一種用核磁共振篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法

專利名稱：一種用核磁共振篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法
技術領域：
本發明涉及一種乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選方法，更具體地說，涉及一種應用核磁共振來篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法。
背景技術：
早老性癡呆(阿爾茨海默病)是一種以記憶缺損為特征的進行性精神疾病。中樞膽堿能傳導機制的改變是早老性癡呆患者中樞神經系統最顯著的病變，并且與癡呆的嚴重性相關。目前的治療藥物以膽堿酯酶抑制劑為首選。乙酰膽堿酯酶的功能是水解乙酰膽堿，使其失活，進而影響神經突觸的正常生理功能。膽堿酯酶抑制劑可延緩乙酰膽堿的水解，提高乙酰膽堿在突觸間隙的含量，從而保持中樞神經突觸的正常生理功能，產生治療效果。但目前常用的篩選方法是，用從大鼠大腦皮層中分離得到的乙酰膽堿酯酶(AChE)作為篩選模型，加入試樣化合物，再用Ellman′s試劑進行顯色，通過比色法進行比較，由此求得乙酰膽堿酯酶抑制活性(例如，可參見中國發明專利申請說明書第1417209號)。
然而，比色測定法的缺點是，需用較多的酶量，而且，顯色容易受到干擾。

發明內容
本發明的目的是，是尋找一種快捷簡便、不易受干擾的篩選乙酰膽堿脂酶抑制劑的方法。
本發明的乙酰膽堿酯酶抑制劑的篩選方法采用核磁共振的手段，通過觀察試樣化合物分子與乙酰膽堿酯酶的結合狀態來篩選有效的乙酰膽堿酯酶抑制劑。
即，本發明是在下述實驗的基礎上完成的在作為底物的試樣化合物的溶液中加乙酰膽堿酯酶，觀察加入乙酰膽堿酯酶前后的試樣化合物質子的弛豫性質的變化，如底物分子與酶結合，則底物質子的選擇性弛豫速率變快，同時，通過雙照射方法測得底物分子的相關運動時間變長；如底物分子與酶未發生結合，則底物的質子在加酶前后的核磁共振性質無明顯變化。
因此，本發明提供這樣一種篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法，它通過測定作為底物的試樣化合物在加入乙酰膽堿酯酶前后的弛豫速率，確定選擇性弛豫速率變快的試樣化合物為乙酰膽堿酯酶抑制劑。
在上述方法中，所述測定方法可采用翻轉恢復法。即應用180度脈沖使要觀察的質子磁矢量翻轉，在不同的等待時間以后觀測磁矢量的恢復程度，根據磁矢量的恢復時間來判斷磁豫速率。
質子的非選擇性自旋晶格速率(以下簡稱弛速)Rns為同時照射分子中所有質子時各質子的弛豫速率。質子的選擇性自旋晶格速率Rs為照射分子中特定質子時該質子的弛豫速率。Rns和Rs滿足以下的等式Rins=Σj≠iρij+Σj≠iσij+ρi*...(1)]]>Ris=Σj≠iρij+ρi*...(2)]]>在等式〔1〕、〔2〕中，ρij為Hi質子被照射后將能量交給其相互偶極的其它質子時對弛豫速率的貢獻。σij為相互偶極的兩質子同時被照射后相互影響對弛豫速率的貢獻，ρi*為其它弛豫機制對Hi弛豫速率的影響。比較〔1〕、〔2〕可看出，〔2〕式中，Rs由于只照射Hi質子，所以無其它被照射質子對Hi的影響項σij。
為進一步檢測石杉堿甲與電鰩乙酰膽堿酯酶TnAChE分子間的相互作用，我們應用雙照射的方法測定了分子的相關運動時間。從等式〔1〕、〔2〕可知，質子間的交叉弛速σij＝Riij-Ris，Riij為同時照射Hi及與其偶合的質子Hj時測得的Hi質子的馳速。Rs為照射分子中單獨照射Hi時該質子的弛豫速率。當酶與底物相互結合、存在一動態平衡體系時，下列等式(3)和(4)成立 σobsij=pfreeσfreeij+pboundσboundij...(4)]]>式中，pfree為溶液中未結合酶的底物比率，pbound為結合酶的底物的比率，σfreeij為未加酶時觀察到的交叉馳豫速率，σboundij為計算得到的純酶結合狀態下的交叉馳豫速率。
當以最保守的方法考慮σboundij與σfreeij，即設定酶與底物發生了完全的結合，則pbound＝〔蛋白質〕/〔配位體〕，pfree＝1-pbound。再根據等式〔4〕計算出σboundij的值，應用分子運動相關時間τboundij與σboundij間的關系等式〔5〕，可得出底物與酶結合后的分子相關運動時間。
式中，σboundij為計算得到的純酶結合狀態下的交叉馳豫速率，σboundij為計算得到的純酶結合狀態下的交叉馳豫速率，σfreeij為未加酶時觀察到的交叉馳豫速率，Pbound為結合酶的底物的比率，γ是質子的磁旋比值， 是Plank’s常數的修正值， rij是質子Hi和Hj間的距離，為Hi和Hj運動相關時間，ω是質子的Larmor頻率。
在本發明的方法中，可根據加入乙酰膽堿酯酶后底物的質子選擇性白旋晶格速率Rs的增量是否大于其非選擇性自旋晶格速率Rns的增量來確定有效的乙酰膽堿酯酶抑制劑。
另外，在本發明的方法中，可根據加入乙酰膽堿酯酶時底物的質子選擇性自旋晶格速率Rs大于加入丁酰膽堿酯酶時的質子選擇性自旋晶格速率Rs來確定有效的乙酰膽堿酯酶抑制劑。
此外，在本發明的方法中，還可以根據加入乙酰膽堿酯酶后底物的分子相關運動時間ωτ是否變長來確定有效的乙酰膽堿酯酶抑制劑。
所述分子相關運動時間ωτ變長例如是從小于1轉化為大于1。
該方法的優點是1，簡便快速將待測樣品與酶放在一起，直接應用核磁共振儀測試，10分鐘內可看到明顯結果。無需苛刻的測試條件和試劑等。2，實時性因酶溶解在體內環境的緩沖液中進行與待測分子的結合觀察，因而此方法可檢測酶在生物環境、溶液狀態下與底物的結合。3，可一次篩選多個成分與酶結合的情況，根據各成分加酶前后的核磁共振信號的改變情況，找出與酶結合的分子。
具體實施例方式
石杉堿甲是由我國科學家首先從中草藥蛇足石杉中分離得到的一種天然產物，經測定，是乙酰膽堿酯酶的可逆抑制劑，具有選擇性高、毒性低和藥效時間長等特點，是目前為止國際上治療老年癡呆較為理想的候選藥物。
在本發明中，本發明者以石杉堿甲、同樣從蛇足石杉中分離得到的生物堿石杉堿乙和8-羥基馬尾杉堿乙作為試樣化合物。
石杉堿甲 石杉堿乙 8-羥基馬尾杉堿乙實施例1分析試樣的制備和測試石杉堿甲、石杉堿乙和8-羥基馬尾杉堿乙系從藥用植物千層塔中提取獲得，用HPLC提純，純度均在99％以上。
所用的乙酰膽堿酯酶為中國丁氏雙鰭電鰩乙酰膽堿酯酶，由電鰩電器官經親和層析方法分離純化獲得，其分解乙酰膽堿活性通過比色法測定。
丁酰膽堿酯酶購于Sigma公司。
所用分析試劑皆為分析純。
試樣配制將石杉堿甲溶于20-100mM pH7.0的重水磷酸鹽緩沖液中，再加入含乙酰膽堿酯酶的50mM pH7.0重水磷酸鹽緩沖液，配制成含石杉堿甲1μmol/ml+乙酰膽堿酯酶5×10-3μmol/ml的加酶試樣。另外，用不含乙酰膽堿酯酶的50mM pH7.0重水磷酸鹽緩沖液代替上述酶液作為空白對照，使未加酶試樣含石杉堿甲1μmol/ml。
用同樣的方法配制石杉堿乙和8-羥基馬尾杉堿乙的分析試樣。
NMR分析所有實驗在美國Varian公司的Varian Inova 600NMR譜儀上以298K進行。化學位移用DSS(4，4-二甲基-4-硅雜戊磺酸鈉)定標。質子的弛豫時間應用翻轉恢復法測定(是最有效、最簡便的方法。弛豫速率通過指數方程求得。
實施例2底物測定濃度的確定底物分子在溶液中的聚合狀態的不同可引起化學位移的改變，同時聚合狀態也會影響底物中質子的弛豫時間，從而影響到加酶后的弛豫速率的測定。
為此，需要測量未加酶時不同濃度下底物分子的化學位移，以確定底物聚合狀態。通過觀察0.2～30.0mM范圍內的石杉堿甲的H3質子化學位移變化(圖2)，發現隨濃度的增高，H3質子的化學位移向高場位移。說明有聚集態的發生，但在≤1mM濃度下，分子以單聚態存在。故確定在≤1mM的濃度下測定石杉堿甲的弛豫速率，以使測得的弛豫速率不受分子聚合狀態的影響。對石杉堿乙和8-羥基馬尾杉堿乙也在同樣條件下測定。
實施例3底物分子運動速率的測定質子的非選擇性自旋晶格速率(以下簡稱弛速)Rns為同時照射分子中所有質子時各質子的弛豫速率。質子的選擇性自旋晶格速率Rs為照射分子中特定質子時該質子的弛豫速率。Rns和Rs滿足以下的等式Rins=Σj≠iρij+Σj≠iσij+ρi*...(1)]]>Ris=Σj≠iρij+ρi*...(2)]]>在等式〔1〕、〔2〕中，ρij為Hi質子被照射后將能量交給其相互偶極的其它質子時對弛豫速率的貢獻。σij為相互偶極的兩質子同時被照射后相互影響對弛豫速率的貢獻，ρi*為其它弛豫機制對Hi弛豫速率的影響。比較〔1〕、〔2〕可看出，〔2〕式中，Rs由于只照射Hi質子，所以無其它被照射質子對Hi的影響項σij。
在本實施例中，我們觀察了石杉堿甲、石杉堿乙與乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶結合時石杉堿甲、石杉堿乙中的H2，H3，H7/H8，M10和M16質子的弛豫速率。其它質子由于化學位移相互重疊(如H8、H11)或為多重峰型(如H6，H14同碳質子為AB系統峰型)，無法選擇合適的180度軟脈沖照射而忽略。被測質子的弛速值示于表1、2中。實驗結果表明，加酶前后，質子化學位移無明顯變化，即，質子化學位移未受加酶的影響(具體數據未示出)，但幾乎所有質子的弛豫速率在加酶后得到增強。而且，Rs增強明顯大于Rns。這是因為當小分子與大分子結合后，σij值往往為負值，使得由ρij帶來的弛速增強被抵消所致。Rs明顯增強說明底物石杉堿甲、石杉堿乙均與酶發生了結合。Rs的影響順序為H7＝H3＞H2＞M16＞M10，顯示石杉堿甲、石杉堿乙中的不飽和羰基共軛環部分與蛋白作用強。比較石杉堿甲、石杉堿乙分別與乙酰膽堿酯酶、丁酰膽堿酯酶結合時的Rs，可以發現，石杉堿甲、石杉堿乙與乙酰膽堿酯酶結合的Rs值普遍大于石杉堿甲、石杉堿乙與丁酰膽堿酯酶結合的Rs值，說明石杉堿甲、石杉堿乙與乙酰膽堿酯酶的結合強度較大。
實施例4交叉弛豫速率和分子相關運動時間的測定為進一步檢測石杉堿甲與電鰩乙酰膽堿酯酶TnAChE分子間的相互作用，我們應用雙照射的方法測定了分子的相關運動時間。從等式〔1〕、〔2〕可知，質子間的交叉弛速σij＝Riij-Ris，Riij為同時照射Hi及與其偶合的質子Hi時測得的Hj質子的馳速。Rs為照射分子中單獨照射Hi時該質子的弛豫速率。當酶與底物相互結合、存在一動態平衡體系時，下列等式(3)和(4)成立 σobsij=pfreeσfreeij+pboundσboundij...(4)]]>式中，pfree為溶液中未結合酶的底物比率，pbound為結合酶的底物的比率，σfreeij為未加酶時觀察到的交叉馳豫速率，σboundij為計算得到的純酶結合狀態下的交叉馳豫速率。
當以最保守的方法考慮σboundij與σfreeij，即設定酶與底物發生了完全的結合，則pbound＝〔蛋白質〕/〔配位體〕，pfree＝1-pbound。再根據等式〔4〕計算出σboundij的值，應用分子運動相關時間τboundij與σboundij間的關系等式〔5〕，可得出底物與酶結合后的分子相關運動時間。
式中，σboundij為計算得到的純酶結合狀態下的交叉馳豫速率，σboundij為計算得到的純酶結合狀態下的交叉馳豫速率，σfreeij為未加酶時觀察到的交叉馳豫速率，pbound為結合酶的底物的比率，γ是質子的磁旋比值， 是Plank’s常數的修正值， rij是質子Hi和Hj間的距離，為Hi和Hj運動相關時間，ω是質子的Larmor頻率。本試驗中，我們對石杉堿甲相鄰的三組質子(H2-H3，H7-H8，H10-H11)進行了雙照射試驗，結果見表3，其中，交叉馳豫速率變量Δσij為σobsij與σfreeij為二者的差值。可以看出，交叉馳豫速率σij從未結合狀態下一個較小的正值轉變為結合狀態下的一個較大的負值，說明石杉堿甲與TnAChE結合后其分子運動相關速率減慢，使得ωτ即單位時間下的運動相關時間從小于1轉化為大于1，這里我們用H2-H3質子作為參考來計算分子運動相關時間，σbound23=-11.2s-1,]]>根據等式[5]，計算得τbound23=40.5]]>毫微秒(ns)，與未結合態相比〔τ一般在微微秒(ps)范圍內〕，說明石杉堿甲與TnAChE發生了結合。
比較例1陰性對照試驗當生物小分子粘附于蛋白表面，而非結合于蛋白的活性位點時，受蛋白的影響，同樣可造成小分子的運動性發生一定的改變從而影響小分子的弛豫性質。為了觀察石杉堿甲是否真正地結合于蛋白的活性位點，排除由于粘附現象引起的弛豫性質改變的假象，我們觀察了同樣從千層塔中分得的另一個與石杉堿甲分子大小相似但結構不同的生物堿-8-羥基馬尾杉堿乙在加電鰩乙酰膽堿酯酶前后的質子弛豫時間的改變。應用與上述同樣的實驗方法，結果顯示，加入TnAChE前后，8-羥基馬尾杉堿乙的7H，16Me的弛豫性質末發生改變，8-羥基馬尾杉堿乙未與TnAChE結合時，7H的Rs＝1.211±0.052s-1，16Me的Rs＝1.584±0.064s-1，8-羥基馬尾杉堿乙與TnAChE結合后，7H的Rs＝1.119±0.0346s-1，16Me的Rs＝1.546±0.076s-1，比較結合前后結果無顯著差異。說明8-羥基馬尾杉堿乙未同TnAChE發生結合。
表1.在有或無TnAChE(5μM)和丁酰膽堿酯酶(5μM)的存在下測得的石杉堿甲(1mM)的1H NMR P參數(600MHz，溶劑D2O，pH 7.0，T＝298K)

表2.在有或無TnAChE(5μM)和丁酰膽堿酯酶(5μM)的存在下測得的石杉堿乙(1mM)的1H NMR P參數(600MHz，溶劑D2O，pH 7.0，T＝298K)

表3.在有或無乙酰膽堿酯酶(5μM)的存在下測得的石杉堿甲(1mM)的1H NMR交叉弛豫速率和分子相關運動時間(600MHz，溶劑D2O，pH 7.0，T＝298K)

權利要求
1.一種利用核磁共振篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法，其特征在于，它通過測定作為底物的試樣化合物的溶液中，加入乙酰膽堿酯酶，使乙酰膽堿酶前后的弛豫速率改變，測定底物分子運動速率、交叉馳豫速率、分子相關運動時間，確定選擇性弛豫速率變快的試樣化合物為乙酰膽堿酯酶抑制劑。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，作為底物的試樣化合物的溶液為50μMPH＝7.0的重水磷酸鹽緩沖液濃度20～100mM。
3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，加入乙酰膽堿脂酶到底物的試樣化合物的溶液前，測量未加酶時不同濃度下底物分子的化學位移，確定底物聚合狀態。
4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述測定方法是翻轉恢復法。
5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，加入乙酰膽堿酯酶后，所述乙酰膽堿酯酶抑制劑的質子選擇性自旋晶格速率Rs的增量大于其非選擇性自旋晶格速率Rns的增量。
6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，加入乙酰膽堿酯酶時，所述乙酰膽堿酯酶抑制劑的質子選擇性自旋晶格速率Rs大于加入丁酰膽堿酯酶時的質子選擇性自旋晶格速率Rs。
7根據權利要求1所述的方法，其特征在于，加入乙酰膽堿酯酶后，所述乙酰膽堿酯酶抑制劑用雙照射方法測得的分子相關運動時間ωτ變長。
8.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，所述ωτ從小于1轉化為大于1。
全文摘要
本發明提供一種篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法，它通過測定作為底物的試樣化合物在加入乙酰膽堿酯酶前后的弛豫速率，確定選擇性弛豫速率變快的試樣化合物為乙酰膽堿酯酶抑制劑。即，在作為底物的試樣化合物的溶液中加乙酰膽堿酯酶，觀察加入乙酰膽堿酯酶前后的試樣化合物質子的弛豫性質的變化，如底物分子與酶結合，則底物質子的選擇性弛豫速率變快。同時，用雙照射方法可以測得底物分子的相關運動時間變長；如底物分子與酶未發生結合，則底物的質子在加酶前后的核磁共振性質無明顯變化。使用本發明的方法，可以快捷簡便、只需極少量乙酰膽堿酯酶且不易受干擾地從大量天然產物分子中篩選有效的乙酰膽堿酯酶抑制劑。
文檔編號A61P25/28GK1808106SQ200510023500
公開日2006年7月26日 申請日期2005年1月21日 優先權日2005年1月21日
發明者李醫明, 蔣山好, 朱大元, 杜為紅, 黃才國 申請人:中國科學院上海藥物研究所