提高標準化的松果菊制備物的免疫調節活性的方法

專利名稱：提高標準化的松果菊制備物的免疫調節活性的方法
專利說明提高標準化的松果菊制備物的免疫調節活性的方法
背景技術：
松果菊屬(Genus Echinacea)植物的提取物常常被用于在調節哺乳動物免疫反應。松果菊屬植物是生產黃雛菊的多年生植物，并且在首次種植后能夠進行多年收割。松果菊屬植物需要種植兩年。在收獲之前，各個新種植的植物經過數個成熟階段。在第一到第七階段，松果菊屬植物經過營養階段從發芽到開花，然后到完全開花。松果菊屬作物通常在全開花期收獲，并且被加工來提取具有醫學特性的產品。
對于調節哺乳動物中的免疫反應的特定松果菊屬化合物是未知的。但是，松果菊屬植物含有大量活性植物化學物質，例如咖啡酸衍生物(例如菊苣酸)、烷基胺(例如十二碳四烯酸丁胺)，和糖蛋白/多糖。攝食松果菊屬中的所有植物化學物質來獲得組合的效果。去除一類組分會降低有效作用。植物提取物被規格化來含有特定含量標記化合物。典型地，松果菊提取物被規格化來含有已知含量的一種或多種菊苣酸，多糖或烷基胺。


發明內容
本發明所描述方法中的一個實施方案是用于確定藥用植物的最佳收獲期(window)，通過從植物的各種大量不同成熟階段獲收獲至少一種植物；將植物的制備物加入到細胞培養物中；收獲細胞培養物；分析細胞培養物中藥用植物誘導的產物的水平；和觀察對應于各個不同成熟階段的產物的水平。
在此描述的方法的另一個實施方案是通過在完全開花期之前，在成熟階段收獲松果菊植物提高松果菊的免疫調節作用的方法。優選地，松果菊植物在階段6成熟的過程中或者之前被收獲。階段6的特征在于顏色為綠色或白色的直立葉舌花。更加優選地，在特征為植物具有約18mm的小芽的階段3成熟期或之前收獲松果菊植物。最優選地，在營養期(成熟期1)收獲植物。
在此描述的還有另一個本發明的實施方案是具有標準濃度的菊苣酸和被提高含量的免疫激活活性的松果菊制備物，其中制備物從在完全開花之前的成熟期中收獲的松果菊植物中獲得。
術語“提高”被用于指所觀察的活性升高。
術語“苞葉”是指保護花序的被修飾的葉片或葉片樣植物部分。
術語“免疫調節”和“免疫刺激”被用于指信使核糖核酸(mRNA)轉錄或者與免疫反應相關的蛋白質的生產水平的改變。
術語“誘導”(induce)或“誘導”(induction)(例如免疫細胞因子mRNA的誘導)是指通過定量RNA或蛋白質含量測定總的轉錄或翻譯產物或活性的升高。
術語“花序”是指植物的開花部分。
術語“舌葉”或“舌葉花”是指復合花(a composite flower)的傘形花序小花的花冠。
術語“成熟期”或“階段”是指在各個年周期中的植物發育過程的一個階段。該術語不是指多年生作物的年齡(以年計算)。
術語“分生組織”是指生成新細胞的組織。
術語“制備物”是指從脫水和/或粉碎的植物原料或者從植物材料的化學提取物中獲得的松果菊植物產品。



附圖1是描述在用來自在成熟期1、3和6收獲的松果菊植物的提取物處理后由THP-1細胞產生的細胞因子IL-1a、IL-1b、IL-6、IL-8和IL-10的mRNA含量以及IFN-g、MIP-1和TNF-a的含量的柱形圖，與用作陽性對照的標準脂多糖(LPS)溶液比較。

具體實施例方式 藥用植物例如松果菊的用途通常基于或者衍生于這些植物的最初發現者的使用。松果菊的最初發現者根據經驗選擇使用特定的植物。例如，早期的松果菊使用者可根據植物成熟(readiness)的視覺線索，知道何時收獲植物，來獲得期望的結果。最近，開發出更加精確的方法。該方法由進行化學分析一種或多種標記化合物的存在和含量構成。
菊苣酸是紫花松果菊制備物的優選標記化合物，這是由于該標記在品種鑒定中的應用是有價值的。
但是，在任何單獨的特定標記和所觀察免疫調節活性之間不存在確定的關系。經驗的或化學的方法都不能揭示最佳的收獲期，來獲得細胞水平上的最有利的免疫刺激活性。通常在完全開花期收獲松果菊。但是在植物成熟的較早階段收獲松果菊作物能夠獲得更好的免疫調節或者免疫刺激，通過人細胞中的基因反應來產生，并且維持高水平的用于標準化的標記化合物。在此描述的方法通過使用體外分析來測定免疫刺激核酸和/或蛋白質的誘導，確定理想的收獲期，來獲得最佳水平的免疫刺激。
紫花松果菊植物經過在此確定為成熟期1-7的多個成熟階段。階段1是營養期。階段2特征在于隱芽(hidden bud)形成。為了觀察階段2，環繞頂端分生組織的葉子必需被打開以確定存在指示花序開始的苞葉。階段3是小芽時期，其中苞葉直徑約一個美國硬幣的大小(18mm)。階段4是芽長大階段，其中苞葉的直徑約美國五分鎳幣的大小(21mm)。階段5的特征在于球果(cone)形成。球果是密集排列的小花的復合物。在階段6中，舌葉出現并直立生長。階段6的直立舌葉沿著球果的周邊形成，為綠色或白色。階段7是完全開花期，一旦舌葉伸長，凋萎變色，該階段結束。顏色在粉色到深紫色之間變化。
在上述的各個成熟期中，剪除地面以上約5厘米的整個松果菊植物。地面以上約5厘米是田地里機械收割松果菊植物的位置。收獲生長了6年的植物。在春季重新種植該植物。在重新種植該植物后約71天收獲階段1的植物。在重新種植該植物后約76天收獲階段3的植物。在重新種植該植物后約83天收獲階段6的植物。采集植物的5厘米以上的所有空中部分，用修枝剪刀剪成約1-2英寸大小的碎片，在烘干機中54℃(130°F)下脫水24h。然后被切碎和干燥的植物用咖啡磨研磨成粉末。可以通過許多方法，例如剁碎、切碎、研磨、碾磨或者通過其他方法來降低植物材料的顆粒大小。
由于個體間的發育步調的天然變化，各個植物的發育階段可能不同于鄰近的植物。理想地，全部被種植的植物都在期望收獲的發育階段。但是，由于發育步調的自然變化，約80％的種植植物在任何時間處于特定階段。觀察到階段1的成熟約90-100％一致。階段3約80％一致，而階段6約70％一致。目前一般實踐是在完全開花期收獲松果菊。在完全開花期收獲可能收集到一些已經開始退化的植物。
HPLC分析 已經被干燥和降低大小的干燥植物材料被加到80％的甲醇水溶液中，加熱到60℃(140°F)1小時，并搖晃。隨后，將植物材料放到搖床上，在室溫下1小時，然后根據分析需要被過濾和稀釋。
通過高壓液相層析(HPLC)確定各個成熟階段的植物提取物的菊苣酸含量。HPLC系統裝備了Photo Diode Array探測器。所用的柱是Waters公司(Milford，MA)的Symmetry C18，P/N WATO54215，4.6mm×250mm，5μm(微米)顆粒直徑。采用如下條件 移動相A0.2％磷酸水溶液 B100％甲醇 C100％乙腈 溶劑程序 梯度時間溶劑A溶劑B溶劑C0 70％20％10％25 54％36％10％30 25％40％35％35 70％20％10％45 70％20％10％ 流速0.6mL/min 注入體積10uL 柱溫度室溫25℃(77°F)；檢測波長330nm。
被檢測的各個成熟階段的分析結果顯示在表1中表1.菊苣酸濃度階段菊苣酸濃度(％)平均數標準誤差 1營養期3.49 0.09 2隱芽3.52 0.16 3小芽3.26 0.10 4提高芽3.62 0.115球果形成3.36 0.12 6舌葉直立3.54 0.14 7舌葉變色2.59 0.10 在成熟期1-6中測定的松果菊的菊苣酸含量基本上相似或相同。在成熟期7收獲的松果菊植物具有較低的商業價值，由于在這個階段觀察到菊苣酸含量下降。也就是說，表1中所列的菊苣酸含量之間的變化，屬于本領域技術人員通常可接受的個體植物之間的變化的水平內，或者屬于用于這些類型的分析的可接受耐受的變化。
作為植物的藥用產品，標記例如菊苣酸的標準化滿足市場或調節的期望是重要的。通過基因誘導測定的松果菊提取物的功能性隨著成熟階段而變化，而階段1-6的標記含量基本上不受收獲時間的變化的影響。 基因誘導分析 被干燥和通過剪切和/或研磨降低到較小碎片的植物材料首先被溶解在體積為50∶30∶20的二甲基亞砜(DMSO)∶乙醇∶水的混合物中。隨后，提取物進一步用期望體積的細胞培養葉稀釋來獲得用于基因誘導分析的特定濃度。
比較紫花松果菊的3個成熟期的對THP-1單細胞/巨噬細胞系的免疫刺激作用。THP-1細胞系來自人外周血，可從ATCC，Manassas，VA獲得(ATCC號TIB-202)。THP-1單細胞/巨噬細胞系被用作人和其他哺乳動物的循環血單細胞和巨噬細胞模型。循環血單細胞和巨噬細胞在炎癥和免疫反應中起重要作用。在體內轉錄水平上測定巨噬細胞和單細胞來源的細胞因子，包括腫瘤壞死因子α、干擾素γ、白介素(IL)-1α、IL-1β、IL-6、IL-10，以及趨化因子，包括巨噬細胞炎癥蛋白-1(MIP-1)和IL-8的含量，并被規格化到看家基因、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)。
THP-1細胞在37℃(98.6°F)在具有2mM谷氨酰胺的供應商推薦的RPMI 1640培養液中生長，該培養液被調節以含有1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄糖、10mMHEPES和1.0mM丙酮酸鈉并添加0.05mM 2-巰基乙醇、90％胎牛血清，10％。在試驗前的24h，細胞以106個細胞/mL的濃度種植。然后用在成熟期1、3和6收獲的植物的松果菊提取物處理細胞。脂多糖(LPS)被用作陽性對照。以在生長液中100ug/ml(微升/毫升)的濃度制備提取物。將提取物加入50％DMSO、30％乙醇、20％水的母液中，以在處理中不超過0.5％的最終溶劑濃度。作為陽性對照的LPS以500ng/ml的最終濃度被使用。在收獲細胞之前，細胞培養物在37℃(98.6°F)下培養6h。
通過離心來收獲細胞。如Stratagene(La Jolla，CA)的RNA分離試劑盒(#200345)的指示，用常規的Trizol/異硫氰酸胍基礎溶解緩沖液分離RNA。還通過刮擦(scraping)和胰蛋白酶消化(trypinizing)來收獲細胞培養物。通過已知的定量反轉錄酶-聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)測定免疫細胞因子mRNA和趨化因子mRNA的誘導。測定基線測定值為非LPS刺激，并與實時PCR數據比較。該結果顯示在附圖1中。通過比較該結果與未被誘導的THP-1細胞中的各個基因的表達水平來計算倍數誘導。
當比較紫花松果菊的3個成熟期對THP-1單細胞/巨噬細胞系的免疫刺激作用，階段1的材料具有最可能的誘導活性，特別是對細胞因子干擾素γ和腫瘤壞死因子α的誘導的作用。
階段1、3和6的菊苣酸含量沒有顯著變化，參見表1。顯示在附圖1中的結果表明，雖然在成熟期之間標準化標記的含量沒有顯著變化，但是免疫刺激誘導在收獲植物的成熟期中發生巨大改變。在完全開花之前收獲松果菊植物用作沉積免疫系統的產品不與目前實施的標準操作沖突，但是可能會產生更好的免疫刺激作用。
除了上面討論的特定制備物外，既便植物制備物發生變化，只要這種變化沒有從制備物中去除植物化學物質，有望觀察到標記含量的標準化以及免疫刺激反應提高。例如，從攝食來自在完全開花前的成熟期中收獲的松果菊植物的植物化學物質產生的提高的免疫刺激作用，也可以從Menon等人的美國專利6,217,878中的粉末狀松果菊制備物中獲得。
除非本文另外指出或與本文明顯抵觸，在描述本發明的文(特別是附隨的權利要求書)中使用的術語“一個”和“該”以及類似指示被解釋為包括單數和復數。除非本文另外指出，本文的數值范圍的引用僅僅是作為分別對應于落入保護范圍的各個分離數值的速記方法，各個分離數值被結合到說明書中，如同其在此被分別地引用。除非本文另外指出或與本文明顯抵觸，本文描述的所有方法可以以任何合適順序被實施。除非另外要求，在此提供的任何和全部實施例或者示例性用語(例如，“如”或“例如”)的使用僅僅是為了更好地說明本發明，而不是對本發明的保護范圍的限定。說明書中的用語都不應當被解釋為表示完成發明必需的任何非要求保護的要素。
本發明在此描述的為優選實施方案，包括發明人知曉的實施發明的最佳模式。當然，那些優選實施方案的改變對于本領域技術人員來說在閱讀了前面的描述后是顯而易見的。本發明人期望本領域技術人員適當地進行這種改變，并且本發明人期望以不同于在這種特別描述的其他方式來實施本發明。因此，本發明包括所附的權利要求中引用主題的專利法所允許的所有改進和等同形式。而且，除非本文或別處另外指出，本發明包括以上描述的要素以其所有可能變化的任何組合。
權利要求
1.用于確定藥用植物的最佳收獲期的方法，該方法包括的步驟為
在多個植物成熟階段收獲至少一棵植物；
將植物制備物加入細胞培養物中；
收獲細胞培養物；
分析細胞培養物中的藥用植物誘導的產物的含量；
觀察對應于各個不同成熟期的產物的含量。
2.根據權利要求1所述的方法，還包括在多個成熟階段確定各個植物的標記化合物的濃度的步驟。
3.用確定松果菊植物的最佳收獲期的方法，該方法包括的步驟為
在多個植物成熟階段收獲至少一棵植物；
將植物制備物加入細胞培養物中；
收獲細胞培養物；
分析細胞培養物中的由松果菊誘導的免疫刺激產物的含量；和
觀察對應于各個不同成熟期的免疫刺激產物的含量。
4.根據權利要求3所述的方法，還包括在多個成熟階段確定各個植物的標記化合物的濃度的步驟。
5.根據權利要求4所述的方法，其中標記化合物選自菊苣酸、烷基胺、糖蛋白、多糖以及它們的組合。
6.根據權利要求3所述的方法，其中免疫刺激產物選自細胞因子mRNA和趨化因子mRNA。
7.根據權利要求3所述的方法，其中免疫刺激產物是選自IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α、干擾素γ、以及巨噬細胞炎癥蛋白-1。
8.增強松果菊提取物的免疫刺激作用的方法，該方法包括步驟
在成熟階段收獲松果菊植物，包括完全開花之前的階段；
干燥植物；
降低植物大小；
用溶劑提取植物。
9.根據權利要求8所述的方法，其中成熟階段是營養期。
10.根據權利要求8所述的方法，還包括維持標準含量菊苣酸的步驟。
11.增強松果菊提取物的免疫刺激作用的方法，該方法包括步驟
在營養期的成熟階段收獲松果菊植物；
干燥植物；
降低植物大小；
用溶劑提取植物。
12.一種松果菊制備物包括
標準濃度的菊苣酸；和
提高水平的免疫刺激活性；
其中從在完全開花之前的成熟階段收獲的松果菊植物中獲得該制備物。
13.根據權利要求12所述的制備物，其中提高水平的免疫刺激活性通過在THP-1細胞中誘導選自IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α、干擾素γ、以及巨噬細胞炎癥蛋白-1的mRNA轉錄本來測定。
14.根據權利要求12所述的制備物，其中提高水平的免疫刺激活性通過在THP-1細胞中誘導選自腫瘤壞死因子α和干擾素γ的mRNA轉錄本來測定。
15.一種松果菊制備物包括
標準濃度的菊苣酸；和
提高水平的免疫刺激活性；
其中從營養期收獲的松果菊植物中獲得該制備物。
16.根據權利要求15所述的制備物，其中提高水平的免疫刺激活性通過在THP-1細胞中誘導選自IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α、干擾素γ、以及巨噬細胞炎癥蛋白-1的mRNA轉錄本來測定。
17.根據權利要求15所述的制備物，其中提高水平的免疫刺激活性通過在THP-1細胞中誘導選自腫瘤壞死因子α和干擾素γ的mRNA轉錄本來測定。
18.一種松果菊制備物包括
標準濃度的菊苣酸，
其中該制備物誘導提高水平的免疫刺激活性；和
其中從營養期收獲的松果菊植物中獲得該制備物。
19.根據權利要求18所述的制備物，其中提高水平的免疫刺激活性通過在THP-1細胞中誘導選自IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子α、干擾素γ、以及巨噬細胞炎癥蛋白-1的mRNA轉錄本來測定。
20.根據權利要求18所述的制備物，其中提高水平的免疫刺激活性通過在THP-1細胞中誘導選自腫瘤壞死因子α和干擾素γ的mRNA轉錄本來測定。
21.紫花松果菊制備物包括
通過HPLC分析測定至少約3.49百分含量的標準濃度的菊苣酸；
其中制備物在THP-1細胞中產生至少100倍的提高免疫刺激反應。
22.根據權利要求21所述的制備物，其中提高水平的免疫刺激反應通過在細胞中誘導選自腫瘤壞死因子α和干擾素γ的mRNA轉錄本來測定。
全文摘要
具有標準的菊苣酸含量并且誘導提高水平的免疫刺激活性的松果菊制備物。通過選擇松果菊植物的收獲時間來實現提高免疫刺激活性，該收獲時間是完全開花之前的植物成熟階段。通過在完全開花之前收獲的松果菊植物提高免疫刺激作用的方法。
文檔編號A61K36/28GK1680584SQ20051000760
公開日2005年10月12日 申請日期2005年2月6日 優先權日2004年2月6日
發明者E·A·布魯維利, H·羅－施密特, A·布萊克漢 申請人:愛克斯國際商務集團公司