干細胞的制作方法

專利名稱：干細胞的制作方法
技術領域：
本發明涉及干細胞，具體涉及可從骨髓和血液中分離的新型干細胞。
干細胞可產生新細胞以修復身體中任何組織的損害，并因此對于所有類型的再生醫學具有極大的潛能。干細胞存在于所有身體組織和器官中，但是一些組織和器官，像骨髓和血液，要比其它組織和器官，像肝臟和腦更容易獲得。然而，干細胞在骨髓和血液中存在的數目非常小，且在它們可在臨床上使用前必需先提取出來然后再增加數目(“擴大”)。當前，正進行許多嘗試以達到提供足夠數目的干細胞以用于進行組織特異性干細胞移植的目的。
各種努力集中在骨髓作為干細胞的來源。到此為止的證據提示骨髓含有兩類干細胞-負責產生血液的造血干細胞(HSC)，以及能產生屬于有限范圍的軀體組織細胞的間充質干細胞(MSC)。MSC不能被精確地定義或分離并且顯示有限的提供多種細胞類型的能力。它們對培養物中的刺激作出反應，形成成骨細胞、成軟骨細胞和脂肪細胞，但是有許多細胞類型它們不能形成，如肝細胞。MSC的延長培養導致長出稱作多潛能成年祖細胞(MAPC)的細胞亞群，其到目前為止似乎具有最廣泛的組織再生的潛能。然而，在MAPC出現前，需要延長組織培養時間以及許多細胞分裂的事實意味著，首先，它們可能已經累積了遺傳損害，且其次，不可能肯定它們一定代表骨髓的正常細胞成分。事實上，它們可能是組織培養的人工產物。這些重要的考慮潛在地表明MAPC不能用于臨床。MAPC可形成具有內胚層、外胚層或中胚層標記的細胞，但是很重要地是，在培養物中不產生造血細胞。
使用從干細胞衍生的分化細胞生產它們的天然蛋白產物優于使用細胞產生重組蛋白，特別是由于能進行蛋白產物的適當的糖基化和翻譯后的修飾。
本發明人現在已經鑒定了一種新型干細胞，其可直接從成人骨髓和血液中分離，例如，外周血，并且具有分化成外胚層、中胚層和內胚層細胞的獨特能力。如果不是全潛能的話，這些細胞因此很顯然是多潛能的。因此這里所描述的干細胞提供用于可以以自體(自己對自己)方式進行組織移植的新的細胞來源。此外，如下所述，這些干細胞不需要延長的組織培養。
本發明的干細胞優選地從成人獲取的樣品中獲得，如成人骨髓或成人外周血。因此細胞優選地是成人干細胞。細胞也可從其它樣品如臍帶中獲得，且因此在一個實施方案中，本發明的干細胞群體可包括胎兒以及成人細胞。也可使用胎兒來源，例如胎肝或骨髓。
因此，在本發明的一個方面，提供分離的干細胞群體，其中所述干細胞是CD34+，能夠自我再生并且能分化成外胚層、中胚層和內胚層細胞，優選地分化成造血細胞。優選地，干細胞是成人干細胞。
這些干細胞的另一個特征是在培養期間，它們能粘附到塑料(例如，標準組織培養容器的塑料)上。因此在這里所描述的培養方法中細胞“能”粘附到塑料上，并且不需要任何特殊的另外的條件或修飾。適當的容器是由Corning Incorporated，New York，美國生產的那些容器。
本發明干細胞的另外特征是它們不需要飼養層，即支持干細胞生長的細胞(一般通過γ照射滅活，其供給重要的代謝物，而它們自己不進一步生長或分裂)。因此，優選地，在干細胞的培養期間不使用飼養層。
這些干細胞的一個主要特征和特別有利的特色是它們能分化成非常廣泛的各種不同的細胞類型，包括外胚層、中胚層和內胚層細胞。因此，本發明的這些干細胞可分化成由胚胎的三種胚層，外胚層、中胚層和內胚層發育衍生的細胞類型；例如來自中胚層的造血細胞和肌細胞；來自外胚層的神經細胞或上皮細胞；以及來自內胚層的腺上皮或肝細胞。
由于基本上無其它的細胞類型，所以細胞群體是“分離的”。優選地，基本上無表達CD33、CD38、HLA/DR、CD19和CD3的細胞類型。“基本上無”應當被解釋為與實施例中所提供的經驗數據一致。同樣地，群體基本上無專門用于特定譜系的細胞和/或攜帶與此有關標記的細胞。優選地群體具有低于20％，更優選地低于10％，例如，低于5％的譜系定向細胞。其可能在本發明干細胞群體的分離中有助于結合陰性選擇(細胞的除去)和陽性選擇(細胞的分離)，在兩種情況中都可能使用抗體結合。“分離的”細胞包括直接從樣品中分離的那些細胞以及從這種樣品中培養的或衍生的細胞。
認為干細胞是在成人骨髓中產生的，但是在血液中也發現了干細胞。可根據標準采樣技術從這些來源的任一種中收集本發明的干細胞。優選地在用G-CSF進行干細胞動員以增加干細胞在循環中的數目后獲取血液樣品。例如，可皮下施用5μg/kg體重/天，持續5天。也可能直接獲取骨髓樣品，例如，通過吸引術。
可從骨髓的來源中獲取骨髓細胞，例如，髂嵴、脛骨、股骨、脊柱或者其它骨腔。可根據常規技術方便地從骨中吸出骨髓。干細胞的其它來源包括血液，包括成人外周血和臍帶血。
細胞優選地是哺乳動物來源的，即，從哺乳動物樣品中分離的或者從這種樣品中所分離的細胞中衍生的。特別優選的哺乳動物是人和小鼠。更優選的哺乳動物包括母牛、馬和伴侶動物。
可使用各種技術通過初步取出專用譜系的細胞以分離細胞。單克隆抗體對鑒定與特定細胞譜系和/或分化階段相關的標記(表面膜蛋白)特別有用。可將抗體附著到固體支持物上以允許粗分離。所使用的分離技術應當將要收集的級分的生存力的保持最大化。“相對粗的”分離，即，其中存在的最高10％，通常不超過約5％，優選地不超過約1％的總細胞不具有標記，但可與將要保留的細胞群體一起保留，可使用不同效率的各種技術。所使用的特定技術將取決于分離的效率、方法的細胞毒性、進行的容易程度和速度、以及對復雜裝置和/或技術技能的必要性。
分離的方法可包括磁性分離，其中使用抗體包被的磁珠；親和層析；與單克隆抗體結合的或與單克隆抗體結合使用的細胞毒性劑，例如，補體和細胞毒素；以及用附著到固體基質，例如，平板上的抗體的“淘選(panning)”；或者其它適當的技術。提供準確分離的技術包括熒光激活細胞分選儀，其可具有各種復雜程度，例如，多個色道、低角度和鈍光散射檢測通道、阻抗通道等。
方便地，可將抗體與標記綴合，所述標記如磁珠，其允許直接分離；生物素，其可用與支持物結合的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白除去；熒光染料，其可與熒光激活細胞分選儀一起使用，等等，以允許很容易地分離特定的細胞類型。可使用不過度地傷害剩余細胞生存力的任何技術。
優選地使用LymphoprepTM(Axis Shield)密度梯度分離血液或骨髓樣品的單核級分。可使用MiniMACS(Miltenyi Biotec)技術從單核級分中分離CD34+細胞。
本發明的干細胞可進一步通過獲得它們所用的方法來表征，因此細胞可通過組合的親和純化和通過粘附的選擇方法獲得。更具體地，細胞可用CD34單克隆抗體(MAb)標記，然后用本身結合CD34 MAb的(順)磁珠標記。可選擇地，可使用結合細胞的，本身用CD34 MAb標記的珠。然后可將標記的或結合的細胞應用到柱上，并通過磁體保持在適當的位置上；未被標記的細胞將被洗脫下來，且通過除去磁體(或者通過從磁體移去柱)釋放被標記的細胞。
然后可將如此釋放的CD34+細胞在適當的溫度下，例如在35-38℃之間，優選地在37℃在組織培養塑料容器中溫育至少2小時，優選地至少3小時，例如，3-5小時，其中通過用HBSS(Hanks氏平衡鹽溶液)洗滌除去非粘附的細胞。粘附的CD34+細胞是本發明的干細胞，且包含低于1％的總CD34+群體。它們優選地是基本上同質的群體，通常不被其它干細胞亞群污染。一般地，低于30％，優選地低于20％，更優選地低于5％，最優選地低于3％的所收集細胞與本發明的干細胞不同。然而，實施例顯示不可能在分離的群體中的每個細胞上都發現所有單獨的標記，且術語“同質群體”應當用這個觀點來解釋。本發明的干細胞群體優選地在CD34表達、粘附到組織培養級塑料和小淋巴細胞樣形態學方面同質。“粘附的”細胞被定義為能抵抗三次劇烈的洗滌而不從固體支持物(特別是組織培養級塑料或玻璃)脫附的那些細胞。由于當制備用于培養的細胞時通常拋棄粘附細胞，所以CD34+細胞的粘附亞型的有利的性質令人驚訝。
本發明的干細胞能自我再生，即，根據干細胞的標準定義，干細胞能分裂形成另外的干細胞，以及分化成各種不同的細胞類型。
本發明的干細胞進一步被表征為CD34+，即，在干細胞，特別是在骨髓中所生產的干細胞(HSC和MSC)上表達抗原CD34，即一種所發現的糖蛋白標記，但不是僅僅如此。也可富集表達Thy-1標記的細胞的本發明的干細胞群體，即，包括非常大比例的Thy-1+細胞。因此可富集相對于起始細胞群體(樣品)的Thy-1的干細胞群體。實施例5表明平均28.1％，但是最高90％的細胞都是Thy-1+。
更具體地，細胞可被表征為CD34+、CD38-、CD33-和HLA-DR-。優選地細胞群體也富有AC133+、Thy-1+和/或c-met+，更優選地細胞主要地是AC133+、Thy-1+和/或c-met+。
干細胞是淋巴細胞樣的，因為它們是圓的單核的細胞并且相當小，具有高的核胞質比。這種形態學與原始干細胞有關。
它們的特征是能在培養中在少于16天，例如12-14天產生分化的細胞。優選地在少于14天，例如，少于10天，更優選地在少于7天，甚至在4-5天便可觀察到分化。
可進一步表征根據下列步驟獲得的本發明的干細胞(i)將造血組織(即，血液或骨髓樣品)進行密度梯度分離；(ii)使低密度細胞接觸CD34的親和配體(優選地附著到順磁珠上)(iii)回收附著到所述CD34配體上的細胞；(iv)使CD34+亞群接觸組織培養級塑料；和(v)回收粘附到塑料上的CD34+細胞。
將本發明的干細胞樣品于2004年9月24日保藏到歐洲動物細胞保藏中心(ECACC)，Health Protection Agency，Porton Down，Salisbury，SP40JG，英國，登記號為04092401。保藏由本發明人作出并且將細胞系命名為“干細胞Omnicyte”。
本發明的干細胞可來自任何動物，例如，實驗室、家畜或伴侶的動物；優選地來自靈長類動物，最優選地來自人。
在另一個實施方案中，本發明提供一種培養物，包括(i)一種分離的成人干細胞群體，其中所述的干細胞是CD34+，能自我再生并且能分化成外胚層、中胚層和內胚層細胞；和(ii)能支持所述干細胞生長的培養基。
優選地，本發明提供一種培養物，包括(i)一種(分離的)干細胞群體，其中所述的干細胞是CD34+，能自我再生并且能分化成外胚層、中胚層和內胚層細胞以及能粘附到組織培養級塑料上；和(ii)能支持所述干細胞生長的培養基。
一旦干細胞被分離，它們就可通過下述方法繁殖，在基質細胞的條件培養基中生長，如可從骨髓、胎兒胸腺或胎肝中獲得且顯示能提供分泌與干細胞維持有關的生長因子的基質細胞，與這種基質細胞共培養，或者在包含支持干細胞增殖的維持因子的培養基中生長，其中基質細胞可以是自體的、同種異體的或異種的。在用于共培養前，混合的基質細胞制劑可以是無造血細胞的，其中使用適當單克隆抗體除去不期望的細胞，例如，用抗體-毒素綴合物，抗體和補體等。可選擇地，可使用克隆的基質細胞系，其中基質細胞系可以是同種異體的或異種的。因此，上面所指的“培養基”包括如基質細胞這樣的細胞。
本發明的干細胞和從其衍生的分化的細胞可在液氮中的深低溫保藏下存活。
在另一個方面，本發明提供一種分離成人干細胞群體的方法，其中所述的干細胞是CD34+，能自我再生并且能分化成外胚層、中胚層和內胚層細胞，其中該方法包括從受試者中采集血液或骨髓樣品和從其中提取所述的細胞群體。優選地，本發明提供一種分離干細胞群體的方法，其中所述的干細胞是CD34+，能自我再生并能分化成外胚層、中胚層和內胚層細胞以及能粘附到組織培養級塑料上，其中該方法包括從受試者中采集血液或骨髓樣品以及從中提取所述的細胞群體。上面討論了優選的提取步驟，且在血液取樣的情況中，一般地干細胞動員將是第一步，其優選地通過向受試者施用G-CSF來完成。
粘附到組織培養塑料上是包括骨髓間充質干細胞、單核細胞和巨噬細胞的幾種細胞類型的特征，但是以前一直沒有用于表征或分離CD34陽性細胞亞群。已發現粘附到組織培養塑料是一種簡單的、可重復的以及可行的選擇原始干細胞的方法，而不需要采取多種抗體標記步驟或者其它操作。本發明的CD34+細胞也能夠粘附到玻璃上，且因此可使用玻璃或其它適當的固體支持物替代本發明方法中的組織培養級塑料。
本發明的干細胞在研究中有用，例如在檢測和評估與干細胞再生相關的生長因子中。干細胞也可能通過基因修飾或自體干細胞的置換在遺傳疾病的治療中有直接的效用。特別是細胞可用于與造血細胞相關疾病的治療，如β-地中海貧血和鐮狀細胞貧血，其中將野生型基因引入到干細胞中。因此，在另一個方面，本發明提供一種分離的成人干細胞群體，其中所述的干細胞是CD34+，能夠自我再生并能夠分化成造血細胞和間充質細胞，其進一步結合治療性基因以用于治療。
優選地，本發明提供一種分離的干細胞群體，其中所述干細胞是CD34+，能粘附到組織培養級塑料上并且能夠自我再生以及能分化成造血細胞和間充質細胞，其進一步結合治療性基因以用于治療。同樣地，本發明提供一種基因治療的方法，其包括向所需患者施用干細胞群體，其中所述的干細胞是CD34+，能自我再生并且能分化成外胚層、中胚層和內胚層細胞以及結合治療性基因。優選地，本發明提供一種基因治療的方法，其包括向所需患者施用干細胞群體，其中所述的干細胞是CD34+，能粘附到組織培養級塑料上并能自我再生以及能分化成外胚層、中胚層和內胚層細胞并結合治療性基因。
適當的治療性基因將包括基因的野生型，其在患者中是缺陷的，或者是藥物抗性基因。
不需要另外的治療性基因，干細胞仍然具有治療效用，例如，在再生缺乏干細胞的患者的造血系統中。
非常感興趣的另一種效用涉及從本發明的干細胞中產生不同的分化的細胞類型。至此如在附圖中所示，可能在有利地短時標內產生間充質細胞、造血細胞、內皮細胞、上皮細胞、管形成細胞以及樹突形成細胞。特別優選地是制備造血細胞和間充質細胞。在少于14天后觀察到具有肝臟細胞、神經細胞、間充質細胞、內皮細胞、上皮細胞和造血細胞外形的細胞。
依賴于所需的細胞類型，將干細胞與不同細胞因子的混合物培養。混合物一般地包括G-CSF、GM-CSF、IL-3以及干細胞因子，其中添加HGF和FGF以刺激肝細胞的分化；添加尼克酰胺和LY294002以刺激分化成胰細胞，以及添加FGF和二丁酰環AMP以促進產生神經細胞。其它生長因子是技術人員已知的，在其它細胞類型的分化中很重要，如骨、軟骨、骨骼肌和心肌、腎、肺、神經、皮膚和內分泌組織。以這種方式生產的優選的細胞類型是肝細胞、胰細胞、造血細胞、神經元細胞和少突膠質細胞。
因此，在另一個方面，本發明提供一種生產靶細胞類型的方法，其包括與多種生長因子一起培養本發明的干細胞。如在實施例中所描述的和在附圖中所顯示的，成功的分化可通過視覺檢查、流式細胞術、逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)或者免疫分型來顯示。除了表達CD34的細胞，還確定了例如表達清蛋白、甲胎蛋白、α1-抗胰蛋白酶和肝細胞生長因子受體(HGF受體-c-met)(肝細胞的特征)、波形蛋白(骨骼肌和神經元細胞)以及平滑肌肌動蛋白(肌細胞)的細胞。
分化細胞優選地將具有各種特征，例如，它們天然存在的對應細胞的形態和功能。然而，分化細胞可通過它們的同質性與天然存在的和分離的細胞區分開來，在這種情況下同質性是指細胞在正常細胞周期中的位置。本發明的這些分化細胞群體將基本上是同質的，即，所有成員大多數將是位于細胞周期中的相同點；相反，天然存在的細胞群體在這個方面將是異性的。
然后可將分化細胞移植到所需的患者中。特別有益的是產生從患者自身干細胞衍生的，用于細胞或組織移植的分化細胞的潛能。這種技術是本領域中已知的并根據特定的靶組織使用不同的施用途徑。例如在引入健康的肝細胞群體后，肝臟能自我再生，其中肝臟已被損傷，例如，由于肝炎感染或酗酒引起的肝臟損傷。可通過施用淋巴細胞治療免疫抑制，通過引入骨骼肌細胞治療肌肉消瘦，通過移植胰細胞治療糖尿病等等。
細胞可以局部的方式施用，例如，直接注射到靶器官如肝臟內。可選擇地，細胞可在遠離靶位點的部位施用，例如，通過靜脈內送遞。可通過在所產生的細胞類型和靶向配體之間形成復合體實現組織靶向，所述靶向配體如單克隆抗體、細胞粘附分子和它們的配體、細胞因子、趨化因子以及toll樣受體和它們的配體。這種“復合體”包括在它們的表面上表達靶向配體的細胞。
本發明的干細胞可直接用于治療方法，包括再生和修復的方法，細胞的分化可發生在體內。可用干細胞和分化細胞修復受損的器官和/或可能是器官再生，而且也可在器官未這樣受“損傷”但結果不能以正常方式發育的情況中使用。“再生”因此應當被廣泛地解釋成包括器官生長或改善的所有方法。
在一個優選的實施方案中，使移植的細胞適于體內追蹤，即它們結合標記部分，這意味著可在體內鑒定細胞的位置。方便地細胞將結合鐵化合物，例如氧化鐵，然后可使用MRI以確定移植細胞的位置，特別是用于確定它們是否已經到達它們的靶組織。如在實施例4中所描述的，MR試劑Resovist是合適的含鐵化合物，在與其培養時其可被細胞攝入。
因此，根據另一個方面，本發明提供根據上述所定義的方法制備的分化細胞群體和用于治療的這些細胞，以及包括向患者施用這些分化細胞群體的醫學治療的方法。具體地，本發明包括分化細胞群體的移植方法，該方法包括(i)與多種生長因子一起培養本發明的干細胞群體以便使其分化；和(ii)將所述分化的細胞移植到患者中。
優選地患者是人，且同樣優選地，用于培養以產生分化細胞的干細胞來自患者。
從患者中采集標品以及生長成用于施用的分化細胞所需的較短時間是本發明所提供的特別益處。
本發明的干細胞和由其衍生的分化細胞也用于體外生產目的蛋白。因此，在另一個方面本發明提供一種體外生產蛋白的方法，其包括培養本發明的干細胞或從其衍生的分化細胞系，然后收獲細胞以及回收由所述細胞表達的一種或多種蛋白。
動物細胞已成為體外生產靶蛋白，特別是治療劑的主要蛋白表達系統，這是因為它們能進行蛋白的翻譯后修飾(例如糖基化)。本發明的干細胞和它們的分化后代可用于絕大多數(如果不是全部的話)具有治療重要性的蛋白的生產，如紅細胞生成素、生長因子、蛋白激素如胰島素等或者合成的蛋白。為了提供或提高特定靶蛋白的產量，可將細胞進行基因改造。然而本發明所賦予細胞類型的一個特別期望的特征是能分化成適當的細胞類型(例如，實質細胞)，從而使得細胞能天然地生產靶蛋白而不需要基因工程改造。
本發明細胞(干細胞和分化細胞)的上述用途也適用于非蛋白產物如類固醇，在兩種情況中，適當的培養和收獲技術對于技術人員來說是已知的。
本發明的干細胞具有必要的細胞機構以繁殖載體如腺病毒、逆轉錄病毒、腺伴隨病毒等；這是制備這種載體的動態藥品生產管理規范(cGMP)的必需步驟。因此，在另一個方面，本發明提供如在這里所定義和描述的本發明的干細胞在載體，特別是病毒載體生產中的用途。可選擇地考慮到，本發明提供一種載體生產的方法，其中目的載體在如這里所定義的和描述的本發明的干細胞中繁殖。載體(感染性試劑)一般是病毒載體如腺病毒、逆轉錄病毒或腺伴隨病毒。
將在下列非限制性的實施例中并參考附圖進一步描述本發明，其中

圖1-10是顯示本發明的干細胞以及隨著時間的推移，它們分化成間充質細胞(圖3、5和6)、造血細胞(圖4)、上皮樣細胞(圖7和8)、管形成細胞(圖9)和樹突形成細胞(圖10)的照片。
圖11是顯示根據實施例4中所述的方案，CD34+細胞如何能夠攝取Resovist(Schering AG)的照片。根據該圖，單個點代表如下情況1、106細胞，0.25mmol Resovist，過夜溫育2、106細胞，0.25mmol Resovist+珠，過夜溫育3、106細胞，珠，過夜溫育4、106細胞，陰性對照(未染色)5、5×105細胞，陰性對照(未染色)6、5×105細胞，0.25mmol Resovist，過夜溫育7、5×105細胞，0.25mmol Resovist+珠，過夜溫育8、5×105細胞，珠，過夜溫育9、106細胞，0.25mmol Resovist，溫育2小時10、106細胞，0.25mmol Resovist+珠，溫育2小時11、106細胞，珠，溫育2小時12、5×105細胞，0.25mmol Resovist，2小時13、溫育5×105細胞，0.25mmol Resovist+珠，溫育2小時14、5×105細胞，珠，溫育2小時15、僅有珠，沒有細胞圖12是顯示干細胞分化成肝細胞的照片，如通過存在肝細胞標記清蛋白和甲胎蛋白所證明的。
圖13是顯示在培養物溫育的第7天向基本細胞因子(GM-混合物)(GM-混合物/基本細胞因子是G-CSF、GM-CSF、IL-3和干細胞因子的組合)添加肝細胞生長因子(HGF)和表皮生長因子(EGF)對細胞數目的影響高于在第0天或在第3天添加它們時對細胞數目影響的圖。
圖14是顯示在基本細胞因子中維持60天的培養物中實際的和累積的細胞數目的圖。
圖15是培養7天后，證明細胞端粒酶活性的凝膠放射自顯影圖。
圖16是通過免疫過氧化物酶免疫細胞化學顯色的顯微鏡載玻片制劑的照片，顯示了對照小鼠的肝不存在人細胞角蛋白18，但是在移植小鼠的肝中細胞角蛋白18呈陽性。
圖17是通過免疫過氧化物酶免疫細胞化學顯色的顯微鏡載玻片制劑的照片，顯示了對照小鼠的肝不存在人清蛋白，但是在移植小鼠的肝中清蛋白呈陽性。
圖18是三色免疫熒光圖象的照片，顯示了細胞角蛋白18和清蛋白的雙重染色。
圖19是對照和移植小鼠肝切片的照片，分別顯示了不存在和存在用抗人核抗體染色的細胞。
圖20是顯示在移植小鼠的肝中人染色體的原位雜交分析的熒光的照片。
圖21是顯示深低溫保藏不同血清濃度的新鮮分離的ASC34對它們隨后在培養物中生長影響的圖。
實施例A部分實施例1.細胞提取從正常個體的骨髓中或者動員的血液中獲得用于移植目的的造血細胞。使用LymphoprepTM密度梯度從全部造血細胞中分離單核級分。使用MiniMACS技術從單核級分中分離CD34+細胞。將細胞首先用CD34單克隆抗體標記，然后用順磁珠標記。將標記的細胞上樣到在磁體上保持的柱上，洗脫未標記的細胞并通過從磁體上除去柱子釋放標記的細胞。將CD34+細胞在37℃在組織培養塑料容器中溫育至少2小時。通過用HBSS洗滌除去非粘附細胞。
實施例2.細胞培養將細胞(2×105/ml)在含有血清、100ng/ml粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、5ng/ml白細胞介素-3(IL-3)、20ng/ml干細胞因子(SCF)和1ng/ml粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)的甲基纖維素培養基中培養。該細胞因子的組合也可稱作“基本細胞因子”或“GM-混合物”。這導致產生細胞的異質群體，其隨后可被表征。然后使用定制的細胞因子混合物使所選的單個群體靶向于分化。
實施例3.流式細胞術和免疫細胞化學流式細胞術.通過刮平皿取出在培養物中已發育的粘附群體。將細胞在4％多聚甲醛中固定并透化。將細胞用與FITC綴合的單克隆抗體標記并使用Becton Dickinson流式細胞儀進行分析。
免疫細胞化學.通過刮平皿取出在培養物中已發育的粘附群體。將細胞離心(cytospun)到玻璃載玻片上并通過甲醇固定。將細胞用單克隆抗體標記并使用APAAP(堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶)反應進行顯色。
在下面的表1中顯示流式細胞術和免疫細胞化學的結果。
表1.
*表示群體中陽性細胞的％**表示群體中大細胞是陽性的并且小細胞是陰性的。
清蛋白、甲胎蛋白、α1抗胰蛋白酶和c-MET(HGF受體)是肝細胞標記；GFAP(星形膠質細胞)是腦細胞標記；且平滑肌肌動蛋白是間充質細胞的標記。
圖12顯示培養12天后顯現肝細胞標記的細胞。
實施例4.將氧化鐵摻入到細胞中以及用順磁珠標記細胞將CD34+(106和5×105)細胞在37℃與0.25mmol Resovist(Ferrixan的商標，可購自Schering AG的羧基-葡聚糖包被的氧化鐵納米顆粒(nanoparticle))溫育2和24小時并用MRI進行分析。在兩種情況中，通過MRI都獲得陽性信號，從而提示Resovist在體內檢測CD34+細胞中的可能用途。圖11的結果表明顆粒可被細胞攝入，且因此當它們在體內運動或者位于靶組織中時，用于追蹤CD34+細胞或者它們的分化后代。
也通過錐蟲藍排除測定檢驗Resovist的體外毒性，并證明其無顯著性(＜4％)。
該試驗的結果顯示于圖11中。
B部分(另外的實施例)實施例5ASC 34的來源通過吸引術從健康供體中獲得的骨髓(BM)、通過白細胞提取法從給予一段時間粒細胞集落刺激因子(G-CSF)的健康供體中獲得的經過動員的外周血(PB)以及從正常足月分娩中獲得的臍帶血(UCB)是通常使用的ASC 34的來源。在所有病例中必需獲得知情同意和研究倫理學委員會(Research Ethics Committee)批準。
已經在成人骨髓、足月臍帶血、胎肝(妊娠11.6-13.8周齡)和胎兒骨髓(12.7-15.4周)以及成人造血組織和臍帶血中檢測到ASC-34活性。這些細胞與胚胎干細胞不同，因為認為胚胎在受精后8周形成胎兒。
實施例6粘附的CD34陽性人類干細胞(ASC34)同質群體的純化干細胞初步純化成同質是隨后它們自我更新、分化和體內移入潛力研究所期望的。這種群體是通過連續的密度梯度分離、免疫磁珠選擇以及差異粘附法獲得的，并且對于CD34表達、粘附到組織培養級塑料或玻璃上以及小淋巴細胞樣形態學方面是同質的。
通過經過Lymphoprep的密度梯度離心從整個樣品中分離單核的細胞(MNC)級分，然后使用MiniMACS技術(Miltenyi Biotech)從MNC中分離CD34陽性細胞級分。對于這個，首先將細胞用抗CD34單克隆抗體標記，然后用順磁微珠標記。將標記的細胞上樣到在磁體上保持的柱上，洗脫未標記的細胞，然后通過從磁體上除去柱釋放標記的細胞。將純化的(＞98％)CD34陽性細胞在補充了15％血清的α培養基中稀釋到2×105/ml。
通過在37℃將CD34陽性細胞懸浮液在組織培養塑料容器中溫育至少2小時，獲得粘附的CD34陽性干細胞(ASC34)。
通過在Hanks氏平衡鹽溶液(HBSS)中洗滌組織培養容器，除去非粘附的CD34陽性細胞。
不管用于啟始培養的造血組織(BM、PB、UCB)如何，粘附的CD34陽性干細胞最多占總CD34陽性細胞群體的約1％。未分化的CD34+粘附干細胞(ASC34)顯示具有高的核胞質比的同質小淋巴樣形態。在培養開始時，它們在組織培養表面如單個細胞一樣被廣泛地隔開。根據定義，起始細胞是CD34陽性的。如使用骨髓集落形成細胞的生產作為讀數所測量的，用抗-Thy-1單克隆抗體的抗體排除實際上除去了粘附的CD34+細胞的所有活性；根據使用從6個獨立的樣品中所分離的細胞的免疫細胞化學結果，平均28.1％，但是最高90％的細胞表達Thy-1。它們也表達局限于核中的AC133和c-met，但不表達CD3或CD19。它們不表達CD33、CD38或HLA-DR。它們是非周期性的細胞，對用細胞周期活性藥物5-氟尿嘧啶的處理有抗性。
表2證明在CD33、CD38和HLA-DR的表達方面，ASC34顯著地比非粘附的CD34陽性細胞更同質。
表2在粘附的和非粘附的級分中抗原陰性的CD34陽性細胞的百分比
*平均值±sem(平均值的標準誤)；**比較粘附的和非粘附的CD34+細胞的Mann-Whitney U檢驗；n＝檢驗的樣品數實施例7使用對組織培養塑料的粘附作為選擇標記對組織培養塑料的粘附是包括骨髓間充質干細胞、單核細胞和巨噬細胞的幾種細胞類型的特征，但是這種特征以前一直沒有用于表征CD34陽性細胞亞群。已發現對組織培養塑料的粘附是一種簡單的，可重復的以及可行的選擇原始干細胞的方法，而不需要采用多個抗體標記步驟或者其它操作。另一個優點是細胞利用塑料作為它們開始的生長基質并且純化后不需要轉移到獨立的培養環境。
將在培養基中懸浮的CD34陽性細胞以每毫升5×105細胞的濃度引入到組織培養塑料容器中。將容器在37℃在潮濕的5％ CO2的空氣中培養。通過用培養基徹底洗滌，除去占總CD34陽性群體99％的非粘附的CD34陽性細胞。ASC34很容易地結合玻璃，但不結合非組織培養級塑料。
可使用細胞刮棒通過機械性地將它們從組織培養塑料中取出來回收ASC34以用于進一步的研究或者操作。胰蛋白酶和accutase是無效的。
實施例8經過動員的血液作為粘附的CD34陽性人類干細胞(ASC34)的來源的用途可獲得的用于啟動培養的細胞數目是在從所培養的干細胞中進行組織再生發展過程中的一個限制性因素。骨髓和臍帶血是有利的來源。然而，PBPC(外周血祖細胞)收獲物產生更多的用于啟動培養的細胞，因此降低放大的程度以及減少產生臨床上有用產物所需的時間。
將供體(自體的或同種異體的)通過皮下施用5mg/kg G-CSF處理一周。使用程序化單采血液成分術機器通過白細胞提取法收獲細胞。細胞的一般產量為5到10×1010，其中的絕大多數是單核的細胞，且約1％(5-10×108)是CD34+的。使用CliniMacs系統(MiniMacs的按比例擴大版)分離CD34陽性細胞。通過直接的觀察，ASC34占CD34陽性群體的約1％(5-10×106)。這種估計通過ASC34活性的有限稀釋分析得到證實，其中使用造血集落形成細胞測定作為讀數。因此，在1-2周期間可獲得3-4log擴大，將產生用于臨床應用的5-100×109細胞。
實施例9ASC34的培養第二階段條件培養的第一階段由擴大粘附細胞組成。用含有血清(Methocullt H4230；Metachem Diagnostics，Northampton，英國)和細胞因子的基本混合物(100ng/ml G-CSF(Chugai Pharma，London，英國)1ng/ml GM-CSF、5ng/ml IL-3、20ng/ml SCF(所有都購自First Link，West Midlands，英國))的甲基纖維素覆蓋ASC34。將培養物在37℃，5％潮濕的CO2空氣中培養。ASC34分裂并自我更新形成粘附的干細胞集落，接著形成顯示間充質、上皮、血管和神經細胞類型的形態學特征的粘附細胞。在培養的第一周中粘附細胞的數目增加40倍。另外，非粘附細胞釋放到甲基纖維素內，其中發現了大量的造血細胞(白細胞)集落。
從培養環境中省略甲基纖維素將使細胞生產降低60％。將所接種的CD34+細胞數目提高到常規5×105/ml以上并不能導致細胞生產的同等增加。添加4mM氯化鋰不能增加細胞數目。
第二階段條件在第二階段中，將細胞轉移到液體培養條件中，其中根據需要添加另外的細胞因子以誘導選擇性的細胞分化。下面列舉用于不同地指導分化的適當的細胞因子。
表3指導分化的適宜條件
如在圖13中可以看到的，一些細胞因子當在培養的第7天加入時比它們在第0天或第3天加入時更有效。表4顯示不同的細胞因子和組合對兩周齡培養物中的總細胞數目的影響。
表4不同的細胞因子和細胞因子組合對細胞產量的影響*.
*相對于僅有GM混合物的細胞產量，即存在所添加的細胞因子時的細胞產量僅存在GM混合物時的細胞產量之間的比數據顯示，額外的細胞因子總的說來對細胞的數目沒有較大影響。更重要地是，所設計的用于誘導分化的組合(HGF+EGF+β動物纖維素+活化素A/KGF+尼克酰胺+葡萄糖)不降低細胞產量。
可將培養物在第二階段條件中維持60天(圖14)。
實施例10端粒酶活性使用TRAP測定來測量端粒酶活性。將細胞轉移到1×CHAPS緩沖液中，并使用DC測定(Bio-Rad)測定所得裂解液的蛋白濃度，所述裂解液標準化到77ng/μl并用CHAPS緩沖液以1∶10、1∶40和1∶160稀釋。將裂解液使用TRAPeze端粒酶檢測試劑盒(Intergen)進行分析。將TS引物在37℃標記20分鐘并在85℃熱變性5分鐘。然后運行PCR，進行28個循環，其中退火溫度為59℃。將得到的TRAP產物在TRAP上樣染料中稀釋并在12.5％丙烯酰胺-0.5×TBE凝膠上進行電泳，干燥并曝光于X光膠片。
在培養開始時，如通過TRAP測定所評估的，細胞不表達端粒酶活性，這與細胞在分離時的休眠性質一致。從7天齡培養物開始，細胞中的端粒酶活性非常顯著(圖15)，這與細胞在該階段的增殖一致。
實施例11聚合酶鏈反應從ASC34(第0天)中和從在基本細胞因子或者在添加如在圖例中所示的HGF或EGF培養7天和14天后ASC34衍生的細胞中制備裂解液。在另一個實驗中，對培養中的細胞分析最多35天。從培養細胞的粘附的和非粘附的細胞級分中制備單獨的裂解液。通過PCR分析基因表達。
在第0天ASC 34的基因表達自我更新和多潛能標記。
Rex-1氧化還原傳感轉錄阻抑物Oct 4八聚體結合轉錄因子-4Nanog促進ES細胞自我更新的同源域蛋白造血細胞標記CD34 造血干細胞標記CD133膽固醇結合蛋白prominin 1。脂質筏標記。
RECAM血小板-內皮粘附分子VWF von Willibrand因子。凝固TAL-1T細胞急性白血病-1。堿性螺旋-環-螺旋蛋白CXCR4SDF-1的趨化因子受體。對干細胞歸巢和移入很重要血管生成素1 Tie 2的配體。維持造血干細胞休眠Tie 2血管生成素-1的受體。維持造血干細胞休眠。
骨骼肌標記TNNT1骨骼慢肌鈣蛋白1結蛋白 肌肉的主要中間絲蛋白伴肌動蛋白橫紋肌肌節絲的結構成分心臟連接蛋白-43 心肌細胞中的間隙連接成分GATA-4心肌細胞中結合FOG2的鋅指轉錄因子神經CXCR4 神經前體上SDF-1的趨化因子受體連接蛋白-43 星形膠質細胞上的間隙連接成分內皮CD34 造血干細胞標記。也由內皮細胞表達CD133 膽固醇結合蛋白prominin 1。脂質筏標記VEGF 血管內皮生長因子KDR 激酶插入結構域受體。VEGF的受體血管生成素1 血管生成因子。Tie 2的配體血管生成素2 血管生成因子。Tek的配體Tie 2 血管生成素1的受體CXCR4 SDF-1的趨化因子受體。對于血管形成很重要PECAM 血小板-內皮細胞粘附分子ICAM 2細胞間粘附分子2。介導白細胞外滲VE鈣粘著蛋白 形成粘著連接TAL-1 T細胞急性白血病-1。
VWF von Willibrand因子。凝固因子肝臟α-1抗胰蛋白酶細胞角蛋白18巢蛋白波形蛋白c-met 肝細胞生長因子的受體CD34 造血干細胞抗原。也在候選的肝臟干細胞上表達。
胰NGN-3 β細胞分化中pdx-1的靶培養14天后由ASC 34所產生的細胞的基因表達。
造血細胞標記CD133 膽固醇結合蛋白prominin 1。脂質筏標記PECAM 血小板-內皮細胞粘附分子VWFvon Willibrand因子。凝固TAL-1 T細胞急性白血病-1。堿性螺旋-環-螺旋蛋白CXCR4 SDF-1的趨化因子受體。對干細胞的歸巢和移入很重要血管生成素1Tie 2的配體。維持造血干細胞休眠骨骼肌標記伴肌動蛋白 巨大細胞骨架蛋白。橫紋肌肌節絲的結構成分心臟肌鈣蛋白1 肌鈣蛋白復合物的亞基伴肌動蛋白 巨大細胞骨架蛋白神經CXCR4 神經前體上的SDF-1的趨化因子受體內皮CD133 膽固醇結合蛋白prominin 1。脂質筏標記VEGF 血管內皮生長因子血管生成素1血管生成因子。Tie 2的配體血管生成素2血管生成因子。Tek的配體CXCR4 SDF-1的趨化因子受體。對于血管形成很重要PECAM 血小板-內皮細胞粘附分子ICAM 2 細胞間粘附分子2。介導白細胞外滲VWFvon Willibrand因子。凝固TAL-1 T細胞急性白血病-1。堿性螺旋-環-螺旋蛋白伴肌動蛋白 巨大細胞骨架蛋白肝臟α-1抗胰蛋白酶 蛋白酶抑制劑細胞角蛋白18 細胞骨架成分LDLR 低密度脂蛋白受體。在膽固醇穩態中起作用清蛋白 類固醇、脂肪酸和甲狀腺激素的載體蛋白
HGF肝細胞生長因子HNF3-B 肝細胞核因子3β。轉錄因子運鐵蛋白 鐵轉運AFP甲胎蛋白胰Pax-6Pdx-1胰島素 抵抗高血糖并刺激脂肪生成IGF-1 胰島素樣生長因子1。生長調節素HNF3-B 肝細胞核因子3β。在產生胰高血糖素的胰島細胞中所表達的轉錄因子。
NeuroD-1 調節胰島素基因表達NGN3每周研究一次在基本細胞因子(GM-混合物)中培養的細胞所表達的胰島素、PDX-1、Neuro D-1和NGN3基因的表達。結果顯示從第7天到第35天表達胰島素，從第7天到第35天表達PDX-1，從第14天到第35天表達NeuroD-1以及從第21天到第35天表達NGN3。因此，在胰島素生產中所涉及的基因的表達持續3-4周，其中最廣泛的表達發生在培養3-5周齡。因此在本發明的優選實施方案中，干細胞能產生后代，其表達胰島素生產中所涉及的基因(胰島素、PDX-1、Neuro D-1和NGN3)。
實施例12ASC34分化成造血細胞將14天后將從培養物中收獲的細胞鋪平板到標準造血集落形成細胞測定中。一般地，～103粒細胞-巨噬細胞集落形成，代表培養物中總細胞的～1％。當收獲ASC34衍生的細胞并在造血集落測定中生長時，紅細胞類的BFU-e、巨核細胞(Mk-CFC)和多潛能(GEMM)集落形成細胞也很明顯。更重要地是，ASC34引起形成骨髓基質粘附的干/祖細胞，其當接種到預先形成的培養基質上時形成母細胞集落/“鵝卵石(cobblestone)”區并且在延長的體外溫育(5周)期間能長期產生造血細胞。
制備細胞的細胞離心(Cytospin)制劑并用Romanowsky細胞化學染料染色。這揭示了粒細胞、單核細胞-巨噬細胞、巨核細胞(mekakaryocytic)以及類紅細胞分化的形態學證據。
實施例13移入動物模型中實驗1將大量的(1×106)ASC34衍生的細胞靜脈內或皮下注射到裸鼠中不導致任何死亡率或可看得出的發病率。
實驗2已用肝臟毒素(1g/kg硫代乙酰胺)處理過的裸鼠接受1×106ASC34衍生的細胞，包括通過直接注射到脾內的候選肝細胞。毒素的裸鼠受體僅作為對照。到第7天所有對照小鼠均死亡，而所有的細胞受體均存活，與它們是否已用環孢菌素(CsA)處理過無關(表5)。
表5將ASC34衍生的細胞移植到具有肝臟損害的小鼠中的結果
*肝臟毒素實驗3設置三個實驗組第1組，TA+細胞；第2組，TA+CsA+細胞；第3組，僅TA。向第2組動物每周施用兩次CsA。第3組中的所有小鼠在用TA處理后2天內均死亡。第1組和第2組中的動物存活，直到被處死用于組織采樣(第1、8和15天)。第2組小鼠的肝臟切片對于人類細胞角蛋白18，一種證明存在人類ASC34衍生細胞的肝特異性標記，染色呈陽性。在對照動物的切片上沒有觀察到染色(圖16)。
實驗4使用抗-Fas抗體JO2誘導進行性慢性肝衰竭。每個動物持續4周接受250μg JO2/kg/周，且第一次JO2注射后24小時脾內注射1×106細胞。每周給予兩次CsA。在12只動物中，2天后有2只發生與手術有關的死亡，且一只動物存活了82天。將剩余的小鼠處死以進行檢查(一只在第2天，兩只在第8天，三只在第13天以及三只在第21天)。
在圖16-20中所顯示的分析證明，人類細胞移入小鼠的肝臟中并且產生清蛋白和細胞角蛋白18。
實施例14深低溫保藏和貯藏在深低溫保藏小瓶中將細胞(回收的粘附的CD34陽性級分或在培養中所產生的它們的后代)懸浮于30％血清/10％ DMSO中并置于-80℃的乙醇冷凍浴中過夜。然后將冷凍小瓶轉移到液氮的蒸氣相中用于貯藏。通過將小瓶在37℃水浴中迅速解凍，從冷凍的狀態中回收細胞，將內容物用培養基稀釋并洗滌細胞。
在處理前，可將白細胞提取法產物在37℃貯藏24小時，對后來的體外生存力或生長沒有任何有害影響(數據沒有顯示)。當在10％DMSO加30-50％血清中深低溫保藏前對粘附細胞進行純化，再解凍時它們仍然保持92±4.8％(平均值±SD)的生存力并且對它們在體外的生長沒有影響(圖21)。
這些結果具有實際的含意1.處理前處理前可將白細胞提取法產物在4℃貯藏24小時。因此，可將冷卻的白細胞提取法產物全世界范圍內從保藏中心運輸到加工中心。
2.純化后可將ASC34懸浮于10％ DMSO/30-50％血清中并在液氮中冷凍。解凍后它們保持90-100％生存力，像新鮮細胞一樣重新粘附到組織培養塑料上并在培養中增殖。因此，分離的有功能的ASC34可全世界范圍內運輸或長期貯藏。
3.培養后將培養14天的細胞進行深低溫保藏、解凍和再培養。可將培養14天的細胞放置在環境溫度中并保持生存力。因此，培養的細胞可全世界范圍內運輸或者長期貯藏。
實施例15ASC-34和間充質干細胞(MSC)之間差異的總結間充質干細胞是可從成人骨髓中衍生的獨立的細胞群體。MSC(也稱作多潛能成人祖細胞-MAPC)和ASC-34細胞(本發明的細胞)顯示下面所總結的很重要的差異。也應當注意到MSC/MAPC細胞不表達CD34。
*參考文獻Javazon，Beggs和Flake.Exp Hematol 2004，32414.
1-MAPC僅在延長培養后被發現。它們一直沒有在新鮮骨髓樣品中被鑒別。
2-ASC-34細胞對5氟尿嘧啶有抗性
權利要求
1.一種分離的干細胞群體，其中所述的干細胞是CD34+，能自我再生，能分化成外胚層、中胚層和內胚層細胞并且能夠粘附到組織培養級塑料上。
2.根據權利要求1的細胞群體，進一步的特征是細胞在分離后的3小時內能粘附到組織培養級塑料上，并且保持粘附至少72小時。
3.根據權利要求1或2的干細胞群體，其中所述細胞是CD33-、CD38-、HLA-DR-、CD3-和CD19-。
4.根據前面任何一項權利要求的干細胞群體，其富集了也是Thy-1+的細胞。
5.根據前面任何一項權利要求的干細胞群體，其富集了也是AC133+和/或c-met+的細胞。
6.根據前面任何一項權利要求的干細胞群體，其表達編碼Rex-1、Oct4、Nanog、CD34、CD133、PECAM、VWF、Tal-1、CXCR4、血管生成素1、Tie2、TNNT1、結蛋白、伴肌動蛋白、連接蛋白-43、GATA-4、VEGF、KDR、血管生成素2、ICAM-2、VE鈣粘著蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、細胞角蛋白18、巢蛋白、波形蛋白和c-met的基因。
7.根據前面任何一項權利要求的干細胞群體，培養后所產生的其后代表達編碼CD133、PECAM、VWF、Tal-1、CXCR4、血管生成素-1、伴肌動蛋白、肌鈣蛋白1、VEGF、血管生成素2、ICAM2、α-1-抗胰蛋白酶、細胞角蛋白18、LDLR、清蛋白、HGF、HNF-3β、運鐵蛋白、甲胎蛋白、Pax-6、Pdx＝1、胰島素、IGF-1、NeuroD-1和NGN3的基因。
8.根據前面任何一項權利要求的干細胞群體，其后代表達胰島素生產中所涉及的基因。
9.根據權利要求1-8中任何一項的干細胞群體，其中所述干細胞是成人干細胞。
10.根據權利要求1-8中任何一項的干細胞群體，其中所述干細胞群體包括從非胎兒樣品，如臍帶樣品中獲得的胎兒細胞。
11.根據前面任何一項權利要求的干細胞群體，其中所述細胞具有在ECACC中保藏的，登記號為No.04092401的那些細胞的特征。
12.根據前面任何一項權利要求的干細胞群體，其是哺乳動物來源的。
13.根據前面任何一項權利要求的干細胞群體，其是人來源的。
14.根據權利要求1-12中任何一項的干細胞群體，其是鼠、馬或牛來源的。
15.根據權利要求1-12中任何一項的干細胞群體，其是分離自或衍生自從伴侶動物中所采集的樣品的。
16.根據前面任何一項權利要求的干細胞群體，在其培養期間不需要飼養層。
17.一種能自我再生并分化成外胚層、中胚層和內胚層細胞的分離的干細胞群體，所述的群體可通過下列方式獲得(i)將造血組織進行密度梯度分離；(ii)使低密度細胞接觸CD34的親和配體；(iii)回收附著到所述CD34配體上的細胞；(iv)使CD34+亞群接觸組織培養級塑料；和(v)回收粘附所述塑料的CD34+細胞。
18.一種培養物，其包括(i)干細胞群體，其中所述的干細胞是CD34+，能粘附組織培養級塑料，能自我再生并能分化成外胚層、中胚層和內胚層細胞；和(ii)能支持所述干細胞生長的培養基。
19.一種分離干細胞群體的方法，其中所述的干細胞是CD34+，能粘附組織培養級塑料，能自我再生并能分化成外胚層、中胚層和內胚層細胞，其中該方法包括從受試者中采集血液或骨髓樣品以及從中提取所述的細胞群體。
20.如在權利要求19中所要求保護的分離方法，其包括(i)將造血組織進行密度梯度分離；(ii)使低密度細胞接觸CD34的親和配體；(iii)回收附著到所述CD34配體上的細胞；(iv)使CD34+亞群接觸固體支持物；(v)回收粘附所述固體支持物的CD34+細胞。
21.根據權利要求20的方法，其中所述固體支持物選自組織培養級塑料或玻璃。
22.如在權利要求19或20中所要求保護的方法，其進一步包括培養所述分離的干細胞群體的步驟。
23.一種生產靶細胞群體的方法，其包括與多種生長因子一起培養如在權利要求1-17中任何一項所限定的干細胞群體，這導致所述干細胞群體的分化。
24.如在權利要求23中所要求保護的方法，其中所述靶細胞選自肝細胞、胰細胞、造血細胞、神經元細胞以及少突膠質細胞。
25.一種培養如在權利要求1-17中任何一項所限定的干細胞群體的方法，其包括使所述細胞群體與多種生長因子接觸，這促進和/或維持所述干細胞群體的增殖。
26.通過如在權利要求19-25中任何一項所要求保護的方法生產的細胞群體。
27.如在權利要求1-17和26中任何一項所要求保護的細胞群體，其中細胞能在深低溫保藏下存活。
28.如在權利要求1-17、26或27中任何一項所要求保護的細胞群體，其中通過插入核酸區改變基因組。
29.權利要求28的細胞群體，其中通過使用DNA病毒、RNA病毒或逆轉錄病毒載體插入DNA而改變基因組。
30.如在權利要求1-17、26或27中任何一項所要求保護的細胞群體，其中部分基因組已滅活，例如，通過存在反義核酸分子、核酶序列或抑制性RNA序列。
31.如在權利要求1-17或26-30中任何一項所要求保護的細胞群體，其用于治療。
32.如在權利要求1-17或26-30中任何一項所要求保護的細胞群體，其用于再生器官或修復受損器官。
33.一種再生患者器官或修復患者受損器官的方法，其包括向所述患者施用根據權利要求1-17或26-30中任何一項的細胞。
34.根據權利要求32或權利要求33的細胞群體或方法，其中所述器官選自造血系統或免疫系統、肝臟、肺、胰、骨、軟骨、肌肉、皮膚、腦或神經系統以及心臟或循環系統。
35.根據權利要求32-34中任何一項的細胞群體或方法，其中將所述細胞用可追蹤的標記進行標記，優選地用氧化鐵或順磁珠。
36.一種細胞移植的方法，其包括將如在權利要求1-17或26-30中任何一項所要求的細胞群體引入到受試者中。
37.一種篩選試劑的器官特異性作用的方法，其通過將由如在權利要求23或24中所要求保護的方法所產生的細胞與所述試劑接觸來進行。
38.根據權利要求37的方法，其中所述試劑是懷疑有器官特異性毒性的毒素。
39.根據權利要求37的方法，其中所述試劑是懷疑有器官特異性毒性的藥物或治療劑。
40.根據權利要求37的方法，其中所述試劑是懷疑有有益的器官特異性作用的藥物或治療劑。
41.一種體外產生蛋白的方法，其包括培養權利要求1-17中任何一項的干細胞或者從其衍生的分化細胞系，以及回收由所述細胞所表達的一種或多種蛋白。
全文摘要
本發明涉及一種分離的干細胞群體，其中所述的干細胞是CD3文檔編號A61K35/12GK1918284SQ200480041764
公開日2007年2月21日 申請日期2004年12月20日 優先權日2003年12月19日
發明者M·戈頓, N·哈比布 申請人:奧姆尼賽特有限公司