專利名稱：多巴胺轉運蛋白擬肽抑制劑及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及藥物學領域。更具體地，本發明涉及新的多巴胺轉運蛋白擬肽抑制劑以及含有該抑制劑的藥物組合物。本發明的該新型抑制劑對與多巴胺轉運蛋白相關的神經精神性疾病(尤其是可卡因成癮)有治療作用。
背景技術：
多巴胺轉運蛋白是良好的藥物靶點，一些成功用于治療肥胖、小兒注意力缺乏癥(ADHD)、抑郁癥和帕金森病的化學藥物是典型的多巴胺轉運蛋白抑制劑，如上市的馬吲哚(mazindol)，利他林(ritalin)，安非拉酮(bupropion)和進入臨床實驗的brasofensine等(Dutta，A.K.，Zhang，S.，Kolhatkar，R.&Reith，M.E.Dopamine transporter as target for drug development ofcocaine dependence medications.Eur.J.Pharmacol.479，93-106，2003)。
特別值得關注的是可卡因濫用是全球性社會和醫學問題，盡管現在還無藥可治，臨床實驗證明起效溫和、作用時間長的多巴胺轉運蛋白特異性抑制劑有望成為治療藥物(Gorelick，D.A.，Gardner，E.L.&Xi，Z.X.Agents indevelopment for the management of cocaine abuse.Drugs 64，1547-1573，2004)。
多巴胺轉運蛋白是12次跨膜蛋白，和去甲腎上腺素轉運蛋白、五羥色胺轉運蛋白等在結構、功能上存在同源性，且這類蛋白至今還沒有解析出晶體結構。這些都制約了多巴胺特異性抑制劑的發展。在以可卡因和GBR為模板的藥物設計中得到了多巴胺轉運蛋白特異性抑制劑，但數量有限(Gorelick，D.A.，Gardner，E.L.&Xi，Z.X.Agents in development for the management of cocaine abuse.Drugs 64，1547-1573，2004)。
綜上所述，由于仍缺乏令人滿意的多巴胺轉運蛋白的抑制劑，因此本領域仍然迫切需要開發新的有效抑制多巴胺轉運蛋白的抑制劑。
發明內容
本發明的目的就是提供一種可用作多巴胺轉運蛋白特異性擬肽抑制劑的化合物及其應用。
在本發明的第一方面，提供了一種下式I表示的抑制劑，或其藥學上可接受的鹽[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[L-脯氨酸]-[Xaa3]-[Xaa4](I)式中，Xaa0是L-Phe、L-Fbz、或L-Bip；Xaa1是選自下組的氨基酸Ala、Ile、Leu、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val；Xaa2是選自下組的氨基酸Ala、Gly、Ser、Thr；Xaa3是無，或選自下組的氨基酸Tbz、Ala、Ile、Leu、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val；或是由上述2-5個氨基酸構成肽段；Xaa4是無，或選自下組的氨基酸Ala、Gly；并且所述的抑制劑結合于多巴胺轉運蛋白。
在另一優選例中，所述抑制劑具有β-轉折，并且在218nm處的橢圓率大于20。較佳地，在218nm處的橢圓率大于30，更佳地，在218nm處的橢圓率大于40。
在另一優選例中，Xaa0選自L-Bip；和/或Xaa1選自Tyr、Trp、Phe；和/或Xaa2選自Thr、Ser。
在另一優選例中，Xaa3選自Tbz、Ala、Ile、Leu、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val；和/或Xaa4選自無、或Gly、Ala。
在另一優選例中，Xaa0選自L-Bip、Xaa1選自Tyr、Phe；Xaa2選自Thr；Xaa3選自Phe、Tbz；且Xaa4選自無、或Gly。
在另一優選例中，該抑制劑選自下組(a)具有SEQ ID NO2、3、5、7、8、或9所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2、3、5、7、8、或9所示氨基酸序列經過1-2個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有結合于多巴胺轉運蛋白的由(a)衍生的多肽。
在本發明的第二方面，提供了一種分離的核酸分子，它編碼本發明上述的抑制劑。
在本發明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有(a)安全有效量(如0.01-99.99wt％，較佳地0.1-90wt％，更佳地1-80wt％)本發明上述所述抑制劑或其藥學上可接受的鹽；和(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。
在本發明的第四方面，提供了本發明所述的抑制劑或藥學上可接受的鹽的用途，它們被用于制備治療多巴胺轉運蛋白相關疾病的藥物。
在另一優選例中，所述的多巴胺轉運蛋白相關疾病選自下組帕金森病、可卡因成癮、抑郁癥、小兒多動癥和肥胖癥。
圖1顯示了本發明擬肽的圓二色譜圖。
圖中1-4分別表示肽1-4。肽1-4的序列如下肽1[L-苯丙氨酸]-[L-苯丙氨酸]-[L-酪氨酸]-[L-蘇氨酸]-[L-脯氨酸]-[L-賴氨酸]-[L-蘇氨酸](SEQ ID NO1)；肽2[L-苯丙氨酸]-[4-芐基-L-苯丙氨酸]-[L-酪氨酸]-[L-蘇氨酸]-[L-脯氨酸]-[L-賴氨酸]-[L-蘇氨酸](SEQ ID NO2)；肽3[4-苯基-L-苯丙氨酸]-[L-酪氨酸]-[L-蘇氨酸]-[L-脯氨酸]-[L-賴氨酸]-[L-蘇氨酸](SEQ ID NO3)；肽4[4-苯基-L-苯丙氨酸]-[L-酪氨酸]-[L-蘇氨酸]-[L-丙氨酸]-[L-賴氨酸]-[L-蘇氨酸](SEQ ID NO4)。
圖2顯示了飽和實驗曲線圖。圖中曲線表示多巴胺轉運蛋白的轉運速度隨底物濃度變化的情況，空心方框表示沒有本發明擬肽抑制劑，實心圓點表示250nM肽5，空心三角表示600nM肽5。
其中肽5序列為[4-苯基-L-苯丙氨酸]-[L-酪氨酸]-[L-蘇氨酸]-[L-脯氨酸]-[O-芐基-蘇氨酸]-[L-甘氨酸](SEQ ID NO5)。
圖3顯示了肽5對Win35428結合的影響。圖中曲線表示可卡因類似物Win35428在多巴胺轉運蛋白上的結合隨擬肽濃度的升高而下降。三角形表示肽5，圓形表示肽6。
圖4顯示了肽5在腦內的濃度時間曲線圖。結果表明，皮下給藥后，腦內肽5濃度隨時間變化。其中，每組數據是5只小鼠數據的平均值。
圖5顯示了本發明的擬肽可以拮抗可卡因成癮。
其中，在A中，動物分別皮下注射生理鹽水、20mg/Kg肽5或6、10mg/Kg可卡因。結果表明，只有可卡因會誘導小鼠地點偏好性。每組數據是6只動物的平均值。
在B中顯示了肽5可拮抗可卡因對地點偏好的誘導。每組數據由15只動物組成。星號表示P＜0.05。
在C中顯示了肽5可拮抗可卡因誘導出的地點偏好的表達。每組數據由15只動物組成。星號表示P＜0.05。
具體實施例方式
本發明人經過廣泛而深入的研究，建立了快速靈敏的多巴胺轉運蛋白活性測定方法以及對該蛋白抑制劑的體內活性評價方法，在此基礎上篩選了大量化合物。結果發現多巴胺轉運蛋白偏好整體結構為β-轉折的多肽配基，尤其是4-苯基-L-苯丙氨酸和L-脯氨酸配對組成β-轉折起始模塊。含有所述起始模塊的4-10個短肽可有效地結合于多巴胺轉運蛋白并抑制其活性。在此基礎上完成了本發明。
如本文所用，“L-Fbz”指4-芐基-L-苯丙氨酸。
如本文所用，“L-Bip”指4-苯基-L-苯丙氨酸。
如本文所用，“Tbz”指O-芐基-L-蘇氨酸。
多巴胺轉運蛋白抑制劑如本文所用，“本發明多肽”、“本發明擬肽”、“本發明的多巴胺轉運蛋白抑制劑”可互換使用，指氨基酸序列式I所示結構的抑制劑或SEQ ID NO10所示序列。此外，還包括具有結合或抑制多巴胺轉運蛋白功能的、SEQ ID NO10序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)1-5個(通常為1-4個，較佳地1-3個，更佳地1-2個，最佳地1個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數個(通常為5個以內，較佳地為3個以內，更佳地為2個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改變蛋白質的結構和功能。
該術語還包括式I化合物的活性衍生物。在本發明中，這些活性衍生物指與式I的氨基酸序列相比，有至多5個，較佳地至多3個，更佳地至多2個，最佳地1個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據表a進行氨基酸替換而產生。
表a
另外，本發明多肽還可以以由藥學上或生理學可接受的酸或堿衍生的鹽形式使用。這些鹽包括(但不限于)與如下酸形成的鹽氫氯酸、氫溴酸、硫酸、檸檬酸、酒石酸、磷酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、琥珀酸、草酸、富馬酸、馬來酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、苯磺酸、或羥乙磺酸。鹵化物的鹽同樣適用。其他鹽包括與堿金屬或堿土金屬(如鈉、鉀、鈣或鎂)形成的鹽，以及以酯、氨基甲酸酯或其他常規的“前體藥物”的形式(當以這種形式給藥時，在體內可轉化成活性部分)。
在另一優選例中，本發明抑制劑具有兼具芳香化與β-轉折起始功能的結構模塊Bip-X-X-Pro。
在另一優選例中，本發明抑制劑能夠競爭可卡因在多巴胺轉運蛋白上的結合位點。
在另一優選例中，本發明抑制劑能夠跨越血腦屏障，且在腦內緩慢分布。
在另一優選例中，本發明抑制劑能夠阻斷的可卡因成癮。
制備方法本發明的抑制劑可用常規方法人工合成，也可用重組方法生產。
一種優選的方法是使用液相合成技術或固相合成技術，如Boc固相法、Fmoc固相法或是兩種方法聯合使用。固相合成可快速獲得樣品，可根據目的肽的序列特征選用適當的樹脂載體及合成系統。例如，Fmoc系統中優選的固相載體如連接有肽中C端氨基酸的Wang樹脂，Wang樹脂結構為聚苯乙烯，與氨基酸間的手臂是4-烷氧基芐醇；用25％六氫吡啶/二甲基甲酰胺室溫處理20分鐘，以除去Fmoc保護基團，并按照給定的氨基酸序列由C端逐個向N端延伸。合成完成后，用含4％對甲基苯酚的三氟乙酸將合成的胰島素原相關肽從樹脂上切割下來并除去保護基，可過濾除樹脂后乙醚沉淀分離得到粗肽。將所得產物的溶液凍干后，用凝膠過濾和反相高壓液相層析法純化所需的肽。當使用Boc系統進行固相合成時，優選樹脂為連接有肽中C端氨基酸的PAM樹脂，PAM樹脂結構為聚苯乙烯，與氨基酸間的手臂是4-羥甲基苯乙酰胺；在Boc合成系統中，在去保護、中和、偶聯的循環中，用TFA/二氯甲烷(DCM)除去保護基團Boc并用二異丙基乙胺(DIEA/二氯甲烷中和。肽鏈縮合完成后，用含對甲苯酚(5-10％)的氟化氫(HF)，在0℃下處理1小時，將肽鏈從樹脂上切下，同時除去保護基團。以50-80％乙酸(含少量巰基乙醇)抽提肽，溶液凍干后進一步用分子篩Sephadex G10或Tsk-40f分離純化，然后再經高壓液相純化得到所需的肽。可以使用肽化學領域內已知的各種偶聯劑和偶聯方法偶聯各氨基酸殘基，例如可使用二環己基碳二亞胺(DCC)，羥基苯駢三氮唑(HOBt)或1，1，3，3-四脲六氟磷酸酯(HBTU)進行直接偶聯。所用氨基酸單體或修飾氨基酸單體均經過結構確證。無論是用哪種方法合成得到的擬肽，其純度與結構都經過反相高效液相和質譜分析確證(Stewart et al.，Solid Phase PeptideSynthesis，2nd.ed.，Pierce Chem.co.，Rockford，IL，1984)。
活性測試本發明的多巴胺轉運蛋白測活系統的構建，首先涉及到多巴胺轉運蛋白在細胞膜上穩定表達的問題。多巴胺轉運蛋白的核苷酸全長序列可以用PCR擴增法或人工合成的方法獲得。多巴胺轉運蛋白核苷酸序列可插入到重組表達載體如pCDNA3中。宿主細胞是高等真核細胞，如哺乳動物細胞，代表性例子有中華倉鼠卵巢瘤(CHO)細胞。重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規技術進行，如電擊。電擊后的細胞可以用常規方法培養，如使用含G418的1640培養液篩選轉化子。待細胞長滿孔底后，其中一塊板用于同位素流量測定，用PBS洗滌一次，吸去PBS溶液，每孔加入90ul HBS(10mM Hepes，100mM NaCl，pH8.0)，25℃-37℃溫育10分鐘，每孔加入10ul HBS反應液(含10uCi/ml3H-DA，1mM維生素C，1mM pargyline)。25℃-37℃溫育20分鐘，用冰浴的PBS溶液洗滌三遍，用100ul 2M NaOH或1％SDS溶液裂解30分鐘，吸取各孔的裂解液加入到1.6ml的閃爍液(PPO 3.6g，POPOP 0.36g，二甲苯600ml，Triton X-100 300ml)中，放入液閃計數儀中檢測同位素的含量，以此來衡量多巴胺轉運蛋白的活性。最后選取轉運活力最高的細胞克隆保種用于測定擬肽對多巴胺轉運蛋白的抑制活性，擬肽溶解在90ul HBS中，25℃-37℃溫育10分鐘，然后加入10ul HBS反應液，其它同上。同時以不表達多巴胺轉運蛋白的CHO細胞測定同位素的非特異性吸附，非特異性吸附值為多巴胺轉運蛋白攝入值的2％以下。
藥物組合物另一方面，本發明還提供了一種組合物，它含有(a)安全有效量的本發明多肽或其藥學上可接受的鹽；以及(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。本發明多肽的數量通常為10微克-100毫克/劑，較佳地為100-1000微克/劑。
本文所用的術語“有效量”指治療劑治療、緩解或預防目標疾病或狀況的量，或是表現出可檢測的治療或預防效果的量。對于某一對象的精確有效量取決于該對象的體型和健康狀況、病癥的性質和程度、以及選擇給予的治療劑和/或治療劑的組合。因此，預先指定準確的有效量是沒用的。然而，對于某給定的狀況而言，可以用常規實驗來確定該有效量，臨床醫師是能夠判斷出來的。
為了本發明的目的，有效的劑量為給予個體約0.01毫克/千克至50毫克/千克，較佳地0.05毫克/千克至10毫克/千克體重的本發明多肽。此外，本發明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
藥物組合物還可含有藥學上可接受的載體。術語“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體。該術語指這樣一些藥劑載體它們本身不誘導產生對接受該組合物的個體有害的抗體，且給藥后沒有過分的毒性。這些載體是本領域普通技術人員所熟知的。在Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到關于藥學上可接受的賦形劑的充分討論。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、佐劑、及其組合。
治療性組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、甘油和乙醇。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質，如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。此外，免疫組合物中還可以含有免疫佐劑。
通常，可將治療性組合物制成可注射劑，例如液體溶液或懸液；還可制成在注射前適合配入溶液或懸液中、液體載體的固體形式。
一旦配成本發明的組合物，可將其直接給予對象。待預防或治療的對象可以是動物；尤其是人。
本發明的含本發明多肽的治療或預防性藥物組合物(包括疫苗)，可以經口服、皮下、皮內、靜脈注射等方式應用。治療劑量方案可以是單劑方案或多劑方案。
在本發明的一個優選例中，[4-苯基-L-苯丙氨酸]-[L-酪氨酸]-[L-蘇氨酸]-[L-脯氨酸]-[O-芐基-L-蘇氨酸]-[L-甘氨酸](肽5)，依賴于4-苯基-L-苯丙氨酸和L-脯氨酸形成β-轉折結構，特異性抑制多巴胺轉運蛋白，IC50值為330nM。該擬肽為可逆競爭性抑制劑，可以競爭可卡因在多巴胺轉運蛋白上的結合位點，皮下給藥后能緩慢分布到大腦且持續時間超過3小時，能夠顯著性拮抗小鼠的可卡因覓藥行為。該擬肽是一種全新結構的特異性多巴胺轉運蛋白抑制劑，具有良好的體內活性，是多巴胺轉運蛋白相關疾病的合適藥物前體。
本發明的主要優點在于(a)本發明多巴胺轉運蛋白擬肽抑制劑的結構簡單；(b)在體外、體內實驗中可有效而特異地抑制多巴胺轉運蛋白。
(c)本發明抑制劑是競爭性可逆抑制劑，且和可卡因競爭結合位點。
(d)給藥后可進入大腦，且腦內藥時曲線平緩。
(e)給藥后不能使小鼠成癮，但可拮抗可卡因成癮。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例通用方法(a)條件性地點偏好實驗條件性地點偏好實驗被廣泛應用于在實驗動物模型上評價藥物成癮性。實驗方法如下體重在20-25g的雄性Balb/c小鼠，自由飲食，飼養溫度為20±2℃，早7:00至晚7:00光照，其余時間黑暗。測定裝置由兩個相同的塑料盒子組成，每個盒子的長、寬、高分別為25cm，15cm和12.5cm。一個盒子的底板黃色光滑，另一個盒子的底板鋪有灰色柔軟草紙。兩個盒子由一個長、寬、高分別為13cm，4cm和1.5cm的平臺連接，平臺上方有可移動塑料板將兩者分隔開來。在條件性刺激前、后時期，平臺上方沒有阻隔，讓動物在兩個盒子自由活動，同時觀測在各盒子的活動時間。而在條件性刺激中，動物被限制在一個盒子里活動。在條件性刺激前，動物在20分鐘的自由活動中，在鋪有草紙的盒子里活動時間超過10分鐘。在條件性刺激時期，可卡因、肽5或肽6分別和生理鹽水配對，一組動物隨即給藥或生理鹽水。給生理鹽水動物在鋪有草紙的盒子活動30分鐘，而相應給藥的動物在黃色光滑底板盒子活動30分鐘。刺激后動物被放回飼養籠中，8小時后，每組動物給過生理鹽水的給藥，反之亦然。給生理鹽水動物在鋪有草紙的盒子活動30分鐘，給藥物動物在黃色光滑底板盒子活動30分鐘。這組條件性刺激每天依次，重復4天。第5天進行條件性刺激后測試，所有動物都給生理鹽水，放置于白色平臺上，記錄20分鐘內在兩個盒子各自的活動時間。計算在條件性刺激前后，動物在黃色光滑底板盒子中活動時間的差異，差值越大，成癮性越強(Vorel，S.R.et al.Dopamine D3 receptor antagonism inhibits cocaine-seeking andcocaine-enhanced brain reward in rats.J.Neurosci.22，9595-9603，2002)。
(b)活性測試用常規的PCR擴增法獲得多巴胺轉運蛋白的核苷酸全長序列，將多巴胺轉運蛋白核苷酸序列可插入到重組表達載體pCDNA3中。宿主細胞是中華倉鼠卵巢瘤(CHO)細胞。重組DNA轉化宿主細胞可用電擊法進行。電擊后的細胞使用含G418的1640培養液篩選轉化子。待細胞長滿孔底后，其中一塊板用于同位素流量測定，用PBS洗滌一次，吸去PBS溶液，每孔加入90ul HBS(10mM Hepes，100mM NaCl，pH8.0)，25℃-37℃溫育10分鐘，每孔加入10ul HBS反應液(含10uCi/ml3H-DA，1mM維生素C，1mM pargyline)。25℃-37℃溫育20分鐘，用冰浴的PBS溶液洗滌三遍，用100ul 2M NaOH或1％SDS溶液裂解30分鐘，吸取各孔的裂解液加入到1.6ml的閃爍液(PPO 3.6g，POPOP 0.36g，二甲苯600ml，Triton X-100 300ml)中，放入液閃計數儀中檢測同位素的含量，以此來衡量多巴胺轉運蛋白的活性。最后選取轉運活力最高的細胞克隆保種用于測定擬肽對多巴胺轉運蛋白的抑制活性。
各擬肽溶解在90ul HBS中，25℃-37℃溫育10分鐘，然后加入10ul HBS反應液，其它同上。同時以不表達多巴胺轉運蛋白的CHO細胞測定同位素的非特異性吸附，非特異性吸附值為多巴胺轉運蛋白攝入值的2％以下。
實施例1β-轉折肽的設計設計表1所示的多種短肽(肽1-9分別具有SEQ ID NO1-9所示序列)，用常規方法合成。然后用遠紫外圓二色譜來測定擬肽的二級結構。方法如下擬肽溶解于含10％三氟乙醇的20mmol磷酸鉀、40mmol氯化鈉、pH7溶液中，肽濃度為0.4mg/ml。圓二色譜儀的型號是Jasco J-715，測試在20℃下進行，使用標準參數波長為190-250nm；靈敏度為20mdeg；數據采集間距為0.1nm；掃描速度為10nm/s；累積值為1；響應時間為0.25秒；帶寬為1nm；光程為0.1cm。擬肽中β-轉折含量與218nm處的橢圓率正相關。
結果如圖1所示肽1在月205nm處有一波谷，表示存在極少量的類I型β-轉折結構；肽2和肽3在218nm處有強的倒峰，說明這兩種擬肽存在很強的類I’型β-轉折結構；肽4由于L-脯氨酸被置換成L-丙氨酸而稱為無規卷曲結構。
若肽3中的4-苯基-L-苯丙氨酸被置換成1-萘L-丙氨酸、或2-萘L-丙氨酸、或4-苯甲酰基L-苯丙氨酸時，不能形成β-轉折結構。
這些實驗數據說明4-苯基-L-苯丙氨酸和L-脯氨酸聯合使用可起始多肽β-轉折結構的形成。
實施例2擬肽的結構功能關系表1中，肽1-4清楚地顯示β-轉折與擬肽的活性直接相關。肽5是以肽3為基礎設計的，有著相似的二級結構，但活性提高了50倍以上。這和局部結構的改進而增加了擬肽和多巴胺轉運蛋白的結合力有關，如去掉了堿性的L-賴氨酸殘基，C端L-蘇氨酸羥基的芐基化修飾，這些改變增強了分子的疏水性。肽5中C端L-甘氨酸不是活性結構必需的，而是為便于固相合成而設計的。肽7-9說明肽5中的O-芐基L-蘇氨酸可以被L-苯丙氨酸替換、L-酪氨酸可以被或L-苯丙氨酸替換、L-蘇氨酸可以被L-絲氨酸替換。這些替換基本上保持了活性。
表1中，肽3具有非常特異的多巴胺轉運蛋白抑制活性，對同一家族的其它蛋白沒有作用。肽5在提高活性的同時也保持了相當好的選擇性，對其它蛋白的抑制活性比多巴胺轉運蛋白低300倍以上。對于肽5結構上的改動會降低選擇性。
肽6在以后的實驗中作為陰性對照藥。
表1擬肽的結構功能關系
218obs為擬肽在218nm處的橢圓率，與其β-轉折的含量正相關；IC50(μM)為達到最大抑制效應一半時所需的藥物濃度；Nd表示沒有測定；DAT為大鼠多巴胺轉運蛋白，NET為大鼠去甲腎上腺素轉運蛋白，SERT為大鼠五羥色胺轉運蛋白，GAT1為γ-氨基丁酸轉運蛋白，這些屬于同一蛋白家族，結構同源性極高；Phe為L-苯丙氨酸，Tyr為L-酪氨酸，Thr為L-蘇氨酸，Pro為L-脯氨酸，Lys為L-賴氨酸，Fbz為4-芐基-L-苯丙氨酸，Bip為4-苯基-L-苯丙氨酸，Ala為L-丙氨酸，Tbz為O-芐基-L-蘇氨酸，Ser為L-絲氨酸。
實施例3擬肽對多巴胺轉運蛋白的抑制動力學擬肽的動力學分析是在穩定表達大鼠多巴胺轉運蛋白的CHO細胞上進行。1μM肽5可以抑制80％的多巴胺轉運蛋白活性，且經過兩次洗滌后，這種抑制作用可以徹底被逆轉。故肽5是一種可逆性的完全抑制劑。
還用飽和分析實驗來確定肽5作用于多巴胺轉運蛋白的特性(圖2)。沒有抑制劑時，多巴胺轉運蛋白對多巴胺轉運的Km值為1.38±0.27μM，最大轉運速度Vmax為1.27±0.13pmol/min.106cells；在有250nM肽5時，Km值為2.41±0.35μM，Vmax為1.29±0.11pmol/min.106cells；在有600nM肽5時，Km值為3.59±0.20μM，Vmax為1.25±0.08pmol/min.106cells。可以看到肽5只改變Km值而不改變Vmax，是競爭性抑制劑。故肽5是競爭性可逆抑制劑。
還用以上檢測系統分析了肽5和可卡因的類似物Win35，428的相互作用，發現肽5可以抑制可卡因類似物在多巴胺轉運蛋白上的結合，IC50值為494nM(圖3)。這些結果說明肽5直接結合多巴胺轉運蛋白，并且和多巴胺、可卡因競爭結合位點。
實施例4擬肽的腦內分布為了考察高壓液相方法的靈敏度是否能夠達到分析體內肽5的要求，首先驗證了在常規條件下，280nm檢測可以定量檢測1μg肽5。然后，從腦組織中檢測肽5的回收率為90％。Balb/c小鼠近尾端皮下注射肽5溶液(10mg/Kg)后0，0.25，1，2，3，4小時，取腦組織在0.5ml 50％乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)中勻漿后離心取上清，上清凍干后，在用0.1ml 50％乙腈/水(含0.1％三氟乙酸)抽提，離心后上清可用于高壓液相測量。每個時間點為5只小鼠，從圖4中可以看出在皮下給藥后1小時，小鼠腦內肽5濃度達到峰值，4小時后降低到基線值。同時檢測血藥濃度，可以估算出約28％的肽5進入大腦。
實施例5擬肽對可卡因成癮的阻斷作用本實施例用小鼠條件性地點偏好模型同時評價肽5和可卡因的成癮性。如圖5A所示，10mg/Kg可卡因可以誘導出明顯的地點偏好，而20mg/Kg肽5不能誘導出地點偏好。這說明在該模型上肽5無成癮性能。在對小鼠做可卡因條件性刺激前2小時，皮下注射肽5(10mg/Kg)。照樣測定條件性刺激后小鼠的地點偏好性。
結果顯示可卡因誘導的地點偏好明顯減弱(圖5B)，這說明肽5可以阻斷可卡因對小鼠地點偏好的誘導作用。在另一組實驗中，小鼠經過可卡因誘導，其地點偏好在200秒以上，連續兩天皮下注射肽5，10mg/Kg，每天一次。再次測定地點偏好性，發現肽5可以明顯阻斷可卡因誘導的地點偏好性的表達(圖5C)。
實施例6注射劑的制備利用常規技術，混合以下組分，制得注射劑，其配方如下
多巴胺轉運蛋白抑制肽100mg1.2-丙二醇 2.5ml注射用水加至100ml討論擬肽(peptidomimetics)一般是指，以生物大分子的天然多肽配基、相互作用蛋白質表面活性位點、或是從多肽庫篩選所得相互作用氨基酸序列為骨架，通過高級構象的約束和局部結構的修飾，所得到的高活性、高選擇性、具有細胞內或體內活性小分子多肽類似物。擬肽可為基礎研究提供有力工具，也可直接發展成藥物、或作為前體發展成小分子化學藥物。在擬肽設計中，環化和芳香化修飾經常聯合使用，前者是廣泛使用的多肽高級結構限制的方法，后者可增強分子間作用的疏水相互作用力以增強擬肽和大分子的結合(Kieber-Emmons，T.，Murali，R.&Greene，M.I.Therapeutic peptides and peptidomimetics.Curr.Opin.Biotechnol.8，435-441(1997))。
50％以上藥物的作用靶點為膜蛋白，包括受體、離子通道和轉運蛋白。這類蛋白一般缺乏晶體結構解析，且存在多種亞型。基于配基的分子設計是獲得受體特異性激動劑、抑制劑的主流方法。轉運蛋白的底物通常為結構簡單的小分子化合物，且底物和轉運蛋白相互作用的特異性和強度比較低。本發明人從頭設計了多巴胺轉運蛋白的擬肽配基，成功地解決了沒有多肽配基作為藥物設計模板的問題，這種方法也可應用于其它的轉運蛋白激動劑或抑制劑的設計。本發明中發現的兼具芳香化與β-轉折(β-turn)起始功能的結構模塊Bip-X-X-Pro，可能也可用于其它的擬肽設計。
另外，本發明還證明了經過合適修飾的擬肽可以跨越血腦屏障作用于中樞神經系統，在條件性地點偏好實驗中，擬肽可以拮抗可卡因。其原因可能是已有實驗表明可卡因成癮的關鍵原因是其迅速強烈的腦內作用，而起效慢作用持久的藥物通常不成癮；擬肽具有后者特征而不成癮，且可以競爭可卡因作用位點，部分取代可卡因的功能。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>上海南方模式生物科技發展有限公司上海生物泰生命科學研究有限公司<120>多巴胺轉運蛋白擬肽抑制劑及其應用<130>052697<160>10<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>人工合成的短肽<400>1Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr1 5<210>2<211>7<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>Xaa＝Fbz<400>2Phe Xaa Tyr Thr Pro Lys Thr1 5<210>3<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)<223>Xaa＝Bip<400>3Xaa Tyr Thr Pro Lys Thr1 5<210>4<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>Xaa＝Bip<400>4Xaa Tyr Thr Ala Lys Thr1 5<210>5<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>Xaa＝Bip<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>Xaa＝Tbz<400>5Xaa Tyr Thr Pro Xaa Gly1 5<210>6<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)<223>Xaa＝Bip<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>Xaa＝Tbz<400>6Xaa Tyr Thr Ala Xaa Gly1 5<210>7<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>Xaa＝Bip<400>7Xaa Tyr Thr Pro Phe1 5<210>8<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>Xaa＝Bip<400>8Xaa Phe Thr Pro Phe1 5<210>9<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)<223>Xaa＝Bip<400>9Xaa Tyr Ser Pro Phe1 5<210>10<211>6<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(1)<223>Xaa＝L-Phe、L-Fbz、或L-Bip<220>
<221>misc_feature<222>(2)..(2)<223>Xaa1＝Ala、Ile、Leu、Phe、Pro、Trp、Tyr、或Val<220>
<221>misc_feature<222>(3)..(3)<223>Xaa＝Ala、Gly、Ser、或Thr<220>
<221>misc_feature<222>(5)..(5)<223>Xaa＝無，或選自下組的氨基酸Tbz、Ala、Ile、Leu、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val；或是由上述2-5個氨基酸構成肽段；<220>
<221>misc_feature<222>(6)..(6)<223>Xaa是無，或選自下組的氨基酸Ala、Gly<400>10Xaa Xaa Xaa Pro Xaa Xaa1 權利要求
1.一種下式I表示的抑制劑，或其藥學上可接受的鹽[Xaa0]-[Xaa1]-[Xaa2]-[L-脯氨酸]-[Xaa3]-[Xaa4](I)式中，Xaa0是L-Phe、L-Fbz、或L-Bip；Xaa1是選自下組的氨基酸Ala、Ile、Leu、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val；Xaa2是選自下組的氨基酸Ala、Gly、Ser、Thr；Xaa3是無，或選自下組的氨基酸Tbz、Ala、Ile、Leu、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val；或是由上述2-5個氨基酸構成肽段；Xaa4是無，或選自下組的氨基酸Ala、Gly；并且所述的抑制劑結合于多巴胺轉運蛋白。
2.如權利要求1所述的抑制劑，其特征在于，所述抑制劑具有β-轉折，并且在218nm處的橢圓率大于20。
3.如權利要求1所述的抑制劑，其特征在于，Xaa0選自L-Bip；和/或Xaa1選自Tyr、Trp、Phe；和/或Xaa2選自Thr、Ser。
4.如權利要求1所述的抑制劑，其特征在于，Xaa3選自Tbz、Ala、Ile、Leu、Phe、Pro、Trp、Tyr、Val；和/或Xaa4選自無、或Gly、Ala。
5.如權利要求1所述的抑制劑，其特征在于，Xaa0選自L-Bip、Xaa1選自Tyr、Phe；Xaa2選自Thr；Xaa3選自Phe、Tbz；且Xaa4選自無、或Gly。
6.如權利要求1所述的抑制劑，其特征在于，該抑制劑選自下組(a)具有SEQ ID NO2、3、5、7、8、或9所示氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2、3、5、7、8、或9所示氨基酸序列經過1-2個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有結合于多巴胺轉運蛋白的由(a)衍生的多肽。
7.一種分離的核酸分子，其特征在于，它編碼權利要求1所述的抑制劑。
8.一種藥物組合物，其特征在于，它含有(a)安全有效量的權利要求1所述抑制劑或其藥學上可接受的鹽；和(b)藥學上可接受的載體或賦形劑。
9.權利要求1所述的抑制劑或藥學上可接受的鹽的用途，其特征在于，用于制備治療多巴胺轉運蛋白相關疾病的藥物。
10.如權利要求9所述的用途，其特征在于，所述的多巴胺轉運蛋白相關疾病選自下組帕金森病、可卡因成癮、抑郁癥、小兒多動癥和肥胖癥。
全文摘要
本發明提供了一種新的多巴胺轉運蛋白擬肽抑制劑以及含有該抑制劑的藥物組合物。本發明的該新型抑制劑對與多巴胺轉運蛋白相關的神經精神性疾病(尤其是可卡因成癮)有治療作用，可特異性作用于多巴胺轉運蛋白，競爭可卡因在多巴胺轉運蛋白上的結合位點；能夠透過血腦屏障，皮下注射后緩慢分布于腦內，且作用時間持久。動物實驗發現本發明抑制劑可以拮抗可卡因成癮。
文檔編號A61P3/04GK1854151SQ20051002554
公開日2006年11月1日 申請日期2005年4月29日 優先權日2005年4月29日
發明者費儉, 崔大敷, 丁金國 申請人:上海南方模式生物科技發展有限公司, 上海生物泰生命科學研究有限公司