專利名稱：單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉制劑的制備方法
技術領域：
本發明涉及藥品的制備方法，具體地是從動物組織中分離提取以單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉(GM1)為主要成分的糖脂類物質的制備方法。
背景技術：
神經節苷脂(Gangliosides，GLS)是一類含唾液酸(N-乙酰神經氨酸)的酸性糖脂，是哺乳動物細胞膜的重要成分，它由一族異構的含唾液酸殘基的結構復雜的膜糖脂，其分子皆由一個疏水的神經酰胺部分和一個親水的唾液酸寡糖基團組成。神經節苷脂分子既有水溶性，又有脂溶性，是一種兩親性分子；按唾液酸殘基的位置和寡糖核心區的長度，將神經節苷脂分為不同的種類，其中GM1為單唾液酸四己糖神經節苷脂。它具有多種重要的生物學功能，已成為當今生命科學研究的熱門課題，單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉在臨床上已用于神經損傷性疾病的治療。對于單個神經節苷脂而言，GM1，GD1b及GT1集中于突觸前后膜。神經節苷脂位于神經元細胞膜雙層結構外層，神經酰胺一端嵌入膜內，而寡糖鏈一端伸出細胞膜外突入外環境。神經節苷脂的這種非對稱性分布以及它們的化學性質差異，使其特別易與各種細胞外信息發生相互反應，從而在細胞膜活動上充當重要角色。神經節苷脂在神經元胞體中含量略低于平均水平，而在突觸小體中含量高于平均水平。
神經節苷脂GM1在神經系統中的主要生理作用是1.促進神經細胞的生長、分化發育和神經再生；2.參與突觸傳遞，維持腦的正常機能，參與各種學習記憶活動；3.在細胞與細胞，細胞與微生物以及細胞與基質間的相互作用過程中起介導作用；4.調節細胞膜中各種蛋白質功能，如離子通道，表皮生長因子受體等。實驗證明外源性神經節苷脂尤其是單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉能嵌入神經細胞膜，模仿內源性神經節苷脂的某些功能，調節膜介導的細胞功能，并能刺激中樞神經系統損傷后潛在的代替機制阻止損害的發展，保護未受損的神經組織；同時還能影響體外培養的神經元的生長及其活性，促進其存活及生長。由意大利Fidia公司從牛腦組織中提取的GM1注射液(商品名Sygen)已于90年代正式在我國銷售。由于GM1能通過血腦屏障，注射后快速在大腦和脊髓組織中分散，因此臨床上GM1治療效果十分顯著。主要用于治療人血管性或創傷性中樞神經系統損傷，如腦卒中，急性脊髓損傷和腦外傷。補充神經節苷脂，一方面降解脂褐素的積累，另一方面修復被破壞的腦神經細胞，從而達到延緩神經細胞衰老、增強腦動力，恢復腦功能。
神經節苷脂及GM1提取和分離純化已有文獻和專利報道。其主要提取方法是豬腦或牛腦經絞拌，用丙酮脫水制成丙酮粉。再用氯仿、甲醇、水混合有機溶劑提取[Svennerholm.et al Biochemical et BiophsicaActa，617-109(1980)]。提取物神經節苷脂轉入水相[J.Folch，The Journal ofBiological Chemistry，226，497-509(1957)]。用DEAE-Sephadex-A25純化[R.W.Ledeen，et al.Journal of Neurochemistry，21，829(1973)]。硅膠層析，GM1得率達到14％。神經節苷脂的分離有用a環糊精技術(EP00469352A1)，也用大孔徑樹脂吸附技術(CN85102590)。神經節苷脂脫唾液酸有用唾液酸酶處理法(Richard Kuhn，etal.，Chemische berichte，1963.96.886)。有用加熱處理法(US4868292)以及微生物處理方法(Fukano Y，et al.，Appl EnvironMicrobiol，1997.63.1861)。GM1純化方法Momoi TaKashi建立了陰離子交換層析技術(Biochim Biophys Acta，1976，411，488)。親和層析技術(Krishna Kant，etal J.Chromato，1989.494289)等。
國內外實驗室多采用DEAE-Sephadex和latrobeads大顆粒硅膠球進行柱層析分離提取。上述方法的缺點是有機溶劑消耗量大，費時，兩種填料均需進口，故成本高。
發明內容
本發明的目的是創立以現代生物膜為核心的大規模制備神經節苷脂的方法。
具體的制備方法是1)用新鮮(或凍存)豬或牛腦去除表面的包膜及血管等，在室溫條件下加1～10倍體積的冷丙酮，經3～6次的按壓脫水，用多層紗布過濾，用孔徑為0.1～1.0um微孔有機膜過濾澄清，傾出丙酮后，將脫水后的腦組織研碎，置60-80℃烘干(不能用明火)，用干磨粉碎至細粉，得丙酮粉，密閉分裝，保存備用；
2)取丙酮粉5.0Kg，加用三氯甲烷∶異丙醇∶水＝10～50∶20～80∶0.1～10配制成的提取液5～50Kg攪拌1～3小時，過濾得澄清液，再加入0.1～10純化水進行分提，得上層清液用截流分子量為1000～10萬的超濾膜進行超濾，得到的超濾液，經萃取液萃提，萃取液為氯仿∶甲醇∶0.1～4.0mol/L醋酸鹽(鈉鹽、鉀鹽等)＝1～4∶1.5～8∶0.1～1.5配制成；小心顛倒兩次后靜止分層；取上層液再用截流分子量為100～1000的納濾膜進行納濾濃縮1/5～1/10體積時即可，除去小分子，棄透過液，收集清亮的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉濃縮液；經除菌得精制品。經此步分離純化的GM1經高效液相色譜分析其純度大于95％。
3)制備的濃縮液經稀配后、灌裝成成品，制成無菌制劑，既為達到國家藥品質量標準的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液。
或2)步驟所得的濃縮液，經0.2um孔徑的微孔濾膜除菌過濾、分裝、低溫真空冷凍干燥后成乳白色或灰白色的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉干粉，即為單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉無菌凍干粉針劑。
本發明改變了提取有機溶劑的極性，神經節苷脂幾乎全部釋放到溶液中。經測定神經節苷脂全部進入上層水相，而色素及大部分磷脂、硫脂等其它物質分配到下層有機相。本發明根據神經節苷脂在唾液酸和酰氨基團數目的差異，選用離子型納濾膜將其分離和轉化。經此步分離純化的GM1經高效液相色譜分析其純度大于95％。本發明采用現代膜分離技術取代上述兩種填料，代替柱層析技術獲得成功，節省大量溶劑和時間，提高了產率。
具體實施例方式
實施例11)用新鮮(或凍存)豬腦去除表面的包膜及血管等，在室溫條件下加2倍體積的冷丙酮，經3次的按壓脫水，用多層紗布過濾，用孔徑為0.2um微孔有機膜過濾澄清，傾出丙酮后，將脫水后的腦組織研碎，置60～80℃烘干(不能用明火)，用干磨粉碎至細粉，得丙酮粉，密閉分裝，保存備用；2)取丙酮粉5.0kg，加三氯甲烷∶異丙醇∶水＝10∶20∶0.1的體積比配制成的提取液6kg攪拌1～3小時，過濾得澄清液，再加入0.2kg的純化水進行分提，得上層清液用截流分子量為3000的超濾膜進行超濾，得到超濾液，經萃取液萃提，萃取液為氯仿∶甲醇∶0.1～4.0mol/L醋酸鈉＝1∶1.5∶0.1的體積比配制而成；取上層液再用截流分子量為300的納濾膜進行納濾濃縮至1/5體積時即可，棄透過液，收集得清亮的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉濃縮液；3)上述制備的濃縮液經稀配后、灌裝成成品，制成無菌制劑，既為達到國家藥品質量標準的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液。
實施例21)用新鮮(或凍存)牛腦去除表面的包膜及血管等，在室溫條件下加10倍體積的冷丙酮，經6次的按壓脫水，用多層紗布過濾，用孔徑為1.0um微孔有機膜過濾澄清，傾出丙酮后，將脫水后的腦組織研碎，置60～80℃烘干(不能用明火)，用干磨粉碎至細粉，得丙酮粉，密閉分裝，保存備用；2)取丙酮粉5.0Kg，加三氯甲烷∶異丙醇∶水＝50∶80∶10的體積比配制成的提取液50kg攪拌1～3小時，過濾得澄清液，再加入10kg純化水進行分提，得上層清液用截流分子量為10萬的超濾膜進行超濾，得到超濾液，經萃取液萃提，萃取液為氯仿∶甲醇∶0.1～4.0mol/L醋酸鈉＝4∶8∶1.5的體積比配制而成；取上層液再用截流分子量為1000的納濾膜進行納濾濃縮至1/10體積時即可，棄透過液，收集得清亮的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉濃縮液；3)經0.2um孔徑的微孔濾膜除菌過濾、分裝、低溫真空冷凍干燥后成乳白色或灰白色的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉干粉，經除菌得精制品，即為單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉無菌凍干粉針劑。
權利要求
1.一種單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉制劑的制備方法，其特征在于1)用新鮮或凍存豬腦或牛腦去除表面的包膜及血管等，在室溫條件下加1～10倍體積的冷丙酮，經3～6次的按壓脫水，用多層紗布過濾，用孔徑為0.1～1.0um微孔有機膜過濾澄清，傾出丙酮后，將脫水后的腦組織研碎，置60-80℃烘干，用干磨粉碎至細粉，得丙酮粉密閉分裝，保存備用；2)取丙酮粉5.0Kg，加三氯甲烷∶異丙醇∶水＝10～50∶20～80∶0.1～10的體積比配制成的提取液5～50Kg攪拌1～3小時，取澄清液，再加入0.1～10Kg的純化水進行分提，得上層清液用截流分子量為0.1萬～10萬的超濾膜進行超濾，得到的超濾液，經萃取液萃提，萃取液為氯仿∶甲醇∶0.1～4.0mol/L醋酸鹽＝1～4∶1.5～8∶0.1～1.5的體積比配制而成；小心顛倒兩次后靜止分層；取上層液再用截流分子量為100～1000的納濾膜進行納濾濃縮1/5～1/10體積時即可，除去小分子，棄透過液，收集得清亮的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉濃縮液；經除菌得精制品。經此步分離純化的GM1經高效液相色譜分析其純度大于95％。3)配制的濃縮液經稀配后、灌裝成成品，制成無菌制劑，既為達到國家藥品質量標準的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉注射液。或2)步驟所得的濃縮液，經0.2um孔徑的微孔濾膜除菌過濾、分裝、低溫真空冷凍干燥后成乳白色或灰白色的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉干粉，即為單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉無菌凍干粉針劑。
全文摘要
本發明是一種單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉制劑的制備方法。它是用新鮮或凍存豬腦或牛腦去除表面的包膜及血管等，用冷丙酮，經多次的按壓脫水，用有機膜過濾澄清，傾出丙酮后，處理成丙酮粉密閉分裝，保存備用；對丙酮粉提取澄清液，用超濾膜進行超濾，得到的超濾液，經萃取液萃提，用納濾膜進行納濾濃縮，除去小分子，棄透過液，收集得清亮的單唾液酸四己糖神經節苷脂鈉濃縮液；經除菌得精制品。本發明改變了提取有機溶劑的極性，神經節苷脂幾乎全部釋放到溶液中。本發明根據神經節苷脂在唾液酸和酰氨基團數目的差異，選用離子型納濾膜將其分離和轉化。采用現代膜分離技術取代填料，代替柱層析技術獲得成功，節省大量溶劑和時間，提高了產率。
文檔編號A61P25/00GK1799552SQ20051001060
公開日2006年7月12日 申請日期2005年1月6日 優先權日2005年1月6日
發明者嚴家定 申請人:嚴家定