用于對人及高等動物進行治療性和預防性免疫刺激的取代的非編碼核酸分子的制作方法

專利名稱：用于對人及高等動物進行治療性和預防性免疫刺激的取代的非編碼核酸分子的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于調控人或動物的免疫系統活性的取代的、非編碼核酸分子，以及制備這種分子的方法和含有所述取代的、非編碼核酸分子的疫苗。
在對抗抗原的免疫應答的形成過程中，能區分出免疫系統的兩個主要分支其中一支是體液支(arm)，它依賴于B淋巴細胞的抗體合成以及非適應性免疫的體液組分(補體系統)；另一支是細胞支，它依賴于免疫系統的T淋巴細胞、NK細胞和抗原呈遞細胞的活性。T淋巴細胞能識別被病毒所感染的細胞。相應地，細胞支也被稱作為TH1應答以及體液支被稱作為TH2應答。
TH2支常常攻擊主要存在于細胞外的細菌和寄生蟲。但是，TH1支(指的主要是細胞毒細胞)主要攻擊主要停留在細胞內的病原體，例如一些細菌物種和所有的病毒。
對疫苗的研制已經持續地生成了更為有效的并同時顯示出更少副作用的疫苗。除了減毒活疫苗或滅活病原體以外，已經研制出了由重組方法制備的抗原構成的疫苗(例如抗B型肝炎病毒的疫苗、抗單純皰疹病毒、人乳頭瘤病毒(宮頸癌)和疏螺旋體的重組疫苗都處于臨床研制中)。這些疫苗導致了主要是TH2占優勢的免疫應答，并需要共施用佐劑以便獲得穩定的免疫。因此，這些佐劑導致了體液及細胞免疫應答之間的平衡。
如果疫苗能引發TH1占優勢的免疫應答，那么只要疫苗接種就能防護一些感染性疾病。對于這些疫苗，DNA疫苗(誘導細胞免疫)以及重組抗原(誘導體液免疫)的組合目前被認為是最佳組合(Esteban et al.，Vaccine 2002，201226-1231)。重組蛋白合成困難且價格昂貴，這是這個過程中的決定性的成本因素。能較為廉價地制備的肽只有有限的用處，因為它們誘導了向TH2占優勢的免疫應答的轉化。
雖然在DNA疫苗接種上取得了很大的進步，但是直到今日還沒有實現真正的突破。對于這個事實，存在著一些原因，其中有不充分的轉染和所造成的低水平的疫苗接種的抗原的表達、和疫苗接種所形成的總體上不足夠顯著的免疫應答。
為了提高轉染效率，通過不同的結合方法已經將不同的肽和其他的有機分子連接到基因轉移載體上。也嘗試通過結合配體，利用配體-受體相互作用提高對基因轉移載體的攝取(Fraser et al.，1998，Semin.Immunl.，10(5)363-72)。
通過SV-40病毒的核定位信號(NLS)與編碼肝炎病毒的小表面抗原(HBsAg)的表達構建體的共價連接，在肌肉內施用后，可以證實抗體滴度增加了10到15倍(Schirmbeck et al.，J.Mol Med.2001 Jun；79(5-6)343-50)。
為了避免現有的病毒的和基于質粒的基因轉移系統的缺點，研制了共價閉合的、最小化的DNA表達構建體(見EP 0 914 318 B1)。這些最小化的表達構建體也能與SV-40病毒的核定位信號共價連接，并導致向TH1為主的免疫應答的轉化(見WO 03/0031469)。
為了產生提高的免疫應答，采用CpG寡核苷酸(CpG-ODN)作為一種新型的免疫調控分子。這些未甲基化的CpG基序存在于細菌DNA內，并構成了免疫系統的危險信號。作為一種病原體相關的分子模式(PAMP)，它們主要造成了對固有免疫系統的非特異性激活(Krieg，Nat.Med 2003，9831-835)。
CpG ODN也通過細胞因子白介素-12、干擾素-γ和腫瘤壞死因子-α的方式誘導了基于TH1的免疫應答。
包括所述的CpG ODN的免疫刺激核酸序列(ISS)在長度上只有數個堿基，并且不通過其上所編碼的蛋白的表達發揮功能。
在此所用的ISS是啞鈴形共價閉合脫氧核糖核酸分子。寡核苷酸包括能部分彼此形成配對的堿基、和一個或兩個包括30個堿基的發夾環，并含有一些CpG基序(見EP 1 196 178)。已經證實這些啞鈴形共價閉合脫氧核糖核酸分子的免疫調控作用強烈地依賴于環狀雙鏈組合以及其中所含的CpG基序。線性化、發夾環的缺失、分子的縮小或CpG基序的去除都導致了細胞因子的誘導模式的變化。
對細胞免疫應答的強烈刺激有助于對調節周期的影響，在沒有干擾的情況下，這將導致令患者滿意的免疫活性。
在下面，這些包括至少一個或多個CpG基序以及在其一個或兩個末端上的單鏈發夾環的啞鈴形共價閉合非編碼核酸分子被同義地稱為“載體分子”。
在上下文中，術語“核酸”被理解為指的是脫氧核糖核酸。
在本發明的上下文中，免疫刺激表示用核酸分子刺激免疫系統的中介物和效應細胞，使得細胞增殖、遷移、分化或變成為活性細胞，所述的中介物和效應細胞具體地是目前已知的具有輔助功能的胸腺細胞、和細胞毒胸腺細胞、B細胞和所謂的NK(自然殺傷)細胞、巨噬細胞和單核細胞、以及樹突狀細胞和它們的前體細胞、以及如在本發明中所述的在免疫系統內具有功能但其功能仍未被解釋的細胞群。免疫調控除了表示提供在上面所定義的意義內的一般刺激外，還表示通過影響當前仍在發育或成熟中的免疫反應或通過自身調控已經建立的反應的特點影響免疫反應的性質或特點。
在本發明的上下文中，短核酸分子是具有如在下面的實施例中所給出的鏈長度(優選地是48到116個核苷酸)的分子。
與本領域的現有技術不同的是，本發明的目的是提供能誘導有效的免疫應答的適當修飾的載體分子，以及合成這些修飾的載體分子的方法和含有修飾的載體分子的疫苗。
本發明通過提供權利要求1的非編碼核酸分子實現這個目的，所述核酸分子由由部分單鏈的啞鈴形脫氧核糖核苷酸殘基鏈組成，并在其單鏈或雙鏈區內含有一或多個序列的堿基序列N1N2CGN3N4，其中N1N2是選自包括GT、GG、GA、AT或AA的組的元件，N3N4是選自包括CT或TT的組的元件，以及C是脫氧胞苷，G是脫氧鳥苷，A是脫氧腺苷和T是脫氧胸苷，且其通過共價連接與一個或多個取代基連接。
根據脫氧核糖核酸分子的實施方式，共價連接的取代基選自包括肽(包括陽離子肽)、蛋白質、糖、抗原結構、DNA和/或RNA的組。
在本發明的核酸分子的一個實施方式中，其中對于共價連接超過一個取代基的情況，這些取代基選自相同的或不同的組。對于與數個取代基共價連接的脫氧核酸分子，這些取代基可以彼此是相同的或不同的。
在本發明的一個核酸分子中，一或多個取代基以及與取代基化學連接的核苷酸都被化學修飾。但是，為了達到所需的共價結合，僅僅需要化學修飾兩種配體中的一種也是有可能的。此外，通過采用雙官能偶聯劑實現取代基和核苷酸之間的連接也是可能的。
通過權利要求8的方法合成本發明的核酸分子。該合成方法的特征在于下面的方法步驟a.在適當的反應條件下，將兩種部分自身互補的且其中至少一種經過化學修飾的寡脫氧核苷酸與化學修飾的取代基進行反應，所述化學修飾的取代基選自包括肽(包括陽離子肽)、蛋白質、糖、抗原結構、DNA和/或RNA的組，其中所述化學修飾的一或多個寡核糖核苷酸直接地或通過雙官能偶聯劑與取代基共價連接，b.接著，通過短暫加熱以及隨后在冰上冷卻以使得純化的偶聯反應的產物部分形成堿基對并形成發夾結構，和c.所形成的部分雙鏈的非編碼核酸分子的自身互補的突出端彼此連接或與偶聯于其他取代基的寡脫氧核苷酸連接；
d.之后用核酸外切酶處理以便消化與取代基偶聯的未共價閉合的寡脫氧核糖核苷酸的鏈，隨后e.最后純化與取代基連接的非編碼核酸分子。
本發明的方法采用與取代基結合的經一種或多種烷基碳酸、胺、巰基或醛基官能團、或馬來酰亞胺基團化學修飾的寡脫氧核苷酸。根據所合成的核酸分子的實施方式，也可采用經一種或多種烷基碳酸、胺、硫基或醛基官能團、或馬來酰亞胺基團化學修飾的取代基。
在人或高等動物的治療性或預防性疫苗接種中，可以采用本發明的核酸分子作為佐劑。此外，本發明的核酸分子用于對人和高等動物進行免疫刺激是可能的，其中可以在體外或體內實現這種刺激。
本發明的核酸分子也可以是疫苗的一種組分，所述疫苗被用于調控人或高等動物體內的免疫應答。
也提供了包括本發明的核酸分子和與取代基連接的啞鈴形線性共價閉合DNA表達構建體的組合的疫苗。這種組合疫苗可被用作人或高等動物的治療性或預防性疫苗接種中的疫苗或用作在體內和體外刺激人或高等動物體內的免疫應答的佐劑。
根據本發明，通過合成短的、非編碼核酸分子實現本發明的目的，所述核酸分子包括至少一個或數個CpG序列，所述分子也被稱作“載體分子”，以及所述核酸分子通過共價結合與選自肽(包括陽離子肽)、蛋白質、糖、抗原結構、DNA和/或RNA的組的至少一種或數種取代基相連接。此外，還提供包括本發明的連接于取代基的載體分子以及取代基修飾的最小化的DNA表達載體的新的疫苗組合。
所述短的、非編碼核酸分子包括部分單鏈的、啞鈴形核苷酸殘基序列，并包含一種或多種序列的堿基序列N1N2CGN3N4，其中N1N2是一種選自GT、GG、GA、AT或AA的元件，N3N4是一種選自CT或TT的元件，以及C是脫氧胞苷，G是脫氧鳥苷，A是脫氧腺苷和T是脫氧胸苷。從開放鏈的脫氧核糖核酸分子中獲得這類共價閉合的脫氧核糖核酸分子是有可能的，所述開放鏈的脫氧核糖核酸分子具有部分自身互補的序列，并且它們能彼此相互一起或與第二分子形成一種中間的穩定雜交體，其具有一個帶有糖磷酸骨架上的缺口的閉合的雙鏈區，可通過適當的酶例如來源于T4噬菌體的DNA連接酶來連接骨架中的缺口。或者，通過分子的分子內連接也可獲得本發明的分子，所述分子至少具有兩個僅由磷酸骨架中的缺口所分開的自身互補的區域。
因此，取代基與該載體分子的共價連接以及從中所形成的相應的分子的新品質是重要的。可以實現與莖狀或環狀(發夾形單鏈區)的任何核苷酸的連接。在下面所給出的實施例中，通過在胸腺嘧啶中所插入的巰基基團(SH基團)的方式可以實現共價連接；通過雙官能偶聯劑方式的連接也是可行的。其他可選擇的方法是可能的并不被本說明書所排除。因此，下面所給出的實施例并不是唯一的方式。
在氨基末端上被馬來酰亞胺基團所修飾的任何選自肽(包括陽離子肽)、蛋白質、糖、抗原結構、DNA和/或RNA的組的取代基都可用于連接。
NLS(SV40病毒的核定位序列)肽應當作為理解術語取代基的范例。載體分子與NLS肽的共價連接造成了在經已描述的結構元件(雙鏈、發夾環和CpG ODN的組合)誘導的免疫應答中的協同作用。通過與NLS肽的連接顯著地增強了載體分子的佐劑作用。當使用本發明的分子時，用B細胞體外刺激檢測法證實了表面標記物CD80的表達比對照增加了50％(見圖2)。
此外，用于激發保護性免疫應答的抗原或其表位都應當被理解為是在取代基的定義范圍之內。作為非排他性的實例，所述抗原或其表位包括例如人乳頭瘤病毒、流感病毒的抗原表位，例如SARS病毒的蛋白H、M1和NP的免疫原性表位、例如結核分枝桿菌的蛋白S、M和N的免疫原性表位、HI病毒和B型肝炎病毒的抗原表位，和寄生蟲病例如利什曼病的抗原表位以及一組已知來自腫瘤疾病的腫瘤相關性抗原(TAA)。
載體分子在雙鏈區或在發夾環上與一種或數種抗原表位的連接的優點一方面是誘導獲得性免疫的抗原特異性免疫應答，另一方面是激活固有的免疫系統。另外，通過相應的細胞因子的分泌增強了TH1占優勢的免疫應答。對于某些抗原表位，這種對載體分子所觸發的快速的、非特異的免疫調控以及取代基所觸發的延遲的、特異的免疫應答的聯合誘導也容許在急性的迫在眉睫的感染事件中采用這些分子。
明確地提供了不同的、非相同的取代基與載體分子的連接。在圖3中給出了與取代基連接的這些本發明的核酸載體分子的實例，但并非把本發明的范圍限定于這些實例。
本發明的另一個方面是與取代基相連接的核酸載體分子和與取代基相連接的最小化的線性DNA表達載體的聯合應用，所述最小化的線性DNA表達載體攜帶有相應抗原的遺傳信息。圖4羅列了本發明的組合疫苗。一或數個相同的或不同的取代基可以與這些DNA表達載體共價連接。取代基選自肽(包括陽離子肽)、蛋白質、糖、抗原結構、DNA和/或RNA的組。所表達的抗原以及作為取代基所連接的抗原可以是相同的抗原。也提供了所表達的抗原和與DNA表達構建體相連接的取代基是不同的抗原，并選自不同的組。
這樣一種疫苗可以通過與取代基相連接的載體分子組分激活固有的免疫系統，并因此能夠在24-48h內賦予了抗病毒、寄生蟲和細菌感染的保護。第二種組分(與取代基相連接的DNA表達構建體)介導了抗原特異性免疫。因此，在疫苗接種的2周內就能獲得特異抗體的生成以及細胞毒性免疫應答的形成。
這種疫苗的組合物形成了具有快速起效的由表達抗原的最小化的表達構建體和與取代基相連接的載體分子所構成的可變疫苗。與載體分子以及與DNA表達構建體相連接的取代基可以是相同的取代基，所述取代基是DNA表達載體作為抗原表達的取代基，但是所表達的抗原可以不同于取代基。
一或數個相同的或不同的取代基可以與載體分子共價連接。對于相同的取代基與載體分子相連接的情況，提供了將這些載體分子與帶有不同取代基的其他載體分子相混和，然后施用所形成的包括不同取代基的混和物。
圖4顯示了本發明的分子和本發明的組合的圖解說明。
有利的是，本發明的分子沒有游離的5’或3’末端，因此不受核酸外切酶影響。
根據實施方式，本發明的核酸分子可以包括序列(Seq ID.1)5’Ph-TCC CGT GGT TAC CAC CTT CAT TGG AAA ACG TTC TTCGGGGCG TTC TTA GGT GGT AAC C或(Seq ID.2)5’Ph-ACG GGA GG TTAC CAC CTT CAT TGG AAA ACG TTC TTCGGGGCG TTC TTA GGT GGT AAC C要求保護的具有特異序列或具有上面所給出的序列區的核酸分子優選地包括最大長度多達200個核苷酸，特別優選地包括48到116個核苷酸。
在所附的權利要求書中描述了更多的有利的方式，在下面的附圖和實施例中更詳細地描述了本發明。


圖1以示例的形式顯示了可能的載體分子和本發明的與取代基相連接的載體分子。在發夾環中，用圓圈著重指出了載體分子的結構特征CpG基序。在實施例中所用的與相應的取代基相連接的胸腺嘧啶核苷酸被描繪為灰色，而任何其他的核苷酸也是同樣有用的。在發夾環內的一些位置上可以實現取代基的連接，在載體分子的雙鏈區內也能實現連接。具體地，顯示了A在雙鏈區內具有劃分出的可能的連接位點以及在每個發夾環內都具有三個CpG基序的載體分子。
B具有一個發夾環的載體分子。
C用一個發夾環與取代基相連接的載體分子。
D顯示了一個在實施例6中作為對照的與ODN相連接的取代基。
F顯示了一個在實施例6中作為對照的取代基。
圖2在B細胞刺激檢測法的框架內進行對與取代基相連接的載體分子的免疫刺激作用的測定，使用了下面的樣品對照沒有添加樣品的B細胞FNLS肽D與NLS肽相連接的ODNB具有一個發夾環的載體分子C連接有NLS的載體分子在x-共坐標上，顯示了樣品值和對照值的比值。短棒顯示了讀取所刺激的表面標記物CD80的表達的體外試驗的結果。樣品F和D也作為對照，并且沒有顯示出刺激作用。單獨的NLS肽和與ODN相連接的NLS肽都不能刺激B細胞增加CD80的分泌。具有發夾環以及沒有NLS肽的載體分子導致了CD80分泌的增加。對于本發明的NLS相連接的載體分子，這個刺激作用所增加的倍數為3。本試驗顯示只有本發明的雙鏈組分、單鏈發夾環、CpG基序以及取代基(NLS肽)的共價連接的組合物導致了令人驚訝的結果。
圖3圖解顯示了相同的和不同的取代基與載體分子連接的可能性。具體地，顯示了A一種具有兩個發夾環的載體分子，其中所含的CpG基序被描述為灰色圓圈，并且具有兩種不同的與載體分子的雙鏈區相連接的取代基。
B一種具有兩個發夾環的載體分子，其中所含的CpG基序被描述為灰色圓圈，并且具有兩種不同的與載體分子的單鏈發夾環區相連接的取代基。
C一種具有兩個發夾環的載體分子，其中所含的CpG基序被描述為灰色圓圈，并且具有兩種相似的與載體分子的雙鏈區相連接的取代基。
D一種具有兩個發夾環的載體分子，在此所含的CpG基序被描述為灰色圓圈，并且具有兩種相似的與載體分子的單鏈發夾環區相連接的取代基。
圖4顯示了與本發明的取代基相連接的載體分子以及組合疫苗的概況。具體地，顯示了A一種由單鏈發夾環和雙鏈的組合物構成的，并含有CpG基序(用圓圈圖解描述)的載體分子。
B與取代基相連接的最小化的、共價閉合的DNA表達構建體。
C一種與取代基相連接的載體分子，其在雙鏈區內連接有兩個相似的取代基。
D一種與取代基相連接的載體分子，其在雙鏈區內連接有不同的取代基。
E顯示了本發明的與取代基相連接的載體分子和與取代基相連接的DNA表達構建體的組合物。兩種分子的取代基是不同的，但也可以是相同的。
實施例1根據EP 1196178合成未修飾載體分子將磷酸化的序列為CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACGTTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC(TIB-Molbiol，Berlin)的ODN(Seq ID.3)加熱到90℃5分鐘，隨后在冰上冷卻以促進發夾環結構的形成。在存在T4DNA連接酶(0.1U/μg ODN)時，在37℃下連接自身互補的突出端(DNA的終濃度為1μg/μl)24個小時。在苯酚提取以及之后用氯仿提取和異丙醇沉淀(含MgCl2(終濃度為10mM)和NaAc(終濃度為300mM))之后，和在離心及懸浮在水中之后，得到了產物。
為了去除內毒素污染，將連接產物進行后面的陰離子交換層析(載體物質LiChrospher DMAE，Merck Darmstadt；0-1M NaCl的50mM磷酸鈉溶液)，并用異丙醇沉淀濃縮。對于體內試驗，在無菌條件下進行這個方法，并將終產物懸浮在無菌PBS中。實施例2通過兩種不同的反應途徑a)和b)合成與取代基相連接的載體分子a)馬來酰亞胺功能化的取代基與修飾的脫氧核糖核苷酸的巰基(SH)的連接用保護性基團二甲氧三苯甲基(DMT)給SH-ODN的巰基基團加帽，因為其內在的高反應性。在反應之前去除該保護性基團。對于與取代基相連接的載體分子的合成，在實施例1中使用了不同的ODN，所有ODN都保證了具有一個明確的SH-ODN的修飾。或在莖內或在環內或在莖和環內進行明確的連接。對于這個目的，采用了ODN1和2ODN 1(Seq ID.1)5’Ph-TCC CGT GG XT TAC CAC CTT CAT TGG AAA ACG TTCTTC GGGGCG TTC TTA GGT GGT AAC C和ODN 2(Seq ID.2)5’Ph-ACG GGA GG XT TAC CAC CTT CAT TGG AAA ACG TTCTTC GGGGCG TTC TTA GGT GGT AAC C(由Eurogentec，Belgium提供)，其中XT是SH修飾的T，而Ph為5’磷酸化。
為了去除保護性基團DMT，將SH-ODN溶解在去保護緩沖液(4mMK2HPO4、4mM KH2PO4、pH 6.8)中，并加入120mM硝酸銀。將反應物在室溫下孵育30分鐘。此后，將去保護反應物與0.2體積的DTT混和，并在室溫下孵育20分鐘。短暫離心反應物，并將上清液加入到凝膠過濾柱(NAP-5，Amersham Biosciences)中，以便純化去保護的SH-ODN。
在結合緩沖液(100mM Na2HPO4，150mM NaCl)中，將去保護的SH-ODN與馬來酰亞胺修飾的取代基發生反應。將反應物在室溫下孵育1個小時，以便讓馬來酰亞胺基團與SH基團發生反應。理論上，其他的含有被保護的或去保護的SH基團的ODN的應用都是可能的。SH基團與馬來酰亞胺取代基的連接僅僅是所有含馬來酰亞胺的取代基的組中的一個實例。
b)含巰基基團的取代基經雙官能交聯分子與氨基ODN的連接作為概念上的驗證，采用了所連接的取代基中具有的巰基基團與ODN中的馬來酰亞胺基團的反應。通過在合成時已經被插入到ODN內的氨基殘基(稱為X)與商品化得到的雙官能偶聯劑的反應，經偶聯劑所具有的NHS羧酸的轉酰胺作用將馬來酰亞胺基團引入到反應物的核酸組分中。對于合成，采用了下面的氨基修飾的ODNODN 1(Seq ID.1)5’Ph-TCC CGT GGXT TAC CAC CTT CAT TGG AAA ACG TTC TTCGGGGCG TTC TTA GGT GGT AAC C和ODN 2(Seq ID.2)5’Ph-ACG GGA GGXT TAC CAC CTT CAT TGG AAA ACG TTCTTC GGGGCG TTC TTA GGT GGT AAC C(由Eurogentec，Belgium提供)，其中XT是NH修飾的T，而Ph為5’磷酸化。
在結合中如下使用氨基修飾的ODN在30分鐘的間隔內，往氨基-ODN(終濃度0.1mM)內加入四等份于反應物的交聯分子(在此是DMSO中的硫代-KMUS(N-(馬來酰亞胺基十一酰氧基)磺基琥珀酰亞胺(sulfo-KMUS(N-(maleimidoundecanoyloxy)sulfosuccinimide))，PIERCE產品編號21111)，直到終濃度達到5mM。在交聯結合緩沖液(50mMNaHPO4、75mM NaCl、pH 7.6)中，37℃下進行反應2個小時。隨后，加入Tris-HCl(pH 7.5、終濃度為50mM)終止反應。將活化的氨基-ODN在-70℃的乙醇中沉淀30分鐘(300mM NaOAc pH 5.3、20mM MgCl2、2.5倍反應體積的100％乙醇abs.)。將沉淀物在15,000rpm(4℃)離心30分鐘，并在相似條件下、70％乙醇中洗滌15分鐘。將活化的氨基-ODN溶解在結合緩沖液(1x＝50mM NaHPO4、75mM NaCl、pH 7.0)中，使得終濃度為0.1mM。加入巰基取代基(由Dr.Peter Henklein，Charité，Berlin提供)，使得終濃度為0.2mM。在37℃下進行反應1個小時。
用反相HPLC進行對從未反應的ODN中所生成的連接有取代基的ODN的純化和分離。用凝膠電泳分析單個部分。在真空離心機中濃縮含連接有取代基的ODN的HPLC部分，并將其重懸在超純水(MilliporeMilliQ)中。用HPLC在Nukleosil-300C18柱(10微摩爾，250mm×8mm內徑)中純化連接有取代基的ODN。在47分鐘內，按2.4ml/min的流速，梯度從0％緩沖液A(100mM碳酸銨)到42％緩沖液B(80％乙腈)。
將已經在實施例2a和2b中合成的連接有取代基的ODN加熱到95℃5分鐘，隨后在冰上冷卻以促進發夾環結構的形成。在存在T4 DNA連接酶(0.01U/μg ODN)時，在37℃下連接自身互補的突出端(DNA的終濃度為0.55μg/μl)24個小時。在熱滅活(68-72℃)T4連接酶20分鐘后，在37℃下進行T7 DNA聚合酶消化12個小時，以便去除沒有被共價閉合的連接有取代基的ODN。在苯酚提取以及隨后用氯仿提取以及異丙醇沉淀(具有MgCl2(終濃度為10mM)和NaAc(終濃度為300mM))之后，和在離心及懸浮在水中之后，得到了產物。
為了去除內毒素污染，將連接產物進行后面的陰離子交換層析(載體物質Fractogel DMAE，Merck Darmstadt；0-1M NaCl的20mM Tris/HCl，pH7.0)，并用異丙醇沉淀濃縮。對于體內試驗，在無菌條件下進行這個方法，并將終產物懸浮在無菌PBS中。
實施例3合成與取代基相連接的具有環的載體分子ODN 3(Seq ID.4)5′Ph-TCC CTG TTA CCA CCT TCA TTG GAA AAC GTT CTT CGGGGC GTT CTTAGG TGG TAA CA和ODN 4(Seq ID.5)5′Ph-GGG AGT CCA GT XTT TCTG GAC(由Eurogentec，Belgium提供)，其中XT是NH修飾的T，而Ph為5’磷酸化。
根據在實施例2b中所述的偶聯機制，通過NH基團和雙官能交聯劑硫代-KMUS的方式連接ODN4(Seq ID.5)和半胱氨酸基團的巰基。如所述的進行連接和隨后的步驟。
實施例4合成用于組合疫苗的最小化的、共價閉合DNA表達構建體在此所采用的DNA表達構建體是由CMV啟動子、一個內含子、編碼抗原的基因序列和多腺苷化系列構成的線性的、共價閉合的表達構建體(見EP 0 941 318 B1)。用Eco31I消化合適的包括相應序列的質粒直到完成。在存在Eco31I時，用T4DNA連接酶進行與5’磷酸化的ODN5(SeqID.7)5’-Ph-AGG GGT CCA GTT TTC TGG AC(由Eurogentec，Belgium提供)的連接，并通過加熱到70℃以終止連接。濃縮所形成的混和物，并在沒有三磷酸脫氧核糖核苷酸時，用Eco31I和T7 DNA聚合酶處理所形成的混和物。用陰離子交換層析進行純化。
實施例5合成具有取代基的最小化的、共價閉合DNA表達構建體對于最小化的、共價閉合DNA表達構建體的合成，在NLS肽作為取代基的本實施例中，采用了在發夾環中具有經氨基基團修飾的脫氧尿嘧啶(XT)的ODN4(Seq ID.5)和未修飾的ODN5(Seq ID.7)ODN 4(Seq ID.5)5’-Ph-GGG AGT CCA GT XT TTC TGG AC(由Eurogentec，Belgium提供)，其中XT是NH修飾的T，而Ph為5’磷酸化。
和ODN 5(Seq ID.7)5’-Ph-AGG GGT CCA GTT TTC TGG AC(由Eurogentec，Belgium提供)。
在偶聯反應中如下使用氨基修飾的ODN4在30分鐘的間隔內，往氨基-ODN(終濃度0.1mM)中加入四等份于反應物的交聯分子(在此是DMSO中的硫代-KMUS(N-(馬來酰亞胺基十一酰氧基)磺基琥珀酰亞胺(sulfo-KMUS(N-(maleimidoundecanoyloxy)sulfosuccinimide))，PIERCE產品編號21111)，直到終濃度達到5mM。在交聯結合緩沖液(50mMNaHPO4、75mM NaCl、pH 7.6)中，37℃下進行反應2個小時。隨后，加入Tris-HCl(pH 7.5；終濃度為50mM)終止反應。將活化的氨基-ODN在-70℃的乙醇中沉淀30分鐘(300mM NaOAc pH 5.3、20mM MgCl2、2.5倍反應體積的100％乙醇abs.)。將沉淀物在15,000rpm(4℃)離心30分鐘，并在相似條件下、70％乙醇中洗滌15分鐘。將活化的氨基-ODN溶解在超純水(MilliQ，Millipore)中，并冷凍直到在-20℃下更多的結合。
實施例5aNLS肽與活化ODN的連接將在5中所述的活化的氨基ODN溶解在結合緩沖液(1x＝50mMNaHPO4、75mM NaCl、pH 7.0)中，使得終濃度為0.1mM。將NLS肽PKKKRKVEDPYC(由Dr.Peter Henklein，Charité，Berlin提供)溶解在水中，并按0.2mM的終濃度加入。在37℃下進行反應1個小時。
用反相HPLC進行對從未反應的ODN中所生成的連接有NLS的ODN的純化和分離。用凝膠電泳分析單個部分。在真空離心機中濃縮含連接有取代基的ODN的HPLC部分，并將其重懸在超純水(MilliporeMilliQ)中。用HPLC在Nukleosil-300C18柱(10微摩爾，250mm×8mm內徑)中純化修飾的ODN。在47分鐘內，按2.4ml/min的流速，梯度從0％緩沖液A(100mM碳酸銨)到42％緩沖液B(80％乙腈)。
如下獲得具有NLS取代基的最小化的共價閉合DNA表達構建體在通過Eco31I消化制備表達構建體之后，進行與所制備的ODN的連接。在存在Eco31I時，用T4DNA連接酶實現與5’磷酸化發夾形ODN4的連接，其與NLS肽和ODN5連接，隨后通過加熱到70℃以終止連接。濃縮所形成的混和物，并在沒有三磷酸脫氧核糖核苷酸時，用Eco31I和T7DNA聚合酶處理所形成的混和物。用陰離子交換層析進行純化。通過限制性消化獲得取代基與DNA表達構建體的成功連接的證據，它證實了成功連接。
實施例6與取代基相連接的載體分子對免疫學相關的表面蛋白的刺激用B細胞刺激檢測法的方式進行對與取代基相連接的載體分子的功能性的控制。在48個小時內進行RPMI-8226細胞(B系的細胞株)與等摩爾量的分子(1μ摩爾)的孵育。用FACS測定法分析結果。因此所得到的數值指的是未刺激的狀態(對照)。確定表面標記物CD80陽性細胞％。
序列表<110>莫洛根股份公司<120>用于對人及高等動物進行治療性和預防性免疫刺激的取代的非編碼核酸分子<130>XI 302-04<150>PCT/DE2004/000361<151>2004-02-20<160>7<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>58<212>DNA<213>Artificial<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>synthetisches Oligodesoxynukleotid；T＝chemisch modifiziertesThymin<400>1tcccgtggtt accaccttca ttggaaaacg ttcttcgggg cgttcttagg tggtaacc58<210>2<211>58<212>DNA<213>Artificial<220>
<221>misc_feature<222>(9)..(9)<223>synthetisches Oligodesoxynukleotid；T＝chemisch modifiziertesThymin<400>2acgggaggtt accaccttca ttggaaaacg ttcttcgggg cgttcttagg tggtaacc58<210>3<211>58<212>DNA<213>Artificial<220>
<221>misc_feature<223>unmodifiziertes synthetisches Oligodesoxynukleotid<400>3cctaggggtt accaccttca ttggaaaacg ttcttcgggg cgttcttagg tggtaacc58<210>4<211>56<212>DNA<213>Artificial
<220>
<221>misc_feature<223>synthetisches Oligodesoxynukleotid<400>4tccctgttac caccttcatt ggaaaacgtt cttcggggcg ttcttaggtg gtaaca 56<210>5<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<221>misc_feature<222>(12)..(12)<223>synthetisches Oligodesoxynukleotid；T＝chemisch modifiziertesThvmin<400>5gggagtccag ttttctggac 20<210>6<211>12<212>PRT<213>Simian virus 40<220>
<221>MISC_FEATURE<223>NLS Peptid<400>6Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Glu Asp Pro Tyr Cys1 5 10<210>7<211>20<212>DNA<213>Artificial<220>
<221>misc_feature<223>synthetisches Oligodesoxynukleotid<400>7aggggtccag ttttctggac 20
權利要求
1.非編碼核酸分子，其由部分單鏈的啞鈴形共價閉合脫氧核糖核苷酸殘基鏈組成，并在其單鏈或雙鏈區內含有一或多個序列的堿基序列N1N2CGN3N4，其中N1N2是選自包括GT、GG、GA、AT或AA的組的元件，N3N4是選自包括CT或TT的組的元件，以及C是脫氧胞苷，G是脫氧鳥苷，A是脫氧腺苷和T是脫氧胸苷，其特征在于所述非編碼核酸分子共價連接有一或多個取代基。
2.權利要求1的脫氧核糖核酸分子，其中取代基選自肽、蛋白質、糖、抗原結構、DNA和/或RNA的組。
3.權利要求1或2的脫氧核糖核酸分子，其中對于共價連接超過一個取代基的情況，這些取代基選自相同的或不同的組。
4.權利要求3的脫氧核糖核酸分子，其中起源于權利要求2中所述的組中的一組的幾個取代基彼此是相同的或不同的。
5.權利要求1到4中任一項的脫氧核糖核酸分子，其中化學修飾的取代基和/或化學修飾的核苷酸彼此共價連接。
6.權利要求1到4中任一項的脫氧核糖核酸分子，其中取代基和核苷酸通過雙官能偶聯劑彼此連接。
7.權利要求1到6中任一項的脫氧核糖核酸分子，其中以核定位信號(Seq ID.6)對其進行至少一次取代。
8.制備權利要求1到7中任一項的連接有取代基的非編碼脫氧核糖核酸分子的方法，包括以下反應步驟a.在適當條件下，將兩種寡脫氧核糖核苷酸直接或通過雙官能偶聯劑連接于化學修飾的取代基，所述寡脫氧核糖核苷酸是部分自身互補的且其中至少一種是化學修飾的，所述取代基選自權利要求2中所述的組中的一組，b.隨后，通過對純化的偶聯反應產物進行短暫加熱和在冰上冷卻以形成部分堿基對和發夾結構，和c.所形成的部分雙鏈的非編碼脫氧核糖核酸分子的自身互補突出端彼此連接或與共價連接于其他取代基的寡脫氧核糖核苷酸連接，d.隨后用核酸外切酶處理以降解與取代基連接的寡脫氧核糖核苷酸的非共價閉合鏈，隨后e.最終純化與取代基相連接的非編碼脫氧核糖核酸分子。
9.權利要求8的方法，其中用于連接于取代基的寡脫氧核糖核苷酸經一或數種烷基羧酸-、胺-、巰基-、醛基-、或馬來酰亞胺基官能團修飾。
10.權利要求8的方法，其中所用的取代基經一或數種烷基羧酸-、氨基-、巰基-、醛基-、或馬來酰亞胺基官能團修飾。
11.權利要求1到7中任一項的脫氧核糖核酸分子作為疫苗在對人和高等動物進行治療性或預防性疫苗接種中的用途。
12.權利要求1到7中任一項的脫氧核糖核酸分子作為佐劑用于對人和高等動物體內進行免疫刺激的用途。
13.權利要求1到7中任一項的脫氧核糖核酸分子在制備用于對人和高等動物體內進行免疫刺激的疫苗中的用途，其中除了所述脫氧核糖核酸分子外，也包括與取代基相連接的啞鈴形線性共價閉合DNA表達構建體。
14.權利要求13的用途，其中所述啞鈴形線性共價閉合DNA表達構建體的取代基選自肽、蛋白質、糖、抗原結構、DNA和/或RNA。
15.權利要求14的DNA表達載體，所述DNA表達載體以核定位信號(Seq ID.6)進行至少一次取代。
16.權利要求12到15中任一項的疫苗在對人和高等動物進行治療性或預防性疫苗接種中的用途。
17.權利要求12到15中任一項的疫苗作為佐劑的用途，其中可以在體外或在體內實現對人和高等動物體內的免疫刺激。
全文摘要
本發明涉及用于調控人或動物的免疫系統活性的取代的、非編碼核酸分子，其制備方法和含有所述取代的、非編碼核酸分子的疫苗。本發明的這一部分包括共價偶聯于取代基的載體模塊并涉及由此產生的新的特性，其中取代基偶聯于莖或環(即發夾狀環)的任何核苷酸。本發明的核酸分子還可成為用于調控人和高等動物的免疫應答的疫苗成分。本發明還公開了包含本發明的核酸分子和偶聯于取代基的啞鈴狀線性共價閉合表達構建體的組合疫苗。所述組合疫苗還可作為佐劑用于對人和高等動物進行治療性或預防性疫苗接種或在體外或體內對人和高等動物進行免疫刺激。
文檔編號A61K31/713GK1918293SQ200480041871
公開日2007年2月21日 申請日期2004年5月19日 優先權日2004年2月20日
發明者貝爾納黛特·布澤茲查, 克里斯蒂安尼·尤爾斯, 弗洛里安·扎克, 曼努埃爾·施密特, 布格哈特·維蒂希, 馬蒂亞斯·施羅夫 申請人:莫洛根股份公司