使用抗cd20嵌合抗體治療循環腫瘤細胞相關的血液惡性腫瘤的制作方法

專利名稱：使用抗cd20嵌合抗體治療循環腫瘤細胞相關的血液惡性腫瘤的制作方法
技術領域：
本發明為分案申請，母案申請日為1999年11月9日，申請號為99814329.4，發明名稱為“使用抗CD20嵌合抗體治療循環腫瘤細胞相關的血液惡性腫瘤”。
本發明領域本發明涉及通過施用治療上有效量的結合B細胞表面抗原Bp35(CD20)的嵌合或人源化抗體，治療大量的循環腫瘤細胞相關的血液惡性腫瘤。
本發明背景先前已報道了抗CD20抗原的抗體作為B細胞淋巴瘤的診斷和/或治療劑的應用。CD20是B細胞淋巴瘤的有用標志或靶標，因為該抗原在惡性B細胞，即其居高不下的增殖能導致B細胞淋巴瘤的B細胞，的表面以極高的密度表達。
CD20或Bp35是在早期前B細胞發育過程中表達并保持到漿細胞分化的B淋巴細胞限制性分化抗原。一些人認為CD20分子可調節細胞周期起始和分化所必需的B細胞激活過程中的一個步驟。而且，正如指出的那樣，CD20通常在贅生性(“腫瘤”)B細胞中以極高水平表達。
先前報道的涉及抗CD20抗體的治療包括單獨施用治療性抗CD20抗體，或治療性抗CD20抗體結合第二個放射性標記的抗CD20抗體或化學治療劑一起施用。
事實上，食品和藥物管理局(Food and Drug Administration)已同意了一個這種治療性抗CD20抗體RITUXAN在復發的以前治療過的低級非何杰金淋巴瘤(NHL)中的治療應用。另外，RITUXAN聯合放射性標記的鼠抗CD20抗體也被建議用于治療B細胞淋巴瘤。
但是，盡管已報道抗CD20抗體特別是RITUXAN，可有效治療B細胞淋巴瘤如非何杰金淋巴瘤，但如果可開發對其它惡性腫瘤的有效抗體治療將會是有益的。更具體地，如果抗CD20抗體可用于治療其它類型的惡性腫瘤，將是有益的。
本發明簡述為此，本發明人針對以血液中含有大量腫瘤細胞為特征的血液惡性腫瘤，開發了一種新的治療方法，該方法涉及施用治療上有效量的抗CD20抗體。在優選實施方案中，該抗CD20抗體含嵌合、人源化或人抗人CD20抗體。該血液惡性腫瘤的例子包括B幼淋巴細胞白血病(B-PLL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)和轉化的非何杰金淋巴瘤。
因此，本發明的一個目標是提供一種新的血液惡性腫瘤治療方法，該方法包括施用抗CD20抗體。
本發明的一個更具有的目標是提供一種新的治療B幼淋巴細胞白血病(B-PLL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)和轉化的非何杰金淋巴瘤的方法，該方法包括施用抗CD20抗體。
本發明的一個更為具體的目標是治療B幼淋巴細胞白血病(B-PLL)或慢性淋巴細胞白血病(CLL)，包括施用治療上有效量的RITUXAN。
本發明詳述本發明涉及如下發現，即通過施用治療性抗CD20抗體可有效地治療血液惡性腫瘤，尤其是那些以血液中含有大量腫瘤細胞為特征的血液惡性腫瘤。這些惡性腫瘤包括，尤其是，CLL、B-PLL和轉化的非何杰金淋巴瘤。
該發現是令人驚奇的，盡管已有RITUXAN可極為成功地治療復發的以前治療過的低級非何杰金淋巴瘤的報道。尤其是，考慮到這些患者中所觀察到的非常大量的腫瘤細胞，以及考慮到這些惡性腫瘤細胞例如CLL細胞典型地并不表達高密度的CD20抗原這一事實，該發現是令人驚奇的，其中CD20抗原的高密度表達是一些B細胞淋巴瘤例如先前已治療過的復發低級非何杰金淋巴瘤的特征。因此，不能合理預測，CD20抗原可構成這些惡性腫瘤的治療性抗體治療的合適靶標。
根據本發明，血液惡性腫瘤如CLL、B-PLL和轉化的非何杰金淋巴腫瘤的治療包括施用治療上有效量的抗CD20抗體，該施用可單獨或與其它治療例如化療、放療(如全身輻射、或用放射性標記抗體進行的治療)聯合進行。此外，和細胞因子一起進行的聯合治療可能對于上調淋巴瘤細胞表面的CD20是有用的。
在優選的實施方案中，抗CD20抗體以高親和性，即從10-5至10-9M，與CD20結合。優選地，抗CD20抗體包括嵌合、靈長類、靈長類源化(primatize)、人、人源化抗體。此外，本發明包括抗體片段的使用，例如Fab、Fv、Fab、F(ab)2和它們的聚集體。
嵌合抗體是指含有非人可變區和人恒定區的抗體，最典型的是嚙齒類動物的可變區和人的恒定區。
靈長類源化(primatize)抗體是指具有靈長類可變區如CDR和人恒定區的抗體。優選地，該靈長類可變區來源于(Old World monkey)舊大陸猴。
人源化抗體是指主要具有人的框架和恒定區，以及非人互補決定區(CDR)的抗體。“主要”是指人源化抗體典型地保留有至少幾個(CDR所來源的非人親本抗體的)供體框架殘基這一事實。
制備嵌合、靈長類、靈長類源化、人源化和人抗體的方法是本領域熟知的。見例如頒發給Queen等的美國專利5,530,101，頒發給Winter等的美國專利5,225,539，分別頒發給Boss等和Cabilly等的美國專利4,816,397和4,816,567，所有這些均完整地以參考文獻方式并入。
人恒定區的選擇可能對于目的抗CD20抗體的治療效果是重要的。在優選實施方案中，目的抗CD20抗體含有人γ1或γ3恒定區，更優選地含有人γ1恒定區。頒發給Robinson等的美國專利中公開了γ1抗CD20抗體作為治療劑的應用。
制備人抗體的方法也是已知的，包括例如SCID小鼠中生產和體外免疫。
正如指出的，特別優選的抗CD20嵌合抗體是RITUXAN，其是嵌合γ1抗人CD20抗體。該抗體的完整氨基酸和相應核酸序列可在美國專利5,736,137中找到，該專利完整地以參考文獻方式并入。在IDEC制藥公司商品化的專利CHO細胞表達系統中產生的該抗體可通過CHO細胞轉染瘤進行制備，該CHO細胞轉染瘤依據布達佩斯條約的規定于1992年11月4日保藏在美國典型培養物保藏中心，該保藏中心位于12301 ParklawnDrive，Rockville，MD 20852，現在位于10801 University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209(ATCC 69119)。該細胞系被確定是存活的，并且在保藏期間如果其不能存活則將被更換。根據5,736,137專利的發布該細胞系不可改變地可為公眾獲得，而且可無限制地從ATCC獲得。該細胞系還可在根據本申請授予的任何專利的有效期中無限制地獲得。
所述抗CD20抗體可通過各種給藥途徑，典型的是非腸胃途徑進行施用。非腸胃途徑包括靜脈內、肌肉內、皮下、直腸、陰道、并且優選靜脈內灌注。
該抗CD20抗體可通過標準方法配制用于治療用途，這些方法例如有加入藥物上可接受緩沖液如無菌鹽水、無菌緩沖水、丙二醇、和它們的組合。
有效劑量取決于具體的抗體、患者情況、年齡、重量、或任何其它治療和其它因素。典型地，有效劑量從0.001-大約30mg/kg體重，更優選從0.01-25mg/kg體重，最優選從0.1-大約20mg/kg體重。
取決于施用的劑量和患者的反應，所述給藥可通過各種方案實現，例如每周、每兩周、或每月一次。而且，所述給藥與其它治療的聯合可能是可取的，這些治療例如有靶向和非靶向的放療、化療、以及淋巴因子或細胞因子如白介素、干擾素、TNF、集落刺激因子等的施用。
典型地，治療可每周進行，持續大約2-10周，更典型地持續大約4周。一種尤其優選的給藥方案包括每周施用大約0.375mg/kg，總共進行4次灌注。此外，可能甚至更優選累加給藥的方案(stepped-up dosingschedule)。
如果聯合使用放射和治療性抗CD20抗體，則優選使用釔標記的抗CD20抗體，正如以參考文獻形式完整地并入本文的美國專利5,736,137所公開的。已報道抗體2B8-MX-DTPA在治療B細胞淋巴瘤中的有效性。產生2B8抗體的細胞系根據布達佩斯條約的規定于1993年6月2日保藏在美國典型培養物保藏中心，根據美國專利5,736,137的發布可無任何限制和不可更改地為公眾獲得。該細胞系是存活的，而且如果發現其不存活，則在根據本申請授予的任何專利的有效期內會進行相似更換。
可以聯合所述抗體的免疫治療一起使用的一個尤其優選的化療方案包括CHOP免疫治療，該治療包括聯合施用環磷酰胺、阿霉素、長春新堿和強的松。其它已知的化療劑包括氨甲蝶呤、順鉑、托瑞米芬和他莫昔芬。
以下的實施例并不旨在，也不應理解為限制本發明。這些實施例旨在提供臨床證據支持本發明的有效性。
實施例1我們對兩名患者進行了研究，這兩名患者出現與嚴重肺灌注相關毒性和血小板減少有關的血液腫瘤細胞的快速減少。而且，從醫師提交的RITUXAN治療相關的不利事件的報告中收集了其它兩名患者。這些患者治療前的狀況包括平均年齡60歲(范圍是26-73)，診斷患有B幼淋巴細胞白血病(B-PLL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)或轉化的非何杰金淋巴瘤。所有這些患者由于血液腫瘤疾病、腫大性腺病和內臟增大而出現白細胞計數增加。所有這4個患者均出現嚴重灌注相關反應的獨特癥狀，特征是發燒、寒戰、支氣管痙攣和伴隨的缺氧，需要暫時停止RITUXAN治療。伴隨這些癥狀出現的是循環腫瘤細胞負載的快速減少(治療前平均98×109/L；范圍73-132，相對于治療后平均11×109/L；范圍3.7-24.6)和快速腫瘤溶解的輕微電解跡象。在所有4個患者中均注意到血小板減少，一種不常與RITUXAN治療相關的現象(治療前平均145×109/L；范圍57-277，相對于治療后平均56×109/L；范圍2-120)，在一個病例中需要輸血。該綜合癥的癥狀需要住院治療但經支持性醫護后消退。所有患者對隨后的RITUXAN治療均有很好的耐受。對兩個后來的具有高血液腫瘤計數的CLL患者使用累加給藥(第1天100mg/m2，之后在第2天進行其余治療)，產生明顯效果，血小板減少但灌注相關的毒性很小。在患有血液腫瘤細胞疾病的血液惡性腫瘤患者中施用RITUXAN可能與較高頻率的要求謹慎臨床監護的嚴重初始灌注相關反應和血小板減少有關。考慮到這些患者中的RITUXAN初步活性，應使用累加給藥計劃在CLL和PLL中進行進一步的研究。
實施例2對于NHL治療，未標記的免疫球蛋白(Mab)是有吸引力的，因為它們可介導補體(CDC)或效應細胞(ADCC)的細胞毒性；實現細胞程序化死亡；比連接毒素或藥物的Mab具有更小的毒性、更小的免疫原性以及可能更有效；不需要放射性標記的Mab治療(RIT)所需的復雜程序，而且不產生高劑量RIT典型的骨髓抑制。直到最近，Mab在血液惡性腫瘤治療中的使用仍是有限的。然而，嵌合抗CD20 Mab，RITUXAN，具有低毒性和顯著的臨床效果，而且目前已被食品和藥物管理局同意用于治療復發或頑固性、低級或濾泡性(R＝LG/F)NHL。在單因素臨床試驗(PIII)中，用RITUXAN以每周375mg/m2治療166個R-LG/F NHL患者，進行4次灌注(102-05號研究)，總應答率(ORR)為48％(6％完全應答(CR)和42％部分應答(PR))。對于應答者，發展的平均時間是13.1個月，應答持續時間是11.2個月。在第一次給藥后，平均循環B淋巴細胞計數降至零。CD3、CD4、CD8和NK細胞計數保持不變。外周血中的B細胞恢復開始于第6-9個月，第9-12個月后完全恢復。沒有觀察到血清補體水平的明顯改變。用CDC、ADCC、細胞程序化死亡和/或其它考慮的因素仍不能解釋該反應機制。盡管缺乏臨床/實驗室的相關性，但CDC的作用不可忽視。我們觀察到基線上的較高NK絕對細胞數和對Mab應答間的相關性。
注N＝來自102-05號研究的166名患者，和來自102-06號研究的37名患者。絕對計數NK，CD3＝細胞數/mm3；ANC，Pts.＝細胞數×10e3/mm3。P值表示絕對計數間的差異。
ADCC可能對于在RITUXAN治療的患者中所觀察到的臨床活性是一個重要機制。增強效應細胞數目和活性的試劑可與Mab協同作用。此外正在進行RITUXAN聯合細胞因子如IL-2、G-CSF、GM-CSF、INF的研究。
實施例3CLL中RITUXAN的I/II期研究RITUXAN是靶向CD20的單克隆抗體，在治療低級淋巴瘤(LGL)中有顯著效果。當以375mg/m2劑量的方式每周4次給藥，復發患者(PTS)的應答率為43％(McClaughlin等，J Clin.Oncol，16(8)2825-33)。小淋巴細胞淋巴瘤患者比其它亞型LGL有較低的應答率(13％)和較低的RITUXAN血清水平。SLL中所見的降低的應答可能與較低的CD20抗原密度和/或較高的循環B細胞計數相關。這兩個因素被認為可能(負面)影響CLL中所見的應答。為了最大化CLL中的活性，我們進行了I/II期研究。所有患者接受375mg/m2的首劑量以最小化灌注-復發的副作用。之后每周給藥(3次)保持不變，但給予增加的劑量水平。16名患者以500-1500mg/m3的劑量治療。平均年齡為66歲(范圍，25-78)。81％的患者患有III/IV末期疾病。平均白細胞數為40×109/L(范圍，4-200)，Hgb為11.6g/dl(范圍，7.7-14.7)，血小板為75×109/L(范圍，16-160)，平均β2免疫球蛋白為4.5mg/L(范圍，3.1-9.2)。預先治療的平均數為2.5(范圍，1-9)。60％患者對治療不反應。兩名患者在服用第一個劑量(375mg/m3)后出現嚴重的高血壓；另一名患者接受進一步治療。盡管沒有對患者在1500mg/m3劑量水平進行全部評價，隨后增加劑量的毒性是輕微的。8名患者完成治療(500mg/m24次、650mg/m23次、825mg/m21次)。以560mg/m2治療的一名患者獲得完全的癥狀緩解。一名患者在治療時出現進行性淋巴細胞增生，所有其它患者的外周血淋巴細胞增生減少，但較少影響淋巴結。劑量增加研究正在進行中。
實施例4
細胞因子用于上調CD20的表達改善CLL患者中應答的另一個方法是使用細胞因子上調CD20抗原。在體外研究中，將來自CLL患者的單核細胞與各種細胞因子一起孵育24小時。流式細胞計結果顯示IL-4、GM-CSF和TNF-α引起顯著上調。Venugopal P，Sivararnan S，Huang X，Chopra H，O’Brein T，Jajeh A，Preisler H，通過體外暴露于細胞因子慢性淋巴細胞白血病(CLL)細胞中的CD20表達上調，血液(Blood)1998；10247a。實際上，最近的數據提示CLL細胞上所觀察到的CD20上調可能限于腫瘤細胞(Venogopal等，海報-泛太平洋淋巴瘤會議，1999年6月，慢性淋巴細胞白血病(CLL)細胞中細胞因子誘導的CD20抗原表達上調可能限于腫瘤細胞。初步數據還提示α干擾素當以500-1000U/ml的濃度應用時僅在24小時后也可上調CLL細胞上的CD20。
因此，在施用Rituximab之前或同時通過給CLL患者施用某些細胞因子，可上調惡性B細胞表面的CD20表達，由此使得CD20以及其它細胞表面標志如CD19，成為免疫治療的更具有吸引力的靶標。
已啟動一個測試用于體內CD20上調的最佳細胞因子劑量的協作研究。研究步驟包括10名患者最初以250mcg/m2SQ QD X3的GM-CSF進行治療、10名患者以mcg/kg SQ QD X3的IL-4進行治療、10名患者以5mcg/kgSQ QD X3的G-CSF進行治療。通過Ficon Hypaque離心分離單核細胞用于細胞凋亡研究，以確定CD20的上調是否導致Rituximab對腫瘤細胞的殺傷增強。
實施例5聯合抗體和化療的方法CLL的抗體治療可聯合其它常規已知對CLL治療有用的化療法。對于CLL最為經常使用的單個試劑是苯丁酸氮芥(瘤可寧)，給藥方法為每天0.1mg/kg或每4周0.4-1.0mg/kg。苯丁酸氮芥通常聯合口服強的松(30-100mg/m2/d)，這在處理自身免疫性血細胞減少方面是有用的。環磷酰胺是苯丁酸氮芥的一種替代物，通常使用劑量為每3-4周1-2g/m2，并聯合長春新堿和類固醇一起使用(如COP療法)。
已有各種藥物組合用于CLL，包括COP(環磷酰胺、長春新堿和強的松)，和CHOP(這三種藥加上阿霉素)。氟達拉濱在CLL治療中顯示出有作用，而且在以每3-4周25-30mg/m2/d方式治療的患者群中產生50％的ORR。http//www.cancernetwork.com。盡管一些患者表現出對氟達拉濱不起反應。這些患者可能也抗2-CdA，因為通常對氟達拉濱不起反應的患者也對2-CdA不起反應(O’Brien等，N.Engl.J.Med.330319-322(1994))。
因此，抗CD20抗體治療將對那些頑固性或化療藥物治療后復發的患者尤其有用。在這些患者中Rituximab治療還可與放療聯合。相對75-150cGy總劑量有15cGy低劑量的TBI在大約三分之一的患者中顯示有效。
目前正在通過CALGB在CLL患者中進行II期實驗。Rituximab和氟達拉濱同時施用，之后進行Rituximab鞏固，或是在氟達拉濱誘導后給予Rituximab。
研究的目的是(1)確定氟達拉濱治療的CLL患者的完全應答(CR)率，和同時和鞏固性Rituximab治療(Arm I)的毒性以及鞏固性Rituximab治療(Arm II)的毒性；(2)在接受Rituximab和氟達拉濱(Arm I的誘導期)同時治療的患者中評價CR率；(3)在接受Rituximab鞏固性治療的CLL患者中評價部分應答(PR)轉化成CR或穩定性疾病轉化成PR或CR的頻率；(4)跟蹤Rituximab和氟達拉濱治療對免疫學標志CD4、CD8、IgG、IgA和IgM的影響；和(5)檢查Arm I和II中的無疾病惡化性存活和完全存活。
盡管對于清楚和理解的目的，本發明通過說明和實施例進行了相當詳細地描述，但明顯地在所附權利要求的范圍內進行的某些改變和修飾可能是可行的。
權利要求
1.抗CD20抗體在制備用于治療與大量的循環腫瘤細胞相關的血液惡性腫瘤的藥物中的應用。
2.權利要求1的應用，其中所述惡性腫瘤是白血病。
3.權利要求1的應用，其中所述惡性腫瘤是B幼淋巴細胞白血病(B-PLL)或慢性淋巴細胞白血病(CLL)。
4.權利要求1的應用，其中所述抗體是嵌合、人源化或人抗CD20抗體。
5.權利要求1的應用，其中所述藥物以0.1-30mg抗體/kg的劑量施用。
6.權利要求5的應用，其中所述劑量每周施用，持續大約2-10周。
7.權利要求1的應用，其中所述抗體是rituximab。
8.權利要求3的應用，其中所述藥物聯合放射、化療和/或淋巴因子一起施用。
9.權利要求1的應用，其中所述藥物以每周375mg/kg劑量灌注，共施用4周。
10.權利要求8的應用，其中所述淋巴因子選自IL-4、GM-CSF、TNF-α和干擾素α。
11.權利要求8的應用，其中所述化療選自苯丁酸氮芥(瘤可寧)、強的松、環磷酰胺、COP、CHOP和氟達拉濱。
12.抗CD20抗體在制備用于治療對化療頑固的與大量的循環腫瘤細胞相關的血液惡性腫瘤的藥物中的應用。
全文摘要
通過施用治療性抗CD20嵌合抗體治療與高循環腫瘤細胞數相關的血液惡性腫瘤的方法。這些惡性腫瘤尤其包括B－幼淋巴細胞白血病(B－PLL)、慢性淋巴細胞白血病(CLL)、和轉化的非何杰金淋巴瘤。
文檔編號A61K31/675GK1679934SQ200510004368
公開日2005年10月12日 申請日期1999年11月9日 優先權日1998年11月9日
發明者A·J·格瑞羅-魯佩茲, C·A·懷特 申請人:Idec藥物公司