專利名稱：活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法
技術領域：
本發明涉及一種活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法。
背景技術：
中藥復方中的化學成份組成復雜，因而對復方的有效成份、有效部位研究一直是中成藥基礎研究和相關應用研究中心難點。單純用中藥化學和藥理學的研究方法，來探求中藥復方與功能主治相關的化學有效部位或有效物質基礎，都易流于盲目和片面的弊端，而將兩個學科結合起來，則是一個較有效率的思路，但是一直以來缺乏具體可行的系統研究的方法。
發明內容
本發明的目的是提供一種活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法。
本發明的目的是這樣實現的活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，中藥成方中的組成藥材，其中有揮發油的藥材用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，然后各個藥材分別用水煎煮提取，每次1-3小時，加水量10倍以上，提取2次以上，合并多次提取液，濃縮，另取含有揮發油的藥材提取后剩余的水煎液濃縮后，濾過，攪拌中緩緩加入乙醇，令含醇量達70-80％，靜置24小時以上，則各藥材的上清液部分為一個水平，沉淀部分為一個水平，揮發油部分為一個水平，水煎煮提取液為一個水平。
上述的活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，在上述所述的因素水平表的基礎上，再根據因素水平的數量選擇正交表，再配制各組的供試藥品，同時設原方對照組，進行能夠反映該中藥復方主要功效的藥理動物實驗，最后根據實驗結果，統計計算，將各個水平的均值填入因素水平表中各自相對應的表欄中，分析該表，根據均值的大小確定各藥材第一次分離后，得到的化學組成部份中起最主要作用的即是主要有效部分。
上述的活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，各個藥材分別取第一步的主要有效部分，通過按比吸附量樹脂量和藥材量之比為1∶1裝填的大孔樹脂柱，先以去離子蒸餾水洗脫，再以25％乙醇洗脫，繼以50％乙醇洗脫，最后以乙醇洗脫，分別收集各部分的洗脫液，回收乙醇，濃縮后的水溶液則為各個藥材的多個水平，繼而根據因素水平的數量選擇正交表，再配制各組的供試藥品，同時設原復方對照組和上一步的有效部分組合的對照組，進行能夠反映該中藥復方主要功效的藥理動物實驗，最后根據實驗結果，統計計算，將各個水平的均值填入因素水平表中各自相對應的表欄中，分析該表，根據均值的大小確定各藥材第二次分離后，得到的化學組成部份中起最主要作用的即是第二步找到的主要有效部分。
上述的活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，各個藥材分別取第二步的主要有效部分，濃縮后用鹽酸調pH值至2，以正丁醇萃取，然后酸液用氫氧化鈉調PH值至10，再以正丁醇萃取，萃取后的堿液用鹽酸調PH值至中性，除去水溶液中的殘留溶劑后，濃縮，即得各個藥材的酸性萃取、堿性萃取和萃取后余下部分這三個水平，繼而根據因素水平的數量選擇正交表，再配制各組的供試藥品，同時設原復方對照組和上一步的有效部分組合的對照組，進行能夠反映該中藥復方主要功效的藥理動物實驗，最后根據實驗結果，統計計算，將各個水平的均值填入因素水平表中各自相對應的表欄中，分析該表，根據均值的大小確定各藥材第三次分離后，得到的化學組成部份中起最主要作用的即是第三步找到的主要有效部分。
上述的活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，各個藥材分別取上一步的主要有效部分，折算成相當于原藥材的生藥克數，取不同的克數設為各藥材的多個水平，繼而根據因素水平的數量選擇正交表，再配制各組的供試藥品，進行能夠反映該中藥復方某一主要功效的藥理動物實驗，最后根據實驗結果，統計計算，找出各味藥材各自適宜的服用劑量。
本發明的優點在于1.本發明為尋找化學成份組成復雜的中藥復方或天然藥物中的有效部位或成份，提供了一種可行的系統研究方法。
2.本發明大大縮短實驗周期，加快尋找并確定復方或天然藥物中有效部位或成份的研究進程。研究進程是以指數冪的級數快速進展的。
本發明的
具體實施例方式實施例1活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，其特征是中藥成方中的組成藥材，其中有揮發油的藥材用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，然后各個藥材分別用水煎煮提取，每次1-3小時，加水量10倍以上，提取2次以上，合并多次提取液，濃縮，另取含有揮發油的藥材提取后剩余的水煎液濃縮后，濾過，攪拌中緩緩加入乙醇，令含醇量達70-80％，靜置24小時以上，則各藥材的上清液部分為一個水平，沉淀部分為一個水平，揮發油部分為一個水平，水煎煮提取液為一個水平。
在上述所述的因素水平表的基礎上，再根據因素水平的數量選擇正交表，再配制各組的供試藥品，同時設原方對照組，進行能夠反映該中藥復方主要功效的藥理動物實驗，最后根據實驗結果，統計計算，將各個水平的均值填入因素水平表中各自相對應的表欄中，分析該表，根據均值的大小確定各藥材第一次分離后，得到的化學組成部份中起最主要作用的即是主要有效部分。
實施例2上述的活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，各個藥材分別取第一步的主要有效部分，通過按比吸附量樹脂量和藥材量之比為1∶1裝填的大孔樹脂柱，先以去離子蒸餾水洗脫，再以25％乙醇洗脫，繼以50％乙醇洗脫，最后以乙醇洗脫，分別收集各部分的洗脫液，回收乙醇，濃縮后的水溶液則為各個藥材的多個水平，繼而根據因素水平的數量選擇正交表，再配制各組的供試藥品，同時設原復方對照組和上一步的有效部分組合的對照組，進行能夠反映該中藥復方主要功效的藥理動物實驗，最后根據實驗結果，統計計算，將各個水平的均值填入因素水平表中各自相對應的表欄中，分析該表，根據均值的大小確定各藥材第二次分離后，得到的化學組成部份中起最主要作用的即是第二步找到的主要有效部分。
實施例3
上述的活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，各個藥材分別取第二步的主要有效部分，濃縮后用鹽酸調pH值至2，以正丁醇萃取，然后酸液用氫氧化鈉調PH值至10，再以正丁醇萃取，萃取后的堿液用鹽酸調PH值至中性，除去水溶液中的殘留溶劑后，濃縮，即得各個藥材的酸性萃取、堿性萃取和萃取后余下部分這三個水平，繼而根據因素水平的數量選擇正交表，再配制各組的供試藥品，同時設原復方對照組和上一步的有效部分組合的對照組，進行能夠反映該中藥復方主要功效的藥理動物實驗，最后根據實驗結果，統計計算，將各個水平的均值填入因素水平表中各自相對應的表欄中，分析該表，根據均值的大小確定各藥材第三次分離后，得到的化學組成部份中起最主要作用的即是第三步找到的主要有效部分。
實施例4上述的活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，各個藥材分別取上一步的主要有效部分，折算成相當于原藥材的生藥克數，取不同的克數設為各藥材的多個水平，繼而根據因素水平的數量選擇正交表，再配制各組的供試藥品，進行能夠反映該中藥復方某一主要功效的藥理動物實驗，最后根據實驗結果，統計計算，找出各味藥材各自適宜的服用劑量。
舉例如下如，采用四次成功的步步深入的L9(34)正交試驗，就可將組成復方的某單味藥材的提取(如水箭煮)總化學成份，切分到其1/81的化學組成部份第一次總化學成份的1/3第二次總化學成份的1/3×1/3＝1/9第三次總化學成份的1/3×1/3×1/3＝1/27第四次總化學成份的1/3×1/3×1/3×1/3＝1/81而復方的化學成份，在人體中達到服用后能使該化學成分發揮藥理活性的有效血藥濃度的，最大不過數十種，所以應用本方法能夠通過較少次的循環實驗，就能迅速的找出復方中的化學成份組成最少的有效部位。
初步實踐簡述如下黃芪12g白術12g防風6g。其功能主治中選增強免疫功能的藥理作用為重點，確定以小鼠碳廓清實驗的結果為對照指標。
小鼠20-26g/只，雌雄各半。實驗按體重分為每組10只，除L9(34)正交實驗的9組外，另設對照組、正常組和模型組。
對照組的供試樣制備將三味藥材分別粉碎成細粉，按處方量稱重后混勻，加入水一定體積，臨用時搖勻使成混懸液，抽取折算的體積數給小鼠灌胃。
其它的供試樣配制時，每個按不同路線提取得到的部分，各自折算成相當于原藥材的量來配制。
模型組采用腹腔注射氫化可的松30mg/kg/日，連續給藥至實驗結束(周期8-10日)。各給藥組于注射氫可的第二天開始灌胃給予供試樣，同時并行每日注射氫可，直至最終的碳廓清指標測定，具體實驗操作詳見參考文獻。第一步供試樣的制備1.黃芪每次加10倍量水煎煮2次，2hr/次，合并煎液，濃縮至1∶1(藥材重量∶體積)，下表中稱為“水煎液”。取水煎液醇沉，攪拌加入乙醇令含醇量約達80％，放置24hr，上清液濃縮至一定體積。取濃縮液上D101大孔吸附樹脂柱，依次用水、70％乙醇洗脫，收集70％乙醇洗脫液，濃縮至1∶1(m/v)，下表中稱為“總苷”。取上述醇沉后的沉淀，加水溶解，濾過，濾液在下表中稱為“醇沉后的沉淀”。
2.白術和防風各自水煎液的制備及醇沉的條件同黃芪，表中稱謂的含義也同黃芪，醇沉后的上清液濃縮后，稱為“醇沉后的溶液”。另取兩藥材分別粉碎成粗粉，采用2005版藥典附錄中的“揮發油測定法”提取揮發油，提得的揮發油用β-環糊精包裹后備用，在表中稱為“揮發油”。
因素水平表
實驗結果正常組3.8，造模組0，由于實驗結束時，該組小鼠剩余數量不足以進行統計，我把結果數值定為0，對照組4.2。
表格右下角的最后一列、從“均值1”行至“極差”行，所填人的內容是空白列的計算結果。
第一步實驗的分析總結將實驗結果的平均值填入因素水平表。
分析藥理作用較強的有效部分確定A.黃芪為均值最高的總苷。B.白術根據后兩個水平的比較，水煎液＝2.8，水煎液+揮發油＝1.3，則揮發油起到的是負作用(1.3-2.8＝-1.5)；據前兩個水平比較，同樣都有揮發油的情況下，明顯醇沉后的溶液作用強度高于水煎液(2.6＞1.3)。所以，其有效部分是醇沉后的溶液。C.防風水平1和3比較，揮發油起正作用(2.7-1.2＝1.5)；水平2和3比較，都有揮發油的情況下，水煎液和醇沉后的沉淀無明顯差異(2.7＝2.7)。因此，揮發油肯定是有效部分之一，而水煎液醇沉分離的路線似乎不合適，可在下一步重新設計。第二步黃芪前面步驟不變，同第一步總苷部分的提取，但在其過程中，自上柱之后，改為依次用水、25％乙醇、50％乙醇、75％乙醇洗脫，收集后三種洗脫液。白術取上一步醇沉后的溶液部分，同黃芪總苷條件，上樹脂柱，依次用水、25％乙醇、50％乙醇、乙醇洗脫，分別收集洗脫液。防風取上一步水煎液，濾過，取濾液，后同黃芪總苷條件，上樹脂柱，依次用水、25％乙醇、50％乙醇、乙醇洗脫，分別收集洗脫液。揮發油因無合適的儀器設備，仍取第一步的揮發油，不作進一步分離的設計。其它的具體實驗條件及操作，包括藥理實驗部分，基本都與第一步相同，此不贅述。
實驗結果正常組4.2，對照組3.7。另設一對照組，供試樣的組成是第一步各藥材的有效部分，即黃芪的總苷+白術的醇沉后溶液+防風的(揮發油+水煎液)。對照組結果為3.9。因在第一步中，已將因素水平表、正交實驗各分組結果統計表等詳細示例列出了，所以第二步的類似表格在此略去。
第二步實驗的分析總結將實驗結果的平均值填入因素水平表。
分析藥理作用較強的有效部分確定A.黃芪為50％乙醇部分。B.白術為25％乙醇部分。C.防風三個水平間的差異微小，從組成上看，(25％乙醇+揮發油)部分在作用相同的情況下最為精簡。結合第一步的結果，也可以猜想，防風藥材在本方中的主要有效部分，可能只是揮發油。
另外還可以看出，大多數實驗組的作用強于對照組(3.7)和(第一步有效部分)對照組(3.9)，后兩者之間，對照組更強些。說明將藥材提取分離、甩掉部分無用(甚至起負作用)的成分后，藥效仍能得以維持，甚而得到加強。第三步黃芪和白術分別取其第二步的有效部分，同樣按如下步驟制備用稀鹽酸調pH值至2，水飽和正丁醇萃取4次，合并正丁醇提取液，蒸干，得到下表中所稱的“酸性”部分。水溶液再用氨試液調pH值至10，水飽和正丁醇萃取4次，合并正丁醇提取液，蒸干，得到下表中所稱的“堿性”部分。余下的水溶液用稀鹽酸調pH值至中性，得到下表中所稱的“余下”部分。防風取第二步上柱以后的水洗脫液和25％乙醇洗脫液，下表中稱“水洗”和“25％乙醇”。揮發油部分仍同第二步。
實驗結果正常組3.9，對照組3.7。另設一對照組，供試樣品組成為第二步各藥材的有效部分，即黃芪的50％乙醇部分+白術的25％乙醇部分+防風的揮發油部分。對照組結果為4.1。
分析藥理作用較強的有效部分確定A.黃芪為酸性部分。B.白術為余下部分。C.防風為(水洗+揮發油)部分。
權利要求
1.一種活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，其特征是中藥成方中的組成藥材，其中有揮發油的藥材用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，然后各個藥材分別用水煎煮提取，每次1-3小時，加水量10倍以上，提取2次以上，合并多次提取液，濃縮，另取含有揮發油的藥材提取后剩余的水煎液濃縮后，濾過，攪拌中緩緩加入乙醇，令含醇量達70-80％，靜置24小時以上，則各藥材的上清液部分為一個水平，沉淀部分為一個水平，揮發油部分為一個水平，水煎煮提取液為一個水平。
2.根據權利要求1所述的活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，其特征是在上述所述的因素水平表的基礎上，再根據因素水平的數量選擇正交表，再配制各組的供試藥品，同時設原方對照組，進行能夠反映該中藥復方主要功效的藥理動物實驗，最后根據實驗結果，統計計算，將各個水平的均值填入因素水平表中各自相對應的表欄中，分析該表，根據均值的大小確定各藥材第一次分離后，得到的化學組成部份中起最主要作用的即是主要有效部分。
3.根據權利要求1或2所述的活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，其特征是各個藥材分別取第一步的主要有效部分，通過按比吸附量樹脂量和藥材量之比為1∶1裝填的大孔樹脂柱，先以去離子蒸餾水洗脫，再以25％乙醇洗脫，繼以50％乙醇洗脫，最后以乙醇洗脫，分別收集各部分的洗脫液，回收乙醇，濃縮后的水溶液則為各個藥材的多個水平，繼而根據因素水平的數量選擇正交表，再配制各組的供試藥品，同時設原復方對照組和上一步的有效部分組合的對照組，進行能夠反映該中藥復方主要功效的藥理動物實驗，最后根據實驗結果，統計計算，將各個水平的均值填入因素水平表中各自相對應的表欄中，分析該表，根據均值的大小確定各藥材第二次分離后，得到的化學組成部份中起最主要作用的即是第二步找到的主要有效部分。
4.根據權利要求1或3所述的活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，其特征是各個藥材分別取第二步的主要有效部分，濃縮后用鹽酸調pH值至2，以正丁醇萃取，然后酸液用氫氧化鈉調PH值至10，再以正丁醇萃取，萃取后的堿液用鹽酸調PH值至中性，除去水溶液中的殘留溶劑后，濃縮，即得各個藥材的酸性萃取、堿性萃取和萃取后余下部分這三個水平，繼而根據因素水平的數量選擇正交表，再配制各組的供試藥品，同時設原復方對照組和上一步的有效部分組合的對照組，進行能夠反映該中藥復方主要功效的藥理動物實驗，最后根據實驗結果，統計計算，將各個水平的均值填入因素水平表中各自相對應的表欄中，分析該表，根據均值的大小確定各藥材第三次分離后，得到的化學組成部份中起最主要作用的即是第三步找到的主要有效部分。
5.根據權利要求1或4所述的活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法，其特征是各個藥材分別取上一步的主要有效部分，折算成相當于原藥材的生藥克數，取不同的克數設為各藥材的多個水平，繼而根據因素水平的數量選擇正交表，再配制各組的供試藥品，進行能夠反映該中藥復方某一主要功效的藥理動物實驗，最后根據實驗結果，統計計算，找出各味藥材各自適宜的服用劑量。
全文摘要
活用正交試驗設計尋找中藥復方中化學有效部位或成份的方法。單用中藥化學和藥理學的研究方法，探求中成藥與主治相關的有效物質基礎，易流于片面。本發明中藥成方中的組成藥材，其中有揮發油的藥材用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，然后各個藥材分別用水煎煮提取，每次1－3小時，加水量10倍以上，提取2次以上，合并多次提取液，濃縮，另取含有揮發油的藥材提取后剩余的水煎液濃縮后，濾過，攪拌中緩緩加入乙醇，令含醇量達70－80％，靜置24小時以上，則各藥材的上清液部分為一個水平，沉淀部分為一個水平，揮發油部分為一個水平，水煎煮提取液為一個水平。本發明用于中成藥中化學有效部位的分離和確定及其制劑應用。
文檔編號A61K36/00GK1836672SQ20051000984
公開日2006年9月27日 申請日期2005年3月23日 優先權日2005年3月23日
發明者劉凱 申請人:劉凱