢1.能在體外大批量擴增培養，傳代至40-50代或擴增109以上仍保持不分化的特性和不丟失其多向分化潛能；2.外源基因易于植入并整合到間質干細胞的基因組中穩定表達而不影響干細胞特性；3.外源基因的表達具有組織特異體，受所定位微環境的作用；4.間質干細胞是未分化的原始細胞，不表達成熟的細胞抗原，異體注射免疫源性很弱，不發生異體排斥反應；5.間質干細胞具有自我更新能力，治療基因導入間質干細胞后如果能長期表達，病人可終生受益；6.間質干細胞具有向各系分化的能力，只要少數間質干細胞轉染目的基因后，由其分化而成的細胞便可隨著血液循環分布到全身各部位，利于其攜帶的外源治療基因能更大限度地發揮治療作用；7.間質干細胞無論在骨髓內還是在循環或組織中，治療基因表達產物都能通過血液循環而達到靶器官，也能通過血腦屏障進入腦循環；8.當機體損傷或病變時，病變局部會誘發出信號，間質干細胞會循著信號到達病變部位，釋放細胞因子和細胞生長因子或表達治療基因的產物，對局部病變起到治療和保護作用。由于這些優勢和特點，使用間質干細胞作為靶細胞和載體，為人類多種疾病的基因治療帶來新的希望。
基因治療21世紀是生命科學的世紀，基因治療的興起和人類基因組計劃的全面實施已有力地說明了這一點。2000年6月26日獲得了人類基因組計劃的“工作框架圖”。2003年4月14日人類基因組序列繪制成功，成為人類基因組計劃的一個重要里程碑。基因組計劃的成功為基因治療奠定了堅實的基礎。基因治療的基本原理來源于人類對自身遺傳機制的了解，基因作為機體內的遺傳的基本單位，不僅可以決定人們的相貌，高矮，膚色，而且它的異常變化將會不可避免的導致各種疾病。某些缺陷的基因可能會遺傳給他們的后代(血友病，高血壓，糖尿病等)，而有些則不能遺傳。基因治療的最早提出是針對單基因缺陷的遺傳病，目的在于用一個正常的基因來代替或置換缺陷的基因或者補救缺陷基因。
1990年美國國立衛生院(NIH)的Blase RM和Anderson WF用ADA(腺苷酸脫氨酶)基因治愈了一位ADA基因缺陷導致嚴重免疫缺損(SCID)的4歲女孩，我國1991年由復旦大學生命科學院薛京倫教授領導的課題組，用基因治療方法對兩例XIII對凝血因子缺失的患者進行基因治療，取得可喜的成績，使世界各國都掀起研究基因治療的熱潮。至今，基因治療的研究內容也從單基因的遺傳病擴大到多基因的腫瘤，艾滋病，心血管病，神經系統疾病，自身免疫性疾病和內分泌和老年性疾病。
載體技術基因治療方案大部分都包括相輔相成的三個部分治療基因或其它核酸(如RNA分子或合成的寡核苷酸)選擇；可攜帶治療基因進入靶細胞的載體；治療基因在靶細胞，靶組織中的表達調控。如何將精心挑選的治療基因導入體內，穿過細胞膜，進入細胞核獲得表達。這是基因治療成敗的關鍵。無論是體內還是體外途徑的基因轉移都需要一種安全，無毒，高效表達的工具來攜帶外源基因進入細胞內。這種工具被稱之為載體(Vector)。理想的載體應具有以下條件易獲得高滴度的純品；可以穩定，高效的重組體內非增殖狀態的細胞；可以長期穩定地表達外源基因而不會引起細胞毒性、感染或免疫應答；能特異地識別靶組織和在靶細胞內表達外源基因，包括藥理學和生理學上的調控基因。至今，還沒有一種載體系統適用于所有的基因治療方案。目前，已經建立了多種基因轉染方法，其中包括化學的，物理的，以及生物學的方法(如電穿孔，脂質體和基因槍，病毒載體和非病毒載體，病毒載體有腺病毒載體和腺相關病毒載體及其它病毒載體)。本發明選擇腺相關病毒作為間質干細胞的轉染體。腺相關病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)是一個缺陷的非致病性的單鏈DNA病毒，其復制需要輔助病毒的共感染，沒感染時，野生型AAV優先整合到19q 13.3處潛伏存在，直到被輔助病毒“拯救”出來。AAV進行位點特異性的整合需要基因末端的反向重復序列(Inverted Terminal Repeat，ITR)與非結構蛋白Rep78和Rep68共同存在。AAV適用于基因治療的特性包括沒有證明對人體有致病性；廣泛的宿主和組織范圍，可穩定地整合入細胞內并穩定的表達外源基因，在實驗猴子中已觀察rAAV表達持續5年；由于ITR的存在，插入基因引起突變的危險性低；由于缺乏病毒基因，因而不會引起機體對載體的免疫應答，所以用rAAV載體與間質干細胞進行轉染，將有效的治療基因轉染間質干細胞，間質干細胞作為基因治療的靶細胞，攜帶目的基因到達靶組織發揮治療作用。如果用DNA質粒或RNA分子來轉染干細胞，需要提高轉染率。
發明內容
本發明采用干細胞基因工程技術和基因治療方法，結合動物細胞大規模培養工程技術，將治療基因導入大規模培養的人異體間質干細胞中，使人異體間質干細胞(攜帶治療基因)作為基因治療的靶細胞載體，對人類的遺傳性疾病和后天獲得性疾病進行基因治療，徹底治愈人類的各種難治性疾病。
間質干細胞(攜帶基因治療)基因治療的意義基于間質干細胞的更新增殖能力，基因轉染的間質干細胞基因治療與傳統的基因治療相比有明顯的優勢。基因轉染的間質干細胞基因治療包括以下幾個靶標1.轉染間質干細胞的潛能——以間質干細胞為靶標，間質干細胞的某些生物學特性可因為轉入新的基因而發生改變。成人組織中分離出的間質干細胞可能會因為機體年齡的問題，遺傳性或后天獲得性疾病等原因而使其重建受損組織或治療效果受到影響，導入轉錄基因或相關的酶基因進行轉染是一種有效的途徑來維持，增強或抑制干細胞增殖分化的能力。2.改善器官的性能——以間質干細胞的子代細胞為靶標，導入間質干細胞的基因可隨著干細胞的分化傳給子代細胞，由于基因轉染的間質干細胞重建了某一組織后使插入的基因在這一組織中持續表達一生。如對具有遺傳缺陷的組織，特別是造血系統的遺傳性缺陷，或心血管疾病，糖尿病等，可通過基因轉染的間質干細胞進行治療。3.加快組織重建——利用間質干細胞的增殖和分化能力重建受損細胞，如用間質干細胞和造血干細胞重建骨髓造血系統，間質干細胞在骨和軟骨受損處重建，亦可以通過轉染治療基因隨著受損或病變處誘發的信號，到達病變部位和受損區，釋放，表達轉錄治療基因，對病變和受損部位進行治療。此外，機體自身修復過程可由于組織嚴重的損傷，疾病或老年化問題而難以實現。基因轉染的間質干細胞以促進有絲分裂，對負調節因子進行抑制或影響特定基因的原位表達等方式加快被延遲的組織重建過程。間質干細胞基因治療的意義除了上述外，最重要意義是間質干細胞能被轉染和導入廣泛具有治療的基因，作為靶細胞攜帶這些治療基因，執行對各種人類疾病(如癌癥，心血管病，神經系統疾病，自身免疫性疾病，內分泌和老年性疾病等)的全方位的基因治療，克服目前基因治療所遇到的種種難題。基于間質干細胞的治療是癌癥研究中一個重要的領域，研究者正在設計更多的方法，以實現將原于干細胞的特殊細胞鎖定到特定癌細胞上，從而直接將可破壞或修飾癌細胞的藥物送到癌細胞。這一方面，更多是直接將治療基因轉染間質干細胞，以間質干細胞作為靶細胞將按照間質干細胞自身生物學的特征，一方面將治療基因在局部及病變組織釋放表達起到治療作用，另一方面，間質干細胞自身的分化潛能和增殖能力，其子代的細胞會不斷地表達治療基因，起到長效的治療作用。
某些疾病是由于多基因平衡失調所至，因此，在治療上采用單一基因的方法不能起到很好的治療效果。用間質干細胞作為基因轉染的載體，可分別轉染多種治療基因，用同一載體，轉染不同治療基因，同時治療病患，會起到十分滿意的效果，如癌癥的病患就可以采用這一方法，筆者已在另一申請的專利《癌癥的多基因綜合治療》中提到了關于單一基因治療和多基因的綜合治療療效的比較。多基因的綜合治療比單一基因的治療的效果明顯增強。在該專利中筆者使用rAAV作載體，同時用三組治療基因，實施綜合性基因治療。這一方法的理論基礎是在于癌癥的發病機制是多基因的平衡失調所至，腫瘤的發生過程中的癌基因的得能，抑制癌基因的失能，加上癌癥轉移基因的得能和癌癥轉移抑制基因失能的綜合因素失調，導致癌變，最后演變成癌癥的發生，如果治療無效，最終導致癌細胞的轉移，耗盡機能生命體能而死亡。因此，利用間質干細胞作為對癌癥治療的靶細胞時，可實施多基因綜合治療方案，同時分別轉染經精心挑選的基因，組成綜合治療的相關藥物，對癌癥實施多方位的綜合基因治療。組合搭配的治療基因可以從這幾方面著手1.增強機體免疫功能基因；2.直接殺死癌細胞基因；3.抑制癌癥轉移的基因；4.反義核苷；5.增強機體抗癌藥物的耐藥性基因和細胞因子基因。經過精心科學的選擇，組合成最有效的治療方案。對艾滋病的治療亦可以采用多基因的綜合治療，將有效殺死HIV病毒的基因和增強機體免疫能力的基因組合，分別轉染間質干細胞，從幾個方面實施對HIV的患者進行基因綜合治療。除上述外，其它由于多基因平衡失調所致疾病，也可以用基因綜合治療的方案。
人異體間質干細胞(攜帶治療基因)產品的制備工藝異體的種子間質干細胞進行工作庫的放大培養，然后按一定的細胞數目接種在反應器(發酵罐)或轉瓶中進行懸浮或貼壁培養。培養介質中除增殖間質細胞的細胞因子和細胞生長因子外，促分化的細胞因子和細胞生長因子一律不用。產品制備過程1.間質干細胞的發酵罐或轉瓶大規模培養；2.質粒DNA、核酸、RNA分子或rAAV的轉染(其它病毒載體或非病毒載體進行轉染)；3.細胞的收集和純化；4.安全性檢測后包裝儲存。(發酵罐大規模培養詳細過程見如下)取1.5×105/mL量的工作庫種子間質干細胞接種于50L的特殊發酵罐中，接種前培養基的pH值用二氧化碳來校正，發酵罐預熱至37℃時開始接種，培養介質是無血清或血清培養基，發酵罐的攪拌速度約100-300r/min，不得大于350r/min，攪拌葉輪的切片應光滑平整，不能有鋒尖的葉面，避免攪拌時損傷培養細胞，攪拌的目的是保持細胞均勻呈懸浮狀態生長，細胞的培養過程中的氧氣，二氧化碳，pH值，葡萄糖濃度及氨濃度等參數的變化，隨時調整和補充介質。每天觀察細胞生長狀態及檢測生長密度。當細胞長到80％的罐內培養密度時，開始進行治療基因的轉染，治療基因可以是質粒DNA、核酸、RNA分子，轉染過程相對簡單(主要加氯化鈣或其它物質增加細胞膜的通透性，質粒DNA易于吸收入細胞內)，但轉染率比較低。用病毒載體的過程相對復雜，特別是腺相關病毒載體，至少要2-3天的共轉染過程才能比較完全地轉染進入間質干細胞內，在2-3天的轉染過程中，發酵罐的攪拌速度和次數應嚴格按照預定的程序進行，保持每小時輕微的攪拌次數，讓細胞能立即轉染，使細胞不會貼壁生長，一旦完成轉染過程后，陽性比率達到90％以上時，及時收集細胞。常規細胞收集方法是利用反應器(發酵罐)中的濾膜排放系統，將發酵罐內培養液放去80％左右，大約20L的培養液，或用過濾的方法濾去培養液，留下5L的細胞混合液，在洗脫液洗脫下，將收集到的細胞混合液和洗脫液一起經過離心收集沉淀的細胞層，所有收集，測試安全性生物特性后，進行分瓶罐裝，再存入液氮中(逐步降溫后)保存，保證產品始終保持最佳的生物活性。以上的生產工藝已日益完善，特別是發酵罐技術已有突破性進展，使干細胞的大規模培養變成現實。
權利要求
1.人異體間質干細胞包括骨髓間質干細胞或胎盤，臍血及其它組織的間質干細胞，經過放大擴增(大規模)培養，采用基因(質粒DNA、RNA分子或病毒載體和非病毒載體所攜帶的治療基因)轉染技術將治療基因導入間質干細胞中，間質干細胞作為基因治療的靶細胞和載體，讓治療基因通過自身分化表達或子代細胞的表達，對患者實施有目的的基因治療。
2.人異體間質干細胞(攜帶治療基因)，是已導入了質粒DNA、RNA分子、和病毒載體(rAV，rAAV或其它病毒)或非病毒載體。在治療過程中間質干細胞扮演了雙重載體的角色，它即攜帶了病毒的載體(已重組治療基因)，且自身也作為載體轉運治療基因。
3.權利要求人異體間質干細胞(攜帶治療基因)的基因治療方法，可實施單一基因治療，也可以實施多基因綜合治療(特別是針對癌癥等多基因失調病變的基因治療)。多基因綜合治療是指用同一種間質干細胞轉染不同的治療基因。
4.權利要求人異體間質干細胞所攜帶的治療基因，是指對人類疾病(包括各種類型的癌癥，心腦血管疾病，神經系統疾病，內分泌和自身免疫性疾病，血液系統疾病，遺傳性疾病)有治療作用的基因。
5.權利要求所述的人異體間質干細胞(攜帶治療基因)作為治療基因的轉染載體，取已培養至第5-8代以下的細胞做種子細胞，做起始培養(10代以下的間質干細胞生長最旺盛，活性最佳)。
6.權利要求人異體間質干細胞(攜帶治療基因)的基因治療方法，基因治療藥物的包裝是保護劑加上異體間質干細胞(攜帶治療基因)以水劑的形式保存在-180℃的液氮中，降溫過程中以每分鐘降低1-2度為宜(包括出廠臨床使用前均應在-180℃低溫條件中，以確保該產品的生物活性)。
7.權利要求人異體間質干細胞(攜帶治療基因)的基因治療方法，病人的給藥途徑靜脈、動脈注射，局部注射，肌肉注射，臟器內注射，瘤體內注射(如果不是肺部疾病，盡量避開靜脈注射，減少干細胞在肺部的凋亡)。
8.權利要求人異體間質干細胞(攜帶治療基因)的基因治療方法的受試者為人。
全文摘要
本發明公開了一種人異體間質干細胞(MSCs攜帶治療基因)的基因治療方法。用人異體間質干細胞作基因治療的靶細胞和載體，通過基因轉染技術，將治療的目的基因導入間質干細胞內，使間質干細胞自身或分化后的后代細胞表達治療基因的產物，達到基因治療的目的。人異體間質干細胞(攜帶治療基因)的基因治療方法可以是單基因實施方案，也可以是多基因綜合治療，稱之為“間質干細胞(攜帶治療基因)的多基因綜合治療方法”。
文檔編號A61P5/00GK1872344SQ20051002634
公開日2006年12月6日 申請日期2005年6月1日 優先權日2005年6月1日
發明者張云福, 裘建英, 董西銀 申請人:上海二醫新生基因科技有限公司