專利名稱：聚乙二醇修飾的科博肽及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種科博肽及其制備方法和用途，特別是涉及一種聚乙二醇修飾的科博肽及其制備方法和用途。
二.
背景技術：
蛋白質藥物臨床應用的安全性和有效性一直是世界各國醫學工作者關注和研究的熱點，由于其穩定性差，血漿清除率高，體內半衰期短，易產生抗原抗體反應，在臨床治療中受到很大的限制。因此研究人員采用了各種藥物傳遞技術來提高蛋白質藥物的療效，降低蛋白質藥物的副作用，包括采用不同的給藥途徑(如口服，鼻腔給藥，透皮吸收)，不同的載體(如微球，脂質體，紅細胞，單克隆抗體)，不同高分子材料(如多糖)，不同藥物釋放技術(如控釋緩釋技術，前藥)。而目前在藥物傳遞技術中研究最為廣泛的就是聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾技術，這是近三十年來發展起來的一種用于改進蛋白質類藥物體內藥動學性質的新技術，它將活化的聚乙二醇分子鍵合到蛋白質分子表面上，影響蛋白質的空間結構，最終導致蛋白質各種生物化學性質的改變，目前大多數的研究是將多肽分子中的氨基作為修飾位點。制備蛋白質和聚乙二醇結合物的最常用的方法是利用PEG活化后形成的親電子基團和蛋白質上的氨基進行反應，反應后可以在一個蛋白分子上共價連接數個聚合物長鏈，聚合物長鏈的數目取決于蛋白質分子上可供結合的位點數(自由氨基和其他親電子基團)、修飾劑的化學性質，修飾劑的過量比例及反應條件。PEG的衍生物有芳化試劑(含氯化芳基基團，可以與蛋白質上的親核基團反應)、酰化試劑(含酰基，與蛋白質通過酰基鍵相連)或烷化試劑(與蛋白質上的氨基形成仲氨連接)。研究證實，通過共價鍵用聚乙二醇來修飾蛋白質表面的氨基酸殘基可以有效降低蛋白質的免疫原性，提高血漿半衰期，減少給藥次數。但此方法修飾產物的生物活性保留較低和修飾后產物難于純化的不足，不能滿足蛋白質藥物在臨床應用方面的要求。
科博肽是從蛇毒中分離提純的低分子多肽，其化學名稱為蛇毒神經毒素(neurotoxin)，它是由68個氨基組成的單鏈多肽，四個二硫鍵維系其空間結構，分子量在7000道爾頓左右。長期的臨床使用表明，科博肽具有良好的鎮痛效果，具有無成癮性、無耐受性，鎮痛作用持久，使用方便的特點，對停用或禁戒海洛因后出現的各種生理和精神依賴癥狀均有一定療效，應用范圍廣，尤其適用于慢性、頑固性、持續性疼痛治療，出現療效后可減量維持。由于對人體而言科博肽屬異源蛋白，所以在使用過程中同樣具有蛋白質藥物所共有的特點，如具有免疫原性，半衰期短，穩定性差等，其中由科博肽引起的過敏反應已有報道(劉文，陳慧，鄭惠科洛曲片致過敏性休克，藥物不良反應雜志[J].2001，(3)196.)。因此，有必要采用蛋白質修飾技術以獲得低免疫原性的科博肽，從而改善該蛋白質的藥物動力學以提高其耐受性和減少給藥次數。
三.
發明內容
本發明的目的是克服科博肽作為藥物使用所存在的不足，采用聚乙二醇修飾技術對科博肽的氨基進行修飾，來獲得聚乙二醇修飾的科博肽。
本發明的技術方案是一種聚乙二醇修飾的科博肽，其結構通式為 其中m為單甲氧基的縮寫，n1＝0～3，優選n1＝2，R代表去除一個氨基NH2的科博肽分子，聚乙二醇修飾的科博肽的分子量為10000～110000。
所述的聚乙二醇修飾的科博肽的分子量優選值為15000～70000。
所述的聚乙二醇修飾的科博肽的制備方法為在科博肽溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，調節其pH值在4.5-9.5范圍，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，所加入的活化的聚乙二醇或其衍生物與科博肽的摩爾比為0.1～100∶1，反應溫度為4～40℃，反應時間為5～120分鐘，將反應混合液采用凝膠過濾色譜柱進行色譜分離，即可得到聚乙二醇修飾的科博肽。
制備反應按下式進行 其中R-NH2為科博肽，mPEG為CH3O-(CH2CH2O)n2-CH2CH2OHm＝單甲氧基(monomethoxy)的縮寫，n2＝44～2200，優選n2＝100～700；R代表代表去除一個氨基(NH2)的科博肽分子。
所述的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物鏈的分子量為2000～100000。
所述的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物鏈的分子量的優選值為5000～30000。
所述的科博肽為從蛇毒中提取的科博肽，或為用基因工程手段制備的重組科博肽，所述的磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉緩沖液，或為磷酸氫二鉀緩沖液。
所述的聚乙二醇衍生物為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000，或為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000，或為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000，或為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000，或為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000，或為丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000，或為丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000，或為丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000，或為丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000，或為丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000。
在聚乙二醇修飾的科博肽的制備方法中，優選的反應條件為調節pH值在6.0～7.0范圍，反應溫度為20～25℃，反應時間為25～35分鐘。
所加入的活化的聚乙二醇或其衍生物與科博肽的優選摩爾比為8～12∶1。
聚乙二醇修飾的科博肽在制備高效低毒的鎮痛藥物上的應用。
本發明的積極有益效果是1.本發明的聚乙二醇修飾的科博肽能夠基本保持科博肽的生物活性，同時它比未修飾的科博肽有較低的免疫原性和更好的穩定性，因此作為鎮痛藥物，它比未修飾的科博肽有更大的優越性。
研究試驗用小鼠扭體法比較聚乙二醇修飾科博肽和科博肽的鎮痛效果，用小鼠扭體抑制率來表示鎮痛效果，結果如下表
結果表明科博肽經聚乙二醇修飾后，其鎮痛的生物活性得到了較高保留，同時作用時間延長。
2.同科博肽比較，本發明聚乙二醇修飾的科博肽的熱穩定性明顯增加熱穩定性試驗取科博肽和聚乙二醇修飾的科博肽(在液體狀態，無任何保護劑)，分別置于25℃、37℃、45℃、60℃條件下，定時取樣測定其生物活性。結果表明，科博肽在60℃下30min內活性不變，而聚乙二醇修飾的科博肽在90min內活性不變；在25℃時科博肽10天內活性不變，而聚乙二醇修飾的科博肽在30天內活性不變，因此，可以斷定聚乙二醇修飾的科博肽的熱穩定性明顯增加。
3.同科博肽比較，本發明的聚乙二醇修飾的科博肽抵抗胰蛋白酶水解的能力明顯增加
酶穩定性試驗取0.1％胰蛋白酶溶液(pH7.8)2.7ml，分別加入0.3ml科博肽和聚乙二醇修飾的科博肽樣品，37℃水浴，于0、0.5、1、2、4h取樣0.3ml，測定樣品的生物活性，結果表明科博肽在0.5h內活性迅速降到原來的20％，而聚乙二醇修飾的科博肽在1h內活性僅降到原來的50％，因此，聚乙二醇修飾的科博肽抵抗胰蛋白酶水解的能力明顯增加。
4.同科博肽比較，本發明的聚乙二醇修飾的科博肽的毒性明顯降低聚乙二醇修飾的科博肽與科博肽的急性毒性試驗比較研究試驗將四種不同濃度的聚乙二醇修飾的科博肽和科博肽注射至體重為20-25g的小鼠的腹腔內，每種濃度注射8只小鼠，計算聚乙二醇修飾科博肽和科博肽引起50％死亡的劑量(LD50)。(LD50計算方法參見Reed LJ and Muench H.Am.J.Hygiene，1938；27493.)，結果測定出科博肽LD50為0.20mg/kg，聚乙二醇修飾的科博肽10.0mg/kg。因此，科博肽經聚乙二醇修飾后，其毒性顯著降低。
5.同科博肽比較，本發明的聚乙二醇修飾的科博肽的免疫原性顯著降低。
聚乙二醇修飾的科博肽對實驗動物免疫原性的研究試驗以家兔作為制備抗血清的實驗動物，采用福氏佐劑免疫法，并分別以科博肽和聚乙二醇修飾的科博肽作為抗原，劑量均為20μg/kg/次，每周1次，共5次。
分別以科博肽和聚乙二醇修飾的科博肽作為抗原，用雙向免疫擴散法測定它們各自抗血清的效價，測定結果為科博肽組抗血清的效價為1∶16；聚乙二醇修飾的科博肽組抗血清的效價測不出。
分別以科博肽和聚乙二醇修飾的科博肽作為抗原，然后用科博肽組的抗血清作為第一抗體，再以辣根過氧化酶(HRP)標記的羊抗兔IgG作為第二抗體，用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定它們各自的免疫原性，測定結果為科博肽組為陽性，聚乙二醇修飾的科博肽組為陰性。
以上結果表明同科博肽比較，聚乙二醇修飾的科博肽的免疫原性顯著降低。
四.
圖1是聚乙二醇修飾的科博肽的分離純化圖譜；圖2是聚乙二醇修飾的科博肽的HPLC分析圖譜；
圖3是科博肽的HPLC分析圖譜。
五.
具體實施例方式實施例一聚乙二醇修飾的科博肽的分離純化與鑒定取1.1mg/ml的科博肽溶液2ml，加磷酸鹽緩沖液使溶液的pH值為6.5，再加入mPEG-SPA-5000固體15.7mg，溶解，混勻，于25℃反應30min，加入100mg甘氨酸終止反應。
取上述反應液，用截流分子量為10000的超濾膜濃縮至2ml，上柱分離。色譜條件如下層析填料Superdex 75pre grade柱規格1.6×60cm流動相0.05M Na2HPO4-NaH2PO4，pH7.0流速0.4ml/min檢測波長215nm收集每管2ml結果得到兩個洗脫峰，分別為聚乙二醇修飾的科博肽和科博肽，具體結果參見圖1，圖中保留體積65.68的峰為聚乙二醇化科博肽峰，保留體積為72.56的峰為科博肽峰。
采用高效液相色譜(HPLC)對得到的組分峰進行分析，合并相同組分。色譜條件如下色譜柱Symmetry300TMC45μm；3.9×150mm檢測波長215nm流動相A)水/三氟乙酸(100/0.1)B)水/三氟乙酸/乙腈(10/0.1/90)梯度洗脫方法B(0～18min，20％～100％)流速1.0ml/min柱溫37℃，HPLC分析結果表明得到的聚乙二醇修飾的科博肽和科博肽的純度均在95％以上，具體結果參見圖2和圖3，圖中保留時間為12.850min的為聚乙二醇修飾科博肽，保留時間為12.440min的為科博肽。
采用SDS-PAGE對聚乙二醇修飾科博肽和科博肽進行分子量測定，結果表明聚乙二醇修飾科博肽的分子量在12000道爾頓，科博肽的分子量為7000道爾頓，二者相差5000左右，這表明該聚乙二醇修飾科博肽為單修飾，也即是結合了一分子的聚乙二醇。
實施例二取1.5mg/ml的科博肽溶液2ml，加2ml磷酸氫二鈉緩沖液使溶液的pH值為6.5，再加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固體1.6mg，溶解，混勻，取0.3ml置于帶塞試管中，然后置于4℃條件下進行反應，30min后終止反應，將反應混合液采用凝膠過濾色譜柱進行色譜分離，即可得到聚乙二醇修飾的科博肽，比較修飾率，確定修飾條件，此時的修飾率為40％。
實施例三本實施例與實施例二基本相同，相同之處不重述，不同之處在于在10℃條件下進行反應，其修飾率為50％。
實施例四本實施例與實施例二基本相同，相同之處不重述，不同之處在于在25℃條件下進行反應，其修飾率為60％。
實施例五本實施例與實施例二一基本相同，相同之處不重述，不同之處在于在37℃條件下進行反應，其修飾率為45％。
從上述實施例二至實施例五可以得出反應溫度在25℃時，所得到的聚乙二醇修飾的科博肽的修飾率最高。
實施例六取1.5mg/ml的科博肽溶液2ml，加2ml磷酸氫二鈉緩沖液，使溶液的pH值為6.5，再加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固體1.6mg，溶解，混勻，取0.3ml置于帶塞試管中，然后置于25℃條件下進行反應，5min后終止反應，將反應混合液采用凝膠過濾色譜柱進行色譜分離，即可得到聚乙二醇修飾的科博肽，比較修飾率，確定修飾條件，此時的修飾率為40％。
實施例七本實施例與實施例六基本相同，相同之處不重述，不同之處在于反應時間為10min，其修飾率為45％。
實施例八本實施例與實施例六基本相同，相同之處不重述，不同之處在于反應時間為15min，其修飾率為50％。
實施例九本實施例與實施例六基本相同，相同之處不重述，不同之處在于反應時間為30min，其修飾率為60％。
實施例十本實施例與實施例六基本相同，相同之處不重述，不同之處在于反應時間為60min，其修飾率為60.5％。
實施例十一本實施例與實施例六基本相同，相同之處不重述，不同之處在于反應時間為120min，其修飾率為60.8％。
從上述實施例六至實施例十一可以得出反應時間超過30min后，所得到的聚乙二醇修飾的科博肽的修飾率沒有明顯提高。
實施例十二取0.5mg/ml的科博肽溶液2ml，置于帶塞試管中，加入磷酸氫二鈉緩沖液，使溶液的pH值為4.5，再加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固體7.0mg，溶解，混勻，在25℃條件下反應30min后終止反應，將反應混合液采用凝膠過濾色譜柱進行色譜分離，即可得到聚乙二醇修飾的科博肽，比較修飾率，確定修飾條件，此時的修飾率為40％。
實施例十三本實施例與實施例十二基本相同，相同之處不重述，不同之處在于溶液的pH值調為5.5，其修飾率為50％。
實施例十四本實施例與實施例十二基本相同，相同之處不重述，不同之處在于溶液的pH值調為6.5，其修飾率為60％。
實施例十五本實施例與實施例十二基本相同，相同之處不重述，不同之處在于溶液的pH值調為7.5，其修飾率為50％。
實施例十六本實施例與實施例十二基本相同，相同之處不重述，不同之處在于溶液的pH值調為8.5，其修飾率為40％。
實施例十七本實施例與實施例十二基本相同，相同之處不重述，不同之處在于溶液的pH值調為9.5，其修飾率為35％。
從上述實施例十二至實施例十七可以得出反應溶液的pH值調為6.5時，所得到的聚乙二醇修飾的科博肽的修飾率最高。
實施例十八取1.5mg/ml的科博肽溶液2ml，加2ml磷酸氫二鈉緩沖液，使溶液的pH值為6.5，取0.3ml置于帶塞試管中，然后加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固體0.016mg(相當于丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000同科博肽的摩爾比為0.1∶1)，溶解，混勻，反應30min后終止反應，將反應混合液采用凝膠過濾色譜柱進行色譜分離，即可得到聚乙二醇修飾的科博肽，比較修飾率，確定修飾條件，此時的修飾率為50％。
實施例十九本實施例與實施例十八基本相同，相同之處不重述，不同之處在于加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固體0.16mg(相當于丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000同科博肽的摩爾比為1∶1)，此時的修飾率為55％。
實施例二十本實施例與實施例十八基本相同，相同之處不重述，不同之處在于加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固體1.6mg(相當于丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000同科博肽的摩爾比為10∶1)，此時的修飾率為60％。
實施例二十一本實施例與實施例十八基本相同，相同之處不重述，不同之處在于加入丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)固體16mg(相當于丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000同科博肽的摩爾比為100∶1)，此時的修飾率為60％。
從上述實施例十八至實施例二十一可以得出當丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)同科博肽的摩爾比為10∶1時，所得到的聚乙二醇修飾的科博肽的修飾率最高。
用聚乙二醇的其它衍生物如丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000(mPEG-SBA-2000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SBA-5000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000(mPEG-SBA-10000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000(mPEG-SBA-20000)、丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000(mPEG-SBA-30000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000(mPEG-SPA-2000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000(mPEG-SPA-10000)、丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000(mPEG-SPA-20000)或丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000(mPEG-SPA-30000)分別代替上述實施例中的丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000(mPEG-SPA-5000)，可以組成多個實施例，得到與實施例二至實施例二十一相似的結果，這些都在本發明的范圍之內，在此不一一詳述。
權利要求
1.一種聚乙二醇修飾的科博肽，其結構通式為 其中m為單甲氧基的縮寫，n1＝0～3，R代表去除一個氨基NH2的科博肽分子，聚乙二醇修飾的科博肽的分子量為10000～110000。
2.根據權利要求1所述的聚乙二醇修飾的科博肽，其特征是n1＝2，聚乙二醇修飾的科博肽的分子量為15000～70000。
3.一種權利要求1所述的聚乙二醇修飾的科博肽的制備方法，在科博肽上連接聚乙二醇或聚乙二醇衍生物鏈，其特征是在科博肽溶液中，加入磷酸鹽緩沖液，調節其pH值在4.5-9.5范圍，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，所加入的活化的聚乙二醇或其衍生物與科博肽的摩爾比為0.1～100∶1，反應溫度為4～40℃，反應時間為5～120分鐘，將反應混合液采用凝膠過濾色譜柱進行色譜分離，即可得到聚乙二醇修飾的科博肽。
4.根據權利要求3所述的聚乙二醇修飾的科博肽的制備方法，其特征是所述的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物鏈的分子量為2000～100000。
5.根據權利要求4所述的聚乙二醇修飾的科博肽的制備方法，其特征是所述的聚乙二醇或聚乙二醇衍生物鏈的分子量為5000～30000。
6.根據權利要求3所述的聚乙二醇修飾的科博肽的制備方法，其特征是所述的科博肽為從蛇毒中提取的科博肽，或為用基因工程手段制備的重組科博肽，所述的磷酸鹽緩沖液為磷酸氫二鈉緩沖液，或為磷酸氫二鉀緩沖液。
7.根據權利要求3所述的聚乙二醇修飾的科博肽的制備方法，其特征是所述的聚乙二醇衍生物為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000，或為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000，或為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000，或為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000，或為丙酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000，或為丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯2000，或為丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯5000，或為丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯10000，或為丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯20000，或為丁酸甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺酯30000。
8.根據權利要求3所述的聚乙二醇修飾的科博肽的制備方法，其特征是調節pH值在6.0～7.0范圍，反應溫度為20～25℃，反應時間為25～35分鐘。
9.根據權利要求3所述的聚乙二醇修飾的科博肽的制備方法，其特征是所加入的活化的聚乙二醇或其衍生物與科博肽的摩爾比為8～12∶1。
10.聚乙二醇修飾的科博肽在制備高效低毒的鎮痛藥物上的應用。
全文摘要
本發明涉及一種科博肽及其制備方法和用途，特別是涉及一種聚乙二醇修飾的科博肽及其制備方法和用途。聚乙二醇修飾的科博肽的結構通式為(Ⅰ)，其制備方法為在科博肽溶液中，加入磷酸氫二鈉溶液，調節其pH值在4.5－9.5范圍，然后加入活化的聚乙二醇或其衍生物，所加入的活化的聚乙二醇或其衍生物與科博肽的摩爾比為0.1～100∶1，反應溫度為4～40℃，反應時間為5～120分鐘，將反應混合液采用凝膠過濾色譜柱進行色譜分離，即可得到聚乙二醇修飾的科博肽。本發明的聚乙二醇修飾的科博肽能夠基本保持科博肽的生物活性，同時它比未修飾的科博肽有較低的免疫原性和更好的穩定性，因此作為鎮痛藥物，它比未修飾的科博肽有更大的優越性。
文檔編號A61P25/04GK1730494SQ20051001781
公開日2006年2月8日 申請日期2005年7月22日 優先權日2005年7月22日
發明者任晚瓊, 朱天新, 劉永杰, 劉國良, 魏舒 申請人:河南省中泰藥業有限公司