防治齲病的五倍子藥物及其提取方法

專利名稱：防治齲病的五倍子藥物及其提取方法
技術領域：
本發明涉及一種防治齲病的五倍子藥物及其提取方法，屬于中藥制備領域。
背景技術：
齲病是發生在牙體硬組織上的細菌感染性疾病，是人類口腔的常見病、多發病。多年來研究者們一直試圖通過藥物來控制或預防齲病。早期采用的抗生素類如青霉素、紅霉素、四環素及螺旋霉素等，雖具有一定的防齲效果，但長期使用可引起口腔及腸道菌群失調而導致其他疾病。氟化物防齲是研究最多且廣為認可的方法，但其應用有諸多局限性，如氟濃度的穩定性保證，氟毒副作用的防止以及口腔耐氟菌株選擇性生長等方面的問題尚未解決。齲病病因的現代觀點認為齲病的致病菌均為口腔正常菌群，齲病在本質上是菌群生態失衡性疾病。因此，尋找一種使用安全，能有效調理口腔菌群平衡的藥物成為防齲研究的重點，防齲天然藥物的研究受到了眾多學者的關注。
對天然防齲藥物的研究具有鮮明的地域特征。根據全球各地不同的地理環境與國情，不同的國家和地區都有著各具代表性的天然藥物，如非洲與中東的榆綠木、斑鳩菊及胡桃木；拉美國家的血根草、可可果；東南亞的檳榔；澳洲的的桉葉；中國和日本則對中藥及和藥中防齲成分進行研究(Jagtap AG，Karkera SG.Extractof Juglandaceae regia inhibits growth，in-vitro adherence，acid production and aggregation ofStreptococcus mutans.J Pharm Pharmacol.2000 Feb；52(2)235-242)。根據我國藥典的記載，五倍子，黃芩等多種天然藥物都具有較強的抗菌作用，古籍中也多有以蜂房等藥物應用于牙病治療的記錄。近代很多研究也初步證明，大黃、五倍子、厚樸等中藥能抑制變形鏈球菌等口腔致齲菌的生長和產酸，還能抑制葡糖基轉移酶的活性，減少水不溶性葡聚糖的合成。
在防齲天然藥物的研究中，五倍子受到了廣泛的關注。五倍子(GallaChinesis)，別名文蛤、百蟲倉、木附子等，為倍蚜科昆蟲角倍蚜Melaphischinesis(Bell.)Bake或蛋倍蚜M.peitan Tsai et Tang寄生在漆樹科植物鹽膚木、青麩楊或紅麩楊等樹上形成的干燥蟲癭，始載于《開寶本草》，具有斂肺降火、澀腸止瀉、固精縮尿、止汗、止血、解毒、斂瘡等多種臨床功效，以它為原料的各種化工產品被廣泛應用于醫藥、冶金、食品、航天等領域。五倍子的主要成分為水解性鞣質與沒食子鞣酸。研究表明，鞣質可抑制口腔中變形鏈球菌、粘性放線菌、唾液鏈球菌等多種細菌的生長，可降低牙菌斑的聚集，抑制葡糖基轉移酶活性，影響致齲菌生長代謝(黃正蔚，周學東，肖悅等.部分天然藥物對內氏放線菌生長和產酸影響的體外研究.牙體牙髓牙周病學雜志.2002；12(1)4-7；黃正蔚，周學東，李繼遙等.中藥影響變形鏈球菌對唾液獲得性膜粘附的研究.四川大學學報(醫學版).2003；34(1)135-137)。沒食子鞣酸能通過抑制細菌產生水不溶性胞外多糖的關鍵酶——葡糖基轉移酶(GTF)的活性，在菌斑形成的早期即可有效的減少粘附在牙齒表面的細菌數量，并通過細菌間的相互聚集而從口腔中清除。近年來國內學者研究證明，五倍子具有抑制變鏈菌、遠緣鏈球菌、血液鏈球菌等齲病相關細菌生長、產酸、粘附的能力，且能提高釉質的抗酸蝕性，并通過動物實驗證實了其對齲病進展的抑制作用(熊炎斌，李德玲，劉持平等.幾種植物藥對變形鏈球菌生長、產酸、粘附影響的體外實驗.中華口腔醫學雜志.1997；32(5)261)。
綜上，天然藥物五倍子在防齲方面已受到了廣泛的關注。但由于在這些研究中采用的藥物多為簡單的湯、丸、散、膏等粗糙劑型，其中所含的藥物成分種類繁多，結構復雜，機理未明；且現有的研究結果不夠系統深入，缺乏對比，手段簡單，難以得到國際的認可與廣泛推廣。因此本研究立足于五倍子防齲的系統性、有效性、對比性，采用先進的口腔生物膜模型，對五倍子的防齲功效進行了系統研究。

發明內容
本發明的目的是針對現有技術的不足而提供一種防治齲病的五倍子藥物，通過調節口腔生態平衡，恢復口腔生態的生理性組合而達到防齲的目的。
本發明的目的由以下技術措施實現，其中所述原料份數除特殊說明外，均為重量份數。
防治齲病的五倍子藥物的配方組分含有五倍子提取物0.5-12.5份，輔料1-100份，溶劑1-1000份。
輔料為十二烷基硫酸鈉、甜菊糖、薄荷腦、磷酸氫二水合物、二氧化硅顆粒、山梨醇、羧甲基纖維素、甘油、吐溫、月桂氮綽酮中至少一種。
溶劑為乙醇、聚乙二醇、聚乙烯醇、蒸餾水中至少一種。
五倍子藥物的提取方法將五倍子原藥Rhus chinesis Mill.100重量份，粉碎，加入蒸餾水40-1200重量份的燒瓶中，于溫度20±5℃浸漬20-34小時，其間在溫度20±5℃超聲波提取4次，每次1小時，超聲波輸出功率為400-1200W，頻率為2×104-109Hz，過濾，濾液減壓濃縮至固體物，即五倍子提取物。
1.五倍子防齲作用的體外實驗(1)4個體外的系列實驗實驗菌株變形鏈球菌Streptococcus mutans R9，血鏈球菌Streptococcus sanguis SB 179唾液鏈球菌Streptococcus salivarius SS 196，內氏放線菌Actinomyces naeslundii WVU 627粘性放線菌Actinomyces viscosus ATCC 19246以上菌株均由華西口腔醫學院口腔生物醫學工程重點實驗室微生物室提供。
本部分包括(A)五倍子對口腔細菌生長的影響。(B)五倍子對口腔細菌產酸的影響。
(C)五倍子對口腔細菌產胞外多糖的影響。(D)五倍子對口腔細菌在唾液獲得性膜粘附的影響。
(2)生物模型中五倍子提取物防齲作用的綜合評估實驗菌株同前培養條件發酵罐培養條件溫度37℃由循環水浴箱維持；攪拌低速，由磁力攪拌器控制，以使發酵罐中菌懸液混勻；厭氧環境95％N2，5％CO2，流速10ml/min，由蠕動泵控制；pH用0.1N NaOH溶液維持在7.0左右，由pH控制儀與蠕動泵調節；清除率D＝0.1/h由蠕動泵控制。
恒流培養室培養條件溫度37℃由恒溫培養箱維持；循環60ml/min，由蠕動泵控制；清除率D＝0.75/h由蠕動泵控制；
蔗糖(以蒸餾水作對照)每12小時給予1次，每次10ml，使其達到一定終濃度，由蠕動泵及分配器控制。
實驗流程模型裝置無菌連接完成后，向其中的發酵罐內接種實驗菌株混合連續培養，由pH控制儀維持其pH的平衡，恒速加入人工唾液培養基BM-5，作為實驗菌的主要營養來源。待各菌生長穩定后(連續兩日培養液比濁與活菌計數無顯著性差異)；由蠕動泵將發酵罐中的菌懸液引入各個并聯的恒流培養室中，并持續加入BM培養基，介導在羥磷灰石片上形成實驗生物膜。根據實驗目的的不同可通過向其中定時加入不同的藥物溶液，以觀察對實驗生物膜的影響。
實驗結果示例五倍子對實驗生物膜影響的研究A實驗分組當恒流培養室中細菌生長穩定后，每12小時加樣1次，每次10ml，使其達到一定終濃度，由蠕動泵及分配器控制。根據對恒流培養室中加樣的不同，分為以下各組陽性對照組250mM蔗糖溶液，培養室中的終濃度約為25mM。
陰性對照組不含任何糖類的蒸餾水作為空白對照。
實驗組含4mg/ml的五倍子提取物的250mM蔗糖溶液。
B連續培養中pH的動態變化如圖5所示，如圖53所示，在6次定時加藥的過程中，陰性對照組由于加入的為蒸餾水，因此其pH并未見明顯的波動。在陽性對照組與實驗組中，加入終濃度約10mM的蔗糖溶液，在加藥初期，其pH可見明顯下降，但4-5小時后，隨著代謝產物的逐步清除，其pH值逐步恢復到正常范圍。實驗組pH的下降與陽性對照組相比未見明顯抑制。
C實驗生物膜的活菌計數圖6、7可見，隨著6次蔗糖溶液的每12小時定時加入，實驗生物膜上變形鏈球菌，血鏈球菌及內氏放線菌的活菌計數與陰性對照組(蒸餾水加入組)相比多有明顯的增長(P＜0.05)。五倍子對內氏放線菌在生物膜上的生長，與蔗糖組相比有著顯著的抑制表現(P＜0.05)。
在圖4中，可以發現對于不同實驗菌盡管其在生物膜附著數量上有著一定的差異，但在其構成上未見有顯著變化。
D實驗生物膜的掃描電鏡觀察在對實驗生物膜的掃描電鏡觀察中可見陽性對照組中，大量胞外多糖的存在使之呈絨毛樣表現，而在陰性對照組中，各菌細胞間界限清晰，胞外基質較少。含五倍子溶液的蔗糖加入組所成圖像則介于兩者之間。(圖略)E結果討論由此實驗可見，隨著蔗糖溶液的定時補充，羥磷灰石片上生物膜胞外基質明顯增多，細菌間結合更為緊密，而各菌數量上也有明顯的增多，這從另一個方面驗證了菌斑致齲化假說，即隨著碳水化合物的大量攝入，成熟菌斑中酸性代謝產物大量累積，長期處于低pH環境下，各致齲菌的量會有顯著增加，產酸進一步增多，從而使正常菌斑向致齲性菌斑轉變。但五倍子粗提取物溶液的加入，則可顯著減少變形鏈球菌在羥磷灰石片上粘附的量，在掃描電鏡的觀察中也表現出胞外基質的減少，提示五倍子溶液的加入可能對菌斑的致齲化轉變有一定的抑制作用。
2.天然藥物五倍子提取物防齲的動物實驗研究本實驗以48只25天鼠齡的Sparague-Dawley大鼠為研究對象，分為四組0.5mg/ml五倍子提取物，0.2％氟化鈉，0.5mg/ml五倍子提取物加0.2％氟化鈉，蒸餾水。大鼠口腔感染遠緣鏈球菌后，每組分別用上述藥液連續處理牙面57天，每天2次。實驗期間伺以致齲飼料2000#，實驗結束時收集大鼠唾液，檢測變形鏈球菌水平，并根據Keyes氏方法對磨牙齲計分分析。
結果表明，0.5mg/ml五倍子提取物組，0.5mg/ml五倍子提取物加0.2％氟化鈉組唾液變形鏈球菌水平顯著低于0.2％氟化鈉組和蒸餾水組(P＜0.01)。鼠磨牙齲齒計分分析，0.5mg/ml五倍子提取物組，0.2％氟化鈉組齲損較蒸餾水組輕，有顯著性差異(P＜0.01)，而0.5mg/ml五倍子提取物加0.2％氟化鈉組的齲損最輕，與各組都有顯著性差異(P＜0.05)。
實驗結果提示，五倍子提取物能顯著抑制變形鏈球菌的生長，有效降低大鼠齲病的發生，而且五倍子提取物與氟聯合使用有協同防齲的作用。
3.天然藥物五倍子提取物防齲的臨床試驗研究選用30位志愿者進行短期試驗，試驗前潔牙，試驗時停止口腔衛生措施，分別用蒸餾水組、0.2％洗必太、0.2％氟化鈉、0.5mg/ml五倍子提取物、0.5mg/ml五倍子提取物加0.2％氟化鈉混合液漱口，三天后記錄菌斑指數(PI).結果發現，用0.5mg/ml五倍子提取物組和0.5mg/ml五倍子提取物加0.2％氟化鈉組漱口后，PI值明顯低于蒸餾水組(P＜0.01)，此外，0.5mg/ml五倍子提取物加0.2％氟化鈉組的PI值比0.5mg/ml五倍子提取物組下降了15％(P＜0.01)。這顯示0.5mg/ml五倍子提取物能夠有效去除菌斑，而且與氟化物有協同作用。
通過系統的體內、體外研究，評估了五倍子的防齲效果和效能，表明五倍子提取物能夠調節牙菌斑生態平衡，促進牙體硬組織生物礦化，獲得防齲中藥的配方。研究結果推廣應用，將取得巨大的社會效益和經濟效益，具有廣闊的市場應用前景。
四

圖1五倍子對血鏈球菌的產酸抑制作用圖2五倍子對唾液鏈球菌的產酸抑制作用圖3五倍子對內氏放線菌的產酸抑制作用圖4五倍子對變形鏈球菌產水不溶性胞外多糖的影響圖5連續培養中的pH反應曲線圖6羥磷灰石片上生物膜活菌記數圖7對照組(A)與實驗組(B)中生物膜各實驗菌的構成比五具體實施方式
下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只用于對本發明進行進一步說明，但不能理解為對本發明保護范圍的限制，該領域的技術熟練人員可以根據上述本發明的內容作出一些非本質的改進和調整。
實施例五倍子藥物的提取五倍子的主要化學成分為五倍子鞣質，含量約為60％～70％，尚含有沒食子酸、脂肪、樹脂及蠟質等，因此我們采用了不會影響鞣質穩定性的水作為提取溶質。具體的提取方法如下將五倍子原藥Rhus chinesis Mill.100重量份，粉碎，加入蒸餾水1000重量份的燒瓶中，于溫度20±5℃浸漬28小時，其間在溫度20±5℃超聲波提取4次，每次1小時，超聲波輸出功率為400-1200W，頻率為2×104-109Hz，過濾，濾液減壓濃縮至固體物，即五倍子提取物。
1、五倍子含漱液1配方五倍子提取物 0.5g輔料薄荷腦2g，甜菊糖6g溶劑乙醇10g以及蒸餾水余量共制成1000ml用法含漱，每日三次2、五倍子含漱液2配方五倍子提取物 1g輔料薄荷腦2g，甜菊糖6g溶劑乙醇10g以及蒸餾水余量共制成1000ml3、五倍子含漱液3配方五倍子提取物 1.5g輔料薄荷腦2g，甜菊糖6g溶劑乙醇10g以及蒸餾水余量共制成1000ml用法含漱，每日三次4、五倍子含漱液4配方五倍子提取物 2.5g輔料薄荷腦2g，甜菊糖6g溶劑乙醇10g以及蒸餾水余量共制成1000ml
5、五倍子漱口片配方五倍子提取物 12.5g輔料薄荷腦5g，甜菊糖100g溶劑十二烷基硫酸鈉15g共制成1000片用法將一片溶于250ml水中含漱，每日2次6.五倍子凝膠1配方五倍子提取物 0.5g輔料甜菊糖6g，溶劑聚乙烯醇124 20g，聚乙二醇400 50g，蒸餾水余量共制成1000ml用法涂于牙表面，每日二次7.五倍子凝膠2配方五倍子提取物1g輔料甜菊糖6g，溶劑聚乙烯醇124 20g，聚乙二醇400 50g，蒸餾水余量共制成1000ml用法涂于牙表面，每日二次8、五倍子凝膠3配方五倍子提取物1.5g輔料甜菊糖6g，溶劑聚乙烯醇124 20g，聚乙二醇400 50g，蒸餾水余量共制成1000ml用法涂于牙表面，每日二次9、五倍子凝膠4
配方五倍子提取物3g輔料甜菊糖6g，溶劑聚乙烯醇124 20g，聚乙二醇400 50g，蒸餾水余量共制成1000ml用法涂于牙表面，每日二次10、五倍子口香糖配方五倍子提取物12.5g輔料甜菊糖80g，適量軟化劑，適量口香糖基溶劑聚乙烯醇124 15g共制成1000片用法口內咀嚼，每日二次11、五倍子牙膏1配方五倍子提取物0.5g輔料磷酸氫二水合物45g，二氧化硅顆粒2g，山梨醇10g，羧甲基纖維素1g，甘油10g，蒸餾水余量共制成100g用法刷牙，每日兩次13、五倍子牙膏2配方五倍子提取物1.5g輔料磷酸氫二水合物45g，二氧化硅顆粒2g，山梨醇10g，羧甲基纖維素1g，甘油10g，蒸餾水余量共制成100g用法刷牙，每日兩次14、五倍子牙膏3配方五倍子提取物2g
輔料磷酸氫二水合物45g，二氧化硅顆粒2g，山梨醇10g，羧甲基纖維素1g，甘油10g，蒸餾水余量共制成100g用法刷牙，每日兩次15.五倍子噴霧劑配方五倍子提取物1.5g溶劑蒸餾水1000ml用法噴于牙面，每日二次16.五倍子膠漿劑1配方五倍子提取物0.5g輔料甘油100ml溶劑聚乙烯醇(17～88)40g，蒸餾水余量共制成1000ml用法含漱，每日二次16、五倍子膠漿劑2配方五倍子提取物1.5g輔料甘油100ml溶劑聚乙烯醇(17～88)40g，蒸餾水余量共制成1000ml用法含漱，每日二次17.五倍子涂膜劑1配方五倍子提取物0.5g輔料吐溫80 1g，甘油10ml，月桂氮綽酮2g溶劑聚乙烯醇(17～88)5g，蒸餾水余量共制成1000ml用法涂于牙面，每日二次
18、五倍子涂膜劑2配方五倍子提取物2.5g輔料吐溫80 1g，甘油10ml，月桂氮綽酮2g溶劑聚乙烯醇(17～88)5g，蒸餾水余量共制成1000ml用法涂于牙面，每日二次用法涂于牙面，每日二次通過以上研究表明，天然藥物五倍子具有肯定的抗齲作用，可望作為含片、口香糖、凝膠、漱口水、牙膏等防齲制劑，是一種具有開發價值的天然防齲藥物。
表1五倍子粗提物對4種細菌生長的最低抑制濃度(mg/ml)

表2細菌對經Galla Chinensis處理的S-HA的粘附CPM值與其粘附抑制率(％)

*indicate that the CPM data of experiment group is siginificantly different from thatof positive control group(P＜0.05).
表3經各粗提物處理的細菌對SHA的CPM值與其粘附抑制率(％)

*indicate that the CPM data of experiment group is siginificantly different from thatof positive control group(P＜0.05).
權利要求
1.防治齲病的五倍子藥物，其特征在于該五倍子藥物的配方組分按重量計為五倍子提取物0.5-12.5份，輔料1-100份，溶劑1-1000份。
2.如權利要求1所述防治齲病的五倍子藥物，其特征在于輔料為十二烷基硫酸鈉、甜菊糖、薄荷腦、磷酸氫二水合物、二氧化硅顆粒、山梨醇、羧甲基纖維素、甘油、吐溫、月桂氮綽酮中的至少一種
3.如權利要求1所述防治齲病的五倍子藥物，其特征在于溶劑為乙醇、聚乙二醇、聚乙烯醇、蒸餾水中的至少一種。
4.如權利要求1所述防治齲病的五倍子藥物的提取方法，其特征在于該方法含有以下步驟將五倍子原藥Rhus chinesis Mill.100重量份，粉碎，加入蒸餾水40-1200重量份的燒瓶中，于溫度20±5℃浸漬20-34小時，其間在溫度20±5℃超聲波提取4次，每次1小時，超聲波輸出功率為400-1200W，頻率為2×104-109Hz，過濾，濾液減壓濃縮至固體物，即五倍子提取物。
5.如權利要求1所述防治齲病的五倍子藥物的用途，其特征在于該藥物用于防治齲病。
全文摘要
一種防治齲病的五倍子藥物及其提取方法，其特點是將五倍子原藥Rhuschi nesis Mill100重量份，粉碎，加入蒸餾水40－1200重量份的燒瓶中，于溫度20±5℃浸漬20－34小時，其間在溫度20±5℃超聲波提取4次，每次1小時，超聲波輸出功率為400－1200W，頻率為2×10
文檔編號A61P1/00GK1810259SQ200510021968
公開日2006年8月2日 申請日期2005年10月31日 優先權日2005年10月31日
發明者周學東, 謝倩, 左渝陵, 李繼遙, 黃正蔚 申請人:四川大學