專利名稱：新型豬白細胞介素2和6基因表達質粒抗感染制劑的應用技術的制作方法
技術領域：
1.生物技術 2.分子免疫學背景技術白細胞介素-2(Interleuki-2，IL-2)是輔助T細胞分泌的淋巴因子，在動物細胞和體液免疫調節中起樞紐性的關鍵作用，(1)可刺激T淋巴細胞的增殖，維持完整免疫系統發育成熟和激活T和B細胞的關鍵性免疫分子，增強細胞毒T細胞的殺傷活性；(2)IL-2還通過誘導促進天然殺傷(NK)細胞和淋巴因子活化的殺傷細胞(LAK)生長，參與破壞腫瘤的過程。IL-2亦能增強自然殺傷細胞(NK細胞)活性，靜止NK細胞上只表達IL-2R的β鏈和γ鏈，對IL-2的親和力低，只能對高濃度的IL-2發生反應。一旦NK細胞活化，就表達IL-2R的α鏈，成為高親和力的受體；大劑量IL-2誘導的LAK活性主要來源于NK細胞，使T細胞和NK細胞產生IFNγ、TNFβ和TGFβ等因子，促進非特異性細胞毒性；激活腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)以及產生淋巴因子活化的殺傷細胞(LAK)；(3)促進B細胞的激活、增殖、分化及成熟、產生與分泌免疫球蛋白，誘使B細胞表面表達高親和力的IL-2R，促進B細胞由分泌IgM向分泌IgG2轉換；還可誘導產生某些B細胞生長因子以及造血因子等，從而發揮相應的生物學作用；(4)IL-2的持續作用可增強單核一巨噬細胞表達高親和力IL-2R，增強其抗原呈遞能力、殺菌力和細胞毒性，促進許多細胞合成與釋放如干擾素、腫瘤壞死因子多種細胞因子，為動員免疫系統抗感染和抗腫瘤所必不可少的一種細胞因子。
IL-2現已大量用于提高人類疫苗免疫應答水平和增強抗腫瘤的免疫應答，治療一些常規方法難以治療的腫瘤疾病，已展現出廣闊的應用前景。
IL-6是免疫調節網絡系統的關鍵成分，許多活化的細胞高效表達IL-6，與靶細胞結合產生復雜的生物效應。在局部感染處，單核巨噬細胞、成纖維細胞和內皮細胞等分泌IL-6抗病毒，促進局部激活的T細胞增殖生長，誘導T細胞分化成熟為細胞毒性T細胞；增加活化B細胞抗體形成與分泌IgG、IgA和IgM；當IL-6釋放進入循環后，能使靜止的造血干細胞進入激活，促進血細胞的分裂增殖，促進肝臟急性期蛋白的合成，誘導或促進其他免疫細胞產生細胞因子，誘導體溫升高，喚醒機體對抗感染的一系列防御性的生理應答。
由于細胞因子的作用具有多效性和網絡性，細胞因子與靶細胞之間的關系復雜而獨特，構成細胞因子調節網絡，調節和控制著免疫應答的過程。一種細胞的活化常需多種細胞因子的協同作用；而多種細胞因子常具有某些相同或相似的生物學活性，利用不同細胞因子的組合可在功能上互相協同，相互促進。動物免疫系統的免疫應答水平、類型和抗感染免疫保護力的強弱和持續期主要由眾多的細胞因子調節。目前大量實驗限于單一細胞因子的免疫增強效果仍不夠理想，單一細胞因子基因的表達和免疫調節活性較低，因此需用較大劑量的基因質粒，從而妨礙了免疫基因制劑的推廣應用。如何提高免疫基因體細胞表達產物的免疫調節活性是在家畜傳染性疾病防治中廣泛應用免疫基因制劑的關鍵所在。
DNA Shuffling(DNA改組)是1994年由美國Affymax研究所Stemmer等發明的一種基于PCR的DNA突變、重組技術，是DNA分子的體外重組，是基因在分子水平上進行有性重組(sexual recombination)的新技術。它通過基因的有性重組，改變基因或基因家族原有核苷酸序列，不僅可以加速積累有益突變，而且可以使蛋白質兩個或多個的優化性質合為一體，賦予表達產物以更好的生物學功能。同時突變后的基因在序列、結構、功能上均顯著區別于原來基因，可以獲得自主知識產權，故在生物工程的各個領域均已顯示出具有巨大的應用潛力。
研究發現傳統的提高真核基因表達效率的方法對增加白細胞介素活性的作用有限，除采用新的基因工程技術(如基因改組技術)改造白細胞介素基因以顯著提高其表達產物的生物活性外，創制具有多功能的新型細胞因子基因，拓寬其免疫調節范圍，這是當今尋求高效免疫增強劑的另一重要途徑。因此，將多種細胞因子復合應用(包括多功能的融合細胞因子)，有可能獲得高效特異的免疫調節效應，建立穩定持久和廣泛的免疫抗感染保護力。而現代動物免疫學和傳染病疫苗免疫預防中尚缺乏利用多種細胞因子調控免疫效應及其機理的深入研究。
本發明中，我們運用DNA改組技術，將來源于人、藏豬、牦牛和小鼠的白細胞介素-2基因家族進行了改組，構建了改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S；設計合成了一新型CpGODN免疫刺激序列，將其插入含有豬白細胞介素-6的真核載體VPIL6中，構建了重組豬白細胞介素6基因與CpG寡聚核苷酸質粒VRIL6C。利用離子交聯法制備殼聚糖納米顆粒，包裝改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S和VRIL6C組合免疫豬，開展IL6-CpG融合基因、改組IL2基因體內協同表達、調節豬免疫機能和對疫苗的體液和細胞免疫應答的效應和機理研究，為深入研制高效免疫基因制劑，廣泛提高動物抗感染水平奠定可靠基礎，為開發應用具有我國自主知識產權的新型抗感染及免疫調節生物制劑開辟新途徑。
發明內容
本發明所解決的技術問題具體包括白細胞介素-2的改組、改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S的構建、重組豬白細胞介素6基因與CpG寡聚核苷酸質粒VRIL6C的構建、殼聚糖納米顆粒對VRIL2S、VRIL6C重組真核質粒的分子包裝及其增強動物免疫應答和免疫保護力的使用技術。該方法包括下列步驟1、IL-2基因的DNA改組DNA酶切豬、牦牛、小鼠和人IL2基因，分離回收50-100bp的核苷酸片斷；經無引物和有引物兩步PCR重新擴增IL2基因，分離純化獲得改組的IL2基因；構建重組基因庫，篩選高活性的IL2改組基因陽性克隆，改組IL2基因(shuffled IL2，SIL2)連接入PGEX4T-1原核表達載體，轉化感受態細菌，構建重組基因庫；免疫印跡法篩選表達IL2的陽性轉化子，PCR擴增和酶切鑒定陽性克隆基因。
2、改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒的構建將改組IL2基因亞克隆入VR1020真核表達載體，轉化、篩選陽性表達克隆，將構建的改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒命名為VRIL2S。
3、CpG寡聚核苷酸序列及其引物的設計、合成CpGODN全序列5’>CGAGATCTAACGTTGTCGTCGACGTCGTCGTCAGGCCTGACGTTATCGATGGCGTTGTCGTCAACGTTGTCGTTAACGTTAGATCTCG<3’CpGODN序列引物P35’>CGAGATCTAACGTTGTC<3’P45’>CGAGATCTAACGTTAAC<34、重組豬白細胞介素6基因與CpG2寡聚核苷酸質粒及插入CpG1寡聚核苷酸的真核表達質粒的構建將擴增后CpGODN插入含有豬白細胞介素-6基因的真核載體VPIL6中，經Stu I酶切鑒定，該CpGODN序列已成功插入到VPIL6中，重組豬白細胞介素6基因與CpG寡聚核苷酸質粒命名為VRIL6C。
5、納米顆粒的制備利用離子交聯法，以分子量150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖制備納米包裝顆粒，將殼聚糖溶液(pH5.5)和VRIL2S+VRIL6C質粒組合、VR1020質粒(含適當濃度三聚磷酸鹽)溶液50℃水浴分別恒溫20min，然后均勻混合質粒溶液和殼聚糖溶液5min，即得質粒殼聚糖納米顆粒樣品液。
6、免疫用質粒DNA的大量制備接種含有重組真核表達質粒VRIL2S、VRIL6C、VR1020單菌落于含相應抗生素的LB培養基，37℃振搖過夜；離心后收集菌體；加入溶液I懸浮菌體，加入溶液II，翻轉混合后，冰浴加入溶液III，翻轉混合，冰浴；離心后轉移上清至新的離心管，加入異丙醇，-20℃放置，離心去上清，Tris.Cl溶解DNA，加入亞精胺、異丙醇、70％乙醇純化質粒，溶解于滅菌生理鹽水，調節濃度為3pmol/μl。
7、質粒組合殼聚糖納米顆粒抗感染制劑的應用選擇3周齡小豬20只，隨機分為2組，每組10只。采用肌肉注射法，每頭質粒劑量0.5mg/頭。所有豬按該常規免疫程序接種疫苗1周齡免疫接種藍耳病疫苗；2周齡免疫接種偽狂犬疫苗。3周齡在免疫注射基因制劑時同時免疫接種豬瘟疫苗。
豬自免疫后第0，1，2，4，6，8周前腔靜脈采血，分離血清，按照常規ELSA方法檢測體液免疫反應(IgG、IgA、IgM及特異性抗體的含量)，SABC-ELISA檢測了實驗豬細胞免疫水平(血清IL2、IL4和IL6含量)，血球自動分析計數外周血淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞等免疫細胞數量)的變化情況。
結果發現以殼聚糖納米顆粒包裹的改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S和重組豬白細胞介素6基因與CpG寡聚核苷酸質粒VRIL6C組合，聯合豬常規疫苗免疫豬，可以顯著提高免疫豬的IgG、IgA、IgM含量，IL-2、IL-4、IL-6等細胞因子水平，免疫細胞數量與對照組差異顯著(P＜0.05)，對疫苗的特異性抗體免疫應答也顯著加強。殼聚糖納米顆粒包裹質粒后，有效地防止了DNA被體內其它組織蛋白的吸附和體液核酸酶的降解，同時又促進質粒進入細胞，使質粒DNA緩慢釋放，將目的基因DNA轉運到靶細胞中，發揮基因轉錄表達，分泌更多的細胞因子，增強對免疫應答的上調效應，提高體液和細胞免疫水平。這些結果表明殼聚糖納米顆粒包裹改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S和重組豬白細胞介素6基因與CpG寡聚核苷酸質粒VRIL6C組合能顯著提高疫苗免疫豬只的免疫應答水平，可作為有效的新型抗感染免疫調節劑，在增強豬對疫苗體液和細胞免疫應答、提高免疫保護水平和抗病力等方面具有廣泛的重要應用前景。
圖1 IL2基因家族改組結果1Marker2無引物PCR3有引物PCR圖2 改組的TPIL-2酶切電泳圖1DL20002pGTPIL-2/BamHI+EcoRI雙酶切3pGTPIL-2圖3 VRIL2S質粒PCR電泳圖1DL2,0002VRIL2S質粒PCR圖4 重組質粒VP6C的酶切圖譜1marker(Lambda EcoRI/HindIII)2VRIL6C質粒3VRIL6C質粒用stuI單酶切圖5 免疫豬血清中IgG含量圖6 免疫豬血清中IgA含量圖7 免疫豬血清中IgM含量圖8 免疫豬血清中豬瘟特異性抗體含量圖9 免疫組豬血清中豬藍耳病特異性抗體含量圖10 免疫豬血清中IL-2含量圖11 免疫豬血清中IL-4含量圖12 免疫豬血清中IL-6含量圖13 免疫豬白細胞數量變化圖14 免疫豬單核細胞數量變化圖15 免疫豬淋巴細胞數量變化圖16 免疫豬中性粒細胞數量變化
具體實施例方式
1、IL-2基因的DNA改組將克隆得到的豬、牦牛、小鼠和人IL2基因進行DNA酶切，分離回收50-100bp的核苷酸片斷；經無引物和有引物兩步PCR重新擴增IL2基因，分離純化獲得改組的IL2基因；改組PCR后的片段進行2.0％瓊脂糖凝膠電泳，瓊脂糖凝膠小分子DNA抽提試劑盒回收500bp的改組片段。然后將此DNA片段用BamHI/EcoRI進行酶切，與脫脫磷酸化、BamHI/EcoRI雙酶切的pGEX 4T-1載體在T4DNA連接酶作用下16℃水浴過夜。連接產物轉化E.coli DH5α感受態細胞，構建重組質粒，酶切鑒定陽性克隆基因。
結果見說明書附圖1、2。圖1顯示DNaseI消化后獲得的50-100bp左右的隨機片段，經55個循環的無引物PCR后，這些小片段拼接為許多大小不一的改組分子，經電泳檢測為主要集中在100-250bp左右的模糊條帶(第二泳道)，是PCR重組配對的結果。無引物PCR的產物再經過30個循環的有引物PCR，與原模板大小相同的IL-2改組分子(約500bp)被富集(第三泳道)，電泳結果顯示在500bp處出現一特異條帶。圖2顯示將初步篩選的陽性菌落，接種于3ml含Amp的LB培養液中，37℃震蕩過夜，用堿裂解法提取出所有菌落的質粒，然后用BamHI/EcoRI進行酶切，發現大部分切出小片段，大小約500bp左右。
2、改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒的構建改組的IL-2基因亞克隆到VR1020載體，PCR反應和酶切反應鑒定重組子，構建改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒，命名為VRIL2S。結果見附圖3。重組子VRIL2S的質粒PCR的結果顯示，所構建的重組子已成功插入了改組的IL-2基因。
3、CpG寡聚核苷酸序列及其引物的設計、合成CpGODN全序列5’>CGAGATCTAACGTTGTCGTCGACGTCGTCGTCAGGCCTGACGTTATCGATGGCGTTGTCGTCAACGTTGTCGTTAACGTTAGATCTCG<3’CpGODN2序列引物P35’>CGAGATCTAACGTTGTC<3’P45’>CGAGATCTAACGTTAAC<34、免疫用CpG寡聚核苷酸制備以合成的CpG序列為模版，利用PCR(多聚酶連鏈式反應)擴增，擴增產物溶解于滅菌生理鹽水，用紫外分光光度計測其濃度。
5、重組豬白細胞介素6基因與CpG寡聚核苷酸質粒的構建將含CpGODN的重組質粒用BglII酶切后與VPIL6質粒BglII酶切、脫磷酸化的DNA在T4 DNA連接酶作用下進行連接反應。連接產物轉化DH5α感受態細胞，轉化子經酶切Stu I鑒定，得到含有目的CpG片段的重組質粒，將重組豬白細胞介素6基因與CpG2寡聚核苷酸質粒命名為VRIL6C。
結果見說明書附圖4。圖4顯示VPIL6質粒沒有Stu I酶切位點，而CpGODN有Stu I酶切位點，重組質粒被Stu I酶切成一條帶，說明重組豬白細胞介素6基因與CpG寡聚核苷酸質粒已構建成功。
6、納米顆粒的制備以分子量150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)；分別將VR1020、VRIL2S+VRIL6C質粒溶解于三聚磷酸鹽溶液(B液)。將A液、B液置于50℃水浴分別恒溫20min，將DNA溶液按一定比例(氨基摩爾數與DNA的磷酸酯基摩爾數比)加入殼聚糖溶液，磁力攪拌使其充分混合，靜置過濾得到粒徑40-60nm的復合物微粒，即是各質粒殼聚糖納米顆粒樣品液。
7、實驗動物的免疫選擇3周齡小豬20只，隨機分為2組，每組10只。采用肌肉注射法，每頭質粒劑量0.5mg/頭。所有豬按該養豬場常規免疫程序接種疫苗1周齡免疫接種藍耳病疫苗；2周齡免疫接種偽狂犬疫苗。3周齡在免疫注射基因制劑時同時免疫接種豬瘟疫苗。
動物免疫分組見說明書表1。
表1免 疫豬分組
注CNP殼聚糖納米顆粒8、殼聚糖納米顆粒包裝VR1C+VRIL6C質粒組合對豬特異性免疫應答的影響豬自免疫后第0，1，2，4，6，8周前腔靜脈采血，分離血清，用以檢測各項免疫指標。
(1)IgG、IgA及IgM的測定含量實驗豬血清分別作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀釋包被Costar酶標板，用特異性的兔抗豬IgG、IgM和IgA重鏈抗體(美國Bethyl公司生產)作一抗，酶標羊抗兔IgG為二抗(華美生物工程公司)，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，測定豬血清中IgG、IgM和IgA含量。
結果見說明書附圖5、圖6、圖7。圖5、6、7顯示了殼聚糖納米顆粒包裹改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒與重組豬白細胞介素6基因-CpG寡聚核苷酸質粒組合與豬瘟疫苗、豬藍耳病疫苗聯合免疫豬后，豬只血清中免疫球蛋白的變化情況。結果表明在同時免疫了改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒與重組豬白細胞介素6基因-CpG寡聚核苷酸質粒組合后，豬的IgG、IgA、IgM含量比對照組有顯著提高(P＜0.05)。
(2)特異性抗體的測定間接ELISA法。用豬瘟抗原、豬藍耳病抗原包被Costar酶標板，實驗豬血清100倍稀釋為一抗，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，測定豬血清中豬瘟、豬藍耳病特異性抗體含量。
結果見說明書附圖8、9。圖8、9顯示了豬瘟疫苗、豬藍耳病疫苗與VRIL2S+VRIL6C質粒組合聯合免疫動物后豬只特異性抗體變化情況。結果顯示動物在免疫一周后，就檢測到特異性抗體的產生；在同時免疫VRIL2S+VRIL6C質粒組合后，實驗豬只的上述特異性抗體比對照組顯著提高(P＜0.05)。
(3)細胞因子的檢測實驗豬血清100倍稀釋包被Costar酶標板，兔抗豬IL2、IL4、IL6 IgG抗體(武漢博士德生物工程公司提供)為一抗，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，SABC法檢測血清中IL2、IL4及IL6含量，觀測豬細胞免疫應答情況。
結果見說明書附圖10、11、12。圖結果顯示殼聚糖納米顆粒包裹VRIL2S+VRIL6C質粒組合與豬瘟疫苗、豬藍耳病疫苗聯合免疫豬后，豬只血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量較對照組高，差異顯著(P＜0.05)。
(4)免疫豬外周血免疫細胞數量的動態變化常規法血球自動計數儀分類計數中性粒細胞、單核細胞核、淋巴細胞。
結果見說明書附圖13、14、15、16。用豬瘟疫苗、豬藍耳病疫苗聯合殼聚糖納米顆粒包裹VRIL2S+VRIL6C質粒組合免疫豬，豬外周血免疫細胞數量的變化情況結果同樣發現肌肉注射VRIL2S+VRIL6C質粒組合對豬只外周血免疫細胞有較好的提升能力。
8、數據分析上述各種數據均用方差分析進行差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著性標準。
權利要求
1.新型豬白細胞介素2和6基因表達質粒抗感染制劑的應用技術，其特點包括白細胞介素-2基因的改組、改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S的構建，重組豬白細胞介素6基因與CpG寡聚核苷酸質粒(VRIL6C)的構建，殼聚糖納米顆粒對VRIL2S+VRIL6C質粒組合進行分子包裝制備基因納米顆粒制劑，并將此基因制劑應用于增強豬機體免疫應答及抗感染免疫力的使用技術。
2.根據權利要求1所述的新型豬白細胞介素2和6基因表達質粒抗感染制劑的制備，其特征在于所述的基因制劑的主題成分是改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S和豬白細胞介素6基因與CpG寡聚核苷酸重組質粒VRIL6C質粒組合。
3.根據權利要求1所述的新型豬白細胞介素2和6基因表達質粒抗感染制劑的制備，其特征在于所述的基因制劑的包裹材料是分子量為150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖，用離子交聯法制備殼聚糖納米顆粒分子。
4.使用權利要求1要求的殼聚糖納米顆粒包裝改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒與重組豬白細胞介素6基因-CpG寡聚核苷酸質粒組合作為豬新型抗感染分子免疫調節劑的使用技術，其特征在于以制備的殼聚糖納米顆粒包裝改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒與重組豬白細胞介素6基因-CpG寡聚核苷酸質粒組合聯合疫苗(豬瘟疫苗、豬藍耳病疫苗、偽狂犬病疫苗)免疫豬，以殼聚糖納米顆粒包裝VR1020空質粒為對照，檢測了殼聚糖包裝VRIL2S+VRIL6C質粒組合對豬的體液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測定)和細胞免疫水平(細胞因子和外周血免疫細胞數量)的影響情況，結果表明殼聚糖酸納米顆粒包裹改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒與重組豬白細胞介素6基因-CpG寡聚核苷酸質粒組合可顯著增強實驗豬對疫苗的細胞免疫和體液免疫應答反應，提高特異免疫水平，增進疫苗接種動物的免疫保護力。
全文摘要
本發明改組了白細胞介素－2基因，構建了改組豬白細胞介素2基因真核表達質粒VRIL2S，構建了豬白細胞介素6基因與CpG寡聚核苷酸重組真核質粒VRIL6C，以分子量為150000、脫乙酰度95％以上的殼聚糖制備了殼聚糖納米顆粒，提供了利用殼聚糖納米顆粒對VRIL2S+VRIL6C質粒組合進行分子包裝制備基因納米顆粒制劑的方法，公開了該納米顆粒基因制劑作為新型抗感染分子免疫增強劑的應用技術。該方法包括殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2S+VRIL6C質粒組合，將此制備納米顆粒基因制劑以肌肉注射方式協同疫苗免疫豬，增強豬特異細胞和體液免疫機能，提供了殼聚糖納米顆粒包裝VRIL2S+VRIL6C質粒組合作為新型動物抗感染分子免疫增強劑的應用技術。
文檔編號A61K9/16GK1954886SQ20051002195
公開日2007年5月2日 申請日期2005年10月28日 優先權日2005年10月28日
發明者高榮, 武梅, 王澤州, 李江凌, 呂學斌, 謝曌, 王穎玉, 趙鐘鐘, 陳茜, 吳凱源 申請人:四川大學