專利名稱：可卡因－苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗及其制備與應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥工程技術領域，具體涉及一種能對抗嗎啡等精神活性物質引起精神依賴的基因疫苗，及其制備與應用。
背景技術：
精神活性物質依賴(吸毒)和復吸是當今社會嚴重的問題，目前，尚無較理想的方法來防治吸毒與復吸。本發明是基于近年來科學界對可卡因-苯丙胺調節轉錄肽(CART)研究的深入而發明的一種可以刺激機體產生對抗可卡因-苯丙胺調節轉錄肽的抗體的基因疫苗。可卡因-苯丙胺調節轉錄肽是一類與藥物的受酬和依賴效應相關的肽類物質，在可卡因和苯丙胺等精神藥物的誘導下，可卡因-苯丙胺調節轉錄肽有明顯的表達。減少可卡因-苯丙胺調節轉錄肽的表達就可減少了機體對可卡因和苯丙胺等精神藥物長期使用而引起的機體軀體依賴和精神依賴。
基因疫苗技術作為一種新的免疫接種手段有巨大的潛力，它通過把外源基因克隆到真核質粒表達載體上，然后將重組的質粒DNA直接注射到動物體內，使外源基因在活體中表達，產生的抗原激活機體的免疫系統，引發免疫反應。大量的實驗結果表明，基因疫苗可以用于人類，它不僅具有預防疾病的作用，還有治療疾病的作用。
發明內容
本發明的目的是提供一種能對抗嗎啡等精神活性物質(包括阿片類、可卡因、苯丙胺和氯胺酮等)引起精神依賴(導致的成癮行為)的基因疫苗。本發明的另一目的是提供上述基因疫苗的制備方法與用途。
本發明將可卡因-苯丙胺調節轉錄肽(CART)基因，克隆到真核質粒表達載體pcDNA3.1(+)上，然后將重組的質粒DNA直接注射到動物體內，使可卡因-苯丙胺調節轉錄肽在活體中表達，產生的抗原激活機體的免疫系統，引發免疫反應，刺激機體產生了對抗可卡因-苯丙胺調節轉錄肽的抗體，從而減少了機體對嗎啡、可卡因和苯丙胺等精神藥物長期使用而引起的精神依賴。
本發明提供一種可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗，命名為pcDNA31CART，它是真核質粒表達載體pcDNA3.1(+)與可卡因-苯丙胺調節轉錄肽編碼全基因序列重組的核苷酸序列。可卡因-苯丙胺調節轉錄肽編碼全基因序列的gene bank號為NM_017110。
一種可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗是具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。SEQ ID NO1中第926位至第1276位核苷酸序列為可卡因-苯丙胺調節轉錄肽(CART)基因序列。
一種可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗在活體中表達的抗原是具有SEQ ID NO2的蛋白質。SEQ ID NO2中前27個氨基酸為信號肽序列，第28個至116個氨基酸為CART的活性片段，包括3對二硫鍵。
本發明還提供一種制備可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗的方法，該方法包括I、逆轉錄合成cDNA，用PCR擴增大鼠的CART編碼區；II、BamHI酶和XhoI酶雙酶切PCR產物，膠回收片段；III、BamHI酶和XhoI酶雙酶切PcDNA3.1(+)載體，膠回收載體；IV、將膠回收后的CART片段和pcDNA3.1(+)載體進行粘端連接，轉化入大腸桿菌TG1型菌株，抽提質粒，測序；V、用Qiagen質粒大抽試劑盒制備疫苗；VI、分離純化疫苗，將疫苗溶于無菌無熱源的PBS緩沖液中，-20℃貯存。
本發明還提供上述可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗在制備對抗嗎啡等精神活性物質引起精神依賴的藥物中的用途。小鼠肌肉注射pcDNA31CART后，pcDNA31CART被肌細胞吸收，在CMV啟動子作用下，使CART在細胞中表達并分泌，產生的抗原(CART)激活機體的免疫系統，引發免疫反應，刺激機體產生了CART的抗體，該抗體與循環中的CART結合，導致循環中CART水平降低。由于精神活性物質可導致中樞CART水平的增加可能是導致依賴的原因，因此增加的CART將順濃度梯度進入循環被抗體中和，使中樞CART水平降低到正常水平，從而發揮其預防和治療效應。本發明用嗎啡誘導的條件性位置偏愛和自身給藥模型已經證實，pcDNA31CART基因疫苗(即圖中所示pcDNA3.1(+)-CART)不僅對抗嗎啡誘導的條件性位置偏愛，而且抑制大鼠的自身給藥行為，血清中CART抗體的效價在免疫后2個月內可維持在1∶2500-1∶8000之間。因此我們認為pcDNA31CART基因疫苗具有對抗精神活性物質引起的依賴，特別是精神依賴的作用。
圖1是可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗制備流程圖。
圖2是細胞免疫熒光檢測可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗在中國倉鼠卵巢癌細胞(CHO)的表達。
圖3是pcDNA3.1(+)和CART基因疫苗本身對位置偏愛的影響。
圖4是預防性給藥pcDNA3.1(+)-CART對嗎啡誘導的動物條件性位置偏愛的影響。
圖5是治療性給藥pcDNA3.1(+)-CART對嗎啡誘導的動物條件性位置偏愛的影響。
圖6是pcDNA31CART基因疫苗對嗎啡復吸的影響。
圖7是行為學評分表。
圖8是pcDNA31CART基因疫苗對行為學總評分的抑制作用。
圖9是pcDNA31CART基因疫苗對嗎啡部分戒斷癥狀的影響。
圖10是pcDNA31CART基因疫苗以大鼠自身給藥行為的影響。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步描述實施例1如圖1所示制備可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗逆轉錄合成cDNA，用PCR擴增大鼠的CART編碼區；BamHI酶和XhoI酶雙酶切PCR產物，膠回收片段，BamHI酶和XhoI酶雙酶切PcDNA3.1(+)載體，膠回收載體。將膠回收后的CART片段和pcDNA3.1(+)載體進行粘端連接，轉化入大腸桿菌TG1型菌株，抽提質粒，經測序證實CART序列完全正確，見SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。用Qiagen質粒大抽試劑盒(上海基因公司提供的德國Qiagen公司產品)制備疫苗；分離純化疫苗，將疫苗溶于無菌無熱源的PBS緩沖液中，-20℃貯存。
轉染到CHO細胞檢測表達的抗原，見SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。如圖2所示，基因疫苗能在真核細胞中表達出可卡因-苯丙胺調節轉錄肽。表達出的蛋白呈熒光反應。pcDNA3.1(+)組為對照組，取轉染有pcDNA3.1(+)的CHO細胞作對照，沒有產生特異性黃綠色熒光；pcDNA3.1(+)-CART組，細胞形態清楚，有強烈的綠色熒光產生，說明CHO細胞內已經有CART蛋白形成。
實施例2將含可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因質粒用于動物實驗，證實可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗減少了機體對嗎啡等精神藥物長期使用而引起的機體軀體依賴和精神依賴。結果如下一、測定接種可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗(pcDNA3.1(+)-CART)后血清抗體效價。
ELISA檢測肌肉注射CART基因疫苗一周后昆明小鼠血清中的CART抗體效價。將CART55-102蛋白抗原以10mg/L濃度包被96孔板，檢測經倍比稀釋的小鼠抗血清，終止反應后，用酶聯免疫檢測儀測定450nm波長處OD值。將所測的原始OD值減去對照管的OD值所得的值為實際測定值。陽性對照實際測定值/陰性對照實際測定值＞2.0者，方可認為測試效果有效。用稀釋倍數進行相關性分析，并計算當實際測定OD值為最大的可識別值3.5的50％的抗體稀釋度作為抗體效價。結果顯示，給小鼠肌肉注射CART基因疫苗一周后，在血清中可檢測到抗體，CART基因疫苗的抗體效價在1∶2500～1∶10000之間，一次免疫2個月后的抗體效價仍可保持在1∶2000～1∶8000之間。
二、CART基因疫苗對嗎啡精神依賴的影響
(一)條件性位置偏愛模型1.條件性位置偏愛箱本實驗采用的條件位置偏愛穿梭箱采用“直線”型兩箱設計，材料為黑色有機玻璃，壁厚1cm。左右兩箱一黑一白，黑白兩個箱子的內徑為15×15×35cm，穿梭門大小為5×5cm，箱底上方5cm處分別安置有光滑、粗糙的鐵絲網各一塊；黑灰、白灰兩箱中間有穿梭門各一個，為可抽動的擋板。觀察箱具有隔光、隔音的效果，聲強衰減為20-25dB。在每個箱子的頂部，安裝有白光照明燈和紅外LED，并有通風通道和小風扇；黑、白箱均裝有1個微攝像頭，并有DC 12V電源線和A/V視頻線的接頭；箱底部墊有一塊墊板，可有效防止光線的反射，使成像清晰。
2.動物模型構建選擇實驗小鼠 選用雄性小鼠。打開兩室閘門，將小鼠放于中間閘門下，同時采集視頻，采樣速度用15幀/秒。并允許探索黑白箱2min，然后記錄小鼠15min內在黑箱中的停留時間。連續試驗3d，選擇明顯偏愛黑箱的小鼠為實驗用小鼠。
訓練小鼠 將實驗用小鼠按體重以隨機數字表隨機分組。上午sc Mor 4mg·kg-1后放入白箱(伴藥箱)，下午sc saline后放入黑箱(非伴藥箱)。每次在箱內停留50min，連續7d。小鼠經Mor訓練將會改變其天然的偏愛，由偏愛黑箱轉為偏愛白箱。
觀察小鼠 完成訓練后，停止給藥。訓練后d1，將其單只放于穿梭箱內，打開兩室門，允許探索黑白箱2min，之后觀察小鼠15min內在最初偏愛側(黑箱)的停留時間。之后每隔1天觀察一次，直至觀察到恢復其天然的位置偏愛行為。
3.實驗結果(1)pcDNA3.1(+)-CART本身對正常動物位置偏愛無影響。
在訓練前的15min內，小鼠停留在黑箱(非伴藥箱)的時間比白箱(伴藥箱)的長，表明小鼠天性喜歡呆在黑暗的場所。用生理鹽水作為藥物訓練小鼠條件性位置偏愛，在訓練前一周分別給巴比氏小鼠肌肉注射pcDNA3.1(+)-CART、pcDNA3.1(+)和生理鹽水，質粒濃度為1μg/μl，小鼠平均體重為30g，按50μg/只給予。小鼠完成訓練后，停止給藥，第二天觀察小鼠15min內在白箱(伴藥箱)的停留時間。生理鹽水組、pcDNA3.1(+)組和pcDNA3.1(+)-CART組分別為251±62s、276±85s和311±34s，與訓練前的218±37s、282±105s和330±24s相比無明顯差異(P＞0.05)。用pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-CART預處理的小鼠，經過生理鹽水條件性訓練以后，其喜歡停留的場所并沒有改變，表明pcDNA3.1(+)和CART基因疫苗本身沒有影響位置偏愛的作用。
如圖3所示，橫坐標分別是空白對照組，pcDNA3.1(+)組和pcDNA3.1(+)-CART組。縱坐標為伴藥箱時間(秒)，白柱為訓練前，灰柱為訓練后。
(2)預防性給藥pcDNA3.1(+)-CART對嗎啡誘導的動物條件性位置偏愛的影響在訓練前一周分別給小鼠肌肉注射生理鹽水，pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-CART，pcDNA3.1(+)-CART以0.1mg/kg和1mg/kg給予。結果表明兩個劑量的CART均能抑制嗎啡引起的CPP形成。
如圖4所示，縱坐標為伴藥箱時間(秒)，橫坐標分別是空白對照組，嗎啡組，pcDNA3.1(+)組，pcDNA3.1(+)-CART0.1mg/kg組和pcDNA3.1(+)-CART1.0mg/kg組。空白對照組為給小鼠安慰劑但不用嗎啡訓練，嗎啡組為給小鼠安慰劑且用嗎啡訓練，pcDNA3.1(+)組，pcDNA3.1(+)-CART0.1mg/kg組和pcDNA3.1(+)-CART1.0mg/kg組為訓練前一周給小鼠肌肉注射pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-CART，其中pcDNA3.1(+)-CART的劑量分別為0.1mg/kg體重和1.0mg/kg體重。白柱為訓練前，灰柱為訓練后。訓練完成后統計小鼠在伴藥箱時間。**P＜0.01與訓練前比較有顯著性差異，##P＜0.01與嗎啡組訓練后比較有顯著性差異。
(3)治療性給藥pcDNA3.1(+)-CART對嗎啡誘導的動物條件性位置偏愛的影響訓練后分別給小鼠肌肉注射生理鹽水，pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-CART以0.1mg/kg，1.0mg/kg和10mg/kg給予。2小時后嗎啡誘導，結果表明三個劑量的CART均能抑制嗎啡引起的CPP形成。
如圖5所示，縱坐標為伴藥箱時間(秒)，橫坐標分別是空白對照組，嗎啡組，pcDNA3.1(+)組，pcDNA3.1(+)-CART0.1mg/kg組，pcDNA3.1(+)-CART1.0mg/kg組，pcDNA3.1(+)-CART10.0mg/kg組。空白對照組為給小鼠安慰劑但不用嗎啡訓練，嗎啡組為給小鼠安慰劑且用嗎啡訓練，pcDNA3.1(+)組，pcDNA3.1(+)-CART0.1mg/kg組，pcDNA3.1(+)-CART1.0mg/kg組和pcDNA3.1(+)-CART10.0mg/kg組為訓練后給小鼠肌肉注射pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-CART，其中pcDNA3.1(+)-CART的劑量分別為0.1mg/kg體重，1.0mg/kg體重和10mg/kg體重。給藥后2小時嗎啡誘導條件性位置依賴，統計小鼠在伴藥箱時間。白柱為訓練前，灰柱為訓練后。**P＜0.01與嗎啡誘導前比較有顯著性差異，##P＜0.01與嗎啡組嗎啡誘導后比較有顯著性差異。
(4)pcDNA3.1(+)-CART對復吸的影響嗎啡誘導動物產生位置偏愛后，停止嗎啡給藥，在無藥條件下，每3d觀察動物的行為。停藥約十天后，位置偏愛效應消失，腹腔注射嗎啡(1mg/kg)點燃位置偏愛，1h之后觀察小鼠15min內在白箱(伴藥箱)的停留時間。生理鹽水組在點燃前后的時間分別為280±276s和391±221s，無明顯差別。嗎啡組、嗎啡+pcDNA3.1(+)組分別為605±223s、574±257s均比點燃前的379±30s、401±188s明顯增加(P＜0.01)嗎啡+pcDNA3.1(+)-CART組為412±108s，與點燃前的313±86s無明顯差異(P＞0.05)，但明顯低于嗎啡組被點燃后的時間(P＜0.05)，表明CART基因疫苗對復吸有明顯抑制作用。
如圖6所示，縱坐標為伴藥箱時間(秒)，橫坐標為實驗組，分別是空白對照組，嗎啡組，pcDNA3.1(+)組，pcDNA3.1(+)-CART組。空白對照組為給小鼠安慰劑，在不用嗎啡訓練的情況下給嗎啡點燃，嗎啡組為給小鼠安慰劑，用嗎啡訓練，嗎啡點燃。pcDNA3.1(+)組，pcDNA3.1(+)-CART組分別為給老鼠肌肉注射pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+)-CART，嗎啡訓練后用嗎啡點燃。**P＜0.01，*P＜0.05與嗎啡點燃前比較有顯著性差異，#P＜0.05與嗎啡組嗎啡點燃后比較有顯著性差異。
(二)、自身給藥模型1.模型的構建如圖10所示，動物先進行10天的海洛因自身給藥訓練，停藥以后肌肉注射疫苗。經過2星期戒斷，測定條件性線索誘導的海洛因覓藥行為。有效覓藥數指動物在訓練時觸鼻以后給予海洛因，在測定時每次觸鼻后給予條件性線索；而無效覓藥數在訓練過程中與有效觸鼻器左右側分布，動物觸鼻后沒有海洛因，在測定時觸鼻反應不給予條件性線索。
2.實驗結果
***P＜0.001，**P＜0.01，*P＜0.05，與質粒對照組相比；++P＜0.01，+P＜0.05，與Vaccine組相比。Vaccine為不含類毒素的超純疫苗，Vaccine1為含有類毒素的一般疫苗。
三、CART基因疫苗對嗎啡軀體依賴的影響慢性嗎啡處理7天后，第二天腹腔注射納絡酮(10mg/kg)，在觀察的10min內，嗎啡組、pcDNA3.1(+)組和pcDNA3.1(+)-CART基因疫苗組均出現明顯的戒斷癥狀，行為學總評分分別為23.71±3.64、21.67±1.63和17.5±2.95，明顯高于生理鹽水對照組9.67±3.01(P＜0.01)。評分標準見圖7，動物最后一次給予嗎啡后24h，稱量動物體重后，皮下注射納絡酮(10mg/kg)，觀察并記錄動物的戒斷癥狀。根據Rasmussen的方法進行改進后評分，即將15min的評分改為10min評分。10min評分不包括體重的丟失。
但是CART基因疫苗組動物的行為學總評分明顯低于嗎啡組，說明CART基因疫苗具有對行為學總評分具有一定的抑制作用(P＜0.05)，如圖8所示，橫坐標為實驗組別，分別是空白對照組，嗎啡組，pcDNA3.1(+)組，pcDNA3.1(+)-CART組。空白對照組為給小鼠安慰劑，不用嗎啡訓練，用納絡酮戒斷。嗎啡組用嗎啡訓練，用納絡酮戒斷。pcDNA3.1(+)組為給小鼠pcDNA3.1(+)，用嗎啡訓練，用納絡酮戒斷。pcDNA3.1(+)-CART組為給小鼠pcDNA3.1(+)-CART，用嗎啡訓練，用納絡酮戒斷。(**P＜0.01與空白對照組比較有顯著性差異，+P＜0.05與嗎啡組比較有顯著性差異)。
同時，CART基因疫苗組對嗎啡依賴小鼠納絡酮引起的部分戒斷癥狀，如跳躍、站立、濕狗樣顫抖、特殊體位等，具有抑制作用(*P＜0.05與嗎啡組有顯著性差異)。
以上動物行為結果顯示可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗減少了機體對可卡因和苯丙胺等精神藥物長期使用而引起的機體軀體依賴和精神依賴。
SEQUENCE LISTING<110>中國人民解放軍第二軍醫大學<120>可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗及其制備與應用<130>說明書，權利要求書<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5795<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>gene<222>(926)..(1276)<223>可卡因-苯丙胺調節轉錄肽(CART)基因序列<400>1gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg60ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg120cgagcaaaat ttaagctaca acaaggcaag gcttgaccga caattgcatg aagaatctgc180ttagggttag gcgttttgcg ctgcttcgcg atgtacgggc cagatatacg cgttgacatt240gattattgac tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata300tggagttccg cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc360cccgcccatt gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc420attgacgtca atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt480atcatatgcc aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt540
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<212>PRT<213>人工序列<400>2Met Glu Ser Ser Arg Leu Arg Leu Leu Pro Val Leu Gly Ala Ala Leu1 5 10 15Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Gly Ala Gly Ala Gln Glu Asp Ala Glu20 25 30Leu Gln Pro Arg Ala Leu Asp Ile Tyr Ser Ala Val Asp Asp Ala Ser35 40 45His Glu Lys Glu Leu Ile Glu Ala Leu Gln Glu Val Leu Lys Lys Leu50 55 60Lys Ser Lys Arg Ile Pro Ile Tyr Glu Lys Lys Tyr Gly Gln Val Pro65 70 75 80Met Cys Asp Ala Gly Glu Gln Cys Ala Val Arg Lys Gly Ala Arg Ile85 90 95Gly Lys Leu Cys Asp Cys Pro Arg Gly Thr Ser Cys Asn Ser Phe Leu100 105 110Leu Lys Cys Leu11權利要求
1.一種可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗，其特征在于它是真核質粒表達載體pcDNA3.1(+)與可卡因-苯丙胺調節轉錄肽編碼全基因序列重組的核苷酸序列。
2.根據權利要求書1所述的基因疫苗，其特征在于它是具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
3.根據權利要求書1所述的基因疫苗，其特征在于它在活體中表達的抗原是具有SEQ ID NO2的蛋白質。
4.一種制備權利要求書1、2或3所述的可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗的方法，其特征在于，該方法包括VII、逆轉錄合成cDNA，用PCR擴增大鼠的CART編碼區；VIII、BamHI酶和XhoI酶雙酶切PCR產物，膠回收片段；IX、BamHI酶和XhoI酶雙酶切PcDNA3.1(+)載體，膠回收載體；X、將膠回收后的CART片段和pcDNA3.1(+)載體進行粘端連接，轉化入大腸桿菌TG1型菌株，抽提質粒，測序；XI、用Qiagen質粒大抽試劑盒制備疫苗；XII、分離純化疫苗，將疫苗溶于無菌無熱源的PBS緩沖液中，-20℃貯存。
5.權利要求1所述的可卡因-苯丙胺調節轉錄肽基因疫苗在制備對抗精神活性物質引起精神依賴的藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及生物醫藥工程技術領域，具體涉及一種能對抗嗎啡等精神活性物質引起精神依賴的基因疫苗，及其制備與應用。本發明將可卡因—苯丙胺調節轉錄肽(CART)基因，克隆到真核質粒表達載體pcDNA3.1(+)上，然后將重組的質粒DNA直接注射到動物體內，使可卡因—苯丙胺調節轉錄肽在活體中表達，產生的抗原激活機體的免疫系統，引發免疫反應，刺激機體產生了對抗可卡因—苯丙胺調節轉錄肽的抗體，從而減少了機體對嗎啡、可卡因和苯丙胺等精神藥物長期使用而引起的精神依賴。
文檔編號A61K48/00GK1686564SQ20051002529
公開日2005年10月26日 申請日期2005年4月21日 優先權日2005年4月21日
發明者由振東, 路長林, 黃矛, 何成, 葛翠蘭, 艾恒, 林琴, 張曉冬, 鄭杰民, 周文華, 張富強, 楊國棟 申請人:中國人民解放軍第二軍醫大學