一種治療冠心病心絞痛的藥物的制作方法

專利名稱：一種治療冠心病心絞痛的藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種藥物，具體地涉及一種治療心絞痛的藥物。
本發明還涉及上述藥物的制備方法。
本發明還涉及上述藥物在制備治療冠心病心絞痛的藥物中的應用。
背景技術：
冠心病是臨床最常見的疾病之一，在國內一直占據疾病引起死亡的前三位，根據流行病學調查，近年來我國冠心病發病率和病死率有有明顯升高趨勢。因此，冠心病的預防和治療的研究一直被我國列入國家重點醫學科技攻關項目。冠心病是在諸如高血壓、高血脂等多種危險因素作用下，冠狀動脈發生并形成粥樣硬化病灶，使冠狀動脈腔徑狹小或阻塞，而引起心肌缺血至壞死地嚴重疾病。冠心病心絞痛是冠心病的主要疾病類型，因此，冠心病的治療中最主要的是冠心病心絞痛。冠心病心絞痛目前的臨床治療主要是西藥治療，如擴張血管藥物、鈣拮抗劑、抗血小板集聚等治療和預防藥物為主，但多數是緩解臨時癥狀的藥物，不能起到從根本上治療冠心病心絞痛的作用，而治療冠心病心絞痛的中成藥多數為單純活血化瘀或益氣活血的藥物，但實際臨床上冠心病心絞痛患者除了表現有氣虛血瘀表現外，往往還兼有腎虛的表現，尤其是冠心病心絞痛多數是中老年人，因此，在治療用藥上應該兼顧腎虛表現的用藥，而市場上缺乏此類藥物。

發明內容
本發明的目的在于提供一種治療冠心病心絞痛的藥物。
本發明的又一目的在于提供制備上述藥物的方法。
本發明的還一目的在于提供上述藥物在制備治療冠心病心絞痛的藥物中的應用。
為實現上述目的，本發明提供的治療冠心病心絞痛的藥物，是由下述重量配比的原料制成的藥劑
黃芪550-700；丹參350-430；葛根350-430；淫羊藿240-320；姜黃120-220。優選各原料的重量配比是黃芪667；丹參400；葛根400；淫羊藿300；姜黃200g。
所述的藥劑是任何一種藥劑學上所說的劑型。優選的藥劑是顆粒劑。
本發明提供的上述藥物的制備方法，步驟有
a)將黃芪、丹參和葛根加50-70％的乙醇4-6倍量提取2-4次，每次1-1.5小時，合并醇提液，濾過，濾液回收乙醇至無醇味；
b)按姜黃的重量加水6-8倍，水蒸汽蒸餾2-6小時提取揮發油，濾過，水溶液留用；揮發油用β-環糊精包結，其中揮發油∶β-環糊精＝1∶6-1∶8體積比，40-60℃包結，攪拌1-2小時，靜置、濾過、35-40℃干燥；
c)步驟b濾過的藥渣和淫羊藿混合后加水煎煮1-3次，每次加水10-14倍量，煎煮0.5-1.5小時，合并煎液，濾過；
d)步驟c中的濾液和步驟b中經過提取發油后的水溶液混合，于50-60℃濃縮至相對密度在50℃時為1.05-1.10，放置至室溫，取上清液；
e)步驟a的濾液和步驟d的上清液合并，于50-60℃濃縮至相對密度在50℃時為1.25-1.30，70-80℃干燥，粉碎成細粉，與揮發油包結物混合后加入細粉重量1.0-2.0％的甜味劑和細粉重量0.5-1倍量的稀釋劑，混勻。
所述為甜葉菊苷、甜菜堿、阿司帕坦、甘草甜素或糖精鈉；優選阿司帕坦。
所述為淀粉、糊精或乳糖；優選糊精。
所述步驟a中的乙醇濃度為50％。
所述步驟a中的乙醇加入量為6倍。
所述步驟a中的乙醇提取時間為1.5小時。
所述步驟b中水蒸汽蒸餾時間為5-6小時。
所述步驟b中揮發油∶β-環糊精＝1∶8體積比。
所述步驟c中加水量為12倍。
所述步驟c中煎煮次數為3次。
所述步驟c中每次煎煮時間為0.5小時。
所述步驟d中的上清液是經過10000rpm離心的澄清液。
所述步驟e中加入的甜味劑量是細粉重量的2.0％。
所述步驟e中加入的稀釋劑量是細粉重量的1倍。
所述步驟e得到的產品用濃度為80-90％的乙醇制粒，干燥，得顆粒劑產品。
本發明提供的上述藥物可以用來制備治療冠心病心絞痛的藥物。


圖1為本發明制備工藝流程示意圖。
圖2為實施例三各給藥組犬急性心肌缺血程度(∑-ST)的比較示意圖。
圖3為實施例三各給藥組犬急性心肌缺血范圍(N-ST)的比較示意圖。
圖4為實施例三各給藥組犬冠脈血流量變化比較示意圖。
圖5為實施例三各給藥組犬動脈血氧含量變化比較示意圖。
圖6為實施例三各給藥組犬靜脈血氧含量變化比較示意圖。
圖7為實施例三各給藥組犬心肌耗氧量變化比較示意圖。
圖8為實施例三各給藥組犬血清肌酸激酶(CK)的比較示意圖。
圖9為實施例三各給藥組犬血清乳酸脫氫酶(LDH)的比較示意圖。
圖10為實施例三各給藥組犬血漿內皮素(ET)含量的比較示意圖。
圖11為實施例三各給藥組犬血漿TXB2活性的比較示意圖。
圖12為實施例三各給藥組犬血漿6-Keto-PGF1a活性的比較示意圖。
圖13為實施例三各給藥組犬血漿6-Keto-PGFa/TXB比值變化比較示意圖。
圖14為實施例五各給藥組犬動脈收縮壓變化的比較示意圖。
圖15為實施例五各給藥組犬心率變化比較示意圖。
圖16為實施例五各給藥組犬冠脈流量變化比較示意圖。
圖17實施例五各給藥組犬冠脈阻力變化比較示意圖。
圖18為實施例五各給藥組犬左室收縮力變化比較示意圖。
圖19為實施例五各給藥組犬左室作功變化比較示意圖。
圖20為實施例五各給藥組犬左室內壓變化比較示意圖。
圖21為實施例五各給藥組犬左室內壓最大上升速率(dp/dtmax)變化比較示意圖。
圖22為實施例五各給藥組犬心輸出量變化比較示意圖。
圖23為實施例五各給藥組犬外周阻力變化比較示意圖。
圖24為實施例五各給藥組犬動脈血氧含量變化比較示意圖。
圖25為實施例五各給藥組犬靜脈血氧含量變化比較示意圖。
圖26為實施例五各給藥組犬心肌耗氧量變化比較示意圖。
圖27為實施例五各給藥組犬心肌耗氧指數變化比較示意圖。
圖28為實施例五各給藥組犬心肌氧利用率變化比較示意圖。
具體實施例方式
以下詳細介紹本發明治療冠心病心絞痛的藥物的原料、制備方法，以及病理實驗及結果來說明其在制藥領域中的用途。
一、藥物原料
黃芪購于和義南苑藥材批發部，經鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch)Bge.干燥根的飲片，符合《中國藥典》2000年版一部黃芪項下有關規定。
丹參購于和義南苑藥材批發部，經鑒定為唇形科植物丹參Salviamitrowhiza Bge.干燥根及根莖的飲片，符合《中國藥典》2000年版一部丹參項下有關規定。
葛根購于和義南苑藥材批發部，經鑒定為豆科植物甘葛藤Puerariathomsonii干燥根的飲片，符合《中國藥典》2000年版一部葛根項下野葛的有關規定。
淫羊藿購于和義南苑藥材批發部，經鑒定為小檗科植物箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.干燥地上部分。符合《中國藥典》2000年版一部淫羊藿項下有關規定。使用時應除去粗梗與雜質。
姜黃購于和義南苑藥材批發部，經鑒定為姜科植物姜黃CurcumaLonga L.的干燥根莖的飲片。符合《中國藥典》2000年版一部姜黃項下的各項規定。
本發明的藥物中以黃芪為君藥，味甘微溫，歸脾肺經，善于補氣升陽，氣行則血行，氣滯則血凝，故補氣又能行滯。黃芪以其益氣升陽兼行血滯，針對陽氣不足，心血瘀阻而設，故為本方君藥。現代研究表明黃芪對心血管系統作用1)正性肌力作用臨床研究表明黃芪有顯著強心作用。能提高心排量，心臟指數，每搏量及，每搏指數。黃芪強心作用機制可能在于對心肌磷酸二酯酶(PDE)的抑制，從而升高cAMP量，激活了依賴cAMP的蛋白激酶，使鈣通道膜蛋白磷酸化，導致內流增加；同時細胞內cAMP的增加也能促進肌漿網釋放Ca++，導致心肌細胞的興奮—收縮偶聯過程增強，使心肌收縮增加。2)降壓作用黃芪降壓作用較緩慢，持久，其機制主要對血管的直接擴張。3)抗心肌缺血，心率失常及心肌保護作用黃芪可擴張冠脈，增加心肌血流。黃芪能抑制急性壞死心肌之血清肌酸磷酸激酶(Cpk)的升高，而表明對心肌缺血壞死有保護作用。黃芪能拮抗氯化鈣及氯仿誘發大鼠的心率失常。黃芪還有顯著的心肌保護作用，增強心肌細胞對損傷的耐受力。4)黃芪能抑制血小板功能，特別是黃芪和丹參和用能協同抑制血小板凝集。最新文獻報道黃芪有較好的促進血管生成作用。這對冠心病心肌缺血治療有很好的前景。
丹參功能活血祛瘀，而性較平和，能祛瘀生新而不傷正。是治療冠心病的常用藥。現代藥理研究表明丹參對心血管系統的功能1)擴張冠狀動脈，增加冠脈血流量。2)丹參能改善微循環，使血流速度及流量增加。3)丹參能使全血粘度和血清、血漿、纖維蛋白比粘度降低，紅細胞電泳速度加快。4)用ADP誘導血小板聚集，丹參有抑制和解聚作用。5)耐缺氧作用以心電圖變化為指標，丹參能預防和對抗垂體后葉素引起的心肌急性缺氧性T波高聳和S-T段抬高。6)抗脂質過氧化和清除自由基的作用臨床上冠心病患者經丹參治療后血清LPO含量明顯降低。因此，清除有害的自由基，防止或減輕脂質過氧化反應，是丹參防治心腦血管病的作用機制之一。7)對缺血心肌保護作用，丹參對缺血心肌保護作用機制增加冠脈血流，改善微循環，促進側枝循環開放，抗血小板聚集，促進纖溶，降低血液粘稠度，提高缺氧耐受力，抗脂質過氧化，清除有害自由基，同時能調節血液在體內重新分布，有利于心臟血液供應。實驗證明丹參可使心肌毛細血管內皮變性，壞死，血流瘀滯，血栓形成等病變明顯減輕；吞噬細胞活躍，壞死心臟殘片減少，成纖維細胞分裂程度和間質增生程度明顯，并促進梗死區心肌細胞再生。
丹參能顯著降低血清膽固醇三酰甘油，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白和主動脈壁膽固醇含量，減少主動脈粥樣硬化病灶面積和降低動脈內膜通透性。
葛根能升發陽氣，鼓舞脾胃清陽之氣，又有活血功能。現代藥理研究1)對循環系統作用(a)擴張冠狀動脈，增加冠脈血流量。(b)降低心肌耗氧量。改善急性心肌梗死區心肌的氧代謝，降低梗死區的心肌氧消耗，增加心肌對缺血的耐受性。(c)抗心律失常作用葛根能預防氯化鋇所致的心律失常。(d)降壓作用葛根有顯著的降壓作用的β受體阻斷藥。2)降血糖作用。葛根的作用較廣泛，可降低心肌耗氧量，使冠脈血流量增加，明顯緩解心絞痛，抗心律失常，抗氧化，增強機體免疫力，降血糖作用。
淫羊藿補腎壯陽，益精健骨，以其補益腎陽以充養心陽，可達通陽寬胸，緩解疼痛作用，配伍丹參，寧心安神，可治療心悸不寧。現代藥理研究1)增加冠脈血流量，改善心肌供血作用。2)降低血脂、血糖、抑制血小板聚集，降低血液粘稠性作用。
姜黃能活血行氣，使瘀滯通而痛解，用于血瘀氣滯，胸陽不通，心脈閉阻，心胸悶痛或刺痛。現代藥理研究1)姜黃有保護缺血心肌作用。2)降低血液粘滯性，抑制血小板聚集，增加纖溶性作用。3)顯著的降血脂作用。
綜上述，本方黃芪為君藥，丹參、姜黃為臣藥，葛根、淫洋藿為佐藥。相互配伍，益氣活血，補腎助陽，治療胸痹，陽氣不足，心血瘀阻證。結合現代研究，發揮中藥多途徑、多環節治療冠心病、心絞痛優勢。1)對冠心病發病危險因素有預防和治療作用，如高血壓、高血脂糖尿病等。2)從改善心功能方面增加冠脈血流量，改善心肌供血，降低心肌耗氧量，降低血液粘滯。3)從冠心病病理方面阻止冠心病病變血管發展，促進側枝循環建立。
二、制備工藝的確定
黃芪其醇溶性比水溶性好，故確定用乙醇提取。
丹參溶于醇，為保證療效，采用醇提。葛根的醇提取物、總異黃酮、大豆苷元和葛根素均有明顯的擴張冠狀動脈的作用(《范禮理等，中華醫學雜志，1975；55(10)724》、《范禮理等，藥學學報，1984；19(11)801》)、根醇提取物、總異黃酮、大豆苷元和葛根素均有明顯的對抗垂體后葉素引起的急性心肌缺血(《中國醫學科學院藥物研究所，醫學研究通訊，1972；(2)14》)和具有明顯的預防烏頭堿和氯化鋇誘發的心律失常作用(《范禮理等，第二屆全國心血管藥理學術會議會議資料，武漢；198311》)。故確定葛根用乙醇提取。
淫羊藿主要含有淫羊藿苷等黃酮苷類化合物，溶于水。藥理研究表明淫羊藿水煎液能明顯提高性機能，并增加附性器官重量，提高血漿睪酮含量(《牛銳，中國中藥雜志，1989；(9)18》)。還能提高大鼠尿中17-酮含量，提示可能具有提高腎上腺皮質功能的作用(《劉寶慶等，中草藥，1980；11(5)201》)。故淫羊藿宜用水煎提取，醇沉精制。
姜黃主要含有揮發油等成分，而且含量較高，應提取姜黃揮發油，揮發油用β-環糊精包結后，加入制劑中。為保證療效，提油后的藥渣再和淫羊藿共同煎煮提取。
三、制備工藝條件的優選
1.黃芪等藥醇提工藝參數的優選
上述藥物采用混合醇提，鑒于醇提時間和醇提次數相關如每次提取1.5小時，提取2次總時間即為3小時，提取3次總時間即為4.5小時，實際相當于一個因素。如果把提取時間和提取次數作為兩個因素，放在一個正交表中進行試驗進行優選，交互作用太大，則結果就不可信了。故固定提取時間為1.5小時，優選提取次數，采用三因素三水平正交試驗。
稱取黃芪20g、丹參12g、葛根12g，混合，共稱9個樣品，分別按照表1的因素水平、表2的正交試驗安排進行回流提取，提取液分別濃縮、干燥，得9個醇提物，分別按下述方法測定黃芪甲苷的含量
含量測定照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI B)測定。
取提取物約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加2％氫氧化鉀甲醇溶液50ml，輕輕搖勻，稱定重量，加熱回流3小時，放置至室溫，再稱定重量，補足減失的重量，搖勻，濾過。精密量取續濾液25ml，蒸干，殘渣加水25ml使溶解，并轉移至分液漏斗中，用氯仿-正丁醇(2∶1)混合溶液提取4次，每次25ml，合并提取液，以1％磷酸二氫鉀水溶液洗滌2次，每次30ml，棄去，合并提取液，蒸干，放冷，殘渣用甲醇溶解并轉移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另精密稱取黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI B)試驗，精密吸取供試品溶液5ul，對照品溶液1ul與3ul，分別交叉點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(13∶6∶2)10℃以下放置過夜的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10％硫酸乙醇溶液，在100℃加熱至斑點顯色清晰，取出，在薄層板上覆蓋同樣大小的玻璃板，周圍用膠布固定，照薄層色譜法(《中國藥典》2000年版一部附錄VI B薄層掃描法)進行掃描。波長λS＝530，λR＝700，測定供試品峰面積與對照品峰面積，計算每個干膏中黃芪甲苷的含量，換算成相當于黃芪生藥中的含量，并對結果進行方差分析，結果見表2、3。
表1、因素水平表
注每次提取時間固定為1.5小時。
表2、黃芪等藥醇提正交試驗數據表
表3、方差分析表
*F1-0.05(2，2)＝19.0**F1-0.01(2，2)＝99.0
表3結果表明A、C因素對結果有顯著影響，選A1C3，B對結果無明顯影響，結合直觀分析和生產實際，選B2，故最佳條件為A1B2C3，也即加50％的乙醇提取3次，每次1.5小時，加醇6倍量。
2.姜黃揮發油的提取與β-環糊精的包結
1)揮發油提取條件的優選
A.粉碎度對揮發油提取的影響試驗稱取姜黃200g，共三個樣品，其中兩個分別粉碎為8目的粗顆粒和20目的細顆粒，三個樣品分別進行水蒸氣蒸餾8個小時，每小時計錄一次出油量，結果見表4。
表4 不同粉碎度的藥材揮發油出油量數據表
由表4可知粉碎度對揮發油的提取影響不大，考慮到實際生產中細粉多易糊鍋、過濾難等因素，確定以飲片直接提取揮發油。
B.浸泡時間對提取揮發油的影響試驗稱取姜黃200g，共三個樣品，各加8倍量水分別浸泡0、2、4小時，再提取6小時，結果見表5。
表5浸泡對揮發油提取的影響數據表
實驗結果表明浸泡對提取揮發油有影響不大，故工藝中采用不浸泡的方法提取揮發油。
C.揮發油提取時間考察試驗稱取姜黃200g，加8倍量水，進行水蒸汽蒸餾提取揮發油，并記錄每小時的出油量。結果見表6。
表6揮發油提取時間優選數據表
以上結果表明，藥材提取6小時，揮發油已基本提盡，因此，揮發油的提取時間定為6小時。
D.揮發油提取率考察試驗
按處方比例取五藥共600g，按上述方法進行水蒸汽蒸餾試驗，共三批，計算揮發油收率，結果見表7。
表7揮發油收率試驗數據表
由表7可知，揮發油的收率一般為2.8％以上。故暫定揮發油的收率應不低于2.5％。
2)β-環糊精包結揮發油的正交試驗
按L9(34)正交表進行試驗，考察了揮發油與β-CD的比例、包結溫度、攪拌時間3個因素每個因素3個水平(見表9)，采用水蒸餾法，以包結物的揮發油回收率為指標，優選最佳包結條件，實驗結果及分析見表9、10。
A.包結物的制備按L9(34)正交試驗設計方案(見表8、9)的要求，分別稱取β-CD9份，加入適量蒸餾水，在水浴中加熱溶解，制成9個不同濃度的β-CD飽和水溶液，分別放至表8中各自水平的溫度后，在不斷地攪拌下各加入揮發油2ml，繼續攪拌規定時間后，取出，冷藏24小時，抽濾，干燥(35-40℃)，得白色粉末狀包結物。
B.包結物中揮發油的測定取9個包結物，分別置圓底燒瓶中，加入蒸餾水，連接揮發油測定器。按《中國藥典》2000年版一部附錄揮發油測定項下操作，放置30分鐘，讀取揮發油體積，以下式計算包結物中揮發油回收率。
C.空白對照精密量取揮發油2ml，置圓底燒瓶中，加入蒸餾水300ml，按上法蒸餾揮發油，計算空白回收率。空白對照共蒸餾出揮發油1.8ml，故空白回收率為90％。
表8因素水平表
表9試驗安排與結果
由于SA＜Se，故SA與Se合并計算誤差項，方差分析結果見表10。
表10方差分析表
注F1-0.05(2，4)＝6.94；F1-0.01(2，4)＝18.00。
由表10可知，A、B、C三因素對結果均無顯著性影響。
結論根據直觀分析和上述方差分析的結果，結合實際生產中可操作性的具體情況，確定揮發油-β-CD的比例為1∶8，包結溫度60℃(若再高，揮發油易揮發)，攪拌1小時即可。
3、淫羊藿等藥水煎工藝參數的優選
稱取淫羊藿90g，和60g姜黃提油后的藥渣混合，共9個樣品，分別按表10的因素水平和表11的正交試驗設計參數進行煎煮、濾過、濃縮、干燥，得9個水提物，按下述方法測定水提物中淫羊藿苷的含量
含量測定按照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VI D)測定。
色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(30∶70)為流動相；檢測波長270nm。理論板數按淫羊藿苷峰計算應不低于3000。
對照品溶液的制備精密稱取110℃干燥至恒重的淫羊藿苷對照品適量，加甲醇制成每ml含0.1mg的溶液，即得。
供試品溶液的制備取提取物約0.2g，研碎，精密稱定，置100ml錐形瓶中，精密加70％乙醇25ml，稱定重量，超聲處理60分鐘，放置至室溫，再稱定重量，用70％乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，棄去初濾液，精密吸取續濾液10ml，蒸至1ml通過聚酰胺柱(內徑1.5cm，長9cm，聚酰胺13-30目4g，以水100ml預洗)，先以水150ml洗脫，棄去，再以70％乙醇150ml洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇定量轉移至10ml量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.45μm)濾過，即得。
測定法分別精密吸取對照品溶液5μl；供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測定，計算提取物中淫羊藿苷的含量，換算為相當于淫羊藿生藥中的含量，進行方差分析，結果見表11、表12、表13。
表11.因素水平表
表12.淫羊藿等藥水煎正交試驗數據表
因為C因素的S值比D因素的S值還小，故采用二者聯合估計誤差。
表13.方差分析表
*F1-0.05(2，4)＝6.94；**F1-0.01(2，4)＝18.0
結果表明B因素對結果有極顯著影響，選B3，A和C因素對結果無明顯影響，結合直觀分析和生產實際，選A1C2，最佳條件為A1B3C2。也即加水12倍量，煎煮3次，每次煎煮0.5小時。
四、濃縮、干燥方法的研究
1.濃縮方法減壓濃縮，條件為壓力-0.06mpa溫度60℃。
2.干燥方法減壓干燥，條件為壓力-0.1mpa溫度80℃，8小時。
3.干膏收率考察試驗
為了考察醇提、水提后出膏率的情況，按制法項下方法進行了三批提取試驗，結果見表14。
表14.三批出膏率考察試驗數據表
根據上述結果，暫訂出膏率不應低于24％。
五、成型工藝的研究
1.輔料類型的選擇
(1)稀釋劑的選擇中藥制劑常用的稀釋劑為淀粉、糊精、乳糖等。由于本顆粒劑為水溶性顆粒劑，故不能用淀粉(不溶于水)。乳糖雖然具有熱水中溶解度好，但價格太高；而糊精溶于熱水，吸濕性小，且價格低廉，故選糊精為稀釋劑。
(2)甜味劑的選擇常用的甜味劑有甜葉菊苷、甜菜堿、阿司帕坦(Aspartrame)、甘草甜素和糖精鈉等。由于甜菜堿呈堿性，恐對成分有影響，甘草甜素為類腎上腺皮質激素類，長期服用恐影響人體電解質代謝；糖精為合成甜味劑，而甜葉菊苷甜味不正，有一點怪味，故選用阿司帕坦為甜味劑。
2.輔料用量的選擇
(1)糊精按處方量稱取藥材，根據制法項下方法處理，將所得β-CD包結物和減壓干燥后所得藥粉混合，然后分別加入二者混合物量的1/2、1、1.5倍的糊精，混勻，分別用適當濃度的乙醇制粒，干燥。結果表明加糊精1和1.5倍量者軟材粘度適宜，易成型，顆粒性狀好；而加糊精1/2倍量者，軟材太粘，制粒時粘篩，顆粒吸濕變軟，故確定加入藥粉1倍量左右的糊精，做成10g/袋，3袋/日的顆粒劑。
(2)阿司帕坦取按上述工藝制備的未加甜味劑的顆粒三等份，分別加入成品制劑1.0％、1.5％、2.0％量的阿司帕坦，開水沖后，1.0％量的與1.5％量的口感較苦，2.0％量的尚可，故選用加入成品制劑的2.0％量的阿司帕坦。
3.成型參數用82％的乙醇適量(乙醇濃度和用量可根據當時實際的溫、濕度作具體調整)作為濕潤劑制粒，粒度16目。
4.制劑吸濕性考察試驗按處方量稱取藥材，按制法項下方法制備顆粒，干燥、分裝后在相對濕度為85％、40℃的條件下放置一個月，測定其水分含量和外觀性狀，結果見表15。
表15.制劑吸濕性考察試驗數據表
表15結果表明水分含量未見明顯增加，外觀未見明顯變化，說明其吸濕性不強，穩定性良好，制劑工藝可行。
表16三批中試數據
實施例一、
(本發明制備的藥物在以下的實施例中又稱為葛仙丹)
請結合圖1，為本發明制備工藝流程示意圖。
姜黃200g加水8倍量，水蒸汽蒸餾6小時，提取揮發油，濾過，水溶液留用；揮發油用β-環糊精包結(揮發油∶β-環糊精＝1∶8，60℃包結，攪拌1小時，攪拌速度3000rpm)，冷藏過夜，濾過，低溫干燥(40℃)；過濾的藥渣和淫羊藿300g混合后加水煎煮三次，每次加水12倍量，每次煎煮0.5小時，合并煎液，濾過，濾液和上述提取揮發油后的水溶液混合后濃縮至相對密度為1.05-1.10(50℃)，放置至室溫，取上清液高速離心(10000rpm)，澄清液備用。黃芪667g、丹參400g、葛根400g加入6倍重量的濃度50％的乙醇提取三次，每次1.5小時，合并醇提液，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，和藥渣與淫羊藿的澄清液合并后繼續濃縮至相對密度為1.25-1.30(50℃)，減壓干燥，粉碎成細粉，與揮發油包結物混勻。
由于該藥每日服用生藥量為59g，經提取、精制、干燥后出膏率為26.3％，即每日服用提取物量為15.5g。另外還需加適量輔料才能制成穩定的制劑。鑒于服用量過大，制成片劑或膠囊劑等劑型時不如顆粒劑方便，因此再加入藥粉重量2.0％的阿司帕坦和藥粉1倍量的糊精，混勻，用濃度82％的乙醇制粒，干燥，得到顆粒劑1000g，分裝成10g/袋、3袋/日的包裝。
實施例二、葛仙丹顆粒大鼠長期毒性試驗
本實施例的目的是觀察大鼠長期口服葛仙丹顆粒后對機體是否產生蓄積性及遲緩性中毒反應，為臨床的安全用藥提供依據。
為了臨床用藥的安全，根據中藥新藥研究的有關規定，應用SD種大鼠80只，分為對照組及葛仙丹顆粒10.5g生藥/kg、21g生藥/kg、42g生藥/kg劑量組(臨床用量為59g生藥/日，三個劑量組分別為臨床用量的12.5、25、50倍)，連續灌胃給藥三個月，觀察葛仙丹顆粒對動物各項指標的影響。
1.試驗材料
1-1.試驗藥物葛仙丹顆粒，試驗用其提取清膏，4.16g生藥/ml。
1-2.試驗動物SD種大鼠(II級)80只，雌雄各半，體重85.76±5.27g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，合格證號SCXK11-00-0008。
1-3.試驗儀器ECG-6511型Cardiofax心電圖機(上海)；Sysmex-F820型血球計數儀(日本)；RA-1000型全自動生化分析儀(美國)。
1-4.動物飼料配方及營養成份
大鼠飼料，由北京市朝陽區九江口飼料廠生產[京動許字(2000)第007號，總052號]。
主要成分粗灰分8.0％食鹽0.54％粗蛋白26.7.％粗脂肪6.8％粗纖維3.7％鈣1.40％總磷0.92％。
1-5.動物的飼養條件
中國中醫研究院西苑醫院實驗動物中心為二級動物飼養設施，京動許字(1999)第044號；北京醫動字(1999)第01-4010號。室溫22～23℃，相對濕度45～60％。
2.試驗方法
2-1.動物分組、劑量，給藥時間
動物隨機分為四組，雌雄各半，每組20只，對照組，灌服同體積常水；葛仙丹顆粒低劑量組10.5g生藥/kg；中劑量組21g生藥/kg；高劑量組42g生藥/kg。葛仙丹顆粒臨床用量為59g生藥/人/日，即0.84g生藥/kg(人以70kg體重計算)，三個試驗劑量組分別為臨床用量的12.5、25、50倍，給藥量均為10ml/kg。連續灌胃給藥三個月，每周稱體重并調整藥量，每月最后一周連續稱飼料四天，計算100克大鼠日平均攝食量。
2-2.檢測項目及方法
每日觀察動物給藥后的反應，包括精神狀態，行為活動，毛色、攝食、二便等情況。藥后三個月，各組動物取10只，雌雄各半，戊巴比妥鈉麻醉，心電圖機記錄標準II導聯心電圖(定標電壓1∶10)，計算PR間期、QRS間期、QT間期、T波波幅、心率等指標。腹主動脈取血，全自動型血球計數儀測定血紅蛋白(Hb)、紅細胞總數(RBC)、白細胞總數(WBC)及分類、血小板(PLT)等血液學指標；測定凝血時間；分離血清，全自動生化分析儀測定天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、堿性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN)、肌酐(Crea)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血糖(GLU)、總膽紅素(T-Bil)、總膽固醇(TCH)等十項生化指標；解剖取心、肝、脾、肺、腎、胃、十二指腸、大腸、腦、垂體、甲狀腺、胸腺、胰腺、腎上腺、子宮、卵巢、睪丸、前列腺做病理學檢查，其中心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、腦、垂體、子宮、卵巢、睪丸稱重，計算臟器指數。試驗結果進行統計學處理，組間比較，t檢驗判斷其顯著性。各組剩余動物(10只)，于停藥二周后(恢復期)同前處理。
3.試驗結果
3-1.葛仙丹顆粒對動物一般狀況及體重的影響
動物一般狀況給藥三個月及停藥兩周后，各組動物食欲、二便正常，活動及精神狀態良好，毛色白且有光澤，均未出現死亡。
表17結果顯示，各給藥組體重與對照組比較均無顯著性差異。
表17.給藥前后各組體重變化(g，x±SD)
3-2.葛仙丹顆粒對動物攝食量的影響，見表18。
表18.葛仙丹顆粒給藥不同時間各組動物攝食量的比較
(g/100g/d，x±SD)
試驗結果表明，各給藥組攝食量與對照組比較無顯著性差異。
3-3.葛仙丹顆粒對凝血時間的影響，見表19。
表19.各給藥組凝血時間的比較(x±SD)
凝血時間測定結果表明，給藥三個月及恢復期(停藥二周)各給藥組與對照組比較凝血時間無顯著性差異。
3-4.葛仙丹顆粒對血液學指標的影響，見表20。
表20.各給藥組血液學指標的比較 (n＝10，X±SD)
注與對照組比較*P＜0.05
血液指標測定結果表明，給藥三個月低劑量組RBC、中性、淋巴及恢復期PLT(停藥兩周)測量值在正常生理范圍內波動，雖與對照組比較有顯著性差異，無臨床意義。給藥三個月高劑量組及恢復期(停藥兩周)動物RBC測量值與對照組比較均亦有顯著性，但為正常生理范圍。
3-5.葛仙丹顆粒對血液生化指標的影響，見表21、22、23、24。
表21.各組生化指標(藥后三個月)的比較(n＝10，X±SD)
表22.各組生化指標(藥后三個月)的比較(n＝10，X±SD)
表23.各組生化指標(恢復期)的比較(n＝10，X±SD)
表24.各組生化指標(恢復期)的比較 (n＝10，X±SD)
血液生化學十項指標測定結果表明，給藥三個月高劑量組CRE值低于對照組但在正常范圍內，恢復期(停藥兩周)各給藥組與對照組比較無顯著性差異，其它各項指標均在正常范圍內。
3-6.葛仙丹顆粒對心電圖的影響，見表25。
表25.各組心電圖的比較 (n＝10，X±SD)
對照組與葛仙丹顆粒三個劑量組及恢復期(停藥兩周)各組標準II導聯心電圖PR間期、QRS間期、QT間期、T波波幅、心率等指標比較均無顯著性差異。
3-7.葛仙丹顆粒對各組動物臟器指數的影響，見表26、27。
解剖大體觀察各組動物臟器未發現異常改變，各組臟器指數無顯著性差異。
表26.各組臟器指數的比較(g/100g體重，n＝10，X±SD)
表27.各組臟器指數的比較(g/100g體重，X±SD)
實施例三、本實施例的目的是觀察葛仙丹顆粒對麻醉犬心肌缺血、心肌梗塞及相關冠脈血流量、心肌耗氧量和血液生化指標的影響。
本實施例采用心外膜電圖標測心肌缺血范圍及程度，定量組織學(N-BT染色法)測定心肌梗塞范圍，同時測定冠脈血流量、心肌耗氧量及血清CK、LDH和血漿ET、TXB2、6-Keto-PGF1α活性的變化，研究了葛仙丹顆粒消化道給藥對實驗性犬急性心肌缺血、心肌梗塞及相關指標的影響。
1、實驗材料
1)實驗動物健康成年犬25只，雌雄兼用，體重12.52±1.40kg，由北京市通利實驗動物養殖廠提供[京動許字(2000)第010號]。
2)實驗藥物葛仙丹顆粒提取清膏，4.16g生藥/ml膏；合心爽(鹽酸地爾硫
片)，30mg/片，天津田邊制藥有限公司生產(批號0010107)；0.9％氯化鈉注射液，北京雙鶴藥業股份有限公司生產(批號010607122)；內皮素(ET)放免藥盒，北京福瑞生物工程公司(批號0106)；血漿血栓素B2(TXB2)和6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)放免藥盒，北京福瑞生物工程公司(批號0106)。
實驗共分五組(1)空白對照組，生理鹽水3ml/kg，n＝5；(2)合心爽組，5mg/kg，n＝5；(3)葛仙丹顆粒1.0g/kg劑量組，n＝5；(4)葛仙丹顆粒2.0g/kg劑量組，n＝5；(5)葛仙丹顆粒4.0g/kg劑量組，n＝5。
上述實驗藥物，均在實驗前用生理鹽水配制成等體積(3ml/kg)，經十二指腸給藥。
2、實驗方法
動物經戊巴比妥鈉(30mg/kg)靜脈麻醉，氣管插管，連接SC-3型電動呼吸機；左側第四肋間開胸，暴露心臟，剪開心包，做心包床；分離冠狀動脈左旋支，放置電磁流量計(MF-1100型，日本光電株式會社)探頭，測定心臟冠脈血流量；分離冠狀動脈前降支中段，穿線以備結扎，造成急性實驗性心肌缺血模型；縫置多點固定式心外膜電極，連接RM-6100型多道生理記錄儀，描記心外膜電圖(《中醫研究院西苑醫院基礎室藥理組心外膜心電圖方法的改進。新醫藥學雜志(11)53，1978.》)。結扎冠脈15min，進行記錄，作為給藥前對照值，經十二指腸給予實驗藥物或生理鹽水，于藥后15、30、45、60、90、120、180min記錄30個標測點心外膜電圖，以S-T段升高大于2mv為判斷標準，計算心肌缺血程度(S-T段升高總mv數∑-ST)及心肌缺血范圍(S-T段升高總點數N-ST)。經頸外靜脈插管至冠狀靜脈竇，于缺血前、缺血15min(藥前)、藥后30、60、90、120、180min抽血，以AVL912型(瑞士產)血氧測定儀測定冠狀靜脈血氧含量；以SECOMAM S.500P生化分析儀(法國產)測定血清肌酸磷酸激酶(CPK)、乳酸脫氫酶(LDH)，按放免藥盒使用說明書測定ET、TXB2和6-Keto-PGF1α；頸總動脈插管，按上述時間點取血測定動脈血氧含量，與冠狀靜脈血氧含量、冠脈血流量共同計算心肌耗氧量
心肌耗氧量＝(動脈血氧含量-冠狀靜脈血氧含量)×冠脈血流量/100
藥后180min記錄完畢，立即取下心臟，生理鹽水沖洗，稱量全心重，在心臟結扎線以下，平行于冠狀溝均勻地將心室部分橫斷切成5片，然后，置于硝基四氮唑蘭(N-BT)染液中，常溫染色15min。以多媒體彩色病理圖象分析系統(MPIAS-500)測量每片心肌雙側的梗塞區(N-BT非染色區)與非梗塞區(N-BT染色區)，計算每片心肌的面積，心室總面積和梗塞區總面積。計算梗塞區占心室及占全心臟的百分比。
實驗結果進行統計學處理，以t檢驗判斷其顯著性。
3、實驗結果
(一)對犬心肌缺血(心外膜電圖標測)的影響
1)對犬心肌缺血程度(∑-ST)的影響見圖2。
經十二指腸給藥，葛仙丹顆粒2g生藥/kg劑量組、4g生藥/kg劑量組均有減輕心肌缺血程度(∑-ST)的作用，且4g生藥/kg劑量組優于2g生藥/kg劑量組。藥后120min和180min，葛仙丹顆粒2g生藥/kg劑量組動物∑-ST由藥前245.60±38.55mv降至139.40±46.53mv及120.80±38.70mv，分別下降了40.40±25.68％及48.59±20.77％，與藥前及與對照組比較均差異顯著(P＜0.05和P＜0.01)，4g生藥/kg劑量組動物∑-ST從給藥后15min起開始下降，藥物作用隨給藥時間的延長而增加，180min時，動物∑-ST由藥前326.80±55.63mv降至128.60±58.68mv，下降了61.17±17.58％，與藥前及與對照組比較均差異顯著(P＜0.01)。
(二)對犬心肌缺血范圍(N-ST)的影響
結果見圖3。對照組給入生理鹽水后，心肌缺血范圍(N-ST)無明顯改變。合心爽可明顯減小心肌缺血范圍(N-ST)，葛仙丹顆粒也有部分減小心肌缺血范圍(N-ST)的作用。
以上結果表明，葛仙丹顆粒對實驗性急性犬心肌缺血有明顯的改善作用，可顯著減輕心肌缺血程度(∑-ST)，部分減小心肌缺血范圍(N-ST)。
(三)對犬急性心肌梗塞范圍(N-BT染色法測定)的影響
結果見表28，
表28.各給藥組對犬急性心肌梗塞范圍的影響(n＝5，X±SD)
注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
以定量組織學N-BT染色法顯示心肌梗塞范圍，生理鹽水對照組動物心肌梗塞區分別占心臟及心室的7.39±1.03％和19.01±2.04％；葛仙丹顆粒三個劑量組可減少動物心肌梗塞區面積，其中4g生藥/kg組心肌梗塞區面積分別占心臟及心室的2.90±1.56％、7.40±2.72％，分別較生理鹽水對照組降低60.76％和61.07％，與生理鹽水對照組比較均有非常顯著性差異(均P＜0.001)。
(四)對實驗性心肌缺血犬冠脈血流量的影響
結果見圖4，結扎麻醉犬冠狀動脈形成心肌缺血后，冠脈血流量有短時間代償性增加，增加幅度10％左右。合心爽和葛仙丹顆粒藥后有顯著增加缺血心臟冠脈血流量的作用，4g生藥/kg劑量組藥后30～180min冠脈血流量均有增加，其中120min時冠脈血流量增加了20.60±8.73％，與藥前及生理鹽水組比較，均有明顯差異(均P＜0.01)。
(五)對實驗性心肌缺血犬動、靜脈血氧含量及心肌耗氧量的影響
結果見圖5、圖6、圖7，對照組生理鹽水給藥前后動脈、冠狀靜脈竇血氧含量及心肌耗氧量均無顯著變化；合心爽可明顯增加靜脈竇血氧含量；葛仙丹顆粒藥后有不同程度的增加靜脈竇血氧含量的作用趨勢，而無統計學意義。葛仙丹顆粒三個劑量組動物心肌耗氧量亦未見明顯變化，合心爽則顯著降低心肌耗氧量。
(六)對實驗性心肌缺血犬血液生化學指標的影響
1)對血清肌酸激酶(CK)及乳酸脫氫酶(LDH)活性的影響
結果見圖8、圖9，心肌缺血前血清CK、LDH含量分別為314.28±116.46u/L和66.56±23.67u/L(n＝25)，結扎冠脈形成急性心肌缺血后，血中CK、LDH含量明顯升高，分別為443.96±171.79u/L和91.28±44.05u/L。與缺血前比較CK含量增加了41.75％，LDH含量增加了30.03％；CK、LDH活性隨著冠脈結扎時間的延長進一步增加，生理鹽水組藥后30、60、90、120、180min與藥前相比較，CK分別增加96.24％、265.23％、339.90％、399.84％及534.96％；LDH分別增加141.83％、153.76％、200.15％、217.15及455.37％；葛仙丹顆粒能部分抑制心肌缺血、心肌梗塞引起的LDH活性升高，對CK活性升高亦有一定的抑制作用。
2)對血漿內皮素(ET)、血栓素(TXB2)及6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1a)活性的影響。
結果見圖10、圖11、圖12、圖13，持續結扎犬冠狀動脈過程中，生理鹽水對照組動物血漿內皮素(ET)、血栓素B2(TXB2)含量明顯升高；6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1a)及6-酮-前列腺素/血栓素B2比值明顯下降。葛仙丹顆粒對心肌缺血、心肌梗塞引起的血漿血栓素(TXB2)活性有明顯抑制作用，同時可明顯升高6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1a)及6-酮-前列腺素/血栓素B2的比值。
結論本實施例采用心外膜電圖標測心肌缺血范圍及程度，定量組織學(N-BT染色法)測定心肌梗塞范圍，同時測定冠脈血流量、心肌耗氧量及血清CPK、LDH和血漿ET、TXB2、6-Keto-PGF1α活性的變化，研究了葛仙丹顆粒消化道給藥對實驗性犬急性心肌缺血、心肌梗塞及相關指標的影響。
實驗結果證實，葛仙丹顆粒具有明顯改善犬急性心肌缺血和心肌梗塞的作用，減輕由心外膜電圖標測的心肌缺血程度(∑-ST)，減小通過N-BT染色所顯示的梗塞區。
由不同病因造成局部冠狀動脈狹窄或冠狀動脈閉塞形成心肌缺血或心肌梗塞時，其它冠狀動脈分支代償性擴張和開放，可使心肌缺血或心肌梗塞得到緩解。當心肌發生大面積缺血和廣泛性梗塞、這種代償能力“得不償失”時，則造成心肌壞死和不可逆損傷，發生生命危險。實驗觀察到葛仙丹顆粒可明顯增加心肌缺血和心肌梗塞時的冠脈血流量，表明其可促進側支循環開放和建立，同時增加心肌的供氧。
肌酸磷酸激酶(CK)廣泛存在于胞漿中，尤以心肌細胞為多。當心肌細胞損傷時CK溢出，使其在血清中活性提高，血清CK活性越高，反映心肌損傷越重。乳酸脫氫酶(LDH)在心肌梗塞時從組織細胞內大量釋放于體液中，測定冠狀靜脈竇血中其活性，亦反映心肌損傷的程度。本實驗觀察到持續結扎犬冠狀動脈CK和LDH活性持續增加。實驗證明葛仙丹顆粒能部分抑制心肌缺血、心肌梗塞引起的LDH活性升高，對CK活性升高也有一定的抑制作用。
前列環素(prostacyclin，PGI2)、內皮素(endothelin，ET)、血栓素A2(thromboxane A2，TXA2)均為內皮細胞分泌的血管活性物質，其中PGI2為舒血管物質，ET和TXA2為縮血管物質。本實驗通過測定ET、PGI2的終末代謝產物6-酮-前列腺素F1α(6-keto-PGF1α)及TXA2的代謝產物TXB2等活性物質，觀察持續結扎犬冠狀動脈形成心肌缺血和心肌梗塞過程中的變化以及觀察藥物對其影響。結果表明，葛仙丹顆粒對心肌缺血、心肌梗塞引起的血漿血栓素(TXB2)活性有明顯抑制作用，同時可明顯升高6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1a)及6-酮-前列腺素/血栓素B2的比值。
上述結果表明，葛仙丹顆粒可明顯改善犬急性心肌缺血和心肌梗塞的病理表現，減輕心肌缺血程度，減小心肌梗塞區域；還可增加心肌缺血和心肌梗塞時的冠脈血流量，促進側支循環開放和建立，增加心肌的供氧；抑制LDH活性升高及TXB2的釋放；同時可明顯升高6-酮-前列腺素(6-Keto-PGF1a)及6-酮-前列腺素/血栓素B2的比值。
實施例四、本實施例的目的是觀察葛仙丹顆粒對缺血再灌注所致心肌梗塞范圍及血清CK、LDH、MDA、SOD含量的影響。
以大鼠心肌缺血再灌注損傷模型觀察到，葛仙丹顆粒能夠明顯減輕心肌損傷程度，心肌梗塞面積縮小，梗塞區重量減輕，并明顯降低血清肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)含量，增加血清超氧化歧化酶(SOD)活性。
1.試驗材料
1)動物Wistar種大鼠48只，雄性，體重240～260g，北京醫科大學動物部提供，合格證號醫動字第01-3056號。
2)藥物葛仙丹顆粒提取清膏，4.16g生藥/ml膏；合心爽片(鹽酸地爾硫緩釋片)，30mg/片，天津田邊制藥有限公司，批號0010107。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，批號20010423；丙二醛(MDA)試劑盒，南京建成生物工程研究所提供，批號20010419。
3)儀器分光光度計(UV-120-02型)，島津公司生產；全自動生化分析儀(RA-100，美國)。
2.試驗方法動物隨機分為6組假手術組(取血清作正常對照)，模型組，合心爽16mg/kg組，葛仙丹顆粒10.0、5.0、2.5g生藥/kg組。藥物以生理鹽水稀釋至所需濃度，給藥體積為3ml/kg，給藥途徑為十二指腸。
動物以戊巴比妥鈉腹腔麻醉(45mg/kg)，仰位固定，心電圖機(CardiofaxECG 6511型，上海)以標準II導聯心電圖監測；切開氣管，插入氣管插管，接呼吸機(SC-3型，上海醫療設備廠)行人工呼吸(32次/分，呼吸比值1∶3)；開胸，斷3～5肋，打開心包膜，暴露心臟，于冠狀動脈左前降支根部穿線(0號縫合線)，備結扎用；分離十二指腸準備給藥；穿線后穩定10分鐘，將一塑料凹管與血管并列，結扎(無ST段及T波改變者淘汰)，給入受試藥物；40分鐘后，沿凹槽剪斷結扎線，使前降支實現再灌注；縫合胸壁，恢復自主呼吸。
打開結扎2小時后，腹主動脈取血，測定血清CK、LDH、SOD、MDA含量；心臟結扎線以下橫切5片，N-BT染色，采用多媒體彩色病理圖文分析系統(MPIAS-500)，以固定象距測量正常心肌及梗塞心肌面積，觀察心肌梗塞程度；結果進行統計學處理(t檢驗)。
3.試驗結果
1)葛仙丹顆粒對心肌梗塞程度的影響，見表29。
表29.葛仙丹顆粒對心肌梗塞程度的影響
*、**與模型組比較P＜0.05、P＜0.01.
實驗結果證實，模型組梗塞區占心室及心臟百分比分別為34.8及29.5％；對照藥合心爽組梗塞面積明顯減小，梗塞區重量減輕，梗塞區占心室及心臟百分比降低，與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.01)；葛仙丹顆粒10.0、5.0、2.5g/kg組心肌梗塞程度明顯減輕，梗塞面積減小，梗塞區重量減輕，梗塞區占心室及心臟百分比降低，與模型組比較均有顯著性差異(P＜0.05～P＜0.01)。
2)葛仙丹顆粒對血清LDH及CK含量的影響。見表30。
表30.葛仙丹顆粒對血清LDH及CK含量的影響
注##與正常對照組比較P＜0.01；*與模型組比較P＜0.05、P＜0.01.
實驗結果證實，模型組LDH及CK含量明顯增加，與假手術組比較有顯著性差異(P＜0.01)；合心爽組LDH及CK值降低，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)；葛仙丹顆粒2.5g/kg組LDH降低，5.0g/kg組CK值降低，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05)。
3)葛仙丹顆粒對血清SOD及MDA含量的影響。見表31。
表31.葛仙丹顆粒對血清SOD及MDA值的影響
注##與正常對照組比較P＜0.01；*、**與模型組比較P＜0.05、P＜0.01。
實驗結果證實，模型組SOD值明顯降低，MDA明顯升高，與假手術組比較均有顯著性差異(P＜0.01)；合心爽及葛仙丹顆粒三個劑量組SOD值均有升高，與模型組比較有顯著性差異(P＜0.05～P＜0.01)；本試驗未能觀察到各給藥組對MDA值的影響。
結論心肌缺血后再灌注損傷，臨床常發生于冠脈搭橋術后及溶栓術治療心梗后。研究證實，心肌缺血一定時間造成心肌損傷后，再灌注不僅無益于心臟功能的恢復，反而加重已有的心肌損傷，從而導致心肌梗塞的發生或進一步加重。
本實驗以大鼠心肌缺血再灌注損傷模型觀察藥物作用。實驗觀察到，心肌缺血再灌注導致心肌梗塞，N-BT染色后心梗斑塊明顯，心梗面積占心室總面積的34.8％；同時SOD活性明顯降低，MDA含量明顯增高，間接反映了氧自由基的產生對心肌損傷的進一步加重。
葛仙丹顆粒明顯減輕心肌梗塞程度，心梗面積縮小，梗塞區重量減輕，LDH及CK值降低，SOD值升高，對心肌缺血再灌注損傷有明顯的保護作用。
實施例五、本實施例的目的是觀察葛仙丹顆粒對麻醉開胸犬心臟血流動力學及心肌耗氧量的影響，研究其對心臟功能的藥理作用及作用機制。
1.實驗材料
1)動物健康成年雜種犬25只，體重15.38±0.54kg，雌雄兼用。由北京市通利實驗動物養殖廠提供[京動許字(2000)第010號]。
2)藥物葛仙丹顆粒提取清膏，4.16g生藥/ml膏；合心爽(鹽酸地爾硫
片)，30mg/片，天津田邊制藥有限公司生產(批號0010107)；0.9％氯化鈉注射液，北京雙鶴藥業股份有限公司生產(批號010607122)。
上述實驗藥物，均在實驗前用生理鹽水配制成等體積(3ml/kg)，經十二指腸給藥。
2.實驗方法
實驗動物用戊巴比妥鈉(30mg/kg)靜脈麻醉，氣管插管，連接電動人工呼吸機(SC-3型，上海)。施左側第四肋間開胸術，暴露心臟，剪開心包，做心包床，分離冠狀動脈左旋支及主動脈根部，放置電磁流量計(MF-1100型，日本光電)探頭，分別測量冠脈血流量及心輸出量。左心室尖部插管，連接壓力換能器(MPU-0.5A)，經載波放大器(AP-601G)測定左室內壓，再經微分器(ED-601G)計算左室內壓上升最大速率(dp/dtmax)。頸外靜脈插管至冠狀靜脈竇，頸動脈插管，以血氧儀(AVL912型，瑞士)分別測定冠狀靜脈竇血氧含量及動脈血氧含量，計算心肌耗氧量。股動脈插管測定動脈血壓，以肢體導聯觀測標準II導心電圖計算心率及相關心電圖參數。公式計算其它血流動力學指標心搏出量、耗氧指數、冠脈阻力、總外周阻力及氧利用率等。將上述各項指標同步記錄于多道生理記錄儀(RM-6000型，日本光電)。
施腹部手術，分離十二指腸，插管，以備給予所試藥物。
實驗共分五組(1)空白對照組，生理鹽水3ml/kg，n＝5；(2)合心爽組，5mg/kg，n＝5；(3)葛仙丹顆粒1.0g/kg劑量組，n＝5；(4)葛仙丹顆粒2.0/kg劑量組，n＝5；(5)葛仙丹顆粒4.0g/kg劑量組，n＝5。
手術完畢，待所觀察指標穩定后，記錄藥前值，十二腸給入所試藥物。并于藥后15、30、45、60、90、120分鐘進行記錄。將各項觀測指標及推導參數進行統計學處理，以不同觀察時間的實測值進行給藥前后自身比較，其變化百分率進行組間比較，以t檢驗判斷其顯著性。
3.實驗結果
1)對犬動脈血壓、心率及心電圖的影響
結果見圖14、圖15。合心爽藥后有明顯降低血壓和減慢心率的作用；葛仙丹顆粒組試驗犬動脈血壓及心率無明顯變化。藥后動物標準II心電圖PR間期、QRS間期、QT間期及T波等參數均無明顯改化。
2)對犬冠脈血流量及冠脈阻力的影響
結果見圖16、圖17。生理鹽水給藥前后冠脈血流量、冠脈阻力均無明顯變化。葛仙丹顆粒4g生藥/kg組藥后45min冠脈血流量開始有所增加，作用持續至藥后120min，120min時冠脈流量由藥前91.25±26.92ml/100g·min-1，增加到107.38±33.22ml/100g·min-1，增加幅度為18.60±3.54％，與藥前及對照組相比有顯著性差異(P＜0.05)。同時葛仙丹顆粒能不同程度的降低冠脈阻力(P＜0.05～0.001)，幅度在20％左右。鈣拮抗劑合心爽亦可明顯增加冠脈血流量和降低冠脈阻力。
3)對左室收縮力、左室作功的影響
結果見圖18、圖19。各實驗組藥后動物左室收縮力未見明顯變化，葛仙丹顆粒4g生藥/kg組可增加45min時動物左室作功；而合心爽可部分抑制動物左室作功。
4)對犬左室內壓、左室內壓最大上升速率的影響
結果見圖20、圖21。葛仙丹顆粒三個劑量組對左室內壓無明顯影響。各組動物藥后左室內壓最大上升速率(dp/dtmax)與對照組比較均無顯著性差異。
5)對犬心輸出量、心搏出量及總外周阻力的影響
結果見圖22、圖23。葛仙丹顆粒4g生藥/kg組給藥后，動物心輸出量和心搏出量有明顯增加，同時總外周阻力顯著下降。
6)對犬動脈血氧含量、靜脈血氧含量的影響
結果見表圖24、圖25。葛仙丹顆粒各動物藥后，與藥前比較動脈血氧含量無明顯變化。合心爽組動物冠狀靜脈竇血氧含量均明顯增加，與生理鹽水對照組比較均有明顯差異(P＜0.05-0.001)。葛仙丹顆粒組動物藥后，冠狀靜脈竇血氧含量無明顯變化。
7)對犬心肌耗氧量、耗氧指數及氧利用率的影響
結果見圖26、圖27、圖28。陽性對照藥合心爽經十二指腸給藥后，心肌耗氧量、耗氧指數和氧利用率均明顯降低；葛仙丹顆粒組動物心肌耗氧量有所增加，耗氧指數和氧利用率均無明顯變化。
結論本實驗觀察了葛仙丹顆粒對正常麻醉犬心臟血流動力學、心肌耗氧量的影響，用合心爽口服片做為陽性對照藥，證實實驗方法及所取指標的可靠及靈敏性。
實驗結果顯示葛仙丹顆粒可明顯擴張冠脈血管及外周血管，增加冠脈流量和心輸出量，降低冠脈阻力和總外周阻力；改善左室作功，調整心臟血管的順應性，對心血管系統起到調整和改善作用，為臨床治療缺血性心臟病提供了實驗依據。
實施例六、本實施例的目的是觀察葛仙丹顆粒對大鼠體外血栓形成及血液粘度的影響，研究該藥的藥理作用。
1.試驗材料
1)藥物葛仙丹顆粒顆粒提取清膏，4.16g生藥/ml膏；阿司匹林腸溶片(25mg/片)，北京市燕京制藥廠生產，批號991014；試驗時均用蒸餾水配成所需濃度。
2)動物健康雄性Wistar大鼠(貳級)50只，體重242.1±8.7g，由中國醫學科學院實驗動物研究所繁育場提供，合格證號SCXK 11-00-0006。
3)儀器體外血栓形成儀，SDZ-A1型，江蘇無錫縣電子儀器廠產品。血液粘度測定儀，LG-R-20型，北京世帝科學儀器公司產品。
2.試驗方法
將大鼠隨機分為5組(每組10只)①對照組(蒸餾水，10ml/kg)，②葛仙丹顆粒10g生藥/kg劑量組，③葛仙丹顆粒5g生藥/kg劑量組，④葛仙丹顆粒2.5g生藥/kg劑量組，⑤阿司匹林50mg/kg劑量組。各給藥組按所述劑量灌胃給藥，對照組灌胃等體積蒸餾水，每日一次，連續給藥7日，末次給藥后1h，用水合氯醛(0.35g/kg)腹腔注射麻醉，切開腹腔暴露腹主動脈，取血2ml用于體外血栓形成測定，取血3ml(肝素抗凝)用于血液粘度測定。
體外血栓形成測定按照Chandler體外法，立刻將血注入旋轉環內，注入的血量充滿旋轉環1/2以下(1.8ml)，迅速密封，置血栓形成儀上，旋轉10min(實驗溫度為37℃)，傾出血栓，生理鹽水洗滌，測量長度，稱量濕重，將血栓條置80℃烘箱3h，恒重后稱其干重。
血液粘度測定從3ml血(肝素抗凝)中取0.8ml用于全血粘度測定，余血于650×g離心10min，取上清0.8ml用于血漿粘度測定。
3.試驗結果
1)對體外血栓形成的影響，見表32。
表32.葛仙丹顆粒對大鼠體外血栓形成的影響(X±SD)
注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
由表32可見，與對照組比較，葛仙丹顆粒10g生藥/kg劑量組的血栓長度顯著縮短(P＜0.001)，血栓濕重和干重顯著減輕(P＜0.001)；葛仙丹顆粒5g生藥/kg劑量組的血栓長度明顯縮短(P＜0.05)，血栓濕重和干重明顯減輕(P＜0.05)，葛仙丹顆粒2.5g生藥/kg劑量組的血栓長度、濕重及干重均無明顯變化；阿司匹林組的血栓長度顯著縮短(P＜0.001)，血栓濕重和干重顯著減輕(P＜0.05～0.01)。
2)對血液粘度的影響，見表33。
表33.葛仙丹顆粒對大鼠血液粘度的影響(n＝10，X±SD)
注與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001
由表33可見，與對照組比較，葛仙丹顆粒10g生藥/kg劑量組大鼠的全血粘度在切變率5S-1、30S-1及100S-1下均明顯降低(P＜0.05～0.01)，在切變率200S-1下顯著降低(P＜0.001)；葛仙丹顆粒5g生藥/kg、2.5g生藥/kg劑量組大鼠的全血粘度在切變率100S-1和200S-1下均明顯降低(P＜0.05～0.01)，在切變率30S-1和5S-1下有降低趨勢。阿司匹林組大鼠的全血粘度在各切變率下均明顯降低(P＜0.05～0.01)。各給藥組大鼠的血漿粘度與對照組比較均無明顯差異。
結論實驗結果表明，續7天給大鼠灌胃給藥，葛仙丹顆粒10g生藥/kg、5g生藥/kg劑量明顯縮短血栓長度(P＜0.05～0.001)，明顯減輕血栓濕重和干重(P＜0.05～0.001)；葛仙丹顆粒10g生藥/kg劑量明顯降低切變率200S-1、100S-1、30S-1及5S-1下的全血粘度(P＜0.05～0.001)，葛仙丹顆粒5g生藥/kg、2.5g生藥/kg劑量均明顯降低切變率200S-1、100S-1下的全血粘度(P＜0.05～0.01)。提示葛仙丹顆粒具有抑制血栓形成、降低血液粘度的作用。
實施例七、本實施例的目的是觀察葛仙丹顆粒對家兔血小板聚集的影響，研究該藥的藥理作用。
本試驗采用Born氏比濁法，觀察葛仙丹顆粒對家兔血小板聚集的影響。
1.試驗材料
1)藥物葛仙丹顆粒提取清膏，4.16g生藥/ml膏；阿司匹林腸溶片(25mg/片)北京市燕京制藥廠生產，批號991014；試驗時均用蒸餾水配成所需濃度。二磷酸腺苷(ADP)二鈉鹽中國科學院上海生物化學研究所生產，批號9209258，用生理鹽水配制成1.0mM/L的溶液，4℃保存備用。花生四烯酸(AA)Fluka AG產品，臨用時用1.0M/L NaOH配制成鈉鹽，濃度為5.0g/L。膠原(100μg/ml)KOKEN公司產品。
2)動物40只健康雄性日本大耳白家兔，體重2.24±0.15kg，由北京通利實驗動物養殖場提供，合格證號京動許字(2000)第024號總069號
3)儀器血小板聚集儀，BS634型，北京生化儀器廠產品。
2.試驗方法
給藥前穿刺耳中動脈取血測定血小板聚集率，根據血小板聚集率水平及體重將40只家兔隨機分為5組(每組8只)①對照組(蒸餾水，2.0ml/kg)，②葛仙丹顆粒6g生藥/kg劑量組，③葛仙丹顆粒3g生藥/kg劑量組，④葛仙丹顆粒1.5g生藥/kg劑量組，⑤阿司匹林25mg/kg劑量組。給藥組按所述劑量灌胃給藥，對照組灌胃等體積蒸餾水，每日一次，連續給藥7日，末次給藥后1h，穿刺耳中動脈取血，測定血小板聚集率。
血小板聚集率測定方法用硅化注射器穿刺耳中動脈取血，3.8％枸櫞酸鈉溶液抗凝(血∶抗凝劑＝9∶1)，200×g離心8分鐘，取上清部分即富血小板血漿(PRP)，剩余部分2200×g離心10分鐘，取上清部分即貧血小板血漿(PPP)。PRP中血小板計數為4.0×105/mm3左右。按照Born氏比濁法，將盛有200ulPRP及1小磁棒的比濁管置于血小板聚集儀中，37℃保溫1分鐘，經PPP標定后，在攪拌情況下加入誘導劑誘導聚集。所用誘導劑的終濃度為ADP(47.6μM/L)、AA(782.0μM/L)、膠原(4.8mg/L)。根據儀器自動打印出來的聚集曲線及最大聚集率分析藥物對血小板聚集的影響。最大聚集率計算公式如下
3.試驗結果，見表34。
表34.葛仙丹顆粒對家兔血小板聚集率的影響(n＝8)
注1.與對照組比較*P＜0.05，***P＜0.001。
2.差值＝給藥后聚集率-給藥前聚集率。
由表34可見，①當膠原誘導聚集時，給藥前各組間血小板聚集率無明顯差異；給藥后葛仙丹顆粒6生藥/kg劑量組的血小板聚集率明顯低于對照組(P＜0.05)，葛仙丹顆粒3生藥/kg、1.5g生藥/kg劑量組的血小板聚集率與對照組比較有降低趨勢，阿司匹林組的血小板聚集率顯著低于對照組(P＜0.001)。②當ADP誘導聚集時，給藥前各組間血小板聚集率無明顯差異；給藥后葛仙丹顆粒各劑量組的血小板聚集率與對照組比較均無明顯差異，阿司匹林組血小板聚集率與對照組比較明顯降低(P＜0.05)。③當AA誘導聚集時，給藥前各組間血小板聚集率無明顯差異；給藥后葛仙丹顆粒6生藥/kg、3生藥/kg劑量組的血小板聚集率均明顯低于對照組(P＜0.05)，葛仙丹顆粒1.5g生藥/kg劑量組的血小板聚集率與對照組比較有降低趨勢，阿司匹林組的血小板聚集率顯著低于對照組(P＜0.001)。
結論上述結果表明連續7天給家兔灌胃給藥，葛仙丹顆粒6g生藥/kg劑量明顯降低膠原、花生四烯酸(AA)誘導的家兔血小板聚集率(P＜0.05)，葛仙丹顆粒3g生藥/kg劑量明顯降低AA誘導的家兔血小板聚集率(P＜0.05)。提示葛仙丹顆粒具有抑制血小板聚集的作用。
權利要求
1、一種治療冠心病心絞痛的藥物，是由下述重量配比的原料制成的藥劑
黃芪550-700；丹參350-430；葛根350-430；淫羊藿240-320；姜黃120-220。
2.權利要求1的藥物，其中各原料的重量配比是黃芪667；丹參400；葛根400；淫羊藿300；姜黃200g。
3.權利要求1或2的藥物，其特征在于，所述的藥劑是任何一種藥劑學上所說的劑型。
4.權利要求3的藥物，其特征在于，所述的藥劑是顆粒劑。
5.權利要求1所述藥物的制備方法，步驟有
a)將黃芪、丹參和葛根加50-70％的乙醇4-6倍量提取2-4次，每次1-1.5小時，合并醇提液，濾過，濾液回收乙醇至無醇味；
b)按姜黃的重量加水6-8倍，水蒸汽蒸餾2-6小時提取揮發油，濾過，水溶液留用；揮發油用β-環糊精包結，其中揮發油∶β-環糊精＝1∶6-1∶8體積比，40-60℃包結，攪拌1-2小時，靜置、濾過、35-40℃干燥；
c)步驟b濾過的藥渣和淫羊藿混合后加水煎煮1-3次，每次加水10-14倍量，煎煮0.5-1.5小時，合并煎液，濾過；
d)步驟c中的濾液和步驟b中經過提取發油后的水溶液混合，于50-60℃濃縮至相對密度在50℃時為1.05-1.10，放置至室溫，取上清液；
e)步驟a的濾液和步驟d的上清液合并，于50-60℃濃縮至相對密度在50℃時為1.25-1.30，70-80℃干燥，粉碎成細粉，與揮發油包結物混合后加入細粉重量1.0-2.0％的甜味劑和細粉重量0.5-1倍量的稀釋劑，混勻；
所述為甜葉菊苷、甜菜堿、阿司帕坦、甘草甜素或糖精鈉；
所述為淀粉、糊精或乳糖。
6.權利要求5的制備方法，其特征在于，所述甜味劑為阿司帕坦。
7.權利要求5的制備方法，其特征在于，所述稀釋劑為糊精。
8.權利要求5的制備方法，其特征在于，步驟a中的乙醇濃度為50％。
9.權利要求5的制備方法，其特征在于，步驟a中的乙醇加入量為6倍。
10.權利要求5的制備方法，其特征在于，步驟a中的乙醇提取時間為1.5小時。
11.權利要求5的制備方法，其特征在于，步驟b中水蒸汽蒸餾時間為5-6小時。
12.權利要求5的制備方法，其特征在于，步驟b中揮發油∶β-環糊精＝1∶8體積比。
13.權利要求5的制備方法，其特征在于，步驟c中加水量為12倍。
14.權利要求5的制備方法，其特征在于，步驟c中煎煮次數為3次。
15.權利要求5的制備方法，其特征在于，步驟c中每次煎煮時間為0.5小時。
16.權利要求5的制備方法，其特征在于，步驟d中的上清液是經過10000rpm離心的澄清液。
17.權利要求5的制備方法，其特征在于，步驟e中加入的甜味劑量是細粉重量的2.0％。
18.權利要求5的制備方法，其特征在于，步驟e中加入的稀釋劑量是細粉重量的1倍。
19.權利要求5的制備方法，其特征在于，步驟e得到的產品用濃度為80-90％的乙醇制粒，干燥，得顆粒劑產品。
20.權利要求1或2所述藥物在制備治療冠心病心絞痛的藥中的應用。
全文摘要
一種治療冠心病心絞痛的藥物，由黃芪、丹參、葛根、淫羊藿、姜黃組成。制備方法是a)將黃芪、丹參和葛根加乙醇提取，合并醇提液，濾過，濾液回收乙醇至無醇味；b)姜黃用水蒸汽蒸餾提取揮發油，濾過，水溶液留用；揮發油用β－環糊精包結，攪拌1－2小時，靜置、濾過、干燥；c)步驟b濾過的藥渣和淫羊藿混合后加水煎煮，合并煎液，濾過；d)步驟c中的濾液和步驟b中經過提取發油后的水溶液混合，濃縮，放置至室溫，取上清液；e)步驟a的濾液和步驟d的上清液合并，濃縮，干燥，粉碎成細粉，與揮發油包結物混合后加入甜味劑和稀釋劑混勻。
文檔編號A61K9/16GK1864738SQ20051001174
公開日2006年11月22日 申請日期2005年5月19日 優先權日2005年5月19日
發明者李延明 申請人:北京燕京中科生物技術有限公司