人重組磷脂酶d2及其制備方法和在藥物制備中的應(yīng)用的制作方法

專利名稱：人重組磷脂酶d2及其制備方法和在藥物制備中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明描述了人重組磷脂酶D2(recombinant human phospholipase D2，rhPLD2)，一種人磷脂酶D2變構(gòu)體極其編碼該蛋白多肽的多核苷酸序列。同時(shí)闡明了該蛋白多肽和多核苷酸的制備方法；并就其抗炎、抗哮喘、抗白血病細(xì)胞(HL-60)凋亡等功能的研究做了科學(xué)的表述。尤為重要的是指明了該蛋白多肽和多核苷酸的臨床應(yīng)用價(jià)值和巨大的開(kāi)發(fā)前景。
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明所屬領(lǐng)域包括以下內(nèi)容。
(一)分子生物學(xué)范疇。
(二)蛋白分子研究領(lǐng)域。
(三)免疫學(xué)功能研究領(lǐng)域。
(四)疾病治療醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
(一)分子生物學(xué)本申請(qǐng)的主體是人重組磷脂酶D2(rhPLD2)。而該蛋白質(zhì)產(chǎn)物是從Daudi細(xì)胞中提取mRNA，經(jīng)剪切、拼接變構(gòu)，克隆獲得了不含膜結(jié)合部位及信號(hào)肽的，可編碼631個(gè)氨基酸的PLD2 cDNA序列。
(二)蛋白分子研究通過(guò)上述PLD2 cDNA序列的基因表達(dá)、蛋白的分離和純化，獲得了具有一定生物學(xué)活性的rhPLD2蛋白產(chǎn)品。
(三)免疫學(xué)功能研究。
1.與細(xì)胞分化的關(guān)系PLD廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，并與各類細(xì)胞的分化有關(guān)。最近，倆種相關(guān)的PLD同工酶PLD1和PLD2被克隆。PLD1的活性在體外被蛋白激酶C和小分子量三磷酸腺甘(GTP)結(jié)合蛋白(Arf，Rho家族)調(diào)節(jié)。相比之下，PLD2的活性高，且對(duì)這些催化劑無(wú)應(yīng)答。在各種細(xì)胞的分化和凋亡中，細(xì)胞的PLD活性和這些同工酶的mRNA水平有很大的改變。有實(shí)驗(yàn)觀察了在Jurkat T細(xì)胞的凋亡過(guò)程中這類PLD的活性急劇增高。在某些情況下PLD活性被控制在翻譯水平，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞的分化，存活和凋亡中PLD發(fā)揮作用。細(xì)胞外的信號(hào)分子與細(xì)胞表面受體的相互作用經(jīng)常活化PLD-介導(dǎo)卵磷脂和其它的磷脂，產(chǎn)生磷脂酸。PLD的活化被認(rèn)定在細(xì)胞功能和命運(yùn)的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要作用。
2.與受體的關(guān)系
FcgammaRI，人類高親和性IgG受體負(fù)責(zé)免疫復(fù)合物的內(nèi)在化及繼發(fā)溶酶體的降解。我們?cè)诖俗C明在干擾素γ前體細(xì)胞U937上合了免疫復(fù)合物的FcgammaRI聚合，引起暫時(shí)的腫脹小泡結(jié)構(gòu)。可能腫脹的晚期內(nèi)含體在免疫復(fù)合物被降解后消失。Wortmannin and LY294002是PI3-kinases的特異性抑制劑，可延遲這些結(jié)構(gòu)的消失，相應(yīng)地抑制由FcgammaRI介導(dǎo)的免疫復(fù)合物降解。另外這些抑制劑亦可延遲由FcgammaRI介導(dǎo)的免疫復(fù)合物內(nèi)吞作用，并阻止由FcgammaRI介導(dǎo)的PLD活性-PLD是一種與膜運(yùn)輸有關(guān)的酶。這說(shuō)明PLD與免疫復(fù)合物內(nèi)吞作用密切相關(guān)。免疫復(fù)合物的內(nèi)吞作用和人高親和性IgG受體活化PLD需要明顯的phosphoinositide-3激酶活性。
3.與細(xì)胞因子的關(guān)系已發(fā)現(xiàn)EGF可引起細(xì)胞PLD2活化，但值得探討的是EGF-R的活性絲毫不受影響。另外兩種能以ARF-依賴方式激活PLD的是受體-酪氨酸激酶激動(dòng)劑如胰島素、PDGF。這種可與胰島素相互作用的磷脂酶可能為PLD2，因?yàn)橐葝u素的作用可被靜止的無(wú)酶活性的PLD2阻斷，而靜止的PLD1卻不能阻斷胰島素引起的效應(yīng)。通常認(rèn)為趨化性細(xì)胞因子在炎癥狀態(tài)的功能可能是由不同的信號(hào)機(jī)制介導(dǎo)，其中重要的是小GTP酶調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重排，參與細(xì)胞粘附和趨化作用，并介導(dǎo)磷脂酶D(PLD)活化及過(guò)氧化物氧化酶的生成。
(四)疾病治療醫(yī)學(xué)研究PLD可被多種炎癥介質(zhì)(血小板活化因子、IL-1、IL-4、IL-8、IFN-γ、趨化肽等)、激素、細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)、氧化劑、內(nèi)毒素(lipopolysaccharide，LPS)以及生長(zhǎng)因子等諸多細(xì)胞外信號(hào)激活而發(fā)揮該酶在炎癥反應(yīng)過(guò)程中的作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)磷脂酰肌醇二磷酸和磷脂酰三肌醇可直接激活PLD，而磷脂酰肌醇則不具備該生物學(xué)功能。該酶激活后可通過(guò)以下途徑發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，①PLD的直接或間接產(chǎn)物PA、DG、LPA均為第二信使；②PLD水解細(xì)胞膜上的重要的成分磷脂酰膽堿后將改變膜的生物學(xué)性質(zhì)。目前，有研究認(rèn)為PLD水解PC這一過(guò)程在諸如炎癥反應(yīng)、細(xì)胞分裂以及細(xì)胞凋亡等生理、病理過(guò)程中具有非常重要的生物學(xué)作用。1.與炎癥的關(guān)系PLD通過(guò)卵磷脂在信號(hào)傳導(dǎo)和通過(guò)趨化多肽fMet-Leu-Phe刺激分葉核白細(xì)胞產(chǎn)生超氧化物(呼吸爆發(fā)中)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。EOS的磷酸酯酶D有滅活PAF的作用。而PAF是目前已知的在變態(tài)反應(yīng)中致炎作用最強(qiáng)的炎癥因子，其作用約相當(dāng)于其它炎癥介質(zhì)的1000倍。
2.與疾病的關(guān)系1)卵繅卵泡閉塞盡管已證明卵繅卵泡閉塞是由粒層細(xì)胞的凋亡所致，但涉及凋亡細(xì)胞死亡的細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)途徑仍然很少被描述。用Western blot檢測(cè)粒細(xì)胞溶解物及免疫標(biāo)記培養(yǎng)的粒細(xì)胞證實(shí)Fas抗原的表達(dá)。粒細(xì)胞與anti-Fas mAb混合引起重要的鞘磷脂水解，并伴隨內(nèi)源性神經(jīng)酰胺水平的增高。研究結(jié)果表明Fas/神經(jīng)酰胺信號(hào)途徑也許在粒細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用；并認(rèn)為PLD/DAG途徑可能在粒細(xì)胞凋亡中連接Fas/神經(jīng)酰胺途徑。
2)結(jié)核病ATP誘導(dǎo)的人類肥大細(xì)胞殺傷毒性結(jié)核桿菌要PLD的參與。有證明ATPe促進(jìn)患者巨噬細(xì)胞對(duì)毒性結(jié)核桿菌的吞殺，并強(qiáng)調(diào)PLD的活化在此過(guò)程中發(fā)揮這關(guān)鍵作用。用基因脫毒PLD制備的疫苗已被證明可有抗假結(jié)核病棒狀桿菌-引起綿羊干酪樣林巴結(jié)炎，至少部分有效。在抗原提呈細(xì)胞(APC)上，CTLA-4與B7結(jié)合從而直接融合免疫感應(yīng)位點(diǎn)的抗原。已證明與DNA編碼的DeltaPLD比較，靶向DeltaPLD(以CTLA-4作為靶抗原)作為一種融合蛋白明顯地增加抗體應(yīng)答的速度、數(shù)量及時(shí)間。所有的用DNA編碼的DeltaPLD綿羊疫苗，與那些用無(wú)關(guān)質(zhì)粒免疫或未免疫的組比較均能較好地起到保護(hù)作用。因此，APC細(xì)胞上的靶抗原為增強(qiáng)DNA疫苗的功效提供了基因的策略。
3)高血壓近來(lái)證明，PLD催化卵磷脂水解的產(chǎn)物磷脂酸在MAPK級(jí)聯(lián)的調(diào)節(jié)作用中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在A10細(xì)胞，一種平滑肌細(xì)胞系；如果無(wú)PLD活性存在時(shí)，激發(fā)MAPK途徑所需的血管收縮素-Ang II的磷酸化作用被抑制。因此，通過(guò)血管活性多肽改變PLD活性的調(diào)節(jié)作用也許在高血壓的發(fā)展過(guò)程中起重要作用。
4)腫瘤在喜樹(shù)堿及TNF誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的過(guò)程中伴有PLD2活性的增高，抑制PLD2的活性能抑制HL-60細(xì)胞的凋亡。這就表明在誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞分化及凋亡過(guò)程中PLD2具有重要的生物學(xué)功能。也有報(bào)道在其它的細(xì)胞株例如PC-12，在凋亡誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，PLD2的活性增加具有抗凋亡作用。
目前國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)均未報(bào)道或描述人重組磷脂酶D2，英文名稱recombinant humanphospholipase D2，簡(jiǎn)稱rhPLD2，以及人重組磷脂酶D2的變構(gòu)體及其編碼該蛋白多肽的多核苷酸序列。也沒(méi)有報(bào)道或描述該蛋白多肽和多核苷酸的制備方法，尤其是無(wú)其抗炎、抗哮喘、抗白血病細(xì)胞(HL-60)凋亡等功能的研究報(bào)道。更沒(méi)有報(bào)道或敘述該蛋白多肽和多核苷酸的臨床應(yīng)用價(jià)值和巨大的開(kāi)發(fā)前景。

發(fā)明內(nèi)容
(一)rhPLD2的來(lái)源本申請(qǐng)的主體是人重組磷脂酶D2(rhPLD2)。而該蛋白質(zhì)產(chǎn)物是從Daudi細(xì)胞中提取PLD2的mRNA，經(jīng)剪切、拼接變構(gòu)，克隆獲得了不含膜結(jié)合部位及信號(hào)肽的，可編碼631個(gè)氨基酸的PLD2 cDNA序列；通過(guò)上述PLD2 cDNA序列的基因表達(dá)、蛋白的分離和純化，獲得了具有一定生物學(xué)活性的rhPLD2蛋白產(chǎn)品。
(二)發(fā)明的特征1、rhPLD2的特征
1)本研究室已純化干燥的rhPLD2蛋白產(chǎn)品是一種無(wú)味的白色或淡黃色的粉末。較易溶于水，其溶解度在常溫下為88-100％。rhPLD2蛋白分子量為71.6KD。
2)1mg的rhPLD2的活性大約相當(dāng)于65mu PLD。1mg的rhPLD2的活性大約相當(dāng)于65muPLD。其生物學(xué)活性有效范圍約在0.5μg/ml-150mg/ml。最佳范圍0.5μg/ml-150μg/ml。其編碼基因序列為不含膜結(jié)合部位及信號(hào)肽的，可編碼631個(gè)氨基酸的PLD2 cDNA序列，全長(zhǎng)1893bp。詳見(jiàn)序列表<210>1。
3)rhPLD2的氨基酸多肽序列，全長(zhǎng)631個(gè)氨基酸。詳見(jiàn)序列表<210>2。
4)將rhPLD2蛋白質(zhì)產(chǎn)品rhPLD2進(jìn)行動(dòng)物過(guò)敏實(shí)驗(yàn)和毒性實(shí)驗(yàn)。表明經(jīng)腹腔注射濃度為0.4537-2mg/mL的rhPLD2，對(duì)動(dòng)物無(wú)致敏及任何毒性作用。
2、rhPLD2的應(yīng)用特點(diǎn)1)抗哮喘哮喘發(fā)病率的上升使得該疾病近年來(lái)備受關(guān)注，現(xiàn)今全球約有1億6千萬(wàn)患者，并有上升趨勢(shì)。目前，已有大量的生長(zhǎng)因子在支氣管平滑肌中被鑒定出來(lái)，包括血小板源性生長(zhǎng)因子，表皮生長(zhǎng)因子等。因而抑制支氣管平滑肌增殖的信號(hào)傳導(dǎo)通路將是治療哮喘的一個(gè)新視點(diǎn)。PLD的產(chǎn)物PA及DAG可使PKC活化，同時(shí)伴隨細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的上升，而Ca2+濃度的變化是細(xì)胞分泌的必要信號(hào)。另外，PLD2可以調(diào)節(jié)PKC，進(jìn)而通過(guò)影響核轉(zhuǎn)錄因子的活性而調(diào)節(jié)某些參與哮喘發(fā)病的炎癥因子的表達(dá)；并通過(guò)調(diào)節(jié)MAPK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑而調(diào)節(jié)支氣管平滑肌的增生。因此，我們選擇PLD2作為控制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶點(diǎn)，從而抑制支氣管平滑肌的增殖。通過(guò)改變PLD2的活性可能是治療哮喘/或者緩解哮喘癥狀的一種方法。為此，我們應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室制備的人重組磷脂酶D2即rhPLD2(該rhPLD2是一種掐頭PLD2，即去除了N-末端的某些肽段，同時(shí)亦對(duì)PLD2基因某些位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變，從而改變其基礎(chǔ)活性)作為治療因素干預(yù)哮喘豚鼠模型。因此，我們可以選擇PLD2作為控制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶點(diǎn)，從而抑制支氣管平滑肌的增殖及細(xì)胞因子的分泌。這不失為治療哮喘的一種方法。
利用超敏反應(yīng)(哮喘)的動(dòng)物模型，在體外抗炎實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究用rhPLD2干預(yù)前后，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物臨床癥狀的表現(xiàn)及動(dòng)物循環(huán)血液、肺組織及肺泡灌洗液等標(biāo)本中嗜酸性粒細(xì)胞(Eos)、血小板活化因子(PAF)、白細(xì)胞介素5(IL-5)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的水平。
2)抗炎癥小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的單核-吞噬細(xì)胞，具有重要的免疫監(jiān)視和免疫防御功能。當(dāng)CNS發(fā)生炎癥時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞最先出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，參與炎癥反應(yīng)。我們?cè)趍RNA水平和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)rhPLD2均可抑制活化的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IL-1β、TNF-α，這為中樞性炎癥的防治提供了新的思路。
3)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞(HL-60)凋亡白血病是造血系統(tǒng)的惡性腫瘤，俗稱“血癌”，是國(guó)內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一，在小兒的惡性腫瘤中以白血病的發(fā)病率最高。目前，白血病的主要治療手段為化學(xué)療法和造血干細(xì)胞移植。但是化療藥物的毒副作用也是一個(gè)不容忽視的問(wèn)題，這就在一定程度上限制了化療藥物在治療過(guò)程中的使用劑量。并且在化療藥物治療白血病的過(guò)程中，白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生抗藥性也是化療失敗的主要原因。如何提高化療藥物對(duì)白血病細(xì)胞的敏感性，增加化療藥物的治療效果，降低化療藥物的毒副作用是一個(gè)亟需解決的問(wèn)題。而在喜樹(shù)堿誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，通過(guò)激活核內(nèi)PLD而導(dǎo)致核內(nèi)DAG水平升高，進(jìn)而使核內(nèi)PKCα發(fā)生活化，PKCα磷酸化核纖層蛋白B(lamin B)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。
(三)已獲rhPLD2克隆4個(gè)，它們分別是克隆1號(hào)1片段(600bp)；克隆2號(hào)2片段(600bp)；克隆3號(hào)3片段(677bp)；克隆4號(hào)1+2+3片段(1893bp)。
四、發(fā)明目的1.提供分離的新的人重組磷脂酶D2多肽，它包含具有序列表<210>2氨基酸序列的多肽、或其保守性變體、生物活性片段、類似物或衍生物。
2.提供編碼該多肽的多核苷酸。它包含選自下組的一種核苷酸序列或其變體(a)編碼具有序列表<210>2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；(c)與(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少88％相同性的多核苷酸。
更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有序列表<210>1中414-504位的序列；和(b)具有序列表<210>1中615-789位的序列；和(c)具有序列表<210>1中912-1407位的序列；和(d)具有序列表<210>1中1353-1455位的序列。
即本發(fā)明提供了分離的核酸(多核苷酸)，基本由編碼具有序列表<210>2氨基酸序列的多肽的多核苷酸組成。本發(fā)明的多核苷酸序列包括序列表<210>1的核苷酸序列。
3.本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或是RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與序列表<210>1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡(jiǎn)并的變異體。編碼序列表<210>2的成熟多肽的多核苷酸包括只有成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
4.本發(fā)明還涉及上述描述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片斷、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
5.本發(fā)明提供了一種新的多肽一一人重組磷脂酶D2，其基本上是由序列表<210>2所示的氨基酸序列組成的。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生。根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
6.提供含有編碼人重組磷脂酶D2的多核苷酸的重組載體。特別是表達(dá)載體；本發(fā)明中，編碼人重組磷脂酶D2的多核苷酸序列可插入到載體中，以構(gòu)成含有本發(fā)明所述多核苷酸的重組載體。包括本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體。
本領(lǐng)域一般技術(shù)人員都清楚如何選擇適當(dāng)?shù)妮d體/轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件(如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)和選擇性標(biāo)記基因。
7.提供含有編碼人重組磷脂酶D2的多核苷酸的基因工程化宿主細(xì)胞。本發(fā)明中，人重組磷脂酶D2的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細(xì)菌細(xì)胞如鼠傷寒沙門(mén)氏菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅S2或Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。
8.提供生產(chǎn)人重組磷脂酶D2的方法。用本發(fā)明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。可供選擇的是用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行。當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用本發(fā)明的多核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的人重組磷脂酶D2。一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1)用本發(fā)明的編碼人重組磷脂酶D2的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)。
在步驟(2)中，根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間。
在步驟(3)中，重組多肽可包被于細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。這些方法包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLc)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
9.本發(fā)明的編碼人重組磷脂酶D2的特異的多核苷酸序列能用多種方法獲得。例如，用本領(lǐng)域熟知的雜交技術(shù)分離多核苷酸。這些技術(shù)包括但不局限于1)用探針與基因組或cDNA文庫(kù)雜交以檢出同源的多核苷酸序列，和2)表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選以檢出具有共同結(jié)構(gòu)特征的克隆的多核苷酸片段。
10.提供針對(duì)本發(fā)明的人重組磷脂酶D2的抗體，及涉及一種能與本發(fā)明多肽特異性結(jié)合的抗體。
11.本發(fā)明還涉及本發(fā)明的多肽或多核苷酸在制備抗炎、抗哮喘、抗腫瘤等藥物中的應(yīng)用。
12.本發(fā)明的多肽以及該多肽的拮抗劑、激動(dòng)劑和抑制劑可直接用于疾病治療，例如，可治療惡性腫瘤、各類炎癥、哮喘等。
可以將本發(fā)明的多肽、多核苷酸及其模擬物、激動(dòng)劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合后使用。這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合。組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。這些組合物可以作為藥物用于疾病治療。
13.本發(fā)明還提供含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，容器中裝有一種或多種本發(fā)明的藥用組合物成分。與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機(jī)構(gòu)所給出的指示性提示，該提示反映出生產(chǎn)、使用或銷售的政府管理機(jī)構(gòu)許可其在人體上施用。此外，本發(fā)明的多肽可以與其它的治療化合物結(jié)合使用。
藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過(guò)局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、霧化、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑。人重組磷脂酶D2以有效地治療和/或預(yù)防具體的適應(yīng)癥的量來(lái)給藥。施用于患者的人重組磷脂酶D2的量和劑量范圍將取決于許多因素，如給藥方式、待治療者的健康條件和診斷醫(yī)生的判斷。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開(kāi)，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
五

下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明范圍。
圖1是本發(fā)明人重組磷脂酶D2的PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖。
圖2為分離的人重組磷脂酶D2的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖(SDS-PAGE)。71.6kDa為蛋白質(zhì)的分子量。箭頭所指為分離出的蛋白條帶。
圖1.PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖 圖2.rhPLD2的復(fù)性MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL 15000； 1.蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)11片段(600bp)； 2.rhPLD2的復(fù)性后上清71.6kD)22片段(600bp)； 3.rhPLD2的復(fù)性后沉淀(71.6kD)33片段(677bp)；41+2+3片段(1893bp)..
圖3是本發(fā)明人重組磷脂酶D2和人磷脂酶的氨基酸序列同源性比較圖。FROM NET是人重組磷脂酶D2。
圖4是原技術(shù)路線。
圖5是改變后的技術(shù)路線。即PCR法定點(diǎn)突變示意圖。Step1，2用含有突變位點(diǎn)的引物P3(PLDm3)和P4(PLDm5)分別與P1(1+2片段)和P2(2+3片段)擴(kuò)增出兩個(gè)片段；Step3將兩個(gè)片段混合后變性、退火，形成雜合分子；Step4加入pfuDNA高溫聚合酶延伸成模板；Step5加入P1，P2模板擴(kuò)增得到目的產(chǎn)物不含氨基端的hPLD2的cDNA。
圖6是人重組磷脂酶D2蛋白質(zhì)的純化與鑒定的基本流程圖。
六具體實(shí)施例方式
(一)實(shí)施案例下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如sanlbrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New Yorkcold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人重組磷脂酶D2的克隆根據(jù)GenBank公布的已知的hPLD2的cDNA序列(登錄號(hào)AF035483)，按照每600bp為一個(gè)片段，將其2802bp的基因全長(zhǎng)從第909bp起，分為三個(gè)片段。即600bp，600bp，677bp。并設(shè)計(jì)了5’和3’端寡核苷酸引物，在第一片段的5’端引入EcoRI限制性酶切位點(diǎn)，并加上保護(hù)性堿基。在第二片段的第466個(gè)堿基(原序列的第1991個(gè)堿基)將A突變?yōu)镚。即，在1+2片段的3’端引物和2+3片段的5’端引物均引入BamH I限制性酶切位點(diǎn)。在第三片段的3’端引物的5’末端引入KpnI限制性酶切位點(diǎn)。各片段的5’和3’端引物序列分別為見(jiàn)表1.。將Daudi細(xì)胞(1012個(gè)·ml-1)經(jīng)5％CO2，37℃條件下，以20％小牛血清、100μg·ml-1鏈霉素、100U·ml-1青霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。經(jīng)離心，收集沉淀細(xì)胞，然后從中提取mRNA，并根據(jù)所設(shè)計(jì)的5’和3’端寡核苷酸引物及突變引物進(jìn)行RT-PCR。擴(kuò)增條件94℃變性1min；加入Taq酶/LA酶(5U/μl)；然后以94℃30s，55℃40s，72℃45s(全長(zhǎng)2.5min)的程序循環(huán)30次(全長(zhǎng)35次)；最后72℃延伸7min。PCR產(chǎn)物采用基因內(nèi)引物PCR擴(kuò)增和基因內(nèi)限制性內(nèi)切酶酶切方法進(jìn)行分析鑒定正確后，克隆到載體pUCm-Tvector/pSK上。酶切，PCR及測(cè)序鑒定其正確性。DNA片段回收采用玻璃粉法，質(zhì)粒抽提采用堿法，大腸桿菌轉(zhuǎn)化采用氯化鈣法。具體步驟參照《分子克隆》。DNA序列測(cè)定表明PCR產(chǎn)物的DNA序列與序列表<210>1所示的1-1893bp完全相同。(見(jiàn)圖1.)表1.RT-PCR的引物序列 M3為1+2片段的下游(3′末端)引物；M5為2+3片段的上游(5′末端)引物。
Primer15′-GGAATTCGGTCCTTGATTCTCAAGTGC-3′(序列表<210>3)Primer25′-CCTTGGTGATCAGATTGCTG-3′ (序列表<210>4)
Primer35′-CAGCAATCTTATCACCAAGG-3′(序列表<210>5)Primer45′-CACGACACAGTGTCCTGTAAG-3′ (序列表<210>6)Primer55′-CTTCAGGATCCTGTCCATAATC-3′ (序列表<210>7)Primer65′-GACTGTGGACAGGATCCTGAAG-3′ (序列表<210>8)Primer75′-CTTACAGCACCCTGTGTCGTG-3′ (序列表<210>9)Primer85′-GGGGTACCCTATGTCCTCACTTCTAGGG-3′(序列表<210>10)1.原技術(shù)路線是分別獲得hPLD2羧基端的三個(gè)片段，然后連接1+2，2+3片段或直接用PCR擴(kuò)增獲得1+2，2+3片段。最后用SmaI切除1+2片段和2+3片段的共有序列。
但通過(guò)原技術(shù)路線無(wú)法將SmaI切點(diǎn)處連接。分析其原因可能是由于2號(hào)片段本身的酶切位點(diǎn)SmaI是平頭連接，連接效率不高。所以無(wú)法將1+2和2+3片段的克隆連接成全長(zhǎng)。為此，改變技術(shù)路線如下在hPLD2原序列的第1991bp(第二片段的第466個(gè)堿基)處進(jìn)行了一個(gè)點(diǎn)突變使A突變?yōu)镚。即，在1+2片段的3’端引物和2+3片段的5’端引物均引入BamH I限制性酶切位點(diǎn)。因?yàn)锽amH I是粘頭連接，其連接效率高。為此，重新合成全長(zhǎng)片段的中間引物PLDm3(上游片段的3’末端引物)和PLDm5(下游片段的5’末端引物)。
2.改變后的技術(shù)路線詳請(qǐng)見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖5。
實(shí)施例2人重組磷脂酶D2表達(dá)載體的構(gòu)建PCR產(chǎn)物采用基因內(nèi)引物PCR擴(kuò)增和基因內(nèi)限制性內(nèi)切酶酶切方法進(jìn)行分析鑒定正確后，克隆到載體pUCm-Tvector/pSK上。分別采用酶切、PCR及測(cè)序鑒定其正確性。繼而獲得了不含膜結(jié)合部位及信號(hào)肽的，可編碼631個(gè)氨基酸的PLD2 cDNA序列。
將rhPLD2的DNA全長(zhǎng)片段克隆至原核表達(dá)載體pET30a(+)和真核表達(dá)載體COS-7中，構(gòu)建出能表達(dá)出帶有6×His純化標(biāo)記的pET30a-rhPLD2的融合蛋白的原核表達(dá)載體系統(tǒng)及COS-7的表達(dá)質(zhì)粒載體pCI-rhPLD2。
實(shí)施例3人重組磷脂酶D2的體外表達(dá)、分離和純化構(gòu)建的不含信號(hào)肽及氨基端的rhPLD2的E.coli工程菌株的表達(dá)載體，在細(xì)菌細(xì)胞的包涵體中成功獲得了膜蛋白的表達(dá)產(chǎn)物rhPLD2的變構(gòu)蛋白質(zhì)。所獲重組蛋白經(jīng)分離、純化，SDS-PAGE，Western Blot鑒定其分子量和純度。并采用BCA Protein Assay Reagent Kit測(cè)定其蛋白含量。同時(shí)，參照Amplex Red Phospholipase D Assay Kit提供的Protocol進(jìn)行人重組磷脂酶D2蛋白質(zhì)的活性測(cè)定。
將低溫保存的E.coli BL21-Condonplus(DE3)-RP pET30a-rhPLD2工程菌接種于LB固體培養(yǎng)基中(含卡那霉素濃度為15mg/L)，37℃過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落接種于2mL LB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素濃度為15mg/L)，37℃，270r/min培養(yǎng)12-16h。再以1∶100(體積比)接種率接種于250mL LB液體培養(yǎng)基中(含卡那霉素濃度為15mg/L)，37℃，200r/min培養(yǎng)12-16hr，過(guò)夜。次日，利用15升發(fā)酵系統(tǒng)進(jìn)行10L發(fā)酵。發(fā)酵條件PH8.0；轉(zhuǎn)速500rpm.溫度37℃，氣流速度10L/M，壓力3.0PSIG；當(dāng)培養(yǎng)至A600nm0.6-0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度0.5mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)到A600nm1.50(總培養(yǎng)時(shí)間6小時(shí))。收集發(fā)酵菌液，4,000rpm×20min，4℃離心，收集菌體沉淀，用PBS(PH7.4)懸浮，菌液濃度為1013-1015個(gè)/mL。控制循環(huán)水-4℃，在冰浴條件下，用超聲勻漿機(jī)破壁，9,000rpm×20min，4℃離心，收集包涵體沉淀。往包涵體沉淀中加入少量Buffer B(Tris 20mM，Nacl 0.5M，EDTA 1mM，Tween 20 0.5％)，用勻漿器輾磨成乳狀，9,000rpm×20min，4℃離心，收集包涵體沉淀，按1.5∶1000比例加入Denaturing Buffer(Tris 10mM，Urea 8M，βme 10mM)，充分混勻，4℃過(guò)夜。將變性蛋白液倒入滴瓶中，并將其緩慢滴加至Renaturing Buffer(Tris 10mM，Nacl 150mM，GSH 0.1Mm，Tween 20 0.05％)中，在4℃攪拌過(guò)夜以復(fù)性，直至溶液混濁即為蛋白的飽和狀態(tài)。5,000rpm×20min，4℃離心，收集上清待進(jìn)一步純化。重復(fù)多次，直至離心后幾乎看不到沉淀為止。收集復(fù)性上清，進(jìn)行蛋白分離的初步鑒定，宿主菌包涵體中有71.6kD的外源蛋白表達(dá)(圖2.)。其氨基酸序列見(jiàn)序列表<210>2.薄層掃描顯示，蛋白表達(dá)量占菌體總蛋白的68-72％。用含去污劑的緩沖液洗滌菌體裂解液，離心獲得的沉淀，除去一部分雜蛋白，收獲的包涵體經(jīng)SDS-PAGE和輝度掃描分析，rhPLD2的純度達(dá)76％。
實(shí)施例4人重組磷脂酶D2蛋白的鑒定及活性分析復(fù)性上清上Ni2+親和層析膠，Elute Buffer(250mM咪唑、2mol/L Nacl、80mmol/LTis-HCl PH7.9)特異性洗脫。洗脫液再經(jīng)濃縮、透析。所獲重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE鑒定分子量和純度。收集的目的蛋白用6X His monoclonal Antibody Albumin Free和PLD(Carboxy terminus)goatPolyclonal IgG進(jìn)行Western鑒定。蛋白含量測(cè)定采用BCA Protein Assay Reagent Kit。人重組磷脂酶D2蛋白質(zhì)的純化與鑒定的基本流程詳請(qǐng)見(jiàn)說(shuō)明書(shū)附圖6。
經(jīng)與提取的天然膜蛋白及純化的PLD標(biāo)準(zhǔn)(Sigma)比較，rhPLD2具有較好的生物活性。1mg的rhPLD2的活性大約相當(dāng)于65mu PLD。其生物學(xué)活性有效范圍約在0.5μg/ml-150mg/ml。最佳范圍0.5μg/ml-150μg/ml。
將蛋白質(zhì)產(chǎn)品rhPLD2進(jìn)行動(dòng)物過(guò)敏實(shí)驗(yàn)和毒性實(shí)驗(yàn)。表明經(jīng)腹腔注射濃度為0.4537-1.815mg/mL的rhPLD2，對(duì)動(dòng)物無(wú)致敏及任何毒性作用。
實(shí)施例5人重組磷脂酶D2蛋白的應(yīng)用研究人磷脂酶D(Phospholipase D PLD)的活化作用與許多重要的細(xì)胞功能和細(xì)胞命運(yùn)密切相關(guān)，包括吞噬活性、呼吸爆發(fā)、有絲分裂、和調(diào)節(jié)分泌作用。其中，很多功能在疾病狀態(tài)，包括炎癥和腫瘤中具有重要作用。所以研究rhPLD2的免疫學(xué)功能將為今后的臨床應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。
詳見(jiàn)(二)rhPLD2的作用機(jī)理和功效(二)rhPLD2的作用機(jī)理和功效1、rhPLD2的抗哮喘功能1)rhPLD2降低豚鼠慢性哮喘模型血標(biāo)本、支氣管肺泡灌洗液中的嗜酸性粒細(xì)胞水平給豚鼠慢性哮喘模型腹腔注射rhPLD2 1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg后，分別于豚鼠致敏前3～4天、哮喘誘發(fā)成功后9～12小時(shí)、第3次干預(yù)后6小時(shí)、9～12小時(shí)以及18～24小時(shí)取血各1ml進(jìn)行Eos計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示rhPLD2在濃度為3.0mg/kg以上時(shí)可減少豚鼠慢性哮喘模型血液中的Eos的水平。但支氣管肺泡灌洗液中的Eos計(jì)數(shù)結(jié)果表明rhPLD2在濃度為1.2mg/kg-10mg/kg時(shí)具有抑制Eos在肺部的浸潤(rùn)能力。最佳有效濃度為6mg/kg rhPLD2。
2)rhPLD2降低豚鼠慢性哮喘狀態(tài)時(shí)血液中PAF的含量使用血小板聚集法研究rhPLD2對(duì)豚鼠慢性哮喘狀態(tài)時(shí)血液中PAF的影響。發(fā)現(xiàn)①腹腔注射rhPLD2 3.0mg/kg組和rhPLD2 6.0mg/kg組均可減少豚鼠慢性哮喘狀態(tài)時(shí)血液中PAF的含量(與NS組想比較p值均小于0.01)；但該兩組之間無(wú)明顯差異(p＝0.593)。說(shuō)明腹腔注射rhPLD2 3.0mg/kg以上的劑量可降低PAF在血液中的含量，但作用強(qiáng)度并不隨著劑量的加大而加強(qiáng)。
3)rhPLD2干預(yù)下豚鼠肺組織IL-5基因的表達(dá)受到抑制為研究豚鼠慢性哮喘狀態(tài)IL-5的基因表達(dá)與rhPLD2關(guān)系，提取各藥物干預(yù)組肺組織的總RNA，行半定量RT-PCR。獲得目的基因(IL-5)和相對(duì)應(yīng)的看家基因(β-actin)PCR產(chǎn)物，在1.5％瓊脂糖凝膠上觀察電泳條帶。用凝膠圖象對(duì)獲取的擴(kuò)增條帶的熒光強(qiáng)度值進(jìn)行成像分析，即進(jìn)行mRNA半定量分析。結(jié)果顯示腹腔注射高濃度(2.0mg/kg-6mg/kg)的rhPLD2可抑制IL-5在慢性哮喘豚鼠肺組織的表達(dá)。
4)rhPLD2對(duì)豚鼠慢性哮喘狀態(tài)時(shí)支氣管肺泡灌洗液MMP-9蛋白表達(dá)的影響使用ELISA法檢測(cè)rhPLD2對(duì)豚鼠慢性哮喘狀態(tài)時(shí)支氣管肺泡灌洗液MMP-9的表達(dá)。發(fā)現(xiàn)腹腔注射rhPLD2 2.0mg/kg以上可抑制MMP-9在肺組織的表達(dá)。
5)rhPLD2降低慢性哮喘豚鼠血清中GPI-PLD的酶活性通過(guò)TX-114分相法檢測(cè)血清中GPI-PLD酶活性，我們分別檢測(cè)了rhPLD2、地塞米松、生理鹽水干預(yù)哮喘豚鼠后血清GPI-PLD酶活性的變化以及哮喘前后、各干預(yù)組作用后不同時(shí)間段(干預(yù)后6h、12h、18h)酶活性的變化。并且用3個(gè)不同劑量的rhPLD2干預(yù)哮喘豚鼠，觀察不同劑量rhPLD2對(duì)哮喘豚鼠血清中GPI-PLD酶活性的影響。
實(shí)驗(yàn)表明，各干預(yù)組哮喘前后血清GPI-PLD酶活性均有顯著性變化。各干預(yù)組哮喘前后GPI-PLD酶活性配對(duì)t檢驗(yàn)，其p值介于0.001至0.027之間，說(shuō)明GPI-PLD可能在哮喘發(fā)病過(guò)程中有一定的意義。
哮喘后用不同干預(yù)因素干預(yù)，發(fā)現(xiàn)地塞米松及rhPLD2組均可使血清中GPI-PLD的酶活性顯著降低，并以地塞米松組最為明顯，下降至哮喘狀態(tài)的39.4％，而rhPLD2約可降至50.7％；與哮喘狀態(tài)時(shí)豚鼠血清GPI-PLD水平比較，二者P值均小于0.01。而生理鹽水干預(yù)組干預(yù)前后沒(méi)有顯著差異(P＝0.249)，說(shuō)明rhPLD2對(duì)豚鼠血清中的GPI-PLD活性有一定的下調(diào)作用。通過(guò)對(duì)三個(gè)時(shí)間點(diǎn)(6h、12h、18h)的GPI-PLD酶活性的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)rhPLD2對(duì)GPI-PLD活性的下調(diào)作用未隨時(shí)間變化而有顯著性改變，而1.5mg/kg rhPLD2干預(yù)組及3.0mg/kg rhPLD2干預(yù)組在干預(yù)后18h后對(duì)血清GPI-PLD的調(diào)節(jié)作用已不明顯(P值分別為0.113及0.055)。提示rhPLD2對(duì)GPI-PLD活性的調(diào)節(jié)具有劑量依賴性，隨著所用劑量的增高，其對(duì)血清中GPI-PLD調(diào)節(jié)作用愈持久。
6)rhPLD2對(duì)豚鼠慢性哮喘狀態(tài)時(shí)肺組織核轉(zhuǎn)錄因子P65活性的影響通過(guò)試劑盒檢測(cè)的原理(通過(guò)提取物中的核轉(zhuǎn)錄因子與包被在酶標(biāo)板上的特異性寡核苷酸結(jié)合來(lái)檢測(cè)其活性)，按下面的公式檢測(cè)豚鼠肺組織核轉(zhuǎn)錄因子P65活性O(shè)da＝Odt-Odc不同處理組豚鼠肺組織核轉(zhuǎn)錄因子P65活性見(jiàn)表4及圖6，實(shí)驗(yàn)表明哮喘豚鼠肺組織P65活性顯著升高(p值小于0.001)，用rhPLD2及DXM干預(yù)后，P65的轉(zhuǎn)錄活性顯著降低，但兩者之間的療效無(wú)差別(p＝0.736)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)哮喘后NS組其肺組織P65活性亦顯著低于哮喘狀態(tài)組(p＜0.01)，但其降低水平有限(哮喘狀態(tài)組OD值(x±SD)為0.87500±0.096670，生理鹽水治療組為0.72863±0.090955，而正常豚鼠其肺組織P65活性為0.36213±0.066714)。rhPLD2及DXM組與生理鹽水組比較，發(fā)現(xiàn)前二者療效顯著優(yōu)于生理鹽水組(兩者p值均小于0.001)，提示生理鹽水組P65活性的降低乃是由于哮喘豚鼠有自然緩解；而rhPLD2及DXM對(duì)哮喘豚鼠肺組織核轉(zhuǎn)錄因子P65的表達(dá)水平有明顯的抑制作用。
總之1)rhPLD2對(duì)豚鼠無(wú)致敏作用；2mg/ml的rhPLD2 0.5ml對(duì)體重為20g的小白鼠無(wú)急性毒性作用。
2)rhPLD2可抑制豚鼠慢性哮喘的Eos浸潤(rùn)、血液中PAF的含量、血清中GPI-PLD水平、肺組織IL-5 mRNA的表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子P65的活性、支氣管肺泡灌洗液中MMP-9的蛋白含量。
3)rhPLD2可抑制豚鼠慢性哮喘模型相關(guān)炎癥介質(zhì)的釋放。
2、rhPLD2的抗中樞炎癥的功能1)rhPLD2下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞(N9細(xì)胞)IL-1β、TNF-α基因的表達(dá)和蛋白水平小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的單核-吞噬細(xì)胞，具有重要的免疫監(jiān)視和免疫防御功能。當(dāng)CNS發(fā)生炎癥時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞最先出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，由靜止?fàn)顟B(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榛罨癄顟B(tài)，參與炎癥反應(yīng)。為研究小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)與rhPLD2關(guān)系，采用LPS刺激N9細(xì)胞，并按前述方案干預(yù)細(xì)胞，提取各組不同時(shí)間點(diǎn)的總RNA，對(duì)IL-1β和TNF-α進(jìn)行半定量RT-PCR。獲得目的基因和相對(duì)應(yīng)的看家基因PCR產(chǎn)物在1.5％瓊脂糖凝膠上的電泳條帶。
對(duì)凝膠圖象進(jìn)行半定量分析，發(fā)現(xiàn)rhPLD2可顯著抑制活化的N9細(xì)胞表達(dá)IL-1β和TNF-α。①在各時(shí)間點(diǎn)，10μg/ml-120μg/ml的rhPLD2均可抑制IL-1β的表達(dá)(與生理鹽水組比較p＜0.05)。其作用在4小時(shí)點(diǎn)顯著不同于24小時(shí)(p＝0.047)，但其余各組之間未表現(xiàn)出差異。
2)rhPLD2下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞(N9細(xì)胞)IL-1β、TNF-α蛋白的水平ELISA法檢測(cè)各組N9細(xì)胞IL-1β、TNF-α的蛋白表達(dá)量，我們發(fā)現(xiàn)rhPLD2可抑制IL-1β和TNF-α蛋白的表達(dá)。①除24h時(shí)間點(diǎn)，3μg/3ml LPS組與33μg/3ml PLD+0.4μg/3ml anti-PLD實(shí)驗(yàn)組無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(p＝0.062)，余各組均與相對(duì)應(yīng)陽(yáng)性組差異顯著。②在1h時(shí)間點(diǎn)，rhPLD2對(duì)目的蛋白的抑制能力與濃度正相關(guān)。在4h時(shí)間點(diǎn)，rhPLD2對(duì)目的蛋白的抑制能力加強(qiáng)。
綜上所述1)rhPLD2可在mRNA水平抑制活化的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IL-1β和TNF-α。
2)rhPLD2可在蛋白水平抑制活化的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IL-1β和TNF-α。
3)rhPLD2對(duì)活化的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IL-1β和TNF-α的抑制呈一定的濃度依賴性和時(shí)間相關(guān)性。
在mRNA水平和蛋白水平，rhPLD2均可抑制活化的小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)IL-1β、TNF-α，這為中樞性炎癥的防治提供了新的思路。
3、rhPLD2的誘導(dǎo)白血病細(xì)胞HL-60凋亡的功能細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)觀察不同濃度的rhPLD2單用或者合用喜樹(shù)堿對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響，并利用該實(shí)驗(yàn)篩選出rhPLD2作用于HL-60細(xì)胞的最佳濃度梯度。實(shí)驗(yàn)分組①rhPLD2組(通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察rhPLD2對(duì)HL-60細(xì)胞增殖的影響，篩選出五個(gè)合適的濃度梯度)，每個(gè)劑量三復(fù)孔。②喜樹(shù)堿陽(yáng)性對(duì)照組，按照文獻(xiàn)及預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，篩選出一個(gè)最佳的喜樹(shù)堿作用濃度作為陽(yáng)性對(duì)照(作用于HL-60細(xì)胞48小時(shí)后對(duì)細(xì)胞的增殖抑制率大約為50％)，三復(fù)孔。③標(biāo)準(zhǔn)PLD組，濃度為250U/ml，三復(fù)孔。④rhPLD2(五個(gè)濃度梯度同前)及標(biāo)準(zhǔn)PLD(250U/ml)與喜樹(shù)堿聯(lián)合作用組。⑤陰性對(duì)照組，細(xì)胞的接種密度與各處理組相同，但細(xì)胞不經(jīng)任何處理因素干預(yù)。HL-60細(xì)胞在上述干預(yù)因素處理后，于不同的時(shí)點(diǎn)(24h，48h，72h)觀察各處理因素對(duì)HL-60細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。
實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明rhPLD2對(duì)HL-60的生長(zhǎng)具有明顯的抑制作用。當(dāng)rhPLD2的濃度在80ug/ml以上時(shí)，對(duì)HL-60細(xì)胞的生長(zhǎng)表現(xiàn)出極大的抑制作用。與對(duì)照組比較，P＜0.01。
Hoechst 33258及PI雙染法能對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行定性(區(qū)分凋亡與壞死)。
序列表<110>福建醫(yī)科大學(xué) 朱玲<120>人重組磷脂酶D2及其編碼序列<140>2005100191724<141>2005-7-25<160>10<210>1<211>1893<212>DNA<213>人B細(xì)胞骨髓瘤(Daudi細(xì)胞株)<400>11caagagatca ctgagctggc gcagggccca ggcagagact tcctacagct gcaccggcat61 gacagctacg ccccaccccg gcctgggacc ttggcccggt ggtttgtgaa tggggcaggt121 tactttgctg ctgtggcaga tgccatcctt cgagctcaag aggagatttt catcacagac181 tggtggttga gtcctgaggt ttacctgaag cgtccggccc attcagatga ctggagactg241 gacattatgc tcaaraggaa ggcggaggag ggtgtccgtg tgtctattct gctgtttaaa301 gaagtggaat tggccttggg catcaacagt ggctatagca agagggcgct gatgctgctg361 caccccaaca taaaggtgat gcgtcaccca gaccaagtga cgttgtgggc ccatcatgag421 aagctcctgg tggtggacca agtggtagca ttcctggggg gactggacct tgcctatggc481 cgctgggatg acctgcacta ccgactgact gaccttggag actcctctga atcagctgcc541 ttccagcctc ccaccccgcg cccagactca ccagccaccc cagacctctc tcacaaccaa601 ttcttctggc tgggcaagga ctacagcaat cttatcacca aggactgggt gcagctggac661 cggcctttcg aagatttcat tgacagggag acgacccctc ggatgccatg gcgggacgtt721 ggggtggtcg tccatggcct accggcccgg gaccttaccc ggcacttcat ccagcgctgg781 aacttcacca agaccaccaa ggccaagtac aagactccca cataccccta cctgcttccc841 aagtctacca gcacggccaa tcagctcccc ttcacacttc caggagggca gtgcaccacc901 gtacaggtct tgcgatcagt ggaccgctgg tcagcaggga ctctggagaa ctccatcctc961 aatgcctacc tgcacaccat cagggagagc cagcacttcc tctacattga gaatcagttc1021 ttcattagct gctcagatgg gcggacggtt ctgaacaagg tgggcgatga gattgtggac1081 agaatcctga aggcccacaa acaggggtgg agttaccgag tctacgtgct tttgccctta1141 ctccctggct tcgagggtga catctccacg ggcggtggca actccatcca ggccattctg1201 cactttactt acaggaccct gtgtcgtggg gagtattcaa tcctgcatcg ccttaaagca1261 gccatgggga cagcatggcg ggactatatt tccatctgcg ggcttcgtac acacggagag1321 ctgggcgagc accccgtctc ggagctcatc tacatccaca gcaaggtgct catcgcagat1381 gaccggacag tcatcattgg ttctgcaaac atcaatgacc ggagcttgct ggggaagcgg1441 gacagtgagt tggccgtgct ggtcgaggac acagagacgg aaccatccct catgaatggg1501 gcagagtatc aggcgggcag gtttgccttg agtctgcgga agcactgctt cagtgtgatt1561 cttggagcaa atacccggcc agacttggat ctccgagacc ccatctgtga tgacttcttc1621 cagttgtggc aagacatggc tgagagcaac gccaatatct atgagcagat cttccgctgc1681 ctgccatcca atgccacgcg ttccctgcgg actctccggg agtacgtggc cgtggagccc1741 ttggccacgg tcagtccccc cttggctcgg tctgagctca cccaggtcca gggccacctg1801 gtccacttcc ccctcaagtt cctagaggat gagtctttgc tgcccccgct gggtagcaag
1861 gagggcatga tccccccaga agtgtggaca tag<210>2<211>631<212>PRT<213>人B細(xì)胞骨髓瘤(Daudi細(xì)胞株)<400>21 Glu Ile Thr Glu Leu Ala Gln Gly Pro Gly Arg Asp Phe Leu Gln Leu17 His Arg His Asp Ser Tyr Ala Pro Pro Arg Pro Gly Thr Leu Ala Arg33 Trp phe Val Asn Gly Ala Gly Tyr Phe Ala Ala Val Ala Asp Ala Ile49 Leu Arg Ala Gln Glu Glu Ile Phe Ile Thr Asp Trp Trp Leu Ser Pro65 Glu Val Tyr Leu Lys Arg Pro Ala His Ser Asp Asp Trp Arg Leu Asp81 Ile Met Leu Lys Arg Lys Ala Glu Glu Gly Val Arg Val Ser Ile Leu97 Leu Phe Lys Glu Val Glu Leu Ala Leu Gly Ile Asn Ser Gly Tyr Ser113 Lys Arg Ala Leu Met Leu Leu His Pro Asn Ile Lys Val Met Arg His129 Pro Asp Gln Val Thr Leu Trp Ala His His Glu Lys Leu Leu Val Val145 Asp Gln Val Val Ala Phe Leu Gly Gly Leu Asp Leu Ala Tyr Gly Arg161 Trp Asp Asp Leu His Tyr Arg Leu Thr Asp Leu Gly Asp Ser Ser Glu177 Ser Ala Ala Phe Gln Pro Pro Thr Pro Arg Pro Asp Ser Pro Ala Thr193 Pro Asp Leu Ser His Asn Gln Phe Phe Trp Leu Gly Lys Asp Tyr Ser209 Asn Leu Ile Thr Lys Asp Trp Val Gln Leu Asp Arg Pro Phe Glu Asp225 Phe Ile Asp Arg Glu Thr Thr Pro Arg Met Pro Trp Arg Asp Val Gly241 Val Val Val His Gly Leu Pro Ala Arg Asp Leu Thr Arg His Phe Ile257 Gln Arg Trp Asn Phe Thr Lys Thr Thr Lys Ala Lys Tyr Lys Thr Pro273 Thr Tyr Pro Tyr Leu Leu Pro Lys Ser Thr Ser Thr Ala Asn Gln Leu289 Pro Phe Thr Leu Pro Gly Gly Gln Cys Thr Thr Val Gln Val Leu Arg305 Ser Val Asp Arg Trp Ser Ala Gly Thr Leu Glu Asn Ser Ile Leu Asn321 Ala Tyr Leu His Thr Ile Arg Glu Ser Gln His Phe Leu Tyr Ile Glu337 Asn Gln Phe Phe Ile Se Cys Ser Asp Gly Arg Thr Val Leu Asn Lys353 Val Gly Asp Glu Ile Val Asp Arg Ile Leu Lys Ala His Lys Gln Gly369 Trp Ser Tyr Arg Val Tyr Val Leu Leu Pro Leu Leu Pro Gly Phe Glu385 Gly Asp Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Ser Ile Gln Ala Ile Leu His401 Phe Thr Tyr Arg Thr Leu Cys Arg Gly Glu Tyr Ser Ile Leu His Arg417 Leu Lys Ala Ala Met Gly Thr Ala Trp Arg Asp Tyr Ile Ser Ile Cys
433 Gly Gle Arg Thr His Gly Glu Leu Gly Glu His Pro Val Ser Glu Leu449 Ile Tyr Ile His Ser Lys Val Leu Ile Ala Asp Asp Arg Thr Val Ile465 Ile Gly Ser Ala Asn Ile Asn Asp Arg Ser Leu Leu Gly Lys Arg Asp481 Ser Glu Leu Ala Val Leu Val Glu Asp Thr Glu Thr Glu Pro Ser Leu497 Met Asn Gly Ala Glu Tyr Gln Ala Gly Arg Phe Ala Leu Ser Leu Arg513 Lys His Cys Phe Ser Val Ile Leu Gly Ala Asn Thr Arg Pro Asp Leu529 Asp Leu Arg Asp Pro Ile Cys Asp Asp Phe Phe Gln Leu Trp Gln Asp545 Met Ala Glu Ser Asn Ala Asn Ile Tyr Glu Gln Ile Phe Arg Cys Leu561 Pro Ser Asn Ala Thr Arg Ser Leu Arg Thr Leu Arg Glu Tyr Val Ala577 Val Glu Pro Leu Ala Thr Val Ser Pro Pro Leu Ala Arg Ser Glu Leu593 Thr Gln Val Gln Gly His Leu Val His Phe Pro Leu Lys Phe Leu Glu609 Asp Glu Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Ser Lys Glu Gly Met Ile Pro625 Pro Glu Val Trp Thr ***<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<400>3GGAATTCGGTCCTTGATTCTCAAGTGC<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>4CCTTGGTGATCAGATTGCTG<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列
<400>5CAGCAATCTTATCACCAAGG<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>6CACGACACAGTGTCCTGTAAG<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>7CTTCAGGATCCTGTCCATAATC<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>8GACTGTGGACAGGATCCTGAAG<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>9CTTACAGCACCCTGTGTCGTG
<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>10GGGGTACCCTATGTCCTCACTTCTAGGG
權(quán)利要求
1.一種新的人重組磷脂酶D2(rhPLD2)多肽，它包含具有SEQ ID NO.2氨基酸序列的多肽、或其保守性變體、生物活性片段、類似物或衍生物。
2.能編碼該多肽的多核苷酸，它包含選自下組的一種核苷酸序列或其變體(a)編碼具有序列表<210>2氨基酸序列的多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸；(c)與(a)或(b)的多核苷酸序列具有至少88％相同性的多核苷酸；更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有序列表<210>1中414-504位的序列；和(b)具有序列表<210>1中615-789位的序列；和(c)具有序列表<210>1中912-1407位的序列；和(d)具有序列表<210>1中1353-1455位的序列。
3.如權(quán)利要求1或2所述的多核苷酸的變異體，其編碼與該有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片斷、類似物和衍生物；此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體；這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體；如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個(gè)多核苷酸的替換形式，它可能是一個(gè)或多個(gè)核苷酸的取代、缺失或插入，但不會(huì)從實(shí)質(zhì)上改變其編碼的多肽的功能。
4.一種新的多肽一人重組磷脂酶D2，其基本上是由序列表<210>2所示的氨基酸序列組成的；該多肽可以是天然純化的產(chǎn)物，或是化學(xué)合成的產(chǎn)物，或使用重組技術(shù)從原核或真核宿主(例如，細(xì)菌、酵母、高等植物、昆蟲(chóng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞)中產(chǎn)生；根據(jù)重組生產(chǎn)方案所用的宿主，該的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的；該多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
5.含有編碼人重組磷脂酶D2的多核苷酸的重組載體，特別是表達(dá)載體；含有編碼人重組磷脂酶D2的多核苷酸的基因工程化宿主細(xì)胞；該中，編碼人重組磷脂酶D2的多核苷酸序列可插入到載體中，以構(gòu)成含有該所述多核苷酸的重組載體；包括本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動(dòng)物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其它載體；人重組磷脂酶D2的多核苷酸或含有該多核苷酸的重組載體可轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)入宿主細(xì)胞，以構(gòu)成含有該多核苷酸或重組載體的基因工程化宿主細(xì)胞；術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”指原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動(dòng)物細(xì)胞；代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；細(xì)菌細(xì)胞如鼠傷寒沙門(mén)氏菌；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；昆蟲(chóng)細(xì)胞如果蠅S2或Sf9；動(dòng)物細(xì)胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤細(xì)胞等。
6.權(quán)利要求1、2、4或5所述的人重組磷脂酶D2的生產(chǎn)方法，用該所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行；當(dāng)宿主為原核生物如大腸桿菌時(shí)，能吸收DNA的感受態(tài)細(xì)胞可在指數(shù)生長(zhǎng)期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知；可供選擇的是用MgCl2；如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電穿孔的方法進(jìn)行；當(dāng)宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法磷酸鈣共沉淀法，或者常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等；通過(guò)常規(guī)的重組DNA技術(shù)，利用該的多核苷酸序列可用來(lái)表達(dá)或生產(chǎn)重組的人重組磷脂酶D2；一般來(lái)說(shuō)有以下步驟(1)用該的編碼人重組磷脂酶D2的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)合適的宿主細(xì)胞；(2)在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細(xì)胞；(3)從培養(yǎng)基或細(xì)胞中分離、純化蛋白質(zhì)；在步驟(2)中，根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基；在適于宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；當(dāng)宿主細(xì)胞生長(zhǎng)到適當(dāng)?shù)募?xì)胞密度后，用合適的方法(如溫度轉(zhuǎn)換或化學(xué)誘導(dǎo))誘導(dǎo)選擇的啟動(dòng)子，將細(xì)胞再培養(yǎng)一段時(shí)間；在步驟(3)中，重組多肽可包被于細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外；如果需要，可利用其物理的、化學(xué)的和其它特性通過(guò)各種分離方法分離和純化重組的蛋白；這些方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的；這些方法包括但并不限于常規(guī)的復(fù)性處理、蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超聲波處理、超離心、分子篩層析(凝膠過(guò)濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLc)和其它各種液相層析技術(shù)及這些方法的結(jié)合。
7.一種人重組磷脂酶D2的抗體，及涉及一種能與該多肽特異性結(jié)合的抗體。
8.一種人重組磷脂酶D2的多肽或多核苷酸在制備抗炎、抗哮喘、抗腫瘤等藥物中的應(yīng)用。
9.一種人重組磷脂酶D2，其特征在于1mg的rhPLD2的活性大約相當(dāng)于65mu PLD；其生物學(xué)活性有效范圍約在0.5μg/ml-150mg/ml；最佳范圍0.5μg/ml-150μg/ml；人重組磷脂酶D2的多肽以及該多肽的拮抗劑、激動(dòng)劑和抑制劑可直接用于疾病治療，例如，可治療惡性腫瘤、各類炎癥、哮喘等；包括將該的多肽、多核苷酸及其模擬物、激動(dòng)劑、拮抗劑和抑制劑與合適的藥物載體組合后使用；這些載體可以是水、葡萄糖、乙醇、鹽類、緩沖液、甘油以及它們的組合；組合物包含安全有效量的多肽或拮抗劑以及不影響藥物效果的載體和賦形劑。
10.含有一種或多種容器的藥盒或試劑盒，其特征在于容器中裝有一種或多種該的藥用組合物成分；與這些容器一起，可以有由制造、使用或銷售藥品或生物制品的政府管理機(jī)構(gòu)所給出的指示性提示，該提示反映出生產(chǎn)、使用或銷售的政府管理機(jī)構(gòu)許可其在人體上施用；此外，該的多肽可以與其它的治療化合物結(jié)合使用；藥物組合物可以以方便的方式給藥，如通過(guò)局部、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、霧化、鼻內(nèi)或皮內(nèi)的給藥途徑；人重組磷脂酶D2以有效地治療或預(yù)防具體的適應(yīng)癥的量來(lái)給藥；其中所述的藥物為霧化劑、片劑、膠囊或混懸劑。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人重組磷脂酶D2及其制備方法和在藥物制備中的應(yīng)用，本發(fā)明描述了人重組磷脂酶D2(recombinant human phosphol ipase D2，rhPLD2)，一種人磷脂酶D2變構(gòu)體極其編碼該蛋白多肽的多核苷酸序列。同時(shí)闡明了該蛋白多肽和多核苷酸的制備方法并就其抗炎、抗哮喘、抗白血病細(xì)胞(HL－60)凋亡等功能的研究做了科學(xué)的表述。尤為重要的是指明了該蛋白多肽和多核苷酸的臨床應(yīng)用價(jià)值和巨大的開(kāi)發(fā)前景。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1904041SQ20051001917
公開(kāi)日2007年1月31日 申請(qǐng)日期2005年7月25日 優(yōu)先權(quán)日2005年7月25日
發(fā)明者朱玲 申請(qǐng)人:福建醫(yī)科大學(xué)