專利名稱：嘧啶(硫)酮類化合物在制藥中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及嘧啶(硫)酮類化合物在制備治療分泌型腹瀉及常染色體顯性遺傳性多囊腎病藥物中的應用。本發明還涉及一種建立非人類哺乳動物囊性纖維化模型的方法。
背景技術：
囊性纖維化跨膜電導調節因子(cystic fibrosis transmembrane conductanceregulator，CFTR)是一種受環腺苷單磷酸(adenosine 3’5’-cyclic monophosphate acidcAMP)激活的Cl-通道蛋白，該蛋白在哺乳類動物的氣道、小腸、腎臟、胰腺及睪丸等處的上皮細胞中表達。激素(如β-腎上腺素)或者毒素(如霍亂毒素)等通過提高體內的cAMP水平來激活依賴于cAMP激活的蛋白激酶，由此引起CFTR的磷酸化，從而使CFTR Cl-通道開放。CFTR在上皮細胞上大量表達，它為Cl-跨越上皮細胞的頂膜提供了通道，同時它還是跨上皮細胞的鹽和水的轉運的調控點。CFTR Cl-通道的作用與很多種疾病如囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)、男性不育、多囊腎病及分泌型腹瀉有關。
一、CFTR與分泌型腹瀉腹瀉可因暴露于各種病原或致病因子而引發，這些因素包括霍亂毒素、致病性大腸桿菌內毒素、AIDS引起的腹瀉、潰瘍性結腸炎引起的腹瀉、食物中毒或通過CFTR引起腸道分泌增加的其它因素。分泌型腹瀉是發展中國家兒童死亡的主要原因，大約每年有500萬兒童死于此種疾病(Gabriel et al.，1994 Science 166107-109))。在經濟發達國家，腹瀉的致病性和致死性也較高。在美國，每年有8百萬人患有急性腹瀉，入院人數達250000，死亡人數超過500人。此外，傳染性分泌型腹瀉也是危害多種經濟動物的主要疾病之一。應用小鼠的研究表明CFTR Cl-通道是各種激動劑引起腸道Cl-分泌的最終共同途徑(Snyderet al.1982 Bull.World Health Organ.60605-613；Chao et al 1994 EMBO J.131065-1072；Kimberg et al.1971 J.Clin.Invest.501218-1230)。
液體分泌在胃腸道生理中起至關重要的作用。正常情況下腸道主要對腸腔中的液體、電解質和營養物質進行吸收，同時進行少量的基礎分泌維持腸粘膜濕化和幫助混合進入腸腔中的食物。腸道的液體分泌是腸腺上皮細胞從基底測向腸腔側主動轉運Cl-所驅動的跨上皮液體移動過程(Thiagarajah JR.，et al.，2003，Current Opinion in Pharmacology 3594-599)。腸腺上皮細胞基底膜上的Na+K+-ATP酶和K+通道作用下產生的Na+和Cl-濃度差驅動Cl-從基底膜一側通過NKCC共轉運器進入細胞內；Cl-靠電化學作用通過頂膜上的CFTR氯離子通道分泌進入腸腔；Na+和水隨著Cl-通過細胞間途徑進入腸腔。許多生理和病理因素可以激活Cl-和腸液的分泌。例如腸道分泌的神經調節途徑通過腸道嗜鉻細胞釋放五羥色氨，導致膽堿能和血管活性腸肽能神經元的激活和腺上皮內cAMP和Ca+增加，進而激活Cl-通道和腸液分泌過程。炎癥介質如前列腺素、組胺和白細胞介素等也可通過不同的信號途徑激活腸道Cl-分泌。另外，核苷酸和嘌呤能信號途徑也能通過Ca++和cAMP信號途徑刺激腸道Cl-分泌。
CFTR氯離子通道在腸道液體分泌活動中起至關重要的樞紐作用。CFTR敲除小鼠由于腸道分泌減少和吸收增加而引起腸梗阻(Grubb BR.，et al.，1997，Am J Physiol，273258-266)；霍亂毒素在正常小鼠引起小腸液體的大量分泌，而在CFTR敲除小鼠卻無此作用。另外，體外實驗也證明各種激動劑引起的腸粘膜和培養的腸上皮細胞Cl-分泌可被陰離子通道阻斷劑格列苯脲和5-硝基-2-(3-苯丙基胺)苯甲酸[5-nitro2-(3-phenylpropylamino)benzoate，NPPB]抑制。
由于腹瀉最終都會導致脫水，因此，治療的目標之一是糾正脫水，目前通常采用補液和喂食等方法。高親和力的CFTR抑制劑在治療分泌型腹瀉方面將具有重要的作用。雖然聯苯胺-2-羧酸(diphenylamine-2-carboxylate，DPC)、NPPB和格列苯脲在高濃度的條件下也能夠抑制CFTR的活性，但是它們的上述活性是非特異性的(Cabantchik et al.，1992，Am.J.Physiol.262C803-C827；McDonough et al.，1994，Neuron 13623-634；Schultzet al.，1999，Physiol.Rev.79S109-S144.Edwards et al.，1993，Br.J.Pharmacol.1101280-1281；Rabe et al.，1995，Pflugers Arch.429659-662；Yamazaki et al.，1997，Circ.Res.81101-109)。到目前為止，還沒有通過特異性抑制CFTR Cl-通道功能來治療分泌型腹瀉的有效藥物。
二、CFTR與常染色體顯性遺傳性多囊腎病多囊腎病(Polycystic kidney disease，PKD)是一種常見的遺傳性疾病，以腎小管形成多個進行性增大的囊腫為特征，是終末期腎衰的主要原因之一(Wilson PD.2004，NEngl J Med.350151-164)。多囊腎病按遺傳方式可分為常染色體顯性遺傳性多囊腎病(autosomal dominant polycystic kidney disease，ADPKD)和常染色體隱性遺傳性多囊腎病(autosomal recessive polycystic kidney disease，ARPKD)兩種。ARPKD發病率低，約為1/20000，多見于嬰幼兒，患兒多在早期死亡。ADPKD的人群發病率較高，約為1/400～1/1000。大約50％的ADPKD患者在60歲前進入終末期腎衰，臨床上接受腎移植和透析的患者中8～10％是ADPKD的終末期腎衰患者(Hateboer N.，et al.，1999，Lancet，353103-107)。ADPKD除了腎臟表現外，病變還涉及其他多個器官，例如肝臟、胰腺、脾臟的囊腫形成以及顱內動脈瘤、二尖瓣脫垂等。目前已經發現三個ADPKD的致病基因位于16p13.3的PKD1、位于4q21-23的PKD2和PKD3(Ariza M.，et al.，1997，J Med Genet，34587-589)。ADPKD基因都比較大且突變譜比較復雜，無明顯的突變熱點，各種突變分布于整個基因。ADPKD的發病機理在細胞和分子水平上還不十分清楚，致使ADPKD至今仍缺乏有效治療手段。
ADPKD病理學變化包括腎小管上皮細胞異常增生及凋亡、腎小管內液體異常分泌導致的腎小管擴張以及細胞外基質異常重塑(GRANTHAM，J.J.1993，J.Am.Soc.Nephrol，31841-1857)。研究證明，囊腫襯里上皮細胞的液體分泌與多囊腎組織中異常增高的cAMP水平有關，在ADPKD囊腫形成和發展中起關鍵作用。越來越多的證據表明受cAMP激活的CFTR氯離子通道介導的Cl-分泌在ADPKD囊腫內液體積聚過程中起重要作用(Perso A.，etal.，2000，J Am Soc Nephrol.112285-2296；Murcia NS.，et al.，1999，Kidney Int.551187-1197；Hanaoka K.，et al.，1998，J Am Soc Nephrol.9903-916)，提示通過抑制CFTR Cl-轉運活性來阻斷ADPKD囊腫中液體的積聚從而阻止囊腫的形成和發展可能成為ADPKD治療的一個新策略。
三、CFTR與囊性纖維化囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)是一種由CFTR隱性突變引起的致命性遺傳疾病。通過對囊性纖維化患者和CF老鼠模型研究結果表明CFTR在小腸和胰腺的液體轉運及男性生育中起重要作用(Grubb et al.，1999.Physiol.Rev.79S193-S214；Wong，P.Y.，1997，Mol.Hum.Repord.4107-110)。盡管進行性肺功能病變是造成CF患者發病和死亡的常見原因，然而CFTR突變引起囊性纖維化患者氣道病變的機理目前仍不清楚(Pilewski et al.，1999，Physiol.Rev.79S215-S255)。利用人體組織或動物建立囊性纖維化模型對闡明囊性纖維化引起的肺部損傷及致病機制具有極其重要的意義。越來越多的研究表明肺部囊性纖維化產生的原因是因為氣道粘膜下腺液體分泌不足及大分子過度分泌導致了肺絨毛清除功能喪失及細菌的感染。然而由于來自肺移植手術的氣道材料都有嚴重的病變，研究受到了極大的限制。利用CFTR抑制劑建立大動物囊性纖維化模型對研究粘膜下腺CFTR在水、鹽和大分子分泌過程中所起的作用將具有極其重要的意義。高親和力的CFTR抑制劑的發現將在建立CF大動物模型方面發揮重要作用，同樣其對研究CF發病機理及尋找有效的治療途徑也具有重要意義。
發明內容
本發明的目的是提供嘧啶(硫)酮類化合物在制備治療分泌型腹瀉及常染色體顯性遺傳性多囊腎病藥物中的應用。本發明的另一個目的是提供一種建立非人類哺乳動物囊性纖維化模型的方法。
本發明提供高親和力嘧啶(硫)酮類CFTR抑制劑及用其處理受治療者囊性纖維化跨膜轉導調節因子(CFTR)離子轉運功能異常有關的癥狀或狀況方法。嘧啶(硫)酮類化合物是通過利用針對篩選與CFTR直接結合的抑制劑的模型篩選了大量的化合物的基礎上發現的。由于在模型的設計過程中考慮到CFTR的多種激活途徑，并且將多種激活途徑聯合應用到篩選過程中，因而本發明中的嘧啶(硫)酮類化合物認為是結合在Cl-轉運通道處。通過對含有100,000種結構多樣的組合化學庫中的化合物進行篩選我們獲得了幾種屬于嘧啶(硫)酮類化合物的能夠有效地抑制CFTR Cl-轉運功能的化合物。這些化合物與已知的CFTR抑制劑或激活劑在結構上都不同。其中活性最強的CFTR抑制劑的在濃度為10M時既能有效抑制人氣道細胞Cl-電流。當濃度為100μg/kg時能夠有效地抑制霍亂毒素引起的小鼠小腸內液體積聚。當給予發生腹瀉的仔豬按0.25mg/kg每日一次進行注射、連續7天即能有效地預防仔豬腹瀉的發生，而不表現出明顯的體內毒性作用。當濃度為500μg/kg時能夠有效地抑制常染色體顯性遺傳性多囊腎囊腫襯里上皮細胞液體分泌。另外我們所發現的CFTR抑制劑對CFTR的抑制作用迅速、可逆并且是CFTR特異的。
本發明中的嘧啶(硫)酮類化合物的結構包括一個由六個原子所組成的雜環，雜環上連有一個羰基或硫脲基，當雜環上連有一個羰基時為嘧啶酮類化合物，當雜環上連有一個硫脲基時為嘧啶硫酮類化合物。特別是本發明中嘧啶(硫)酮類化合物分子式中，其中X分別是氫、任意有機基團、任意鹵族原子、硝基、偶氮基團、羥基或巰基；Y1、Y2分別是氫、任意有機基團、任意鹵族原子、硝基、偶氮基團、羥基或巰基；A1是氧原子或硫原子；A2分別是氫、任意有機基團、任意鹵族原子、硝基、偶氮基團、羥基或巰基。
某些具體情況下嘧啶(硫)酮類化合物有以下分子式 X是甲基、乙基、丙基、異丙基或烯丙基，Y1是C1-C6的烷基或氫，Y2是C1-C6的烷基或氫，Y1與Y2相同或不同，A1是氧原子或硫原子，A2是C1-C6的烷基或氫。
本發明中的化合物的一些具體形式為(1)N-(2，3-二甲基苯基)-6-甲基-2-硫-4-(4-甲基苯基)-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-酰胺(2)N-(2，4-二甲基苯基)-6-甲基-2-硫-4-(4-甲基苯基)-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-酰胺(3)N-(2，3-二甲基苯基)-4-(4-乙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-酰胺(4)N-(2，4-二甲基苯基)-4-(4-乙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-酰胺(5)N-(2，3-二甲基苯基)-4-(4-異丙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-酰胺(6)N-(2，4-二甲基苯基)-4-(4-異丙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-酰胺(7)4-(4-烯丙基苯基)-N-(2，3-二乙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-酰胺(8)4-(4-烯丙基苯基)-N-(2，4-二乙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-酰胺(9)N-(2，6-二甲基苯基)-6-甲基-2-硫-4-(4-甲基苯基)-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-酰胺(10)N-(2，6-二甲基苯基)-4-(4-乙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-酰胺(11)N-(2，6-二甲基苯基)-4-(4-異丙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-酰胺(12)4-(4-烯丙基苯基)-N-(2，6-二乙基苯基)-6-甲基-2-硫-1，2，3，4-四氫嘧啶-5-酰胺本發明還涉及上述嘧啶(硫)酮類化合物制備治療分泌型腹瀉及常染色體顯性遺傳性多囊腎病藥物的劑型。本發明中的化合物可以與合適的、藥用載體、稀釋劑、賦型劑或佐劑等做成固體、半固體、液體或者氣體的形式。例如片劑、膠囊、粉劑、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑和氣霧劑。本發明中的化合物能夠通過多種途徑給藥。這些途徑包括口服、口腔、直腸、靜脈、腹膜下、皮下、氣道等。
在劑型中本發明中的化合物可以是其藥用鹽形式，它們也可以單獨或聯合或與其它的藥物活性化合物共同施用。
制成口服藥時，本發明中的化合物可以單獨或與適當的添加劑制成片形、粉末、顆粒或者膠囊。例如可以與乳糖、甘露糖醇、玉米淀粉、土豆淀粉等常規的添加劑，或纖維素、纖維素衍生物、金合歡膠、玉米淀粉或明膠的結合劑，滑石粉、硬脂酸鎂等潤滑劑，或者是根據需要與稀釋劑、緩沖劑、濕潤劑、保鮮劑及風味劑等混合制成口服藥。
本發明中的化合物的注射劑型可以為將本發明中的化合物溶解、懸浮、乳化在水或非水溶劑(如植物油、合成的脂肪酸甘油酯、酯類、高級脂肪酸或丙二醇)中。需要時可以加入常規的助溶劑、等滲劑、懸浮劑、乳化劑、穩定劑和保鮮劑。
本發明中的化合物可以制成氣霧劑的形式通過吸入給藥。本發明中的化合物可以與二氯二氟甲烷、丙烷、氮氣等壓縮在一起制成氣霧劑。
本發明中的化合物還可以與如乳化基質、水溶性基質等不同的基質混合制成栓劑。本發明中化合物制成的栓劑可以通過直腸給藥。栓劑的載體可以是可可脂、碳蠟和聚乙烯醇等在室溫下為固體，而在體溫下熔化的載體。
以口服或直腸為給藥形式時，本發明中的化合物可以與糖漿、配劑和懸浮劑等制成計量單位形式。計量單位可以為茶匙、湯匙、片或栓。每一計量單位中含有一定量的一種或多種抑制劑。以肌肉注射或靜脈注射時可以是將本發明中的化合物溶解在無菌水、普通生理鹽水中或其它容許藥用的載體。
隨著所治療的對象或給藥方式或給藥途徑不同，劑量也有所不同。由于不同哺乳動物所需要的劑量相差很大，例如單位體重下人比大鼠所需要的劑量低20、30甚至40倍，所以本發明中的化合物的劑量范圍很寬，例如可以是0.1-10mg/kg/個體/天。同樣不同的給藥方式對給藥劑量也存在影響。例如，腹腔注射10-20mg本發明中的化合物一次即可有效阻斷由霍亂毒素誘導的小鼠腹瀉，但是口服時劑量要提高數十倍才能達到同樣效果。
典型的劑型可以是適于注射給藥的溶液；每天服用2-6次的片劑；每天服用一次的緩釋膠囊或片劑等等。緩釋效果可以通過利用在不同pH條件下溶解的膠囊材料、或在不同滲透壓下緩慢釋放的膠囊、或其它已知的可控制的釋放材料實現。
本發明中化合物可以與其它具有藥物活性的制劑包括CFTR抑制劑一同使用。
藥用賦型劑如稀釋劑、載體、佐劑為常規易得，其它容許藥用的附屬物如pH調節劑、緩沖劑、滲透壓調節劑、穩定劑、濕潤劑等為常規易得。
使用劑量會由于本發明中特定化合物、疾病癥狀的嚴重程度、治療對象對副反應的耐受程度有所變化。對于本發明中某一確定的化合物，通過不同方法確定使用劑量。
本發明中的CFTR抑制劑可以按50-500μg/kg體重的劑量，通過腹腔內、皮下或其它給藥途徑每天給藥1-3次來制造非人類囊性纖維化動物模型。
本發明中的CFTR抑制劑能夠有效地治療分泌型腹瀉及常染色體顯性遺傳性多囊腎病，作用迅速、可逆且不表現出明顯的體內毒性作用。本發明中的CFTR抑制劑在進行長期、大量給藥時能使豬、牛、羊等非人類哺乳動物出現與囊性纖維化類似的表型。
本發明中的CFTR抑制劑在治療CFTR相關的癥狀或狀況即任何與CFTR活動(如CFTR的離子轉運活動)相關聯的狀況、紊亂、疾病、癥狀。這些CFTR相關的狀況、紊亂、疾病、癥狀可以通過抑制CFTR的活動如CFTR離子轉運活動進行治療。
本發明的CFTR抑制劑能夠用來治療與小腸液體分泌的不正常增加尤其是急性的小腸液體的不正常增加相關的癥狀或狀況。業已證明CFTR活性在包括霍亂毒素在內的各種激動劑的作用下引起腸道分泌增加，CFTR抑制劑在能夠有效抑制CFTR離子轉運的劑量下使用可以減少腸道液體分泌。對小鼠小腸液體分泌實驗表明，給小鼠經腹腔注射非毒性劑量的CFTR抑制劑能夠有效地抑制由霍亂毒素引起的小腸液體的過量分泌，因此CFTR抑制劑可以用于治療腸道炎癥性紊亂和腹瀉，尤其是分泌型腹瀉。
CFTR抑制劑還有可能用于治療AIDs引起的腹瀉(AIDs相關腹瀉)和炎癥性胃腸道紊亂諸如潰瘍性結腸炎、炎癥性腸道疾病(IBD)、克隆氏(Crohn’s)病及類似病癥。
本發明中的CFTR抑制劑還可用于治療諸如多囊腎一類的病癥，并可以通過抑制睪丸中CFTR的活性而進一步開發為男性避孕藥。
特別有意義的是，本發明中的CFTR抑制劑可在非人類動物用于誘導囊性纖維化病變。例如將有效抑制CFTR通道活性劑量的CFTR抑制劑在肺上有效地模擬了囊性纖維化中發現的CFTR功能缺陷。CFTR抑制劑的給藥途徑已經在上文中給與了詳細論述。
適用于應用本發明中的抑制劑誘導動物模型的動物包括人和動物尤其是哺乳類動物，例如非人類靈長類(猴子、猩猩、大猩猩、黑猩猩等)、嚙齒類(大鼠、小鼠、沙鼠、倉鼠、兔子、雪貂等)、兔、豬、馬、狗、貓等。其中最感興趣的是大動物模型。
CFTR抑制劑還可與離體的人體組織接觸制造體外疾病模型。這些組織可以與有效降低這些組織中CFTR活性劑量的CFTR抑制劑接觸在15分鐘到2小時內制造出體外人疾病模型。感興趣的人體組織包括但不限于肺(包括支氣管和氣道)、肝臟、胰腺、睪丸等。應用CFTR抑制劑處理過的組織進行生理學、生物化學、基因組學或其它研究可以鑒定在疾病病理生理中起重要作用新型治療性靶分子。例如從沒有囊性纖維化的人類分離出來的離體組織可以暴露于足以誘導囊性纖維化病癥的抑制劑，并且這類研究可以鑒定在囊性纖維化病理生理中起重要作用的新型治療型靶分子。
圖1為本發明的CFTR抑制劑篩選技術的原理示意圖。利用多種激活劑激活穩定共轉染豬CFTR和一種對Cl-/I-敏感的黃色熒光蛋白(YFP)的上皮細胞上表達的CFTR。當加入受試化合物后，向細胞培養孔中加入含I-溶劑測定I-的內流速度。
圖2為篩選所獲得的單一細胞培養孔中測定到的代表性熒光變化曲線。圖中顯示了無激活劑和受試化合物的對照組，無活性受試化合物組和有抑制CFTR氯離子通道開放活性的受試化合物組的熒光變化曲線。
圖3a為篩選所得到的嘧啶硫酮類CFTR氯離子通道抑制劑的化學結構。
圖3b為CFTR氯離子通道抑制劑完整的化學結構，相對活性分別為0.9(CFTRinh-1)，0.9(CFTRinh-2)，0.9(CFTRinh-3)，0.9(CFTRinh-4)，1(CFTRinh-5)，0.8(CFTRinh-6)，0.9(CFTRinh-7)，0.1(CFTRinh-8)，0.6(CFTRinh-9)，0.9(CFTRinh-10)，0.8(CFTRinh-11)，0.2(CFTRinh-12)。
具體實施例方式
實施例1本實施例描述CFTR小分子抑制劑高通量細胞篩選模型的建立研究細胞膜CFTR Cl-離子通道開放情況及篩選其抑制劑的基礎是建立靈敏度高、特異性強、穩定可靠且適于進行高通量篩選的細胞模型。首先我們用豬CFTR表達質粒(SV40啟動子，zeocin為選擇標記)和對鹵族元素敏感的熒光綠蛋白突變體YFP-H148Q表達質粒(CMV啟動子，G418為選擇標記)穩定共轉染Fischer大鼠甲狀腺(fischer rat thyroid，FRT)上皮細胞系。選擇出熒光強度高、生長迅速、基礎氯離子滲透性且在細胞質膜上穩定高表達的克隆FRT/pCFTR/YFP-H148Q/I152L。進行高通量篩選時，將FTR細胞懸浮于F-12Coon’s培養液(含有10％胎牛血清、2mM L-Gln、500u/mL青鏈霉素、500ug/ml Zeocin)中，將上述細胞懸液加入到黑壁透明底的96孔板(Corning-Costar 3904)中，每孔中細胞數量為20,000。培養16-24小時，使細胞長成單層，在FluoStar Galaxy熒光儀上測定氯離子通道功能。進行氯離子通道介導的短路電流測定時，將細胞培養在Snapwell支持載體(Corning-Costar)上，每孔數量為500,000左右。生長8-10天，待細胞間緊密連接(跨細胞電阻抗)形成后用Ussing Chamber進行氯離子跨膜電流測定。
實施例2本實施例描述CFTR小分子抑制劑高通量細胞篩選方法及結果1.化合物100,000種結構多樣的類藥小分子化合物(分子量范圍在350-550道爾頓之間)庫購自ChemBridge公司(ChemBridge Co.San Diego)。化合物的濃度為10mM的DMSO溶液，分裝于96孔板上。初篩時，將上述小分子化合物進行篩選。對篩選到的陽性化合物進行二次篩選和量效分析。對確切的高親和力陽性化合物進行結構分析，并購進或合成其類似物進行進一步檢測。
2.CFTR抑制劑的高通量篩選系統初篩是在Beckman高通量細胞測定篩選系統上進行的。該系統主要由自動化機械手、3米長的滑道、二氧化碳培養箱、多功能載物臺、識碼機、洗板機、細胞培養板去蓋裝置、振蕩器、封板機、液體轉移裝置及熒光檢測儀等組成。熒光檢測儀為FLUOstar(Galaxy，BMGLab Technologies)，該檢測儀含有兩個注射泵，激發波長為HQ500/20X(500±10nm)，發射波長為HQ535/30M(535±15nm)。該系統通過中央主機控制，控制軟件由Beckman公司提供。
3.CFTR小分子抑制劑高通量細胞篩選方法將FTR/pCFTR/YFP-H148Q/I152L細胞按每孔20,000的密度鋪于96孔板中，在二氧化碳孵箱中(37℃，濕度為90％，CO2濃度為5％，空氣濃度為95％)培養至形成單層。以下全部篩選程序是由機械臂操作的自動化過程將細胞培養板從二氧化碳孵箱中取出，去蓋，以磷酸緩沖液(PBS)洗滌細胞三次，每次300μl，最后一次保留50μl PBS，送到移液裝置上，向每孔中加入10μl含有一種激活劑的混合物(含有5μM FSK，100μM IBMX和25μM APG)，5分鐘后加入被測的小分子化合物至單個化合物的終濃度為10μM。15分鐘后送到熒光測定儀，測定碘離子通過氯離子通道內流對細胞內YFP的熒光淬滅動力學。熒光分析的方法為以5點/秒的速度連續測定14秒，其中前2秒為基線。2秒后向細胞培養孔中快速注入160μl含有137mM NaI(取代NaCl)的PBS，繼續測定12秒。利用自定義的三次方程計算熒光變化的初始速度。
4.初級篩選結果本研究的目的是找到能夠直接阻斷野生型CFTR氯離子通道的抑制劑，因此首先我們用一種激活劑的混合物(含有5μM FSK，100μM IBMX和25μM APG)使CFTR氯離子通道處于持續開放狀態。化合物的篩選濃度為10μM。化合物加入后15min后向體系中快速注射I-，并測定細胞內熒光動力學變化(即I-的內流速度)情況(圖1)。
我們以含有激活劑的混合物的PBS鹽溶液作為陰性對照，曲線斜率越小表示在測定濃度下化合物活性越大(圖2)。在所篩選的100,000種化合物中，在濃度為10μM時有99,995個化合物對I-的內流速度沒有明顯影響(曲線斜率降低程度＜10％)，有5個化合物使I-的內流速度降低了10-50％。所篩選到的陽性化合物都具有嘧啶(硫)酮類化合物核心結構(圖3a)。
我們進而對196個具有嘧啶(硫)酮類化合物核心結構的化合物進行了熒光活性分析其中活性最高的如圖3b所示。
實施例3本實施例描述CFTR小分子抑制劑性質測定方法及結果1.化合物FSK、IBMX、APG、購于Sigma公司(Sigma Chemical Co.St.Louis，Mo.)CFTRinh-1，CFTRinh-5，CFTRinh-7自行合成2.CFTR抑制劑抑制CFTR離子轉運活性動力學分析將FRT/pCFTR/EYFP-H148Q細胞按每孔30,000個細胞的密度鋪于黑壁透明底的96孔板(Corning-Costar 3904)，培養成份為F-12Coon’s培養液(含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、500u/mL青鏈霉素)，在二氧化碳孵箱中(37℃，濕度為90％，CO2濃度為5％，空氣濃度為95％)培養24小時后形成單層后備用。
將細胞培養板從二氧化碳孵箱中取出，以磷酸緩沖液(PBS)洗滌細胞三次，每次300μl，最后一次保留40μl PBS，向每孔中加入10μl含有CFTR激活劑的混合物(5μM forskolin，100μM IBMX，50μM genistein)的PBS溶液，5分鐘后，再加入10μl待測的CFTR抑制劑，分別于加入CFTR抑制劑的第2、4、6、8、10、15、20、30、60分鐘，進行熒光分析。熒光分析的方法為以5點/秒的速度連續測定14秒，其中前2秒為基線。2秒后向細胞培養孔中快速注入160μl含有137mM NaI(取代NaCl)的PBS，繼續測定12秒，細胞氯離子轉運的功能實驗直接用熒光值與時間變化曲線反映。計算熒光變化的初始速度。
結果表明，當CFTRinh-1濃度為0.4-0.7μM時即對野生型CFTR有顯著的抑制作用。該活性在10min之內就可以達到最大值(t1/2＝5min)。當CFTRinh-5濃度為0.3-0.6μM時即對野生型CFTR有顯著的抑制作用。該活性在10min之內就可以達到最大值(t1/2＝4min)。當CFTRinh-7濃度為0.3-0.6μM時即對野生型CFTR有顯著的抑制作用。該活性在10min之內就可以達到最大值(t1/2＝5min)。
3.CFTR抑制劑抑制CFTR離子轉運活性可逆性分析將FRT/CFTR/EYFP-H148Q細胞按每孔30,000個細胞的密度鋪于黑壁透明底的96孔板(Corning-Costar 3904)，培養成份為F-12Coon’s培養液(含有10％胎牛血清、2mM谷氨酰胺、500u/mL青鏈霉素)，在二氧化碳孵箱中(37℃，濕度為90％，CO2濃度為5％，空氣濃度為95％)培養24小時后形成單層后備用。
將細胞培養板從二氧化碳孵箱中取出，以磷酸緩沖液(PBS)洗滌細胞三次，每次300μl，最后一次保留40μl PBS，向每孔中加入40μl含有CFTR激活劑的混合物(5μM forskolin，100μM IBMX，50μM genistein)的PBS溶液，5分鐘后，再加入10μl待測的CFTR抑制劑，作用15分鐘后，以磷酸緩沖液(PBS)洗滌細胞三次，每次300μl，最后一次保留50μl PBS，向每孔中加入10μl含有CFTR激活劑的混合物(5μM forskolin，100μM IBMX，50μMgenistein)的PBS溶液，分別于加入激活劑的混合物后第5、10、15、20、30、60分鐘，進行熒光分析。熒光分析的方法為以5點/秒的速度連續測定14秒，其中前2秒為基線。2秒后向細胞培養孔中快速注入160μl含有137mM NaI(取代NaCl)的PBS，繼續測定12秒，細胞氯離子轉運的功能實驗直接用熒光值與時間變化曲線反映。計算熒光變化的初始速度。
結果表明，體系中去除CFTRinh-1 5min后CFTR的活性恢復1/2以上；體系中去除CFTRinh-5 5min后CFTR的活性恢復1/2以上；體系中去除CFTRinh-7 7min后CFTR的活性恢復1/2以上4.CFTR抑制劑通過與CFTR直接作用發揮其功能CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7三種抑制劑均能抑制由FSK、IBMX、APG對CFTR的激活作用，還能夠抑制包括GEN、CPT-cAMP、CPX、8-MPO、UCCF-029及UCCF-853的活性。由于上述這些CFTR激活劑在結構上幾乎沒有相關性，因而我們認為CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7是通過與CFTR直接相互作用來發揮其功能的。
5.CFTR抑制劑抑制CFTR離子轉運活性電生理測定結果將細胞培養在6孔Snapwell支持載體(Corning-Costar)上，每孔數量為500,000。生長8-10天，待細胞間緊密連接(跨細胞電阻抗)形成后，用Ussing Chamber進行氯離子跨膜電流測定將處于極性生長狀態的單層FRT細胞的Snapwell放入Ussing chamber(Physiologic Instruments，Inc)中。然后將基底膜一側加入含有130mM NaCl，2.7mMKCl，1.5mM KH2PO4，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，10mM葡萄糖，10mM Na-Hepes(pH7.3)溶液，而頂膜側加入含有65mM葡萄糖酸鈉，65mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，2mMCaCl2，0.5mM MgCl2，10mM葡萄糖，10mM Na-Hepes(pH7.3)的溶液。將系統于37℃連續通入空氣，然后以250μg/ml兩性霉素B對基底膜進行通透性處理。測定時將Ussing槽與DVC-1000電壓鉗相連(World Precision Instruments)，測定Ag/AgCl電極和1M KCl瓊脂糖橋之間的短路電流。
我們利用電生理的方法研究了CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7抑制CFTR活性的特異性。我們在表達CFTR的FRT細胞的上皮膜一側加入CFTRinh-1(或CFTRinh-5，或CFTRinh-7)，測定其對短路電流的影響。研究發現CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7均能夠快速有效地抑制FRT細胞的短路電流，并且該抑制活性與其濃度呈正相關。
6.CFTR抑制劑毒性分析本實驗對CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7的毒性分別進行了體外和體內分析。利用二氫羅丹明法對CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7的細胞毒性進行了測定。結果表明，在濃度為100μM時共同保溫24小時，我們所發現的CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7對FRT細胞均沒有明顯的毒性。
給小鼠經腹腔注射上述化合物1毫克/公斤體重，每日注射一次，連續注射7天或一次性高劑量(10mg/kg)腹腔注射，小鼠飲食和飲水量正常、血清電解質、葡萄糖濃度、肝功能指數、血清肌酸、淀粉酶、血細胞比容等與正常對照鼠無顯著差異。
7.CFTR抑制劑多重抗藥性活性(MDR-1)分析結果由于CFTR在結構上與ABC(ATP-binding cassette，ABC)轉運蛋白MDR-1具有同源性，因而我們研究了CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7對MDR-1的抑制作用。我們利用測定3H-長春新堿在人支氣管細胞9HTEo-/Dx中的積累程度來測定多重抗藥性蛋白(multidrug resistance protein-1，MDR-1)的活性。具體方法為以阿霉素誘導9HTEo-/Dx細胞表達MDR-1(Rasola et al.1994 J.Biol.Chem.2691432-1436)，然后將細胞按200,000/孔的量鋪于24孔板中，48小時后將上述細胞用洗滌液(含130mM NaCl，2mM KCl，1mM KH2PO4，2mM CaCl2，2mM MgCl2，10mM Na-HEPES pH7.3)洗滌并與200μl含有3H-長春新堿(0.7μM；1μCi/ml)及待測樣品的溶液在37℃保溫1小時。最后將上述細胞用事先預冷的洗滌液洗滌3次，細胞以0.25M NaOH裂解后測定放射劑量。當CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7為5μM時其對MDR-1轉運長春新堿的轉運活性均沒有抑制作用。
實施例4本實施例描述CFTR抑制劑小分子抑制劑抑制霍亂毒素誘導的小鼠小腸分泌實驗方法及結果。
將實驗動物禁食(不禁水)12小時后麻醉，手術于回腸部分別結扎三個2-10厘米長的結段。腸內給藥時，向每段腸腔內注射0.2-2毫升磷酸緩沖液，內含如下成分第一段(無其它成分)；第二段(含10-100微克CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7)；第三段(含1-10微克霍亂毒素和10-100微克CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7)；第四段(含1-10微克霍亂毒素和10-100微克CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7無活性類似物)；第五段(含1-10微克霍亂毒素)。術后關閉腹腔，催醒動物，令其自由活動。于6小時處死動物，取出各段小腸，稱重和測量長度，計算重量/長度比。結果發現，6小時后液體在注射了霍亂毒素的小腸內大量積聚，導致腸段極度膨脹，同時注射了霍亂毒素和CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7實驗組液體在小腸內的積聚減少80％以上。
靜脈給藥時，將實驗動物分為兩組，所有動物于回腸部分別結扎二個2-10厘米長的結段。分別向每段腸腔內注射0.2-2毫升磷酸緩沖液，內含1-10微克霍亂毒素，術后關閉腹腔，維持動物的麻醉狀態。于術后2小時起按0.25毫克/公斤體重給第一組動物靜脈滴注CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7生理鹽水溶液，第二組動物靜脈滴注沒有活性的CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7類似物生理鹽水溶液4小時滴完。取出各段小腸，稱重和測量長度，計算重量/長度比。結果發現，靜脈注射CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7組，液體在小腸內的積聚減少60％以上。
實施例5本實施例描述CFTR抑制劑小分子抑制劑抑制對豬傳染性腹瀉的治療作用實驗方法及結果本課題在長春市城西種豬場進行了一項實地抗腹瀉研究。當時該種豬場出現了嚴重的仔豬黃痢流行，主要發生于出生后3-10天的新生仔豬，多呈現整窩發病。病豬表現為水樣腹瀉、迅速消瘦和嚴重的脫水，發病后3-7天死亡。各窩死亡率高達50-100％。研究表明，單獨使用合成的CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7(0.5毫克/公斤)對10頭發生傳染性腹瀉和嚴重脫水的新生仔豬進行肌肉注射，結果8頭病豬度過危險期并康復，療效極為顯著。而DMSO注射的10頭仔豬中只有2頭存活。
另外，在仔豬傳染性腹瀉高發期對隨機選擇的3窩共33頭仔豬按0.25mg/kg進行每日一次、連續7天的預防性用藥，結果仔豬30天內無一發生腹瀉。血生化分析顯示用藥組和DMSO對照組的肝功能、腎功能、電解質、血糖以及血漿總蛋白等指標均無明顯差異，表明無明顯的體內毒性作用。
實施例6本實施例描述CFTR抑制劑小分子抑制劑誘導豬囊性纖維化模型實驗方法及結果給新生仔豬按0.25mg/kg體重劑量肌肉注射CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7，每日兩次(隔12小時)，連續注射給藥。連續給藥90天。肺部和支氣管粘膜下腺體出現與囊性纖維化癥狀相似的病理變化。
實施例7本實施例描述CFTR抑制劑小分子抑制劑抑制對cAMP刺激的原代培養ADPKD囊腫襯里上皮細胞液體分泌速度的影響的實驗方法及結果。
ADPKD囊腫襯里上皮細胞的原代培養將分離獲得的ADPKD小鼠(Pkd2WS25/-型)和人腎囊腫組織(多囊腎組織和分離的單個囊腫來自臨床上接受腎移植或由于并發癥而部分或全部切除的病腎，事先征得患者同意。一般每月可獲得1-2次標本)以PBS沖洗囊腔3次，以XIV型蛋白酶在4℃酶解過夜，然后以無血清DME-F12培養液沖洗囊腔，收集囊腫襯里上皮細胞。將上述上皮細胞繼續在無血清DME-F12培養液(含有2％胎牛血清，胰島素，轉鐵蛋白，乙醇胺，磷酸乙醇胺，氫化可的松，三碘甲腺原氨酸，視黃酸，牛垂體抽提液)培養、擴增。
ADPKD囊腫襯里上皮細胞CFTR介導的Cl-電流測定將上述細胞經胰酶消化，高密度鋪在可滲透載質(Transwell-COL，Costar)上培養24小時，然后將底部培養液換成DME-F12混合培養液(含有2％胎牛血清，胰島素，轉鐵蛋白，乙醇胺，磷酸乙醇胺，氫化可的松，三碘甲腺原氨酸，視黃酸，牛垂體抽提液)，頂部面對空氣繼續培養大約10天左右可獲得具有極性的單層柱狀上皮細胞層。用Ussing chamber測定CFTR介導的Cl-電流，測定方法為將處于極性生長狀態的單層ADPKD上皮細胞的Snapwell放入Ussing chamber(Physiologic Instruments，Inc)中。然后將基底膜一側加入含有130mM NaCl，2.7mMKCl，1.5mM KH2PO4，1mM CaCl2，0.5mM MgCl2，10mM葡萄糖，10mM Na-Hepes(pH7.3)及不同濃度的CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7溶液，而上皮膜一側加入含有65mM葡萄糖酸鈉，65mM NaCl，2.7mM KCl，1.5mM KH2PO4，2mMCaCl2，0.5mM MgCl2，10mM葡萄糖，10mM Na-Hepes(pH7.3)的溶液。將系統于37℃連續通入空氣，然后以250μg/ml兩性霉素B對基底膜進行通透性處理。測定時將Ussing槽與DVC-1000電壓鉗相連(WorldPrecision Instruments)，測定Ag/AgCl電極和1M KCl瓊脂糖橋之間的短路電流，研究發現CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7均能夠快速有效地抑制FRT細胞的短路電流，并且該抑制活性與其濃度呈正相關。
ADPKD囊腫襯里上皮細胞液體分泌測定用濾紙法測定跨上皮液體分泌時將上述獲得的具有極性的單層柱狀上皮細胞層底部培養液中分別加入cAMP和不同濃度的CFTR特異性抑制劑CaCl2，0.5mM MgCl2，10mM葡萄糖，10mM Na-Hepes(pH7.3)及不同濃度的CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7。研究發現CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7均能夠快速有效地抑制ADPKD囊腫襯里上皮細胞液體分泌。
實施例8本實施例描述CFTR抑制劑小分子抑制劑抑制離體培養ADPKD患者腎囊腫組織液體分泌速度的影響的實驗方法及結果。
將新鮮的ADPKD腎保存在預冷的DME-F12組織培養液中，分離處于腎臟表面的體積重量為5-50g的囊腫組織。無菌注射器將囊腫腔液徹底吸出，準確記錄個囊腫中液體體積，將囊腫分成A、B、C組。A組囊腫中重新注射1/3體積的混合囊腫腔液；B組囊腫中注射1/3體積的含有10mol/L CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7的混合囊腫腔液；C組囊腫中注射1/3體積的含有10mol/L CFTRact-09(一種CFTR特異的激活劑)混合囊腫腔液。將上述A、B、C三組囊腫分別置于含有10mol/L forskolin的DME-F12組織培養液(含有5％胎牛血清、胰島素、轉鐵蛋白、硒、皮質醇、三碘甲腺原氨酸、青霉素和鏈霉素)中，在二氧化碳孵箱中(37℃，濕度為90％，CO2濃度為5％，空氣濃度為95％)培養24小時后測定各組囊腫重量的變化，以囊腫重量的變化除以囊腫的表面積得到囊腫單位表面積液體分泌的速度。以A組為對照，結果發現CFTRinh-1，CFTRinh-5和CFTRinh-7均能夠顯著抑制囊腫液體分泌速度。
權利要求
1.嘧啶(硫)酮類化合物在制藥中的應用，其特征是嘧啶(硫)酮類化合物在制備治療分泌型腹瀉及常染色體顯性遺傳性多囊腎病藥物中的應用。
2.嘧啶(硫)酮類化合物制備治療分泌型腹瀉及常染色體顯性遺傳性多囊腎病藥物的劑型，其特征是嘧啶(硫)酮類化合物可以與合適的、藥用載體、稀釋劑、賦型劑或佐劑做成固體、半固體、液體或者氣體的形式即片劑、膠囊、粉劑、顆粒、軟膏、溶液、栓劑、注射劑、吸入劑和氣霧劑；嘧啶(硫)酮類化合物能夠通過多種途徑給藥包括口服、口腔、直腸、靜脈、腹膜下、皮下、氣道；嘧啶(硫)酮類化合物還可以是其藥用鹽形式，可以單獨或聯合或與其它的藥物活性化合物共同施用。
3.一種豬囊性纖維化模型的建立方法，其特征是給新生仔豬按0.25mg/kg體重劑量肌肉注射CFTRinh-1或CFTRinh-5或CFTRinh-7，每日兩次，間隔12小時，連續注射給藥90天，肺部和支氣管粘膜下腺體出現與囊性纖維化癥狀相似的病理變化。
全文摘要
本發明涉及嘧啶(硫)酮類化合物在制備治療分泌型腹瀉及常染色體顯性遺傳性多囊腎病藥物中的應用。囊性纖維化跨膜電導調節因子是一種受環腺苷單磷酸激活的Cl
文檔編號A61P13/12GK1739521SQ20051001713
公開日2006年3月1日 申請日期2005年9月12日 優先權日2005年9月12日
發明者麻彤輝, 楊紅 申請人:東北師范大學