專利名稱：：用于抑制c－met二聚化及活化的方法和組合物的制作方法
技術領域：
：廣義而言，本發明涉及分子生物學及生長因子調控領域。更具體地說，本發明涉及HGF/c-met信號傳導途徑的調節因子，以及所述調節因子的用途。
背景技術：
：HGF是一種間充質-衍生的多效性因子，對大量不同細胞類型具有促有絲分裂、動力產生和細胞成形的活性。HGF作用是通過一種特異性酪氨酸激酶c-met來介導的，異常的HGF及c-met表達多見于各種腫瘤。參見，例如，Mauliketal.，Cytokine&GrowthFactorReviews(2002)，1341-59；Danilkovitch-Miagkova&Zbar，J.Clin.Invest.(2002)，109(7)863-867。HGF/c-Met信號傳導途徑的調控與腫瘤發展及轉移有關。參見，例如，Trusolino&Comoglio，NatureRev.(2002)，2289-300)。HGF能夠與Met受體酪氨酸激酶(RTK)的細胞外結構域結合，調節各種生物反應，例如細胞分散、增殖及存活。HGF-Met信號傳導對于正常的胚胎發育，特別是肌肉祖細胞的遷移以及肝臟和神經系統的發育是必不可少的(Bladtetal.，1995；Hamanoueetal.，1996；Mainaetal.，1996；Schmidtetal.，1995；Ueharaetal.，1995)。Met敲除與HGF敲除小鼠的發育表型非常相似，表明HGF是Met受體的同源配體(cognateligand)(Schmidtetal.，1995；Ueharaetal.，1995)。另外，HGF-Met還在肝臟再生、脈管生成，和傷口愈合中發揮作用(Bussolinoetal.，1992；MatsumotoandNakamura，1993；Nusratetal.，1994)。Met受體前體經過蛋白水解切割為通過二硫鍵連接在一起的細胞外α亞單位和跨膜β亞單位(Tempestetal.，1988)。所述的β亞單位含有胞質激酶結構域，在C-末端上含有多-底物錨定位點(dockingsite)，接頭蛋白就是結合于此處啟動信號傳導(Bardellietal.，1997；Nguyenetal.，1997；Peliccietal.，1995；Ponzettoetal.，1994；Weidneretal.，1996)。當HGF結合時，Met的活化分別通過Gab1及Grb2/Sos介導的PI3-激酶和Ras/MAPK活化導致酪氨酸激酶的磷酸化和下游的信號轉導，從而驅動細胞的運動和增殖(Furgeetal.，2000；Hartmannetal.，1994；Ponzettoetal.，1996；RoyalandPark，1995).Met能夠轉化致癌物-處理過的骨肉瘤細胞系(Cooperetal.，1984；Parketal.，1986)。在多種人的癌癥中發現了Met的過表達或基因-擴增。例如，Met蛋白在結腸直腸癌中過表達了至少5倍，并且在肝轉移中是基因擴增的(gene-amplified)(DiRenzoetal.，1995；Liuetal.，1992)。另外還有報道Met蛋白過表達于口腔鱗狀細胞癌、肝細胞癌、腎細胞癌、乳腺癌及肺癌(Jinetal.，1997；Morelloetal.，2001；Natalietal.，1996；Oliveroetal.，1996；Suzukietal.，1994)。此外，還發現在肝細胞癌、胃癌，和結腸直腸癌中也有mRNA的過表達(Boixetal.，1994；Kuniyasuetal.，1993；Liuetal.，1992)。在腎乳頭狀癌中發現Met的激酶結構域中有大量突變，導致組成型受體活化(Oliveroetal.，1999；Schmidtetal.，1997；Schmidtetal.，1999)。這些活化突變賦予組成型Met酪氨酸磷酸化，導致MAPK活化，病灶形成及腫瘤發生(Jeffersetal.，1997)。此外，這些突變加強了細胞移動及侵入(Giordanoetal.，2000；Lorenzatoetal.，2002)。轉化后的細胞中的HGF-依賴性Met活化能介導加強的運動、分散及遷移，最終導致侵入性的腫瘤生長及轉移(Jeffersetal.，1996；Meinersetal.，1998)。現已發現Met能夠與驅動受體活化、轉化及侵入的其他蛋白質相互作用。在瘤形成的細胞中，Met能夠與α6β4整聯蛋白相互作用，加快HGF-依賴性的侵入生長，α6β4整聯蛋白是細胞外基質(ECM)成分例如層粘連蛋白的受體(Trusolinoetal.，2001)。此外，已經證實所述的Met的細胞外結構域能與semaphorin家族成員plexinB1相互作用，從而加快侵入性生長(Giordanoetal.，2002)。另外，還發現與腫瘤發生及轉移有關的CD44v6能夠與Met和HGF形成復合體，從而導致Met受體活化(Orian-Rousseauetal.，2002)。Met是受體酪氨酸激酶(RTKs)亞家族的成員，該家族包括Ron和Sea(Mauliketal.，2002)。Met細胞外結構域的結構測定表明其與semaphorins和plexins之間具有同源性。Met的N-末端含有大約500個氨基酸的Sema結構域，該結構域保守存在于所有的semaphorins和plexins中。所述semaphorins和plexins屬于一個大的分泌型及膜結合型蛋白質家族，該家族首先報道了在神經發育中所起的作用(VanVactorandLorenz，1999)。但是，更近的研究發現semaphorin過表達與腫瘤侵入及轉移有關。發現于plexins、semaphorins和整聯蛋白中的富含半胱氨酸的PSI結構域(又稱Met相關序列結構域)位于其后接有4個IPT重復單元的Sema結構域的附近，這4個重復單元是在plexins及轉錄因子中發現的免疫球蛋白-樣區域。最近研究表明MetSema結構域足以結合HGF及肝素(Gherardietal.，2003)。Met激酶結構域的作用已經進行了詳細地研究，但是Met的細胞外結構域還知之甚少。盡管大家都知道HGF結合Met的細胞外結構域導致受體活化，但是還不清楚，哪個亞-結構域，如果有，參與了受體的二聚化。但是，顯然如果能夠闡明Met細胞外結構域中的亞-結構域在活化HGF/c-met信號轉導軸中的作用(如果有的話)，那么將會為靶向治療的設計帶來明顯益處，例如并且尤其是在涉及Met受體本身功能異常的臨床情況中。本申請中引用的所有文獻，包括專利申請及公開文本，在此全文引入作為參考。
發明內容本發明是部分建立在下述試驗結果基礎上的肝細胞生長因子受體c-met的二聚化是一個生物/細胞過程，是一個重要且有利的治療靶標。本申請發現破壞該過程可有效地抑制與細胞生長有關的細胞信號傳導途徑的活化，這種活化與許多疾病狀態例如癌癥中的細胞生長失調有關。本發明還進一步以下述發現為基礎在影響c-met二聚化進而活化HGF/c-met信號轉導軸中，必需的和/或發揮重要作用的是c-met蛋白質的某些而非所有的結構域。本發明還提供了以干擾HGF與c-met細胞外部分特異性結構域間結合為基礎的組合物和方法。鑒定出c-met二聚化或c-met與同源配體結合中所需的c-met特異性部分，能為更好地優化針對下述病理狀況的預防和/或治療方法提供獨一無二且有益的靶標，所述病理狀況即與HGF/c-Met途徑異常或不良信號傳導有關的病理狀況。因此，本發明提供了與調節HGF/c-met途徑有關的方法、組合物、試劑盒及制品，包括對c-met配體結合、c-met二聚化、活化以及其他與HGF/c-met信號轉導有關生物/生理活性的調節。在一個方面，本發明提供了干擾所述HGF/c-met信號傳導途徑的c-met拮抗劑。例如，本發明提供了一種能干擾c-met二聚化的c-met拮抗劑。一個實施方案中，本發明所述的c-met拮抗劑能干擾c-metSema結構域的二聚化功能(即，Sema結構域能夠在影響受體二聚化中發揮作用)。一個實施例中，c-met拮抗劑能干擾c-metSema結構域影響c-met二聚化的能力。干擾可以是直接的或間接的。例如，c-met拮抗劑可以與所述c-metsema結構域中的一段序列結合，從而抑制所述結合結構域與其結合伴侶(例如另一c-met分子)間的相互作用。另一實施例中，c-met拮抗劑與位于所述c-metsema結構域之外的一段序列結合，但是所述結合能破壞c-metSema結構域與其結合伴侶(例如另一c-met分子)間的相互作用。一個實施方案中，本發明的拮抗劑能結合c-met(例如，所述細胞外結構域)從而干擾c-met的二聚化。一個實施方案中，本發明的拮抗劑與c-met結合從而干擾c-metSema結構域影響c-met二聚化的能力。例如，一個實施方案中，本發明提供了一種拮抗劑，該拮抗劑與c-met分子結合時能抑制所述分子的二聚化。一個實施方案中，本發明的c-met拮抗劑能夠與c-metSema結構域中的一段序列特異性地結合。一個實施方案中，本發明的拮抗劑能干擾c-met的二聚化包括均二聚作用。一個實施方案中，本發明的拮抗劑能干擾c-met的二聚化包括異二聚作用(即，c-met與非-c-met分子間的二聚化)。在一些情況下，獲得一種不妨礙配體(例如HGF)與c-met間結合的c-met拮抗劑是有利的。因此，一些實施方案中，本發明的拮抗劑不能結合c-met上的配體(例如HGF)結合位點。另一個實施方案中，本發明的拮抗劑基本上不能抑制配體(例如，HGF)與c-met的結合。一個實施方案中，本發明的拮抗劑基本上不與配體(例如，HGF)競爭性地結合c-met。一個實施例中，本發明的拮抗劑可用于偶聯一種或多種其他拮抗劑，其中所述拮抗劑靶向HGF/c-met軸中的不同過程和/或功能。因此，一個實施方案中，本發明的c-met拮抗劑與c-met上的表位結合，而該表位是與另一種c-met拮抗劑結合的表位不同的表位，例如用保藏號為ATCCHB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)的雜交瘤細胞系制備的單克隆抗體Fab片段。另一個實施方案中，本發明的c-met拮抗劑不同于(即不是)用保藏號為ATCCHB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)的雜交瘤細胞系制備的單克隆抗體Fab片段。一個實施方案中，本發明的c-met拮抗劑不含有用保藏號為ATCCHB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)的雜交瘤細胞系所制備抗體的c-met結合序列。在一些情況下，具有能干擾c-met二聚化以及配體結合的c-met拮抗劑是有利的。例如，本發明的拮抗劑還可以進一步包括與HGF競爭性結合c-met的能力。在本發明c-met拮抗劑的一個實施方案中，拮抗劑與c-met的結合能抑制HGF對c-met的活化。本發明所述c-met拮抗劑的一個實施方案中，所述拮抗劑與細胞中c-met的結合能抑制該細胞的增殖、分散、形態發生(morphogenesis)和/或運動(motility)。一個實施方案中，本發明的c-met拮抗劑包含肽，該肽含有至少一部分c-metSema結構域或其變體。一個實施例中，本發明的拮抗劑包含肽，該肽含有選自下列序列中的至少一種序列LDAQT(SEQIDNO1)(例如，c-met中的第269-273位殘基)，LTEKRKKRS(SEQIDNO2)(例如，c-met中的第300-308位殘基)，KPDSAEPM(SEQIDNO3)(例如，c-met中的第350-357位殘基)和NVRCLQHF(SEQIDNO4)(例如，c-met中的第381-388位殘基)。另一實施例中，本發明的拮抗劑包含肽，該肽基本上由選自下列序列中的至少一種序列組成LDAQT(SEQIDNO1)、LTEKRKKRS(SEQIDNO2)、KPDSAEPM(SEQIDNO3)和NVRCLQHF(SEQIDNO4)。一個實施方案中，所述肽含有序列LTEKRKKRS(SEQIDNO2)。一個實施方案中，所述肽基本上由LTEKRKKRS(SEQIDNO2)組成。一個實施方案中，所述肽含有序列LDAQT(SEQIDNO1)。一個實施方案中，所述肽基本上由LDAQT(SEQIDNO1)組成。一個實施方案中，所述肽含有序列KPDSAEPM(SEQIDNO3)。一個實施方案中，所述肽基本上由KPDSAEPM(SEQIDNO3)組成。一個實施方案中，所述肽含有序列NVRCLQHF(SEQIDNO4)。一個實施方案中，所述肽基本上由NVRCLQHF(SEQIDNO4)組成。一些實施方案中，所述肽是一種變體，其中含有與序列LDAQT(SEQIDNO1)，LTEKRKKRS(SEQIDNO2)，KPDSAEPM(SEQIDNO3)和/或NVRCLQHF(SEQIDNO4)具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％序列同一性的氨基酸序列，其中所述變體保留有能與c-met分子形成復合體的能力。一些實施方案中，這些肽中含有增強其抑制和/或治療作用(包括，例如增強親和力、提高藥物動力學特性(例如半衰期、穩定性、清除率)、減少對受試者的毒性)的修飾。所述修飾包括，例如，涉及糖基化、PEG化(pegylation)、用非天然生成但功能等價的氨基酸、連接基團等取代的修飾。合適的修飾已為本領域所熟知，可以根據需要憑經驗來決定。一些實施方案中，本發明的c-met拮抗劑是或含有小分子(例如，有機分子)、肽(例如，低聚肽)、抗體、抗體片段、適體(aptamer)、寡核苷酸(例如，反義寡核苷酸)，或其組合。一些實施方案中，本發明的c-met拮抗劑通過本申請中本發明所述的篩選或鑒定方法獲得。另一方面，本發明提供了用于篩選或鑒定c-met拮抗劑的方法。一個實施例中，所述方法包括讓侯選物與表達c-met的細胞接觸，在所述侯選物存在下所述細胞中的c-met二聚化和/或活化被抑制(用眾多標準及方法中的任一種，本申請中記載了其中的一些)表明所述物質是c-met拮抗劑。另一實施例中，所述方法包括讓候選物質與其中含有至少一部分c-metSema結構域的靶分子接觸，據此選出能特異性結合所述靶分子的物質(稱為c-met拮抗劑)。一些實施方案中，本發明所述的篩選方法進一步還包括讓被選物質與表達c-met的細胞接觸，然后對該細胞中c-met二聚化的抑制情況進行測定(例如，對所述細胞中c-met二聚化程度進行檢測或測量)。c-met二聚化的抑制情況可以采用本領域已知的眾多方法，根據本領域已知的多種標準中的任一標準進行測定(一些在本申請中已詳細描述)。例如，c-met二聚化抑制情況可以用c-met活化量的減少顯示，也可以用細胞中c-met相關細胞信號轉導量顯示。細胞信號轉導可以使用和依據本領域已知的大量方法及標準測定，其中的一些已在于本申請中描述。例如，HGF/c-met途徑申細胞信號轉導的發生在生物學上可以顯示為所述信號傳導途徑中靶分子磷酸化的改變。因此，例如，可以對與HGF/c-met途徑中一種或多種已知磷酸化靶標有關的蛋白質磷酸化的量進行測量。所述磷酸化靶標的實例包括c-met本身及促有絲分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)。在一個方面，本發明提供了其中含有本發明所述一種或多種拮抗劑以及載體的組合物。一個實施方案中，所述載體是藥物學上可接受的。在一個方面，本發明提供了編碼本發明所述c-met拮抗劑的核酸。一個實施方案中，本發明所述核酸編碼c-met拮抗劑，該拮抗劑是一種多肽或其中含有多肽(例如，低聚肽)。一個實施方案中，本發明所述核酸編碼c-met拮抗劑，該拮抗劑是或含有抗體或其片段。在一個方面，本發明提供了含有本發明所述核酸的載體。在一個方面，本發明提供了含有本發明所述核酸或本發明所述載體的宿主細胞。載體可以是任一類型，例如一種重組載體例如一種表達載體。眾多宿主細胞中的任意一種都可使用。一個實施方案中，宿主細胞是一種原核細胞，例如，大腸桿菌。一個實施方案中，宿主細胞是一種真核細胞，例如哺乳動物細胞如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞。在一個方面，本發明提供了用于制備本發明所述拮抗劑的方法。例如，本發明提供了一種制備本身是或含有抗體(或其片段)的c-met拮抗劑的方法，所述方法包括在合適的宿主細胞中表達編碼所述抗體(或其片段)的重組載體，然后回收所述抗體。另一實施例中，本發明提供了一種制備本身是或含有多肽(例如低聚肽)的c-met拮抗劑的方法，所述方法包括在合適的宿主細胞中表達編碼所述多肽(例如低聚肽)的重組載體，然后回收所述多肽(例如低聚肽)。一個方面，本發明提供了其中包括容器的制品；以及盛裝于該容器中的組合物，其中所述組合物含有一種或多種本發明所述c-met拮抗劑。一個實施方案中，所述組合物含有本發明所述的核酸。一個實施方案中，含拮抗劑的組合物進一步還含有載體，一些實施方案中該載體是藥物學可接受的。一個實施方案中，本發明所述的制品進一步還包括用于指導將組合物(例如，所述拮抗劑)施用至受試者的說明書。在一個方面，本發明提供了一種試劑盒，其中含有第一包裝物，該第一包裝物其中含有一種或多種本發明所述c-met拮抗劑；以及其中含緩沖液的第二包裝物。一個實施方案中，所述緩沖液是藥物學上可接受的。一個實施方案中，含拮抗劑的組合物進一步還含有載體，一些實施方案中該載體是藥物學可接受的。一個實施方案中，本發明所述的試劑盒進一步還包括用于指導將組合物(例如，所述拮抗劑)施用至受試者的說明書。在一個方面，本發明提供了本發明所述c-met拮抗劑在制備用于治療和/或預防疾病的藥物中的用途，例如癌癥、腫瘤、細胞增殖病癥、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相關病癥。所述c-met拮抗劑可以是本申請所述的任一形式，包括抗體、抗體片段、小分子(例如有機分子)、多肽(例如，低聚肽)、核酸(例如，寡核苷酸，如反義寡核苷酸)、適體，或其組合。在一個方面，本發明提供了本發明所述核酸在制備用于治療和/或預防疾病的藥物中的用途，例如癌癥、腫瘤、細胞增殖病癥、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相關病癥。在一個方面，本發明提供了本發明所述表達載體在制備用于治療和/或預防疾病的藥物中的用途，例如癌癥、腫瘤、細胞增殖病癥、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相關病癥。在一個方面，本發明提供了本發明所述宿主細胞在制備用于治療和/或預防疾病的藥物中的用途，例如癌癥、腫瘤、細胞增殖病癥、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相關病癥。在一個方面，本發明提供了本發明所述制品在制備用于治療和/或預防疾病的藥物中的用途，例如癌癥、腫瘤、細胞增殖病癥、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相關病癥。在一個方面，本發明提供了本發明所述試劑盒在制備用于治療和/或預防疾病的藥物中的用途，例如癌癥、腫瘤、細胞增殖病癥、免疫(例如自身免疫)病和/或血管生成-相關病癥。本發明提供了可用于調節與HGF/c-met信號轉導軸失調有關的疾病狀態的方法及組合物。所述HGF/c-met信號傳導途徑涉及多種生物學及生理功能，包括，例如，細胞增殖及血管生成。因此，，在一個方面，本發明提供了一種方法，其中包括向受試者施用能調節c-met胞外部分亞-結構域功能的物質/分子，從而調節HGF/c-met信號轉導。一個實施方案中，所述亞-結構域包含全部或至少一部分c-metSema結構域。在一個方面，本發明提供了一種能抑制c-met活化的細胞增殖的方法，該方法包括讓細胞或組織與有效量的本發明所述c-met拮抗劑接觸，從而抑制與c-met活化相關的細胞增殖。在一個方面，本發明提供了一種治療受試者與c-met活化失調相關的病理狀況的方法，該方法包括向受試者施用有效量的本發明所述c-met拮抗劑，從而治療該病理狀況。在一個方面，本發明提供了一種用于抑制表達c-met或肝細胞生長因子或兩者的細胞生長的方法，該方法包括讓所述細胞與本發明的c-met拮抗劑接觸，從而引發對所述細胞生長的抑制。一個實施方案中，所述細胞與不同細胞所表達的HGF接觸(例如，通過旁分泌作用)。一個方面，本發明提供了一種對哺乳動物進行治療性處理的方法，該哺乳動物患有含表達c-met或肝細胞生長因子或兩者的細胞的癌性腫瘤，所述方法包括向所述哺乳動物施用有效量的本發明所述c-met拮抗劑，從而有效治療所述哺乳動物。一個實施方案中，所述細胞與不同細胞所表達的HGF接觸(例如，通過旁分泌作用)。一個方面，本發明提供了一種治療或防止細胞增殖病癥的方法，該細胞增殖病癥與c-met表達或活性升高或者肝細胞生長加快或者兩者相關，所述方法包括向受試者施用有效量的本發明所述c-met拮抗劑，從而有效治療或防止所述細胞增殖病癥。一個實施方案中，所述增殖病癥是癌癥。一個方面，本發明提供了一種用于抑制細胞生長的方法，其中所述細胞生長至少部分地取決于c-met或肝細胞生長因子或兩者的生長加強作用，所述方法包括讓所述細胞與有效量的本發明所述c-met拮抗劑接觸，從而抑制所述細胞的生長。一個實施方案中，所述細胞與不同細胞所表達的HGF接觸(例如，通過旁分泌作用)。一種治療哺乳動物腫瘤的方法，其中所述腫瘤生長至少部分取決于c-met或肝細胞生長因子或兩者的生長加強作用，所述方法包括讓所述細胞與有效量的本發明所述c-met拮抗劑接觸，從而有效地治療所述腫瘤。一個實施方案中，所述細胞與不同細胞所表達的HGF接觸(例如，通過旁分泌作用)。本發明所述的方法可用于任一適合的病理狀態，例如，與HGF/c-met信號傳導途徑失調相關的細胞和/或組織。一個實施方案中，本發明所述方法中所靶向的細胞是一種癌細胞。例如所述癌細胞可以選自乳腺癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭狀癌細胞(例如，甲狀腺)、結腸癌細胞、胰腺癌細胞、卵巢癌細胞、宮頸癌細胞、中樞神經系統癌細胞、骨肉瘤細胞、腎臟癌細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、前列腺癌細胞、胃癌細胞、頭及頸部鱗狀癌細胞、淋巴瘤細胞、黑素瘤細胞以及血癌細胞。一個實施方案中，本發明所述方法中所靶向的細胞是一種高度增生性的(hyperproliferative)和/或增生性的(hyperplastic)細胞。一個實施方案中，本發明所述方法中所靶向的細胞是一種發育異常的細胞。另一個實施方案中，本發明所述方法中所靶向的細胞是一種轉移性的細胞。本發明所述方法還可以進一步包括補充處理步驟。例如，一個實施方案中，一種方法進一步還包括下述步驟讓靶細胞和/或組織(例如，癌細胞)經歷放療和/或化療。如本申請所述，c-met活化是一種重要的生物反應，它的失調會引發許多病理狀況。因此，本發明所述方法的一個實施方案中，所靶向的細胞(例如，癌細胞)是具有下述特征的細胞與相同組織來源的正常細胞相比，其中的c-met活化增強。一個實施方案中，本發明所述方法可引發靶細胞死亡。例如，與本發明的拮抗劑接觸可以導致細胞無法通過c-met途徑傳導信號，因而導致細胞死亡或細胞生長受到抑制。c-met活化(及因此而導致的信號傳導)的失調可以起因于多種細胞變化，包括，例如，HGF(c-met同源配體)和/或c-met本身的過表達。因此，一些實施方案中，本發明所述方法包括以具有下述特征的細胞為靶細胞與相同組織來源的正常細胞相比，該細胞所表達的c-met或肝細胞生長因子或兩者以更高豐度表達。c-met-表達細胞可以受到多種來源的HGF的調節，即以自分泌或旁分泌方式。例如，本發明所述方法的一個實施方案中，靶細胞與不同細胞中表達的或表達出的肝細胞生長因子接觸/結合(例如，通過旁分泌作用)。所述不同的細胞可以來自與靶細胞相同或不同的組織來源。一個實施方案中，靶細胞是與靶細胞本身表達的HGF接觸/結合(例如，通過自分泌作用/回路)。C-met活化和/或信號轉導還可以不依賴配體單獨發生。因此，在本發明所述方法的一個實施方案中，靶細胞中的c-met活化不依賴配體單獨發生。附圖簡述圖1.Met缺失突變體的簡圖從N-末端對Met胞外結構域進行了亞-結構域缺失，并在TM區后加了V5/His標簽。每一突變體的N-末端都附加了Met信號肽(S.P.)序列。縮寫對應含義如下Sema-semaphorin；PSI-plexin，semaphorin，整聯蛋白；plexins中的IPT-免疫球蛋白樣區及轉錄因子；和TM-跨膜。Sema區上的箭頭指向Met蛋白水解位點。圖2.Sema結構域是Met交聯所必需的A將Met缺失突變體轉染入293細胞，并與遞增濃度的硫代-EGS接觸。取10μg裂解物進行4-12％SDS-PAGE電泳分析，然后用V5抗體進行免疫印跡測試。EC-M代表單體EC-WT，EC-D代表二聚體的EC-WT。星號表示有未處理的EC-WT存在。B將EC-WT-Flag和EC-WT-V5/His轉染入293細胞，然后與遞增濃度的硫代-EGS接觸，裂解，用V5或Flag抗體免疫沉淀，然后進行8％SDS-PAGE電泳分析。將免疫沉淀樣本用Flag或V5抗體作免疫印跡分析。圖3.HGF和抗-Met抗體(本申請中稱為“5D5”)結合Met的Sema結構域A用指定的加有MetV5/His標簽的構建體轉染293細胞，用V5抗體免疫沉淀，4-12％SDS-PAGE電泳，用His抗體免疫印跡。B將A中得到的免疫沉淀物用5μgHGF孵育。將樣本進行4-12％SDS-PAGE電泳，然后用能識別α鏈的HGF抗體進行免疫印跡分析。加入10ngHGF作為陽性對照。CB中的免疫沉淀和免疫印跡都使用scHGF(R494E)進行。作為陽性對照，15ngscHGF(R494E)用樣本進行了分析。D用指定構建體轉染293細胞，4-12％SDS-PAGE電泳，用V5抗體進行免疫印跡分析。E將D中的轉染裂解物用抗-Met5D5抗體免疫沉淀，然后用His抗體進行免疫印跡分析。FB中的硝酸纖維素膜用MetC-12抗體再探測。圖4.腫瘤細胞系中內源c-Met的交聯向已經經受了血清-饑餓的293，H441，MDA-MB-435和A549細胞加入遞增濃度的硫代-EGS。交聯前，A549細胞再用100μg/mlHGF孵育。裂解物用MetC-12抗體作免疫印跡分析。帶有*的條帶表示未經處理的WT-Met。圖5.Met信號傳導被rSemar和抗-Met5D5-Fab抑制。Met的細胞外結構域可減弱Met信號傳導A將A549細胞維持在無血清的培養基，然后用0、5、10、50或100μg/ml的rSema加10ng/mlHGF處理10分鐘，用于磷酸-Met及磷酸-MAPK試驗。裂解物用MetC-12抗體免疫沉淀，用磷酸酪氨酸抗體免疫印跡檢測磷酸化的Met，然后用Met抗體免疫印跡。H441和MDA-MB-435細胞用0，5，10，或100μg/mlrSema加5或10ng/mlHGF分別處理5分鐘。蛋白質用磷酸-MAPK檢測，然后用MAPK抗體再探測。帶*的條帶代表未經處理的WT-Met。B對A中的數據用NIHImage軟件定量，然后繪制為左側的柱形圖，其中含有每一樣本之間磷酸化蛋白相對于非磷酸化蛋白的比例。右側圖表示的是來自另一實驗的數據。C將A549，H441和MDA-MB-435細胞維持在無血清培養，用10μg/mlrSema或抗-Met5D5-Fab處理。將這些樣本用磷酸酪氨酸、Met、磷酸-MAPK或MAPK抗體進行免疫印跡分析。標*的條帶表示未經處理的WT-Met。D將C中數據定量后，按照B中方法繪圖。E用指定構建體轉染A549細胞。通過用V5抗體免疫印跡，檢測Met變體的表達。標*的條帶表示未經處理的EC-WT。F(左)E中裂解物用MetC-12抗體免疫沉淀，然后用磷酸-酪氨酸抗體進行免疫印跡分析。印跡膜用Met抗體再探測。(右)裂解物用磷酸-MAPK免疫印跡分析，然后用MAPK再探測。G對F中的數據用NIHImage軟件定量，然后繪制為左側的柱形圖，其中含有每一樣本之間磷酸化蛋白相對于非磷酸化蛋白的比例。右側圖表示的是來自另一實驗的數據。每一幅圖中的柱形從左至右對應于F中的標出的泳道，分別為“模擬物”，“EC-WT”，“ΔS”，“ΔP”和“TM”。圖6.rSema和抗-Met5D5-Fab抑制細胞運動H441細胞劃痕，在無血清培養基中用模擬物，rSema，抗-Met5D5-Fab或HGF處理兩天。進行4次相互獨立的實驗，給出了有代表性的數據。圖7.細胞遷移被rSema和抗-Met5D5-Fab抑制將MDA-MB-435細胞種植于每一跨孔上部腔室無血清培養基中，并用模擬物、rSema、或抗-Met5D5-Fab處理。作為陽性對照，向模擬物-處理孔的下部腔室加入HGF。移動細胞用結晶紫染色。測量洗脫出的細胞的560nm處吸光度。3個獨立的移動試驗都一式兩份平行進行，并給出了代表性圖形。本發明的實施方式本發明提供了干擾HGF/c-met信號轉導軸從而治療和/或預防與所述軸失調相關病理狀況的方法。本發明至少部分地建立在下列發現基礎之上闡明本申請所述c-met內亞結構域/子序列是配體結合和/或c-met受體二聚化(以及由此導致的c-met活化)所必需的。本發明進一步還提供了可用于本發明所述方法的組合物、試劑盒及制品。本申請還提供了這些方法、組合物、試劑盒及制品的詳細描述。常規技術本發明的實施，除非另有說明外，都采用本領域技術人員已知的分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學及免疫學的常規技術。所述技術在多篇文獻中有充分的解釋，例如，“MolecularCloningALaboratoryManual”，secondedition(Sambrooketal.，1989)；“OligonucleotideSynthesis”(M.J.Gait，ed.，1984)；“AnimalCellCulture”(R.I.Freshney，ed.，1987)；“MethodsinEnzymology”(AcademicPress，Inc.)；“CurrentProtocolsinMolecularBiology”(F.M.Ausubeletal.，eds.，1987，andperiodicupdates)；“PCRThePolymeraseChainReaction”，(Mullisetal.，ed.，1994)；“APracticalGuidetoMolecularCloning”(PerbalBernardV.，1988)。定義就一種肽(例如，VDWVCFRDLGCDWEL，LDAQT，LTEKRKKRS，KPDSAEPM，NVRCLQHF)或多肽而言，″氨基酸序列同一性百分比(％)″的定義為在序列對齊以及必要時為實現最大百分比序列同一性而引入缺口(gap)后，候選序列中的與特異性肽或多肽序列之間相同的氨基酸殘基所占的百分比。為了測定氨基酸序列同一性百分比的對齊可以通過本領域已知的多種方式實現，例如使用公眾可獲得的計算機軟件例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟件。本領域技術人員可以確定適于測量對齊的參數，包括為實現所比較序列全長范圍的最大對齊所需的任一算法。但是，對于本申請目的而言，氨基酸序列同一性％數值可以使用序列比較的計算機程序ALIGN-2得到，其中ALIGN-2程序的全部源代碼見下表A。ALIGN-2序列比較計算機程序由Genentech，Inc.公司編制，表A中顯示的源代碼已經在U.S.CopyrightOffice，WashingtonD.C.，20559中以用戶文件備案，其美國版權登記號為No.TXU510087。ALIGN-2程序公眾可以從Genentech，Inc.，SouthSanFrancisco，California獲取，或者可以用下表A提供的源代碼編程。ALIGN-2程序應該編制為可用于UNIX操作系統，優選數字化的UNIXV4.0D。所有序列比較參數都用ALIGN-2程序設定，且不改變。在使用ALIGN-2進行氨基酸序列比較時，給定的氨基酸序列A與給定的氨基酸序列B之間的氨基酸序列同一性％(也可以表述為給定氨基酸序列A具有或包含與給定氨基酸序列B之間的一定％的氨基酸序列同一性)可以用下列公式計算100乘以X/Y的分數其中X是在A和B程序對齊結果中被序列對齊程序ALIGN-2評分為完全匹配的氨基酸殘基的數目，Y為序列B中的氨基酸殘基的總數。應該理解的是氨基酸序列A的長度并不等于氨基酸序列B的長度，A相對于B的氨基酸序列同一性％不等于B相對于A的氨基酸序列同一性％。除非另外專門說明，本申請中使用的所有氨基酸序列同一性％數值都是用ALIGN-2電腦程序在前段中描述的方法獲得的。表A/* * *C-C從12升至15 *Z為EQ的平均值 *B為ND的平均值 *matchwithstopis_M;stop-stop=0;J(joker)match=0 */ #define_M-8/*valueofamatchwithastop*/ int_day[26][26]={ /*ABCDEFGHIJKLMNOPQRSTUVWXYZ*/ /*A*/{2,0,-2,0,0,-4,1,-1,-1,0,-1,-2,-1,0,_M,1,0,-2,1,1,0,0,-6,0,-3,0}, /*B*/{0,3,-4,3,2,-5,0,1,-2,0,0,-3,-2,2,_M,-1,1,0,0,0,0,-2,-5,0,-3,1}, /*C*/{-2,-4,15,-5,-5,-4,-3,-3,-2,0,-5,-6,-5,-4,_M,-3,-5,-4,0,-2,0,-2,-8,0,0,-5}, /*D*/{0,3,-5,4,3,-6,1,1,-2,0,0,-4,-3,2,_M,-1,2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,2}, /*E*/{0,2,-5,3,4,-5,0,1,-2,0,0,-3,-2,1,_M,-1,2,-1,0,0,0,-2,-7,0,-4,3}, /*F*/{-4,-5,-4,-6,-5,9,-5,-2,1,0,-5,2,0,-4,_M,-5,-5,-4,-3,-3,0,-1,0,0,7,-5}, /*G*/{1,0,-3,1,0,-5,5,-2,-3,0,-2,-4,-3,0,_M,-1,-1,-3,1,0,0,-1,-7,0,-5,0}, /*H*/{-1,1,-3,1,1,-2,-2,6,-2,0,0,-2,-2,2,_M,0,3,2,-1,-1,0,-2,-3,0,0,2}, /*I*/{-1,-2,-2,-2,-2,1,-3,-2,5,0,-2,2,2,-2,_M,-2,-2,-2,-1,0,0,4,-5,0,-1,-2}, /*J*/{0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}, /*K*/{-1,0,-5,0,0,-5,-2,0,-2,0,5,-3,0,1,_M,-1,1,3,0,0,0,-2,-3,0,-4,0}, /*L*/{-2,-3,-6,-4,-3,2,-4,-2,2,0,-3,6,4,-3,_M,-3,-2,-3,-3,-1,0,2,-2,0,-1,-2}, /*M*/{-1,-2,-5,-3,-2,0,-3,-2,2,0,0,4,6,-2,_M,-2,-1,0,-2,-1,0,2,-4,0,-2,-1}, /*N*/{0,2,-4,2,1,-4,0,2,-2,0,1,-3,-2,2,_M,-1,1,0,1,0,0,-2,-4,0,-2,1}, /*O*/{_M,_M,_M，_M,_M,_M，_M，_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,0,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M,_M}, /*P*/{1,-1,-3,-1,-1,-5,-1,0,-2,0,-1,-3,-2,-1,_M,6,0,0,1,0,0,-1,-6,0,-5,0}, /*Q*/{0,1,-5,2,2,-5,-1,3,-2,0,1,-2,-1,1,_M,0,4,1,-1,-1,0,-2,-5,0,-4,3}, /*R*/{-2,0,-4,-1,-1,-4,-3,2,-2,0,3,-3,0,0,_M,0,1,6,0,-1,0,-2,2,0,-4,0}, /*S*/{1,0,0,0,0,-3,1,-1,-1,0,0,-3,-2,1,_M,1,-1,0,2,1,0,-1,-2,0,-3,0}, /*T*/{1,0,-2,0,0,-3,0,-1,0,0,0,-1,-1,0,_M,0,-1,-1,1,3,0,0,-5,0,-3,0}, /*U*/{0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0}, /*V*/{0,-2,-2,-2,-2,-1,-1,-2,4,0,-2,2,2,-2,_M,-1,-2,-2,-1,0,0,4,-6,0,-2,-2}, /*W*/{-6,-5,-8,-7,-7,0,-7,-3,-5,0,-3,-2,-4,-4,_M,-6,-5,2,-2,-5,0,-6,17,0,0,-6}, /*X*/{0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,_M,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0,0},<!--SIPO<DPn="15">--><dpn="d15"/> /*Y*/{-3,-3,0,-4,-4,7,-5,0,-1,0,-4,-1,-2,-2,_M,-5,-4,-4,-3,-3,0,-2,0,0,10,-4}, /*Z*/{0,1,-5,2,3,-5,0,2,-2,0,0,-2,-1,1,_M,0,3,0,0,0,0,-2,-6,0,-4,4} }; /* */ #include＜stdio.h＞ #include＜ctype.h＞ #defineMAXJMP16/*maxjumpsinadiag*/ #defineMAXGAP24/*don′tcontinuetopenalizegapslargerthanthis*/ #defineJMPS1024/*maxjmpsinanpath*/ #defineMX4/*saveifthere′satleastMX-1basessincelastjmp*/ #defineDMAT3/*valueofmatchingbases*/ #defineDMIS0/*penaltyformismatchedbases*/ #defineDINS08/*penaltyforagap*/ #defineDINS11/*penaltyperbase*/ #definePINS08/*penaltyforagap*/ #definePINS14/*penaltyperresidue*/ structjmp{ shortn[MAXJMP];/*sizeofjmp(negfordely)*/ unsignedshortx[MAXJMP];/*baseno.ofjmpinseqx*/ };/*limitsseqto2^16-1*/ structdiag{ intscore;/*scoreatlastjmp*/ longoffset;/*offsetofprevblock*/ shortijmp;/*currentjmpindex*/ structjmpjp;/*listofjmps*/ }; structpath{ intspc;/*numberofleadingspaces*/ shortn[JMPS];/*sizeofjmp(gap)*/ intx[JMPS];/*locofjmp(lastelembeforegap)*/ };<!--SIPO<DPn="16">--><dpn="d16"/> char*ofile;/*outputfilename*/ char*namex[2];/*seqnames:getseqs()*/ char*prog;/*prognameforerrmsgs*/ char*seqx[2];/*seqs:getseqs()*/ intdmax;/*bestdiag:nw()*/ intdmax0;/*finaldiag*/ intdna;/*setifdna:main()*/ intendgaps;/*setifpenalizingendgaps*/ intgapx,gapy;/*totalgapsinseqs*/ intlen0,len1;/*seqlens*/ intngapx,ngapy;/*totalsizeofgaps*/ intsmax;/*maxscore:nw()*/ int*xbm;/*bitmapformatching*/ longoffset;/*currentoffsetinjmpfile*/ structdiag*dx;/*holdsdiagonals*/ structpathpp[2];/*holdspathforseqs*/ char*calloc(),*malloc(),*index(),*strcpy(); char*getseq(),*g_calloc(); /*Needleman-Wunschalignmentprogram * *usage:progsfile1file2*其中file1和file2是兩個dna或兩個蛋白質序列。*序列可以大寫或小寫或者也可以大小寫同時使用*用′;′,′>′或′<′開頭的任一行都被忽略*最大filelength為65535(limitedbyunsignedshortxinthejmpstruct)*其1/3或更多的單元為ACGTU的序列判定為DNA*Outputisinthefile"align.out" * *Theprogrammaycreateatmpfilein/tmptoholdinfoabouttraceback. *OriginalversiondevelopedunderBSD4.3onavax8650 */ #include"nw.h" #include"day.h" static_dbval[26]={<!--SIPO<DPn="17">--><dpn="d17"/> 1,14,2,13,0,0,4,11,0,0,12,0,3,15,0,0,0,5,6,8,8,7,9,0,10,0 }; static_pbval[26]={ 1,2|(1＜＜(′D′-′A′))|(1＜＜(′N′-′A′)),4,8,16,32,64, 128,256,0xFFFFFFF,1＜＜10,1＜＜11,1＜＜12,1＜＜13,1＜＜14, 1＜＜15,1＜＜16,1＜＜17,1＜＜18,1＜＜19,1＜＜20,1＜＜21,1＜＜22, 1＜＜23,1＜＜24,1＜＜25|(1＜＜(′E′-′A′))|(1＜＜(′Q′-′A′)) }; main(ac,av) main intac; char*av[]; { prog=av; if(ac!=3){ fprintf(stderr,"usage:%sfile1file2\n",prog); fprintf(stderr,"wherefile1andfile2aretwodnaortwoproteinsequences.\n"); fprintf(stderr,"Thesequencescanbeinupper-orlower-case\n"); fprintf(stderr,"Anylinesbeginningwith′;′or′＜′areignored\n"); fprintf(stderr,"Outputisinthefile\"align.out\"\n"); exit(1); } namex=av[1]; namex[1]=av[2]; seqx=getseq(namex,&len0); seqx[1]=getseq(namex[1],&len1); xbm=(dna)_dbval:_pbval; endgaps=0;/*1topenalizeendgaps*/ ofile="align.out";/*outputfile*/ nw();/*fillinthematrix,getthepossiblejmps*/ readjmps();/*gettheactualjmps*/ print();/*printstats,alignment*/ cleanup(0);/*unlinkanytmpfiles*/<!--SIPO<DPn="18">--><dpn="d18"/> } /*dothealignment,returnbestscore:main() *dna:valuesinFitchandSmith,PNAS,80,1382-1386,1983 *pro:PAM250values *Whenscoresareequal,weprefermismatchestoanygap,prefer *anewgaptoextendinganongoinggap,andpreferagapinseqx *toagapinseqy. */ nw() nw { char*px,*py;/*seqsandptrs*/ int*ndely,*dely;/*keeptrackofdely*/ intndelx,delx;/*keeptrackofdelx*/ int*tmp;/*forswappingrow0,row1*/ intmis;/*scoreforeachtype*/ intins0,ins1;/*insertionpenalties*/ registerid;/*diagonalindex*/ registerij;/*jmpindex*/ register*col0,*col1;/*scoreforcurr,lastrow*/ registerxx,yy;/*indexintoseqs*/ dx=(structdiag*)g_calloc("togetdiags",len0+len1+1,sizeof(structdiag)); ndely=(int*)g_calloc("togetndely",len1+1,sizeof(int)); dely=(int*)g_calloc("togetdely",len1+1,sizeof(int)); col0=(int*)g_calloc("togetcol0",len1+1,sizeof(int)); col1=(int*)g_calloc("togetcol1",len1+1,sizeof(int)); ins0=(dna)DINS0:PINS0; ins1=(dna)DINS1:PINS1; smax=-10000; if(endgaps){ for(col0=dely=-ins0,yy=1;yy＜=len1;yy++){ col0[yy]=dely[yy]=col0[yy-1]-ins1; ndely[yy]=yy; }<!--SIPO<DPn="19">--><dpn="d19"/> col0=0;/*WatermanBullMathBiol84*/ } else for(yy=1;yy＜=len1;yy++) dely[yy]=-ins0; /*fillinmatchmatrix */ for(px=seqx,xx=1;xx＜=len0;px++,xx++){ /*initializefirstentryincol */if(endgaps){ if(xx==1) col1=delx=-(ins0+ins1); else col1=delx=col0-ins1; ndelx=xx; }else{ col1=0; delx=-ins0; ndelx=0; } ...nwfor(py=seqx[1],yy=1;yy＜=len1;py++,yy++){ mis=col0[yy-1]; if(dna) mis+=(xbm[*px-′A′]&xbm[*py-′A′])DMAT:DMIS; else mis+=_day[*px-′A′][*py-′A′]; /*updatepenaltyfordelinxseq; *favornewdeloverongongdel *ignoreMAXGAPifweightingendgaps */<!--SIPO<DPn="20">--><dpn="d20"/> if(endgaps||ndely[yy]＜MAXGAP){ if(col0[yy]-ins0＞=dely[yy]){ dely[yy]=col0[yy]-(ins0+ins1); ndely[yy]=1; }else{ dely[yy]-=ins1; ndely[yy]++; } }else{ if(col0[yy]-(ins0+ins1)＞=dely[yy]){ dely[yy]=col0[yy]-(ins0+ins1); ndely[yy]=1; }else ndely[yy]++; } /*updatepenaltyfordelinyseq; *favornewdeloverongongdel */ if(endgaps||ndelx＜MAXGAP){ if(col1[yy-1]-ins0＞=delx){ delx=col1[yy-1]-(ins0+ins1); ndelx=1; }else{ delx-=ins1; ndelx++; } }else{ if(col1[yy-1]-(ins0+ins1)＞=delx){ delx=col1[yy-1]-(ins0+ins1); ndelx=1; }else ndelx++; } /*pickthemaximumscore;we′refavoring *misoveranydelanddelxoverdely */<!--SIPO<DPn="21">--><dpn="d21"/> ...nw id=xx-yy+len1-1; if(mis＞=delx&&mis＞=dely[yy]) col1[yy]=mis; elseif(delx＞=dely[yy]){ col1[yy]=delx; ij=dx[id].ijmp; if(dx[id].jp.n&&(!dna||(ndelx＞=MAXJMP &&xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)||mis＞dx[id].score+DINS0)){ dx[id].ijmp++; if(++ij＞=MAXJMP){ writejmps(id); ij=dx[id].ijmp=0; dx[id].offset=offset; offset+=sizeof(structjmp)+sizeof(offset); } } dx[id].jp.n[ij]=ndelx; dx[id].jp.x[ij]=xx; dx[id].score=delx; } else{ col1[yy]=dely[yy]; ij=dx[id].ijmp; if(dx[id].jp.n&&(!dna||(ndely[yy]＞=MAXJMP &&xx＞dx[id].jp.x[ij]+MX)||mis＞dx[id].score+DINS0)){ dx[id].ijmp++; if(++ij＞=MAXJMP){ writejmps(id); ij=dx[id].ijmp=0; dx[id].offset=offset; offset+=sizeof(structjmp)+sizeof(offset); } } dx[id].jp.n[ij]=-ndely[yy];<!--SIPO<DPn="22">--><dpn="d22"/> dx[id].jp.x[ij]=xx; dx[id].score=dely[yy]; } if(xx==len0&&yy＜len1){ /*lastcol */ if(endgaps) col1[yy]-=ins0+ins1*(len1-yy); if(col1[yy]>smax){ smax=col1[yy]; dmax=id; } } } if(endgaps&&xx＜len0) col1[yy-1]-=ins0+ins1*(len0-xx); if(col1[yy-1]＞smax){ smax=col1[yy-1]; dmax=id; } tmp=col0;col0=col1;col1=tmp; } (void)free((char*)ndely); (void)free((char*)dely); (void)free((char*)col0); (void)free((char*)col1);} /* * *print()--onlyroutinevisibleoutsidethismodule * *static: *getmat()--tracebackbestpath,countmatches:print() *pr_align()--printalignmentofdescribedinarrayp[]:print() *dumpblock()--dumpablockoflineswithnumbers,stars:pr_align() *nums()--putoutanumberline:dumpblock() *putline()--putoutaline(name,[num],seq,[num]):dumpblock() *stars()--putalineofstars:dumpblock()<!--SIPO<DPn="23">--><dpn="d23"/> *stripname()--stripanypathandprefixfromaseqname */ #include"nw.h" #defineSPC3 #defineP_LINE256/*maximumoutputline*/ #defineP_SPC3/*spacebetweennameornumandseq*/ extern_day[26][26]; intolen;/*setoutputlinelength*/ FILE*fx;/*outputfile*/ print() print { intlx,ly,firstgap,lastgap;/*overlap*/ if((fx=fopen(ofile,"w"))==0){ fprintf(stderr,"%s:can′twrite%s\n",prog,ofile); cleanup(1); } fprintf(fx,"＜firstsequence:%s(length=%d)\n",namex,len0); fprintf(fx,"＜secondsequence:%s(length=%d)\n",namex[1],len1); olen=60; lx=len0; ly=len1; firstgap=lastgap=0; if(dmax＜len1-1){/*leadinggapinx*/ pp.spc=firstgap=len1-dmax-1; ly-=pp.spc; } elseif(dmax＞len1-1){/*leadingggapiny*/ pp[1].spc=firstgap=dmax-(len1-1); lx-=pp[1].spc; } if(dmax0＜len0-1){/*trailinggapinx*/ lastgap=len0-dmax0-1;<!--SIPO<DPn="24">--><dpn="d24"/> lx-=lastgap; } elseif(dmax0＞len0-1){/*trailinggapiny*/ lastgap=dmax0-(len0-1); ly-=lastgap; } getmat(lx,ly,firstgap,lastgap); pr_align(); } /* *tracebackthebestpath,countmatches */ static getmat(lx,ly,firstgap,lastgap) getmat intlx,ly;/*"core"(minusendgaps)*/ intfirstgap,lastgap;/*leadingtrailingoverlap*/ { intnm,i0,i1,siz0,siz1; charoutx[32]; doublepct; registern0,n1; registerchar*p0,*p1; /*gettotalmatches,score */ i0=i1=siz0=siz1=0; p0=seqx+pp[1].spc; p1=seqx[1]+pp.spc; n0=pp[1].spc+1; n1=pp.spc+1; nm=0; while(*p0&&*p1){ if(siz0){ p1++; n1++;<!--SIPO<DPn="25">--><dpn="d25"/> siz0--; } elseif(siz1){ p0++; n0++; siz1--; } else{ if(xbm[*p0-′A′]&xbm[*p1-′A′]) nm++; if(n0++==pp.x[i0]) siz0=pp.n[i0++]; if(n1++==pp[1].x[i1]) siz1=pp[1].n[i1++]; p0++; p1++; } } /*pcthomology: *ifpenalizingendgaps,baseistheshorterseq *else,knockoffoverhangsandtakeshortercore */ if(endgaps) lx=(len0＜len1)len0:len1; else lx=(lx＜ly)lx:ly; pct=100.*(double)nm/(double)lx; fprintf(fx,"\n"); fprintf(fx,"＜%dmatch%sinanoverlapof%d:%.2fpercentsimilarity\n", nm,(nm==1)"":"es",lx,pct); fprintf(fx,"＜gapsinfirstsequence:%d",gapx);...getmat if(gapx){ (void)sprintf(outx,"(%d%s%s)", ngapx,(dna)"base":"residue",(ngapx==1)"":"s");<!--SIPO<DPn="26">--><dpn="d26"/> fprintf(fx,"%s",outx); fprintf(fx,",gapsinsecondsequence:%d",gapy); if(gapy){ (void)sprintf(outx,"(%d%s%s)", ngapy,(dna)"base":"residue",(ngapy==1)"":"s"); fprintf(fx,"%s",outx); } if(dna) fprintf(fx, "\n＜score:%d(match=%d,mismatch=%d,gappenalty=%d+%dperbase)\n", smax,DMAT,DMIS,DINS0,DINS1); else fprintf(fx, "\n＜score:%d(DayhoffPAM250matrix,gappenalty=%d+%dperresidue)\n", smax,PINS0,PINS1); if(endgaps) fprintf(fx, "＜endgapspenalized.leftendgap:%d%s%s,rightendgap:%d%s%s\n", firstgap,(dna)"base":"residue",(firstgap==1)"":"s", lastgap,(dna)"base":"residue",(lastgap==1)"":"s"); else fprintf(fx,"＜endgapsnotpenalized\n"); } staticnm;/*matchesincore--forchecking*/ staticlmax;/*lengthsofstrippedfilenames*/ staticij[2];/*jmpindexforapath*/ staticnc[2];/*numberatstartofcurrentline*/ staticni[2];/*currentelemnumber--forgapping*/ staticsiz[2]; staticchar*ps[2];/*ptrtocurrentelement*/ staticchar*po[2];/*ptrtonextoutputcharslot*/ staticcharout[2][P_LINE];/*outputline*/ staticcharstar[P_LINE];/*setbystars()*/ /* *printalignmentofdescribedinstructpathpp[]<!--SIPO<DPn="27">--><dpn="d27"/> */ static pr_align() pr_align { intnn;/*charcount*/ intmore; registeri; for(i=0,1max=0;i＜2;i++){ nn=stripname(namex[i]); if(nn＞lmax) lmax=nn; nc[i]=1; ni[i]=1; siz[i]=ij[i]=0; ps[i]=seqx[i]; po[i]=out[i];} for(nn=nm=0,more=1;more;) {...pr_align for(i=more=0;i＜2;i++){ /* *dowehavemoreofthissequence */ if(!*ps[i]) continue; more++; if(pp[i].spc){/*leadingspace*/ *po[i]++=′′; pp[i].spc--; } elseif(siz[i]){/*inagap*/ *po[i]++=′-′;<!--SIPO<DPn="28">--><dpn="d28"/> siz[i]--; } else{/*we′reputtingaseqelement */ *po[i]=*ps[i]; if(islower(*ps[i])) *ps[i]=toupper(*ps[i]); po[i]++; ps[i]++; /* *areweatnextgapforthisseq */ if(ni[i]==pp[i].x[ij[i]]){ /* *weneedtomergeallgaps *atthislocation */ siz[i]=pp[i].n[ij[i]++]; while(ni[i]==pp[i].x[ij[i]]) siz[i]+=pp[i].n[ij[i]++]; }ni[i]++; } } if(++nn==olen||!more&&nn){ dumpblock(); for(i=0;i＜2;i++) po[i]=out[i]; nn=0; } } } /* *dumpablockoflines,includingnumbers,stars:pr_align() */ static<!--SIPO<DPn="29">--><dpn="d29"/> dumpblock() dumpblock { registeri; for(i=0;i＜2;i++) *po[i]--=′\0′; ...dumpblock (void)putc(′\n′,fx); for(i=0;i＜2;i++){ if(*out[i]&&(*out[i]！=′′||*(po[i])！=′′)){ if(i==0) nums(i); if(i==0&&*out[1]) stars(); putline(i); if(i==0&&*out[1]) fprintf(fx,star); if(i==1) nums(i); } } } /* *putoutanumberline:dumpblock() */ static nums(ix) nums intix;/*indexinout[]holdingseqline*/ { charnline[P_LINE]; registeri,j; registerchar*pn,*px,*py;<!--SIPO<DPn="30">--><dpn="d30"/> for(pn=nline,i=0;i＜1max+P_SPC;i++,pn++) *pn=′′; for(i=nc[ix],py=out[ix];*py;py++,pn++){ if(*py==′′||*py==′-′) *pn=′′; else{ if(i%10==0||(i==1&&nc[ix]!=1)){ j=(i＜0)-i:i; for(px=pn;j;j/=10,px--) *px=j%10+′0′; if(i＜0) *px=′-′; } else *pn=′′; i++; } } *pn=′\0′; nc[ix]=i; for(pn=nline;*pn;pn++) (void)putc(*pn,fx); (void)putc(′\n′,fx); } /* *putoutaline(name,[num],seq,[num]):dumpblock() */ static putline(ix) putline intix;{ ...putline inti; registerchar*px;<!--SIPO<DPn="31">--><dpn="d31"/> for(px=namex[ix],i=0;*px&&*px!=′:′;px++,i++) (void)putc(*px,fx); for(;i＜lmax+P_SPC;i++) (void)putc(′′,fx); /*thesecountfrom1: *ni[]iscurrentelement(from1) *nc[]isnumberatstartofcurrentline */ for(px=out[ix];*px;px++) (void)putc(*px&0x7F,fx); (void)putc(′\n′,fx); } /* *putalineofstars(seqsalwaysinout,out[1]):dumpblock() */ static stars() stars { inti; registerchar*p0,*p1,cx,*px; if(!*out||(*out==′′&&*(po)==′′)|| !*out[1]||(*out[1]==′′&&*(po[1])==′′)) return; px=star; for(i=lmax+P_SPC;i;i--) *px++=′′; for(p0=out,p1=out[1];*p0&&*p1;p0++,p1++){ if(isalpha(*p0)&&isalpha(*p1)){ if(xbm[*p0-′A′]&xbm[*p1-′A′]){ cx=′*′; nm++;<!--SIPO<DPn="32">--><dpn="d32"/> } elseif(!dna&&_day[*p0-′A′][*p1-′A′]＞0) cx=′.′; else cx=′′; } else cx=′′; *px++=cx; } *px++=′\n′; *px=′\0′; } /* *strippathorprefixfrompn,returnlen:pr_align() */ static stripname(pn) stripname char*pn;/*filename(maybepath)*/ { registerchar*px,*py; py=0; for(px=pn;*px;px++) if(*px==′/′) py=px+1; if(py) (void)strcpy(pn,py); return(strlen(pn)); } /* *cleanup()--cleanupanytmpfile<!--SIPO<DPn="33">--><dpn="d33"/> *getseq()--readinseq,setdna,len,maxlen *g_calloc()--calloc()witherrorcheckin *readjmps()--getthegoodjmps,fromtmpfileifnecessary *writejmps()--writeafilledarrayofjmpstoatmpfile:nw() */ #include"nw.h" #include＜sys/file.h＞ char*jname="/tmp/homgXXXXXX";/*tmpfileforjmps*/ FILE*fj; intcleanup();/*cleanuptmpfile*/ longlseek(); /* *removeanytmpfileifweblow */ cleanup(i) cleanup inti; { if(fj) (void)unlink(jname); exit(i); } /* *read,returnptrtoseq,setdna,len,maxlen *skiplinesstartingwith′;′,′＜′,or′＞′ *seqinupperorlowercase */ char* getseq(file,len) getseq char*file;/*filename*/ int*len;/*seqlen*/ { charline[1024],*pseq;<!--SIPO<DPn="34">--><dpn="d34"/> registerchar*px,*py; intnatgc,tlen; FILE*fp; if((fp=fopen(file,"r"))==0){ fprintf(stderr,"%s:can′tread%s\n",prog,file); exit(1); } tlen=natgc=0; while(fgets(line,1024,fp)){ if(*line==′;′||*line==′＜′||*line==′＞′) continue; for(px=line;*px!=′\n′;px++) if(isupper(*px)||islower(*px)) tlen++; } if((pseq=malloc((unsigned)(tlen+6)))==0){ fprintf(stderr,"%s:malloc()failedtoget%dbytesfor%s\n",prog,tlen+6,file); exit(1); } pseq=pseq[1]=pseq[2]=pseq[3]=′\0′; ...getseq py=pseq+4; *len=tlen; rewind(fp); while(fgets(line,1024,fp)){ if(*line==′;′||*line==′＜′||*line==′＞′) continue; for(px=line;*px!=′\n′;px++){ if(isupper(*px)) *py++=*px; elseif(islower(*px)) *py++=toupper(*px); if(index("ATGCU",*(py-1))) natgc++;<!--SIPO<DPn="35">--><dpn="d35"/> } } *py++=′\0′; *py=′\0′; (void)fclose(fp); dna=natgc＞(tlen/3); return(pseq+4); } char* g_calloc(msg,nx,sz) g_calloc char*msg;/*program,callingroutine*/ intnx,sz;/*numberandsizeofelements*/ { char*px,*calloc(); if((px=calloc((unsigned)nx,(unsigned)sz))==0){ if(*msg){ fprintf(stderr,"%s:g_calloc()failed%s(n=%d,sz=%d)\n",prog,msg,nx,sz); exit(1); } } return(px); } /* *getfinaljmpsfromdx[]ortmpfile,setpp[],resetdmax:main() */ readjmps() readjmps { intfd=-1; intsiz,i0,i1; registeri,j,xx; if(fj){ (void)fclose(fj);<!--SIPO<DPn="36">--><dpn="d36"/> if((fd=open(jname,O_RDONLY,0))＜0){ fprintf(stderr,"%s:can′topen()%s\n",prog,jname); cleanup(1); } } for(i=i0=i1=0,dmax0=dmax,xx=len0;;i++){ while(1){ for(j=dx[dmax].ijmp;j＞=0&&dx[dmax].jp.x[j]＞=xx;j--) ; ...readjmps if(j＜0&&dx[dmax].offset&&fj){ (void)lseek(fd,dx[dmax].offset,0); (void)read(fd,(char*)&dx[dmax].jp,sizeof(structjmp)); (void)read(fd,(char*)&dx[dmax].offset,sizeof(dx[dmax].offset)); dx[dmax].ijmp=MAXJMP-1; } else break; } if(i＞=JMPS){ fprintf(stderr,"%s:toomanygapsinalignment\n",prog); cleanup(1); } if(j＞=0){ siz=dx[dmax].jp.n[j]; xx=dx[dmax].jp.x[j]; dmax+=siz; if(siz＜0){/*gapinsecondseq*/ pp[1].n[i1]=-siz; xx+=siz; /*id=xx-yy+len1-1 */ pp[1].x[i1]=xx-dmax+len1-1' gapy++; ngapy-=siz; /*ignoreMAXGAPwhendoingendgaps*/<!--SIPO<DPn="37">--><dpn="d37"/> siz=(-siz＜MAXGAP||endgaps)-siz:MAXGAP; i1++; } elseif(siz＞0){/*gapinfirstseq*/ pp.n[i0]=siz; pp.x[i0]=xx; gapx++; ngapx+=siz; /*ignoreMAXGAPwhendoingendgaps*/ siz=(siz＜MAXGAP||endgaps)siz:MAXGAP; i0++; } } else break; } /*reversetheorderofjmps */ for(j=0,i0--;j＜i0;j++,i0--){ i=pp.n[j];pp.n[j]=pp.n[i0];pp.n[i0]=i; i=pp.x[j];pp.x[j]=pp.x[i0];pp.x[i0]=i; } for(j=0,i1--;j＜i1;j++,i1--){ i=pp[1].n[j];pp[1].n[j]=pp[1].n[i1];pp[1].n[i1]=i; i=pp[1].x[j];pp[1].x[j]=pp[1].x[i1];pp[1].x[i1]=i; } if(fd＞=0) (void)close(fd); if(fj){ (void)unlink(jname); fj=0; offset=0; }} /* *writeafilledjmpstructoffsetoftheprevone(ifany):nw()<!--SIPO<DPn="38">--><dpn="d38"/> */ writejmps(ix) writejmps intix; { char*mktemp(); if(!fj){ if(mktemp(jname)＜0){ fprintf(stderr,"%s:can′tmktemp()%s\n",prog,jname); cleanup(1); } if((fj=fopen(jname,"w"))==0){ fprintf(stderr,"%s:can′twrite%s\n",prog,jname); exit(1); } } (void)fwrite((char*)&dx[ix].jp,sizeof(structjmp),1,fj); (void)fwrite((char*)&dx[ix].offset,sizeof(dx[ix].offset),1,fj);在本申請中術語″載體″，是指一種能夠輸送與其連接在一起的另一種核酸的核酸分子。載體的一種類型是″質粒″，是指一種可以接入其他DNA節段的環狀雙股脫氧核糖核酸環。另一類型載體是噬菌體載體。另一類型載體是一種病毒載體，其中可以將其他的脫氧核糖核酸連接入該病毒的基因組。一些載體能夠在其所導入的宿主細胞內自動復制(例如，具有細菌復制起點的細菌載體和游離的哺乳動物載體)。其他載體(例如，非游離的哺乳動物載體)當導入所述宿主細胞時可以整合入宿主細胞的基因組中，從而隨宿主基因組一同復制。另外，一些載體能指導可操作地連接于其上的基因的表達。本申請中所述的載體可稱為″重組表達載體″(或簡稱″重組載體″)。一般而言，重組DNA技術中使用的表達載體通常為質粒形式。本申請中，“質粒”和“載體”可以交互使用，因為質粒是載體的最常見形式。“多核苷酸”和“核酸”在本申請中可以交互使用，是指任一長度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經過修飾的核苷酸或堿基、和/或其類似物，或者可以通過DNA或RNA聚合酶或者通過合成反應引入聚合物的任一取代物。多核苷酸可以包括經過修飾的核苷酸，例如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對核苷酸結構的修飾可以在所述聚合物裝配之前或之后加入。所述核苷酸序列可以被非-核苷酸組分阻斷。多核苷酸還可以在合成后修飾，例如通過與標記物偶聯。其他類型的修飾包括，例如，″帽子″，將一個或多個天然生成核苷酸用類似物取代，核苷酸之間修飾例如，含不帶電連接(例如，甲基膦酸酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidates)，氨基甲酸酯，等)和含帶電連接(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，等)的修飾，含有附加基元，例如，蛋白質(例如，核酸酶、毒素、抗體、信號肽、ply-L-賴氨酸，等)的修飾，帶有嵌入劑(例如，吖啶，補骨脂素，等)的修飾，含有螯合劑(例如，金屬，放射性金屬，硼，氧化的金屬等)的修飾，含有烷化劑(alkylators)的修飾，帶有經修飾連接(例如，α端基異構核酸(anomericnucleicacid)，等)的修飾，以及未經修飾形式的多核苷酸。另外，通常出現于糖類的任一羥基可以用例如膦酸(phosphonate)基團、磷酸(phosphate)基團取代，用常見保護基保護，或者經過活化制備與其他核苷酸間的其他連接，或者可以偶聯至固相或半固相支持物。5′和3′末端的OH可以用長度為1-20個碳原子的胺或有機封端基團(organiccappinggroup)磷酸化或取代。另外還可以將其他羥基衍生至常規的保護基。多核苷酸還可以含有本領域普遍已知的核糖或脫氧核糖糖類的類似形式，包括，例如，2′-氧-甲基，2′-氧-烯丙基，2′-烯丙基-，2′-氟-或2′-疊氮基核糖，碳環形的糖類似物，α-端基異構糖，差向立體異構糖例如阿拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，非環形的類似物以及脫堿基的核苷類似物例如甲基核糖核苷。可以用其他連接基團替代一個或多個磷酸二酯鍵。這些其他的連接基團包括但不限于這樣的實例，其中磷酸酯基被P(O)S(″硫代酸酯基(thioate)″)，P(S)S(″二硫代酸酯基(dithioate)″)，″(O)NR2(″酰胺基團(amidate)″)，P(O)R，P(O)OR′，COCH2(″formacetal″)替代，其中R或R′各自獨立地為H或者取代或未被取代的烷基(1-20個C)，任選含有醚(-O-)鍵、芳香基、鏈烯基、環烷基、環烯基(cycloalkenyl)或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有連接都必需是相同的。上述描述適用于所有本申請所述多核苷酸，包括RNA及DNA。在本申請中“寡核苷酸”通常是指單鏈，一般為合成的多核苷酸，其長度往往但非一定小于約200個核苷酸。術語″寡核苷酸″和″多核苷酸″互不排斥。上述對多核苷酸的描述同樣且完全適合于寡核苷酸。在本申請中，除非另有特別說明或者據上下文明顯看出外，術語“肝細胞生長因子”或“HGF”是指任一天然的或變體(其中包括天然生成的或合成的)HGF多肽，其能在允許該反應發生的條件下活化HGF/c-met信號傳導途徑。術語“抗體”和“免疫球蛋白”廣義上可以交互使用，包括單克隆抗體(例如，全長或者完整的單克隆抗體)、多克隆抗體、單價抗體、多價抗體、多特異性抗體(例如，迄今為止能表現預期生物活性的雙特異性抗體)以及抗體片段。抗體可以是人抗體、人源化抗體和/或親和力成熟(affinitymatured)抗體。“抗體片段”只含有完整抗體的一部分，其中所述的部分優選保留了當其正常情況下存在于完整抗體時與其相關功能中的至少一種，優選多種或全部。一個實施方案中，抗體片段含有完整抗體的抗原結合位點，因此保留了結合抗原的能力。另一個實施方案中，抗體片段，例如其中含有Fc區的抗體片段，保留了當正常情況下存在于完整抗體中的與Fc區相關生物學功能中的至少一種，例如與FcRn結合，抗體半衰期調節，ADCC功能及補體結合功能。在本申請中術語″單克隆抗體″是指獲自基本均一的抗體群體的抗體，即，除了可能有的極少量天然發生的突變外，組成所述群的抗體個體都完全相同。單克隆抗體是高度特異性的，針對單一的抗原。另外，與通常包括針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制劑不同，每一種單克隆抗體都只針對所述抗原上的單一決定簇。本申請中所述的單克隆抗體具體性地包括″嵌合″抗體，其中重鏈和/或輕鏈中的一部分與源自一個特定物種或者屬于一個特定抗體類或亞類的抗體的對應序列等同或同源，其中重鏈和/或輕鏈中的其余部分與源自另一特定物種或者屬于另一特定抗體類或亞類的抗體的對應序列等同或同源，以及所述抗體的片段，只要它們具有預期的生物活性即可(美國專利No.4,816,567；和Morrisonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA816851-6855(1984))。非-人(例如，鼠的)抗體的“人源化”形式是含有最小限度的源自非-人免疫球蛋白序列的嵌合抗體。大部分來說，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受抗體)，其中該接受抗體的高變區被來自非-人物種的高變區(供體抗體)的殘基所取代，例如小鼠、大鼠、兔、非人靈長類，所述來自非-人物種的高變區具有期望的特異性、親和力、和能力(capacity)。在一些情況下，人免疫球蛋白的骨架區(FR)殘基用相應的非-人殘基替代。另外，人源化抗體還可以包含在接受抗體或提供抗體中都未發現的殘基。這些修飾進一步地優化了抗體的性能。通常，所述人源化抗體都基本上包含至少一個，通常為兩個可變區，其中的全部或者基本上全部的高變環出自非-人免疫球蛋白，而全部或基本上全部的骨架區(FR)為人免疫球蛋白序列。另外，所述人源化抗體還任選包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(Fc)，通常為人免疫球蛋白恒定區。詳細內容，參見Jonesetal.，Nature321522-525(1986)；Riechmannetal.，Nature332323-329(1988)；andPresta，Curr.Op.Struct.Biol.2593-596(1992)。另外還可參見下列綜述及本申請中所引參考文獻VaswaniandHamilton，Ann.Allergy，Asthma&Immunol.1105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions231035-1038(1995)；HurleandGross，Curr.Op.Biotech.5428-433(1994)。“人的抗體”是指這樣的抗體，其具有的氨基酸序列對應于通過人制備的和/或使用本申請中公開的用于制備人抗體的任一技術制備的抗體。人的抗體這一定義專門將含有非-人抗原-結合殘基的人源化抗體排除出去。“親和力成熟”抗體是指一個或多個CDRs中有一處或多處變化的抗體，變化導致該抗體的抗原親和力提高，與不含這些變化的親本抗體相比。優選的親和力成熟抗體具有納摩爾或者甚至皮摩爾的目標抗原親和力。親和力成熟抗體可以用本領域已知的方法制備。Marksetal.Bio/Technology10779-783(1992)描述了通過VH及VL結構域改組(shuffling)的親和力成熟。CDR和/或骨架殘基的隨機誘變的描述見Barbasetal.ProcNat.Acad.Sci，USA913809-3813(1994)；Schieretal.Gene169147-155(1995)；Yeltonetal.J.Immunol.1551994-2004(1995)；Jacksonetal.，J.Immunol.154(7)3310-9(1995)；andHawkinsetal，J.Mol.Biol.226889-896(1992)。術語“拮抗劑”在本申請中取其最廣含義，包括能部分或完全封閉、抑制或中和其靶標(例如，c-met)的一種或多種生物學活性的任一分子。例如，“封閉”抗體或“拮抗劑”抗體是指能抑制或減弱其所結合抗原(例如，c-met)的生物活性的抗體。“病癥”是指能從使用本發明所述物質/分子或方法的治療中受益的任一狀況。其中包括慢性和急性的病癥或疾病，包括預先讓所述哺乳動物患所述病癥的那些病理學情況。本申請中所治療病癥的非限制性實例包括惡性及良性腫瘤；非-血癌及淋巴的惡性腫瘤；神經元的、神經膠質的、星形膠質細胞的、下丘腦的以及其他腺體的，巨噬細胞的，上皮的，間質的和囊胚腔的病癥；以及炎癥的、免疫學的及其他的血管生成-相關病癥。所述術語″癌癥″和″癌性的″是指或者用來描述通常以無限制的細胞生長/增殖為特征的哺乳動物生理狀態。癌癥的實例包括但不限于，癌、淋巴瘤、胚細胞瘤(blastoma)、肉瘤和血癌(leukemia)。所述癌癥的更具體的實例包括鱗狀細胞癌、小-細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝細胞癌、胃腸道癌、胰腺癌、惡性膠質瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、陰道癌、甲狀腺癌、肝細胞癌和各種頭頸癌。本申請中的“自體免疫病”是指以自體組織作為攻擊目標引發的非-惡性疾病或病癥。本申請中所述自體免疫疾病專門將惡性的或癌性的疾病或狀況排除在外，尤其要排除B細胞淋巴瘤、急性淋巴母細胞性白血病(ALL)、慢性淋巴細胞性白血病(CLL)、多毛細胞白血病和慢性成髓細胞白血病。自體免疫疾病或病癥的實例包括，但不限于，炎性反應例如炎性皮膚疾病包括牛皮癬和皮炎(例如特應性皮炎)；系統性硬皮病和硬化癥；炎癥性腸病(例如克羅恩氏病和潰瘍性結腸炎)相關反應；呼吸窘迫綜合征(包括成人呼吸窘迫綜合征；ARDS)；皮炎；腦膜炎；腦炎；葡萄膜炎；結腸炎；血管球性腎炎；過敏情況例如濕疹和哮喘及涉及T細胞浸潤和慢性炎性反應的其他情況；動脈粥樣硬化；白細胞粘附缺陷；類風濕關節炎；全身性紅斑狼瘡(系統性紅斑狼瘡)；糖尿病(例如I型糖尿病或胰島素依賴型糖尿病mellitis)；多發性硬化；Reynaud′s綜合征；自體免疫甲狀腺炎；變態反應性腦脊髓炎；Sjorgen′s綜合征；青少年型糖尿病；常見于肺結核、結節病、多肌炎、肉芽腫病和脈管炎的與細胞因子或T-淋巴細胞介導的急性及遲發性過敏反應相關的免疫應答；惡性貧血(Addison’s病)；白細胞滲出疾病；中樞神經系統(CNS)炎性病癥；多器官損傷綜合征；溶血性貧血(包括但不限于冷球蛋白血癥或Coombs陽性貧血)；重癥肌無力；抗原抗體復合物介導疾病；抗-腎小球基底膜疾病；抗磷脂綜合征；過敏性神經炎；Graves’疾病；Lambert-Eaton類重癥肌無力綜合征；pemphigoidbullous；天皰瘡；自體免疫多(種)內分泌腺病；Reiter’s疾病；全身肌強直綜合征(stiff-mansyndrome)；Behcet病；巨細胞性動脈炎；免疫復合物性腎炎；IgA腎病；IgM多神經病；免疫性血小板減少性紫癜(ITP)或自體免疫血小板減少等等。在本申請中，“治療”是指臨床介入以求改變所治療個體或細胞的天然過程，并且可以用于預防或臨床病理學過程中。治療的預期效果包括防止疾病的發生或再發生，減輕癥狀，消除任一疾病的直接或間接病理結果，防止轉移，延緩病癥發展速度，改善或緩和疾病狀態，減輕或改善預后。一些實施方案中，本發明所述拮抗劑可用于延緩疾病或病癥發展。″有效量″是指在一次或一段時間內服用的實現預期治療或預防效果所需的量。本發明所述拮抗劑的治療有效量隨疾病狀況、年齡、性別和個體重量以及拮抗劑激發個體目的反應的能力等因素不同而變化。另外治療有效量還指所述拮抗劑的治療有益效果超過其任一毒性或有害影響的量。″預防有效量″是指以一種或多種劑量方式或在一種段時間內施用的實現預期預防效果所需的量。通常但非一定，由于預防劑量是用于疾病早期的受試者，因此預防有效量小于治療有效量。載體構建編碼本申請所述多肽的多核苷酸序列可以使用常規重組技術獲得。目的多核苷酸序列可以從合適來源的細胞中分離并測序。抗體的來源細胞包括抗體產生細胞例如雜交瘤細胞。替代地，多核苷酸可以使用核苷酸合成儀或PCR技術合成。一旦獲得，將編碼所述多肽的序列插入能夠在宿主細胞中復制并表達異源多核苷酸的重組載體。本領域可獲得的和已知的許多載體可用于本發明。合適載體的選擇主要取決于插入載體中核酸的大小以及該載體預轉化的特定宿主細胞。每一載體可含有不同元件，取決于其功能(擴增或表達異源多核苷酸，或者同時擴增和表達)以及其所要駐留的特定宿主細胞的兼容性。所述載體元件通常包括，但不限于復制起點(特別是當所述載體插入原核細胞時)，篩選標記基因，啟動子，核糖體結合位點(RBS)，信號序列，所插入的異源核酸以及轉錄終止序列。通常，含有復制子和源自于與宿主細胞相容的調控序列的質粒載體用于這些所述宿主。所述載體通常帶有復制位點，以及能在轉化細胞中提供表型選擇的標記序列。例如，大腸桿菌通常用pBR322，一種源自大腸桿菌的質粒轉化。pBR322含有編碼氨芐青霉素(Amp)和四環素(Tet)抗性的基因，因此能提供用于鑒定轉化細胞的簡易方式。pBR322及其衍生物或者其他微生物質粒或噬菌體還可以含有或者經過修飾后含有能夠被用于表達內源蛋白的微生物使用的啟動子。此外，還可以使用含與宿主微生物相容的復制子及調控序列的噬菌體載體作為這些宿主的轉化載體。例如，噬菌體例如λGEM.TM.-11可用于制備能用于轉化敏感宿主細胞例如大腸桿菌LE392的重組載體。組成型或誘導型啟動子都可用于本發明，本領域技術人員可以根據具體情況需要選擇。被多種有效宿主細胞識別的大量啟動子都已為大家所熟知。可以通過下述操作將所選啟動子可操作地連接于編碼本申請所述多肽的順反子DNA通過限制性內切酶消化切除來源于DNA源的啟動子，將分離的啟動子序列插入所選載體。天然啟動子序列和多種異源啟動子都可用于直接擴增和/或表達靶基因。但是，優選異源啟動子，因為與天然目標多肽啟動子相比，異源啟動子通常能提供更高的轉錄和表達量。適合于原核宿主的啟動子包括PhoA啟動子、β-galactamase及乳糖啟動子系統、色氨酸(trp)啟動子系統以及雜合啟動子例如tac或trc啟動子。但是，其他能夠在細菌中發揮功能的啟動子(例如其他已知的細菌或噬菌體啟動子)也是合適的。它們的核苷酸序列已經公開，因此本領域技術人員能夠使用接頭或銜接子提供任一所需限制酶切位點，將其與編碼目標輕鏈和重鏈的順反子可操作地連接在一起(Siebenlistetal.(1980)Cell20269)。一些實施方案中，重組載體中的每一順反子都含有分泌信號序列元件，指導表達多肽的跨膜易位。通常，所述信號序列可以是所述載體的元件，或者也可以是插入載體的目標多肽DNA的一部分。本發明選用的信號序列應該是能夠被宿主細胞識別并加工(即，被信號肽酶切割)。由于原核宿主細胞不能識別并處理異源多肽的天然信號序列，所以應將該信號序列用例如選自下列的原核信號序列取代堿性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或熱穩定性腸毒素II(STII)前導序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。適于表達多肽的原核宿主細胞包括古細菌和真細菌，例如革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體。有用的細菌的實例包括埃希氏菌屬(例如，大腸埃希氏菌)，芽胞桿菌屬(例如，枯草芽胞桿菌)，腸細菌屬，假單胞菌各個種類(例如，綠膿桿菌)，鼠傷寒沙門氏菌，Serratiamarcescans，克雷伯氏桿菌屬，變形桿菌屬，志賀氏菌屬，根瘤菌屬，vitreoscilla屬，或副球菌屬。優選地，使用革蘭氏陰性細胞。優選地，所述宿主細胞應該分泌最小量蛋白水解酶，并且也可以根據需要向細胞培養物引入其他的蛋白酶抑制因子。多肽產物用上述表達載體轉化或轉染宿主細胞，然后培養于常規營養培養基，培養基根據誘導啟動子、篩選轉化子或擴增編碼目的序列的基因的需要作適應性調整。轉染是指表達載體被宿主細胞攝入，而不論任一編碼序列實際上是否表達。許多轉染方法已經為本領域技術人員所熟知，例如，CaPO4沉淀和電穿孔。通常，當指征該載體運行的任一信號在宿主細胞中發生時，可以識別出成功的轉染。轉化是指將DNA作為染色體外元件或者通過染色體整合體導入原核宿主，從而使得該DNA能夠復制。根據所使用的宿主細胞，采用適合該細胞的常規方法進行轉化。使用氯化鈣的鈣處理方法通常用于基本上含有細胞壁屏障的菌體細胞。用于轉化的另一方法可以使用聚乙二醇/DMSO。另外可以使用的技術為電穿孔。原核宿主細胞可以培養于適合于培養所選宿主細胞的任一本領域已知培養基。合適的培養基的實例包括添加了必需營養添加劑的luria肉湯(LB)。所述培養基另外還可以含有篩選因子從而選擇性地保證含有表達載體的原核細胞的生長，篩選因子根據表達載體的構成加以選擇。例如用添加了氨芐青霉素的培養基培養表達氨芐青霉素抗性基因的細胞。另外，還可以引入合適濃度的除碳源、氮源和無機磷酸鹽源之外的任一必需添加物，單獨或者以與另外的添加劑或培養基的混合物的形式引入，所述混合物例如氮源混合物。所述培養基可以任選含有一種或多種選自下列的還原劑谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巰基醋酸鹽、二硫赤蘚糖醇和二硫蘇糖醇。所述原核宿主細胞適溫培養。例如，對于大腸桿菌的培養而言，優選的溫度范圍為約20℃-約39℃，更優選約25℃-約37℃，甚至更優選約30℃。培養基的pH值可以是約5-約9范圍內的任一pH，根據宿主而定。對于大腸桿菌而言，所述pH優選約6.8-約7.4，更優選約7.0。如果表達載體使用的是誘導型啟動子，那么應該在適于活化該啟動子的條件下誘導蛋白質表達。例如，如果使用PhoA啟動子調控轉錄，那么可以將轉化后的宿主細胞培養于誘導用的磷酸鹽-限制性培養基。多種其他誘導物也可使用，根據使用的載體構建體而定，如本領域所知。微生物表達多肽可以分泌入宿主細胞的周質然后從中回收。蛋白質的回收通常包括裂解微生物，通常通過滲透休克、超聲處理或裂解等方式。一旦細胞被裂解，可以通過離心或過濾除去細胞碎片或全細胞。可以通過例如親合樹脂層析對蛋白質進一步純化。替代地，可以將蛋白質運載入培養基，然后從中分離。除去培養物中的細胞，然后過濾并濃縮培養物上清用于所制備蛋白質的進一步純化。表達多肽可以使用通常已知方法進一步分離鑒定，例如免疫親合或離子交換柱進行分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC；硅石或DEAE等陽離子交換樹脂層析；色譜聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如SephadexG-75的凝膠過濾；疏水親合樹脂，使用固定于基質上的合適抗原的配體親合以及Western印跡分析。除原核宿主細胞之外，真核宿主細胞系統也已為本領域所熟知。參見，例如，美國專利Nos.4,816,567。合適的宿主包括哺乳動物細胞系例如CHO，以及昆蟲細胞例如下文所述。多肽的純化可以通過純化獲得所制備多肽的基本上均質的制劑用于進一步的試驗和用途。可以使用本領域已知的常規蛋白質純化方法。下列方法是合適的純化方法的舉例免疫親合或離子交換柱分級分離；乙醇沉淀；反相HPLC；硅石或DEAE等陽離子交換樹脂層析；色譜聚焦；SDS-PAGE；硫酸銨沉淀；使用例如SephadexG-75的凝膠過濾。本發明的方法本申請發現用所述結構域干擾能調節HGF/c-met活性。各種物質或分子(包括肽/多肽、抗體等)都可以用作治療劑。這些物質或分子可以根據已知方法配制成藥物學上有用的組合物，其產物可以與藥物學可接受的載體介質合并為混合物。可以將具有要求純度的活性成分與任選的生理學上可接受的載體、賦形劑或穩定劑混合，制備出治療用制劑(Remington′sPharmaceuticalSciences16thedition，Osol，A.Ed.(1980))，以凍干劑型或水溶液形式貯存備用。可接受的載體，賦形劑或穩定劑在使用劑量和濃度對于接受者是無毒的，并包括緩沖液例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分子量(小于約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白，明膠或免疫球蛋白；親水聚合物例如聚乙烯吡咯烷酮，氨基酸例如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，精氨酸或賴氨酸；單糖，二糖及其他碳水化合物包括葡萄糖，甘露糖，或糊精；螯合劑例如EDTA；糖醇例如甘露醇或山梨醇；成鹽(salt-forming)反離子例如鈉；和/或非離子型表面活性劑例如TWEENTM，PLURONICSTM或PEG。用于體內給藥的劑型必須經過滅菌。這在凍干或重配之前或之后通過用過濾除菌膜過濾很容易實現。本申請中治療組合物通常置于一帶有滅菌入口的容器內，例如，靜脈內用溶液包(intravenoussolutionbag)或者帶有皮下注射針可穿透的塞子的藥瓶中。施用途徑采用已知方法，例如，注射或靜脈內輸注，腹膜內、腦內、肌內、眼內、動脈內或病變部位內(intralesional)途徑，表面給藥，或者通過緩釋系統。本發明所述藥物組合物的劑量及預期濃度隨具體用途而定。合適劑量或給藥途徑的確定普通醫生可以適當掌握。動物試驗為確定人治療用有效劑量提供了可靠指導。可以根據下列文獻記載的原理進行有效劑量的種間調整Mordenti，J.andChappell，W.″Theuseofinterspeciesscalingintoxicokinetics″InToxicokineticsandNewDrugDevelopment，Yacobietal.，Eds.，PergamonPress，NewYork1989，pp.42-96。當體內施用本發明的拮抗劑時，常規的劑量為約每天10ng/kg-100mg/kg哺乳動物體重或更多，優選約1μg/kg/天-10mg/kg/天，根據施用途徑而定。具體劑量及遞送方法的指導文獻中有提供；參見，例如，美國專利Nos.4,657,760；5,206,344；或5,225,212。可以想到的是，不同的劑型對于不同的治療化合物及不同的病癥來說是有效的，靶向一種器官或組織的施用可能需要以與另一器官或組織所不同的方式遞送。當治療需要一種物質或分子的任一疾病或病癥的劑型需要以緩慢釋放的方式施用時，可以考慮使用該物質或分子的微膠囊。用于緩慢釋放的重組蛋白質的微膠囊已經在下列物質成功實現人生長激素(rhGH)、干擾素-(rhIFN-)、白細胞介素-2和MNrgp120。Johnsonetal.，Nat.Med.，2795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，271221-1223(1993)；Horaetal.，Bio/Technology，8755-758(1990)；Cleland，″DesignandProductionofSingleImmunizationVaccinesUsingPolylactidePolyglycolideMicrosphereSystems，″inVaccineDesignTheSubunitandAdjuvantApproach，Powell和Newman，eds，(PlenumPressNewYork，1995)，pp.439-462；WO97/03692，WO96/40072，WO96/07399；和U.S.Pat.No.5,654,010。因其生物相容性及大范圍的生物可降解特性，這些蛋白質的緩釋劑型都采用聚-乳酸-聚乙醇酸(PLGA)(poly-lacticcoglycolicacid)聚合物。PLGA、乳酸和羥基乙酸的降解產物可以很快地從人體清除。而且，該聚合物的可降解性可以根據其分子量及組成從數月調整至數年。Lewis，″Controlledreleaseofbioactiveagentsfromlactide/glycolidepolymer，″inM.ChasinandR.Langer(Eds.)，BiodegradablePolymersasDrugDeliverySystems(MarcelDekkerNewYork，1990)，pp.1-41。本發明還提供了篩選下述用途的化合物的方法鑒定能夠通過干擾c-metSema結構域功能(例如，c-met二聚化、配體結合)抑制HGF/c-met信號轉導的物質。篩選試驗設計為用于鑒定具有下列特征的化合物能與c-metSema序列結合或復合，或者能干擾c-metSema結構域與其他細胞蛋白質之間相互作用。所述篩選試驗包括高通量篩選化學物質/化合物文庫的試驗，使其特別適于鑒定藥物侯選物(例如，肽/多肽，小分子，抗體，等)。該試驗可以多種方式完成，包括蛋白-蛋白結合測定、生物化學篩選試驗、免疫測定和細胞為基礎的試驗，這些都已為本領域熟知。拮抗劑的全部試驗都是常規的，因為它們都要求藥物侯選物與c-metSema結構域在足以保證c-met(Sema結構域)與其結合伴侶間相互作用的條件和時間下接觸。結合試驗中，所述相互作用是結合，所述形成的復合體可以從反應混合物中分離或檢測。一個具體的實施方案中，侯選物物質或分子被固定于固體基質上，例如，固定于微量滴定板，通過共價或非-共價連接。非-共價連接通常伴有下述操作用該物質/分子的溶液包被所述物質表面，然后使其干燥。替代地，可以使用一種固定的親合分子將其錨定至一固體表面，例如特異性針對該物質/分子的抗體，如單克隆抗體。所述試驗可以通過下述操作完成將非-固定成分加至固定成分，例如含有錨定成分的包被表面，非-固定成分可用可檢測標記物標記。當所述反應完成時，通過例如洗滌去除未-反應的成分，然后對錨定在固體表面的復合體進行檢測。當最初的非-固定成分帶有可檢測標記物時，檢測到標記物固定在表面上說明發生了復合反應。當非-固定成分不帶標記物時，可以通過例如使用能特異性地結合固定的復合體的標記抗體對復合反應進行檢測。如果候選化合物與c-metsema結構域相互作用但不結合，那么其與該結構域間的相互作用可用熟知用于檢測蛋白質-蛋白質相互作用的方法進行檢測。所述試驗包括常規方法，例如，交聯，共-免測沉淀法，以及通過梯度或層析柱共-純化。此外，蛋白質-蛋白質相互作用還可以通過使用酵母為基礎建立的遺傳系統進行監測，該系統的描述見Fieldsandco-workers(FieldsandSong，Nature(London)，340245-246(1989)；Chienetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889578-9582(1991))asdisclosedbyChevrayandNathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，895789-5793(1991)。許多轉錄活化因子，例如酵母GAL4都由兩個空間上獨立的模塊結構域(modulardomains)組成，其中的一個作為DNA-結合結構域，另一個為轉錄-活化結構域。上述出版物描述的酵母表達系統(通常稱為″二元-雜合系統″)利用了這一特性，使用了兩種雜合蛋白，其中目標蛋白融合于GAL4的DNA-結合結構域，侯選活化蛋白質融合于活化結構域。在GAL4-活化啟動子調控下的GAL1-lacZ報道基因的表達取決于通過蛋白質-蛋白質相互作用的GAL4活性重構。含有相互作用多肽的菌落可以使用β-半乳糖苷酶顯色底物進行檢測。使用二元-雜合技術鑒定兩種特定蛋白質之間的蛋白質-蛋白質相互作用的成套試劑盒(MATCHMAKERTM)可購自Clontech。該系統還可以擴展用于參與特定蛋白質相互作用的蛋白結構域的作圖，以及精確定位(pinpoint)對這些相互作用至關重要的氨基酸殘基。干擾c-metSema結構域與其伴侶間相互作用的化合物可以用下述操作測試通常，在足以實現這兩產物間相互作用及結合的條件和時間下，制備含有c-metSema序列或其部分與結合伴侶(例如，含有Sema，例如c-met胞外結構域的另一多肽)的反應混合物。為了測試侯選化合物抑制結合的能力，在有及無測試化合物存在條件下進行反應。此外，向第三反應混合物加入安慰劑作為陽性對照。混合物中出現的測試化合物與c-metSema序列間的結合(復合物形成)用上述方法監測。對照反應中形成復合物而含測試化合物的反應混合物中沒有形成，這表明該測試化合物能夠干擾c-metSema結構域與其結合伴侶間的相互作用。為了測定抑制因子(例如拮抗劑)，可以讓表達c-met的細胞與所篩查的是否具有與c-metSema結構域功能相關的特定活性的化合物接觸，如果該化合物能夠抑制所述活性，表明該化合物是Sema結構域(或其亞-結構域)的拮抗劑，特性可以通過測定是否與c-metSema結構域而不與無關分子特異性相互作用來進一步證實。有效拮抗劑的其他具體實例包括能與c-metSema結構域結合的寡核苷酸(可以是aptamer)，特別是抗體，包括但不限于，多-及單克隆抗體和抗體片段，單-鏈抗體，抗-獨特型抗體，以及所述抗體或片段的嵌合或人源化形式，以及人的抗體及抗體片段。替代地，一種有效拮抗劑可以是一種密切相關蛋白質，例如能競爭性抑制野生型c-met作用的c-metSema結構域突變形式。有效拮抗劑包括具有下述特征的小分子能與c-metSema結構域和/或其結合伴侶上的c-metSema結合位點結合，從而封閉c-metSema結構域的正常生物活性。小分子的實例包括，但不限于，肽或肽-樣分子，優選可溶性的肽，和合成的非-肽酰的有機或無機化合物。這些小分子可以上述任一篩選試驗和/或本領域技術人員熟知的任一篩選技術進行鑒定。如本申請所述，本發明的拮抗劑可以是一種肽或多肽。獲取所述肽或多肽的方法已為本領域所熟知，包括從肽或多肽文庫篩選合適目標抗原的結合劑。一個實施方案中，合適的目標抗原含有至少一部分c-metSema結構域。肽和多肽文庫已為本領域所熟知，還可以根據本領域方法制備。參見，例如，Clarketal.，U.S.Pat.No.6,121,416；Bassetal.，U.S.Pat.No.5,688,666。融合于一種異源蛋白成分的肽或多肽文庫，例如噬菌體外殼蛋白，已為本領域所熟知，例如，描述見Clarketal.，Bassetal.，同上。一個實施方案中，能夠封閉c-metSema結構域功能的肽含有氨基酸序列LDAQT(SEQIDNO1)，LTEKRKKRS(SEQIDNO2)，KPDSAEPM(SEQIDNO3)和/或NVRCLQHF(SEQIDNO4)，或其變體。一個實施方案中，能封閉c-metsema結構域功能的多肽含有全部或基本上全部的c-metsema結構域。第一肽或多肽結合物的變體可以通過下述方法制備篩選肽或多肽變體獲得目的特征(例如，加強目標親和力，加強藥物動力學，減少毒性，提高治療指數，等)。誘變技術已為本領域所熟知。另外，掃描(scanning)誘變技術(例如以丙氨酸掃描為基礎)特別有助于對肽或多肽各個氨基酸殘基的結構和/或功能重要性進行測評。對本發明的候選物質/分子調節HGF/c-met信號轉導和/或與所述信號轉導相關的生物學活性的能力進行測定，該測定可通過體內或體外試驗測試所述物質/分子的調節能力來完成，這些已為本領域熟知，例如，描述見Okigakietal.，Biochemistry(1992)，319555-9561；Matsumotoetal.，J.Biol.Chem.(1998)，27322913-22920；Dateetal.，FEBSLet.(1997)，4201-6；Lokkeretal.，EMBOJ.(1992)，112503-2510；Hartmanetal.，Proc.Natl.Acad.SciUSA(1992)，8911574-11578。抗體本發明進一步還提供了包括使用抗體干擾c-met活化所需的一種或多種反應的方法，例如c-met二聚化和/或配體與c-met的結合。列舉的抗體包括多克隆、單克隆、人源化、雙特異性及異源偶聯抗體。1.多克隆抗體本發明所述抗體包括多克隆抗體。制備多克隆抗體的方法已為本領域技術人員所知。多克隆抗體可以通過向哺乳動物注射一種或多種免疫劑制備而得，如果需要再加上佐劑。通常，所述免疫劑和/或佐劑通過皮下或腹膜內多點注射。所述免疫劑含有c-metSema結構域(或其部分)或其融合蛋白。可以采用將所述免疫劑偶聯至已知對于所免疫動物來說具有免疫原性的蛋白質。這類免疫原性蛋白質的實例包括但不限于匙孔-血藍蛋白，血清白蛋白，牛甲狀腺球蛋白，和大豆胰蛋白酶抑制劑。可以使用的佐劑的實例包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷酰脂質A，合成的海藻糖dicorynomycolate)。免疫方案本領域技術人員無需過度試驗即可選定。2.單克隆抗體替代地，本發明所述的抗體可以是單克隆抗體。單克隆抗體可以使用雜交瘤方法制備，例如文獻KohlerandMilstein，Nature，256495(1975)中描述的方法。雜交瘤方法中，通常用免疫劑免疫小鼠、倉鼠或其他合適宿主動物的激發產生或能產生可特異性結合所述免疫劑的抗體的淋巴細胞。替代地，所述淋巴細胞可以體外免疫。所述免疫劑通常含有c-metSemthe結構域(或其部分)或其融合蛋白。通常，如果期望是人源細胞時，則使用外周血單個核細胞(″PBLs″)，或者如果期望是非人源細胞時，則使用脾細胞或淋巴結細胞。然后，使用合適的融合劑，例如聚乙二醇，將所述淋巴細胞與無限增殖細胞系融合形成雜交瘤細胞[Goding，MonoclonalAntibodiesPrinciplesandPractice，AcademicPress，(1986)pp.59-103]。無限增殖細胞系通常是轉化后的哺乳動物細胞，特別是嚙齒動物、牛和人源的骨髓瘤細胞。通常，使用大鼠或小鼠骨髓瘤細胞系。可以將所述雜交瘤細胞培養于一合適的培養基，優選含有一種或多種能抑制未融合的無限增殖細生長或存活的物質。例如，如果所述親代細胞不含次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶(HGPRT或HPRT)，那么雜交瘤的培養基通常含有次黃嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶(“HAT”培養基)，這些物質阻止了HGPRT-缺陷細胞的生長。優選地，無限增殖細胞系能高效融合，通過所選的抗體-產生細胞支持抗體的穩定高水平表達，并且對于HAT培養基等培養基是敏感的。更優選地，無限增殖細胞系是鼠骨髓瘤系，可以獲自，例如，theSalkInstituteCellDistributionCenter，SanDiego，CaliforniaandtheAmericanTypeCultureCollection，Manassas，Virginia。另外還公開了使用人骨髓瘤和小鼠-人雜交瘤細胞系制備人單克隆抗體[Kozbor，J.Immunol.，1333001(1984)；Brodeuretal.，MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications，MarcelDekker，Inc.，NewYork，(1987)pp.51-63].然后測定生長著雜交瘤細胞的培養基中是否存在抗c-metSema結構域的單克隆抗體。優選地，所述通過雜交瘤細胞制備的結合特異性單克隆抗體可以通過免測沉淀法或通過體外結合試驗測定，例如放射性同位素(RIA，或酶聯免疫吸附測定)(ELISA)。這類技術及測定試驗本領域都已知。單克隆抗體的結合親和力可以通過例如下述方法測定theScatchardanalysisofMunsonandPollard，Anal.Biochem.，107220(1980).在鑒定出所需雜交瘤細胞后，可以對所述克隆進行限制稀釋處理，常規方法培養[Goding，同上]。用于該目的的合適培養基包括，例如，Dulbecco′sModifiedEagle′s培養基和RPMI-1640培養基。替代地，所述雜交瘤細胞可以作為哺乳動物腹水體內培養。可以用常規免疫球蛋白純化方法，從培養基或腹水液中分離或純化出通過亞克隆篩選到的單克隆抗體，例如，蛋白質A-Sepharose，羥磷灰石層析，凝膠電泳，滲透，或親和層析法。所述單克隆抗體還可用重組DNA方法制備，例如美國專利No.4,816,567中描述的方法。編碼單克隆抗體的DNA可以很容易地分離和測序，使用常規方法(例如，使用能與編碼鼠抗體重鏈及輕鏈特異性結合的寡核苷酸探針)。表達本發明所述的抗體的雜交瘤細胞是所述DNA的合適來源。一旦分離后，將所述DNA插入表達載體，然后轉染入不經轉染不能產生免疫球蛋白的宿主細胞，例如猿猴(Simian)COS細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞和骨髓瘤細胞，在該重組宿主細胞中實現單克隆抗體的合成。另外還可以對所述DNA進行修飾，例如，通過用人重及輕鏈恒定區的編碼序列取代同源鼠的序列[(美國專利No.4,816,567；Morrisonetal.，同上]或者將免疫球蛋白編碼序列全長或部分共價連接于非-免疫球蛋白多肽。所述非免疫球蛋白多肽可以取代本發明所述的抗體的恒定區，或者也可以取代本發明所述抗體的抗原-結合位點的可變區，制備出嵌合的二價抗體。所述抗體可以是單價的抗體。用于制備單價抗體的方法已為本領域所熟知。例如，一種包括重組表達免疫球蛋白輕鏈及經修飾的重鏈的方法。通常在Fc區中的任一點上截短重鏈從而阻止重鏈交聯。替代地，也可以將有關的半胱氨酸殘基用另一氨基酸殘基取代或者刪除從而阻止交聯。體外方法也適合用于制備單價抗體。可以使用本領域已知常規技術消化抗體制備其片段，尤其是Fab片段。另外還可以通過下述方法制備抗體從噬菌體展示文庫篩選能以合適/期望親和力結合的抗體或抗體片段。所述技術已為本領域所熟知，例如，公開于美國專利Nos.5,750,373；5,780,279；5,821,047；6,040,136；5,427,908；5,580,717，及其中的參考文獻。3.人及人源化抗體本發明所述的抗體還可以進一步包括人源化抗體或人的抗體。非-人(例如，鼠的)抗體的“人源化”形式是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(例如Fv，Fab，Fab′，F(ab′)2或抗體的其他的抗原-結合子序列)其中含有最低限度的源自非人免疫球蛋白的序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白(接受抗體)，其中該接受抗體互補決定區(CDR)的殘基被來自非-人物種的CDR所取代，例如小鼠、大鼠、和兔，所述來自非-人物種的CDR具有期望的特異性、親和力和其它能力(capacity)。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv骨架殘基用相應的非-人的殘基替代。人源化抗體還可以包含既非接受抗體也非輸入的CDR或骨架序列中的殘基。通常，所述人源化抗體都基本上包含至少一個，通常為兩個可變區，其中全部或者基本上全部的CDR區對應于出自非-人免疫球蛋白的CDR區，而全部或基本上全部的FR區(FR)為人免疫球蛋白共有序列。另外，所述人源化抗體還最好包含至少一部分的免疫球蛋白恒定區(Fc)，通常為人免疫球蛋白恒定區[Jonesetal.，Nature，321522-525(1986)；Riechmannetal.，Nature，332323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596(1992)]。用于將非人抗體人源化的方法已為本領域所熟知。通常，人源化抗體具有一個或多個導入其中的來自非-人的氨基酸殘基。這些非人的氨基酸殘基通常稱為″輸入″殘基，通常取自“輸入”可變區。人源化可以基本上按照Winter及其同事的方法進行[Jonesetal.，Nature，321522-525(1986)；Riechmannetal.，Nature，332323-327(1988)；Verhoeyenetal.，Science，2391534-1536(1988)]，用嚙齒動物的CDRs或CDR序列取代人抗體的相應序列。因此，所述“人源化”抗體是嵌合的抗體(U.S.PatentNo.4,816,567)，基本上其中小于整個人可變區的部分已經被來自非人物種的相應序列所取代。實際上，人源化抗體通常是人抗體，只不過是其中一些CDR殘基以及可能還有一些FR殘基被來自嚙齒動物抗體類似位點的殘基所取代。人抗體還可以使用各種本領域已知技術制備，包括噬菌體展示文庫[HoogenboomandWinter，J.Mol.Biol.，227381(1991)；Marksetal.，J.Mol.Biol.，222581(1991)]。Cole等和Boerner等描述的技術也可以用于制備人單克隆抗體(Coleetal.，MonoclonalAntibodiesandCancerTherapy，AlanR.Liss，p.77(1985)andBoerneretal.，J.Immunol.，147(1)86-95(1991)]。類似地，可以通過下述方法制備人抗體將人免疫球蛋白基因座(loci)導入轉基因動物，例如，其中內源免疫球蛋白基因已經被部分或全部滅活的小鼠。當攻擊時，發現有人抗體產生，這在各個方面都與人體內觀察到的十分類似，包括基因重排、裝配和抗體的所有組成成員。該方法描述參見，例如美國專利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，以及下列科技出版物Marksetal.，Bio/Technology10，779-783(1992)；Lonbergetal.，Nature368856-859(1994)；Morrison，Nature368，812-13(1994)；Fishwildetal.，NatureBiotechnology14，845-51(1996)；Neuberger，NatureBiotechnology14，826(1996)；LonbergandHuszar，Intern.Rev.Immunol.1365-93(1995)。另外還可以使用上述已知的篩選和/或誘變方法，使抗體親和力成熟(affinitymatured)。優選的親和力成熟抗體具有比制備該親和力成熟抗體所用起始抗體(通常為鼠的、人源化或人的)高5倍，優選10倍，更優選20或30倍的親和力。4.雙特異性抗體雙特異性抗體是具有針對至少兩種不同抗原的結合特異性的單克隆抗體，優選是人的或人源化的抗體。本發明中，其中的一種結合特異性針對c-metSema結構域，另一種針對任一其他抗原。用于制造雙特異性抗體的方法已為本領域所知。通常，雙特異性抗體的重組制備是以2個免疫球蛋白重-鏈/輕-鏈對的共表達為基礎的，其中所述的2個重鏈具有不同的特異性[MilsteinandCuello，Nature，305537-539(1983)]。因為是免疫球蛋白重鏈和輕鏈隨機組合，所以這些雜交瘤(四體雜交瘤(quadromas))生產出10種不同抗體分子的有效(potential)混合物，其中只有1種具有正確的雙特異性結構。這種正確分子的純化通常通過親和層析步驟完成。類似方法的描述見WO93/08829，公開于1993年5月，和Trauneckeretal.，EMBOJ.，103655-3659(1991)。可以將具有目的結合特異性的抗體可變區(抗體-抗原結合部位)融合于免疫球蛋白恒定結構域序列。優選地，所述融合是與免疫球蛋白重鏈恒定結構域融合，其中含有至少部分鉸鏈區、CH2和CH3區。優選地，具有其中含有輕鏈結合必需位點的第一重鏈恒定區(CH1)出現在至少一種所述融合中。將編碼所述免疫球蛋白重鏈融合體以及如果需要還有免疫球蛋白輕鏈的DNAs插入不同的表達載體，然后共轉染入合適的宿主有機體。關于制備雙特異性抗體的進一步詳細描述參見，例如，Sureshetal.，MethodsinEnzymology，121210(1986)。根據WO96/27011中描述的另一種方法，構建一對抗體分子之間的接觸面，以使從重組細胞培養物中回收的雜二聚體百分比最大化。優選的接觸面至少含有抗體恒定區中CH3區的一部分。這種方法中，將來自第一抗體分子接觸面的一個或多個小的氨基酸側鏈替換為較大的側鏈(例如酪氨酸或色氨酸)。通過將較大的氨基酸側鏈取代為較小側鏈(例如丙氨酸或蘇氨酸)，在第二抗體分子接觸面上制造出與較大側鏈相同或類似大小的互補性“腔(cavities)”。這就為提高雜二聚體產量超過其它不想要的終末副產品例如同二聚體提供了一種方法。雙特異性抗體可以是制備成全長抗體或抗體片段(例如F(ab’)2雙特異性抗體)。從抗體片段制備雙特異性抗體的技術已經公開于文獻。例如，雙特異性抗體可以使用化學鍵制備。Brennanetal.，Science22981(1985)公開了一種方法，其中通過蛋白水解切割完整抗體產生F(ab’)2片段。為了穩定鄰位二硫基化合物，阻止分子間二硫化物形成，將這些片段在二巰基化物復合劑(dithiolcomplexingagent)亞砷酸鈉存在下還原。然后，將制備的Fab’片段轉化為硫代硝基苯甲酸鹽(酯)(TNB)衍生物。然后，通過用半胱胺還原將其中之一的Fab’-TNB衍生物復原為Fab’-硫醇，然后與等摩爾量的另一種Fab’-TNB衍生物混合形成所述雙特異性抗體。制備的雙特異性抗體可用作試劑用于酶的選擇性固定。可以直接從大腸桿菌回收Fab’片段，然后化學偶聯形成雙特異性抗體。Shalabyetal.，J.Exp.Med.175217-225(1992)描述了完全人源化雙特異性抗體F(ab’)2分子的制備方法。每一Fab’片段都從大腸桿菌單獨分泌，然后體外進行直接化學偶聯形成雙特異性抗體。因此，形成的雙特異性抗體能夠與過表達ErbB2受體的細胞和正常人T細胞結合，以及能夠激發人細胞毒性淋巴細胞對人乳腺腫瘤目標的裂解活性。直接從重組細胞培養物制備和分離雙特異性抗體片段的各種技術也已經公開。例如，使用亮氨酸拉鏈制備雙特異性抗體。Kostelnyetal.，J.Immunol.148(5)1547-1553(1992).通過基因融合將取自Fos和Jun蛋白質的亮氨酸鋅拉鏈連接至兩種不同抗體的Fab′部分。在絞鏈區將抗體同源二聚體還原形成單體，然后再氧化生成抗體異源二聚體。該方法還可以用于制備抗體同源二聚體。Hollingeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-6448(1993)公開的“雙抗體(diabody)”技術提供了另外一種制備雙特異性抗體的機制。所述片段含有借助接頭連接在一起的重-鏈可變區(VH)和輕-鏈可變區(VL)，該接頭太短因而不同能允許同一鏈上兩個結構域之間配對。因此，一個片段的VH和VL結構域不得不與互補的VL及VH結構域配對，從而形成兩個抗原結合位點。另外還公開了另一種策略，利用單-鏈Fv(sFv)二聚體制備雙特異性抗體片段。參見Gruberetal.，J.Immunol.1525368(1994)。2價以上的抗體也在本發明范圍內。例如，可以制備三特異性抗體。Tuttetal.，J.Immunol.14760(1991).范例性的雙特異性抗體能夠與單一c-metSema結構域上的兩個不同表位結合，或者與c-metSema結構域上的表位和另一多肽上的表位結合。5.異源偶聯(Heteroconjugate)抗體異源偶聯抗體也在本發明范圍之內。異源偶聯抗體由共價聯結的兩個抗體組成。這類抗體已經被計劃用于，例如，將免疫系統細胞靶向至不想要的細胞[(美國專利No.4,676,980]，及用于治療HIV感染[WO91/00360；WO92/200373；EP03089]。可以體外使用已知的合成蛋白化學方法制備所述抗體，包括涉及交聯劑的方法。例如，可以使用二硫化物(disulfide)交換反應或者通過生成硫醚鍵，構建免疫毒素。適于該目的的試劑的實例包括亞氨基硫醇鹽(酯)和甲基-4-巰基丁亞氨酸酯(mercaptobutyrimidate)以及美國專利No.4,676,980中公開的試劑。6.效應子作用(EffectorFunction)構建可以期望在效應子作用方面對本發明所述的抗體進行修飾，從而提高，例如，抗體治療癌癥的效力。例如，可以將半胱氨酸殘基導入Fc區，從而允許該區內鏈間二硫鍵的形成。如此制備的同源二聚抗體提高內化能力和/或增強補體-介導細胞殺傷以及抗體-依賴性細胞毒性(ADCC)。參見Caronetal.，J.ExpMed.，1761191-1195(1992)和以及Shopes，J.Immunol.，1482918-2922(1992)。抗腫瘤活性增強的同源二聚抗體也可以使用異源雙功能交聯物制備，描述見Wolffetal.CancerResearch，532560-2565(1993)。替代地，可以構建具有雙Fc區因而提高補體溶解及ADCC能力的抗體。參見Stevensonetal.，Anti-CancerDrugDesign，3219-230(1989)。7.免疫偶聯物本發明還涉及免疫偶聯物，它包含與細胞毒制劑偶聯的本文所述抗體，所述細胞毒制劑例如化療劑，毒素(例如細菌，真菌，植物或動物源性的酶活性毒素，或其片段)，或放射性同位素(即放射偶聯物)。上文已描述了用于產生此類免疫偶聯物的化療劑。可以應用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A鏈、白喉毒素的非結合活性片段、外毒素A鏈(來自銅綠假單孢菌(Pseudomonasaeruginosa))、蓖麻毒蛋白A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-帚曲毒素、油桐(Aleutitesfordii)蛋白、石竹素蛋白、美洲商陸(PhytolacaAmericana)蛋白(PAPI，PAPII，和PAP-S)、苦瓜(momordicacharantia)抑制因子、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonariaofficinalis)抑制劑，白樹毒素、米托菌素(mitogellin)、局限曲菌素、酚霉素、依諾霉素和單端孢菌毒素(tricothecenes)。多種放射性核素可用于制備放射性偶聯的抗體，實例包括212Bi，131I，131In，90Y和186Re。抗體和細胞毒制劑的偶聯物可通過多種雙功能蛋白偶聯劑來連接，所述雙功能蛋白偶聯劑如N-琥珀酰亞胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亞胺基硫烷(iminothiolane)(IT)，亞胺酸酯的雙功能衍生物(如鹽酸二甲基己二酸亞氨酯)，活性酯類(如二琥珀酰亞胺基辛二酸酯)，醛類(如戊二醛(glutareldehyde))，雙-疊氮化合物(如雙(對-疊氮基苯甲酰基)己二胺)，雙-重氮衍生物(如雙-(對-重氮苯甲酰基)-乙二胺)，二異氰酸酯(如亞甲代苯基2，6-二異氰酸酯)，和雙-活性氟化合物(如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)。例如，蓖麻毒蛋白免疫毒素可如Vitetta等，Science2381098(1987)所述制備。C14標記的1-異硫氰酸苯甲基-3-甲基二乙烯三氨五乙酸(MX-DTPA)是將放射性核苷酸偶聯至抗體的偶聯劑之一。見WO94/11026。另一個實施方案中，將抗體偶聯于一種″受體″(例如鏈霉親和素)用于腫瘤預靶向(pretargeting)，其中將所述抗體-受體偶聯物施用給患者，然后使用澄清劑(clearingagent)除去循環系統中的未結合偶聯物，之后施用″配體″(例如，親和素)，該“配體”偶聯于細胞毒性物質(例如，放射性同位素)。8.免疫脂質體另外還可將本申請公開的抗體配制成免疫脂質體。可以用本領域已知的方法制備含抗體的脂質體，例如下列文獻中描述的方法Epsteinetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，823688(1985)；Hwangetal.，Proc.NatlAcad.Sci.USA，774030(1980)；和美國專利Nos.4,485,045及4,544,545。增加循環時間的脂質體的描述見美國專利No.5,013,556。特別有用的脂質體可以通過反-相蒸發法制備，使用含有磷脂酰膽堿、膽固醇和PEG-衍生的磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂類組合物。用規定大小孔徑的濾器擠出脂質體得到具有預期直徑的脂質體。可以通過二硫化物-交換反應，將本發明所述抗體Fab′片段偶聯至Martinetal.，J.Biol.Chem.，257286-288(1982)中描述的脂質體。可以任選地在脂質體中含有化療劑(例如阿霉素)。參見Gabizonetal.，J.NationalCancerInst.，81(19)1484(1989)。9.抗體的藥物組合物上文所述篩選試驗鑒定出的抗體及其他分子可以藥物組合物形式施用，用于治療各種病癥。如果用完整抗體作為抑制因子，那么優選使用具有內化的抗體。但是，脂轉染物或脂質體還可用于將本發明所述物質/分子遞送入目的細胞。當使用抗體片段時，優選使用較小的抑制性片段。例如，可以根據抗體的可變區序列，設計出符合下列要求的肽分子即保留了結合c-metSema結構域和/或干擾c-metSema結構域與其結合伴侶間相互作用的能力。這類肽可以化學合成和/或通過DNA重組技術制備。參見，例如，，Marascoetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，907889-7893(1993)。本發明所述劑型還可含有一種以上的所治療特定癥狀必需的活性化合物，優選不會彼此抵觸具有互補活性的化合物。替代地，或者另外地，所述組合物可以含有能增強其功能的物質，例如，細胞毒性物質、細胞因子、化療劑或生長-抑制劑。這類分子適合以對預定目標有效的量聯合出現。還可以將活性成分包埋在制備的微膠囊中，例如，通過凝聚技術或通過界面聚合，例如，羥甲基纖維素或明膠-微膠囊及聚甲基異丁烯酸酯微膠囊中，膠體藥物發送系統(例如，脂質體，白蛋白微球體，微乳劑，納米顆粒，和納米膠囊)中或者巨乳劑(macroemulsions)中。所述技術描述見Remington′sPharmaceuticalSciences，同上。用于體內給藥的劑型必須經過滅菌。這一點通過用無菌過濾膜過濾很容易實現。可以制備緩慢釋放制劑。緩慢釋放制劑的合適的實例包括內含抗體的固態疏水聚合物半透性基質，該基質為有形物體，例如，薄層，或微膠囊。緩慢釋放基質的實例包括聚酯、水凝膠(例如，聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)或聚(乙烯醇))，聚交酯(美國專利No.3,773,919)，L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸共聚物，不可降解的乙烯-醋酸乙烯酯，可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物例如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物與醋酸亮丙瑞林(leuprolide)組成的可注射微球體)，和聚-D-(-)-3-羥丁酸。盡管乙烯-醋酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸等聚合物可使分子釋放時間在100天以上，但是某些水凝膠釋放蛋白質的時間則較短。當包封抗體在體內長時間存在時，在37℃濕潤環境它們會變性或聚集，引起生物活性的損失和免疫原性的改變。可以根據選擇機理的不同制定合理策略進行穩定化處理。例如，如果聚集機理是由于硫代-二硫化物互換而形成分子間S-S鍵，可以通過下述操作實現穩定化修飾巰基殘基，從酸性溶液凍干，控制濕度，使用合適添加劑，和開發特異性聚合物基質組合物(polymermatrixcomposition)。制品本發明的另一方面，提供了含可用于治療、預防和/或診斷上述病癥材料的制品。所述制品包含容器以及該容器上的或連接到該容器之上的標簽或包裝插頁。合適的容器包括，例如，瓶，小藥瓶，注射器，等。所述容器可以各種材料制成的，例如玻璃或塑料。所述容器裝有自身或與其他組合物聯用時能有效治療、預防和/或診斷病癥的組合物，帶有一滅菌入口(例如，所述容器可以是一種靜脈內用溶液包(intravenoussolutionbag)或者帶有皮下注射針可穿透的塞子的藥瓶)。所述組合物中至少一種活性物質是本發明的拮抗劑。所述標簽或包裝插頁標明所述組合物可用于選擇治療的病癥，例如癌癥。而且，所述制品可以包含(a)其中裝有組合物的第一容器；該組合物含有本發明的拮抗劑；和(b)其中裝有組合物的第二容器；該組合物含有其他細胞毒性劑。本發明這種實施方案中的制品還可以進一步包含一包裝說明書，標明所述第一和第二組合物可用于治療特定的病癥，例如癌癥。替代地，或另外地，所述制品還可以進一步包含第二(或第三)容器，其中裝有藥物學-可接受的緩沖液，例如滅菌劑注射用水(BWFI)，磷酸鹽緩沖鹽水，Ringer′s溶液和葡萄糖溶液。進一步還可以包括根據商業需要及用戶需求而定的其他物質，包括其他緩沖液，稀釋劑，濾膜，針，和注射器。下面是本發明所述方法和組合物的實施例。當然，根據上文提供的一般說明，還可以實施各種其他實施方案。實施例材料&方法構建體和重組蛋白質使用常規PCR方法構建胞外亞-結構域缺失的c-met。使用的引物為含有Sema起始部分、PSI、第一IPT或第四IPT結構域、側面帶有KpnI位點的N-末端引物，和直至第959位Met殘基且側翼帶有StuI位點的C-末端引物。用c-Met作為模板，使用ZeroBluntTOPOPCR克隆試劑盒(Invitrogen)，按照廠商建議，將每一克隆的PCR片段插入pCR-BluntII-TOPO載體。通過DNA測序對所述克隆進行驗證。然后通過KpnI和EcoRV在C-末端添加一標簽將構建體亞克隆入pcDNA3.1V5/His載體(Invitrogen)。通過HindIII和KpnI位點在每一克隆的N-末端都添加上Met的信號肽。用HindIII和EcoRV消化每一克隆，然后通過HindIII和PmeI亞克隆入pRK5TKneo載體。對EC-WTFlag和EC-WTV5/His克隆而言，含HindIII位點的N-末端引物與至Met第595位殘基側翼帶有StuI位點的C-末端引物配對使用。將EC-WTV5/His通過HindIII/StuI亞克隆入pcDNA3.1V5/His的HindIII/EcoRV位點，然后亞克隆入pRK5Tkneo，如上所述。對EC-WTFlag而言，將PCR片段連接入pCR-BluntII-TOPO載體。將含Flag標簽的寡核苷酸序列插入StuI和KpnI之間。然后通過HindIII和EcoRV/ScaI將EC-WTFlag亞克隆入pRK5Tkneo。R.Schwall(Genentech)提供了重組的HGF和抗-Met5D5-Fab。用哺乳動物細胞制備scHGF，此前已有描述(Peek等，2002)。為了獲得重組Sema和PSI結構域，在編碼MET受體第25-567位殘基的區域上進行PCR擴增。在C-末端添加8xHis標簽和NotI位點，將N-末端直接融合至昆蟲細胞分泌信號pAcGP67A(BDBiosciences)的C-末端。PCR產物用SpeI和NotI消化后亞克隆入pAcGP67A。將純化后的質粒DNA(pAcGP67A加METsema和PSI結構域)轉染入Sf9昆蟲細胞，按照廠商提供的方法(BDBiosciences)。就表達而言，以5×105個細胞/mL密度培養于ESF921培養基(ProteinExpression，LLC)中的1L的Hi5昆蟲細胞用10mL病毒原液轉染，27℃孵育72小時。然后3000g離心15分鐘除去上清中的細胞。向上清中加入1mMNiCl2、5mMCaCl2和50mMTrispH8.0。過濾上清，通過重力自流動向2mLNi-NTA柱(Qiagen)上樣，然后用20mL洗滌緩沖液(50mMTrispH8.0，500mMNaCl，5mM咪唑)洗滌。蛋白質用含有50mMTris8.0、300mMNaCl、250mM咪唑的緩沖液洗脫。單獨制備重組Sema結構域的嘗試沒有得到此前報道的蛋白質Sema3A(Antipenko等，2003)。免測沉淀和Western印跡分析細胞系獲自美國典型微生物保藏中心(ATCC)。將293細胞維持培養于添加了10％FBS(Sigma)、青霉素/鏈霉素(GIBCO)和谷氨酰胺的DMEM中。A549、H441和MDA-MB-435細胞維持培養于添加了10％FBS、青霉素/鏈霉素(GIBCO)和谷氨酰胺的50∶50DMEM/F12(Cellgro)中。按照廠商提供的說明書，使用Lipofectamine2000(Invitrogen)，用1-12μg指定構建體轉染細胞。24小時后，收獲細胞，用含完全蛋白酶抑制劑雞尾片(Completeproteaseinhibitorcocktailtablet)和磷酸酶抑制劑雞尾(cocktail)2(分別購自Roche和Sigma)1％NP40裂解緩沖液。對于Met酪氨酸磷酸化和MAPK磷酸化試驗而言，用0.5％BSA讓細胞血清-饑餓2小時。用10μg/ml抗-Met5D5-Fab或rSema處理后的細胞在裂解前再繼續孵育1小時。離心除去細胞碎片，上清用ProteinASepharose(Sigma)或ProteinG-Plus瓊脂糖微珠(SantaCruz)預澄清1小時。然后取500μg裂解物用10μg5D5抗體(Genentech)或35μlMet(C-28)瓊脂糖偶聯物(SantaCruz)進行免疫沉淀，4℃振蕩過夜。對于HGF結合試驗而言，取500μg裂解物用5μgscHGF或HGF孵育，然后用1μgV5抗體免疫沉淀。加入蛋白A或G微珠再過2小時后，免疫沉淀物用1％NP40裂解緩沖液洗滌3遍。加入含10mMDTT的2X加樣緩沖液后，將樣品進行4-12％Tris-甘氨酸凝膠(Invitrogen)電泳。將蛋白質轉移到硝酸纖維素膜，用5％脫脂奶或BSA封閉1小時，然后4℃下振動過夜，用下列物質進行探測1∶5000V5(Invitrogen)，1∶10000C-末端Met(C-12)(SantaCruz)，1∶1000MAPK(CellSignaling)，1∶500HGF-α(145)(SantaCruz)，1∶1000P-MAPK(CellSignaling)，1∶1000His(CellSignaling)，或1∶1000磷酸酪氨酸4G10(Upstate)抗體。抗小鼠或兔IgG二抗(Amersham)按1∶5000稀釋使用。通過加強的化學發光(ECL-Plus，Amersham)對蛋白質進行了檢測。共價親和力交聯分析對此前公開方法(Blechman等，1995)調整后進行交聯試驗。A549，H441，MDA-MB-435，和293細胞用0.5％BSA血清饑餓兩小時。除去培養基代之以PBS。按照廠商提供的說明書，用遞增濃度的交聯劑硫代-EGS(Pierce)對細胞進行處理。類似地，將293細胞置于6-孔平板，然后用0.1-4μg指定構建體進行轉染，使用Lipofectamine2000(invitrogen)。24時后，用PBS替換培養基，用硫代-EGS進行細胞交聯。然后，用含蛋白酶和磷酸酶抑制因子的1％NP40裂解緩沖液裂解細胞。然后將溶于還原性加樣緩沖液中的10μg裂解物立即進行8％或4-12％Tris-甘氨酸凝膠電泳分析，轉移至硝酸纖維素膜，用5％奶封閉1小時。用1∶1000MetC-12(SantaCruz)或1∶5000V5抗體對膜進行探測，4℃振動過夜。用1∶5000的二抗孵育后，用ECL-Plus對蛋白質進行檢測。用EC-WT-Flag和EC-WT-V5/His共轉染，然后同上所述進行交聯。取500μg交聯后的裂解物用V5或Flag抗體免疫沉淀，8％Tris-甘氨酸凝膠電泳分析，轉移至硝酸纖維素膜，并用1∶5000V5或1∶1000Flag(Sigma)抗體免疫沉淀。蛋白質用ECL-Plus檢測。劃痕(Scrape)試驗將H441細胞以4.5×104個細胞/孔的密度種植于裝有含10％FBS的50∶50DMEM/F12的96-孔平板內。次日，在每一孔匯合的單層上作單一劃痕，按照此前描述方法(Lorenzatoetal.，2002)。然后用含0.5％BSA的培養基孵育孔，然后用模擬物、10μg/ml5D5，10μg/mlSema或100ng/mlHGF處理。對劃痕進行監測，每天拍照。代表性的結果顯示2天。遷移試驗對此前公開方法(Coltellaetal.，2003)調整進行跨孔(transwell)移動試驗。將含0.5％BSA的培養基中的1.2×105個MDA-MB-435細胞種植于事先用10μg/mlIV型膠原纖維(Sigma)包被過的每一跨孔(Costar)的上部腔室。向上部腔室加入模擬物、10μg/ml抗-Met5D5-Fab，或10μg/mlSema。作為陽性對照，另外向模擬物-處理孔的下部腔室添加100ng/mlHGF。次日，這些孔用4％多聚甲醛固定，用0.5％龍膽紫染色。已經移動到下部腔室的細胞用10％乙酸溶解，用微量培養板閱讀儀測量560nm處的吸光度。結果Sema結構域是Met受體交聯所必需的為了測定Met胞外結構域在受體二聚化及活化中所起的作用，制備了亞-結構域缺失的Met，如圖1所示。每一缺失突變體都在N-末端側翼帶有信號肽(S.P.)，C-末端跨膜區帶有V5/His標簽。使用硫代-EGS單個測定Met缺失突變體的交聯能力。將用遞增濃度sulfo-EGS處理過的加V5/His標簽的缺失突變體的轉染體進行裂解，轉染體裂解后用4-12％SDS-PAGE電泳分析。在未經sulfo-EGS處理的樣本中，EC-WT-V5/His表現為處理后的單體(EC-M，～90kD)和未經處理的(*，～120kD)蛋白質。檢測到了EC-WT交聯，表現為從較低(EC-M，～90kD)變為了較高的遷移二聚體(EC-D，～180kD)，如圖2A所示。不含Sema結構域的Met變體沒有出現類似移動。值得注意的是，正如所料，未經處理的EC-WT(*)Met沒有出現交聯，因為硫代-EGS是細胞膜不透性的。當出現在細胞表面上時，胞內的Met單-鏈前體受到蛋白水解切割(Giordanoetal.，1989)。因為硫代-EGS有限的通透性，所以選擇其作為交聯劑，對交聯的膜-插入處理后的Met受體的效力進行了測定。為了查明膜-結合胞外Met是否形成同型二聚體，用EC-WT-V5/His與EC-WT-Flag共轉染細胞，然后用硫代-EGS交聯。裂解細胞，用V5抗體免疫沉淀，8％SDS-PAGE凝膠電泳分析，然后用Flag或V5抗體進行免疫印跡試驗。免疫印跡結果顯示含有EC-WT-Flag和EC-WT-V5/His的較高的移動形式(EC-D，～180kD)，說明兩種形式的EC-WT都發生了交聯及共免疫沉淀。使用Flag抗體的反相免測沉淀得到類似結果(圖2B)。另外在V5免疫沉淀物中檢測到了剩余的未交聯的EC-WTFlag(EC-M)，但是隨著加入的硫代-EGS的增加變為較高的移動形式(圖2B)。總之，交聯試驗表明當sema結構域存在時形成了胞外的膜-結合Met同源二聚體。HGF和scHGF(R494E)結合Sema結構域HGF以非活性單-鏈前體的形式分泌，被細胞外蛋白酶切割為α和β鏈(Nakaetal.，1992)。切割得到的二硫鍵連接的HGF的α和β鏈能以高親和力結合Met受體(Bottaroetal.，1991；Naldinietal.，1991)。對Met缺失突變體的結合HGF的能力進行了測試。用EC-WT，ΔS，ΔP，ΔIPT3，TM或模擬物轉染細胞(圖3A)，與HGF孵育細胞裂解物。用V5抗體免疫沉淀，然后4-12％SDS-PAGE電泳分析，α鏈-HGF抗體檢測發現HGF只與EC-WT結合(圖3B)。HGF不結合其它Met缺失突變體的結果說明Sema結構域是HGF結合所必需的。含有R494E突變的單鏈HGF[scHGF(R494E)]能夠結合并抑制Met受體的活化(Lokkeretal.，1992)。另外還對scHGF(R494E)結合Met胞外結構域進行了測試。裂解轉染后的Met缺失突變體，用scHGF(R494E)孵育，按照上述方法進行分析。數據顯示scHGF(R494E)只結合EC-WT，而不結合Sema缺失變體(圖3C)。這些結果與共免疫沉淀試驗相互印證，其中HGF和scHGF(R494E)都能與重組EC-Met和Sema結構域蛋白結合(數據未給出)。因此，這些數據與觀察結果是一致的，Met的Sema結構域是HGF的相互作用位點(Gherardietal.，2003)。這些數據還表明Met的Sema結構域也是scHGF(R494E)結合的相互作用位點。5D5單克隆抗體能結合Met的Sema結構域現已發現抗-Met5D5的Fab片段(抗-Met5D5-Fab)能抑制HGF/c-met信號轉導。參見，例如，美國專利Nos.5,686,292；5,646,036；6,207,152&6,214,344。通過與抗-Met5D5的共-免測沉淀試驗，對Met缺失構建體進行測試。如前所述用Met缺失構建體或模擬物轉染細胞。這些細胞裂解物用抗-Met5D5免疫沉淀，然后用His抗體進行免疫印跡測試。如圖3E所示，只有含Sema的EC-WT才結合抗-Met5D5。裂解物中檢測到了全部的轉染蛋白質(圖3D)，內源Met被抗-Met5D5免疫沉淀(圖3F)。因此，所述數據表明抗-Met5D5能結合Met的Sema結構域。由于抗-Met5D5-Fab可作為拮抗劑，所以可用作下列功能研究中的對照。腫瘤細胞系中的內源Met交聯由于這些數據表明Sema結構域與兩種功能有關，即結合HGF和受體二聚化，所以對MetSema結構域在排除了HGF結合的二聚化方面的作用進行檢測。除非另有說明，后面的所有試驗都在HGF存在條件下進行。通過RT-PCR和Western印跡，對HGF在293(胚腎)、H441(肺腺癌)、A549(肺癌)和MDA-MB-435(乳腺癌)細胞系中的表達水平進行了測定。MDA-MB-435和H441細胞沒有可檢測的HGFRNA或蛋白質，盡管A549和293細胞表達HGFRNA并且在裂解物和條件培養基中有少量可檢測的HGF蛋白(數據未給出)。為了測定各種腫瘤細胞系表達的Met在無HGF存在下能否交聯，在試驗過程中將這些細胞維持在含0.5％BSA的無血清培養基中。如前所述用硫代-EGS交聯這些細胞系，裂解物用4-12％SDS-PAGE電泳分析，然后用Met抗體進行免疫印跡分析。在無交聯劑存在時，Met表現為處理后的(Met-M)和未經處理的(*)蛋白質，這與此前EC-WT交聯試驗中觀察到的一樣(圖2A)。每一細胞系中，甚至在只有0.1mM硫代-EGS存在下，也都出現了Met-M向較高的移動形式(Met-D)的變動(圖4)。隨著交聯劑濃度的升高，由Met-M到MetD形式的變動增加。與我們此前觀察到的一致，細胞內的未經處理的Met在硫代-EGS處理時并非發生交聯。相反，用100ng/mlHGF孵育A549細胞，出現了如前所述的交聯。Met免疫印跡試驗發現HGF存在時，與無HGF存在時看到的Met-D相比出現了更高的移動形式(圖4)。這些數據表明在無HGF存在時已經形成了交聯的Met二聚體，由于與HGF結合而進一步變動。用rSema和抗-Met5D5-Fab抑制腫瘤細胞中的Met信號傳導由于這些數據表明Sema結構域是Met二聚化所必需的，制備含Met受體Sema和PSI結構域的重組Sema(rSema)蛋白(參見材料和方法部分)，測試其對Met信號傳導的功能性影響。用遞增濃度的rSema處理人腫瘤細胞，對HGF刺激時的Met酪氨酸磷酸化及促有絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的下游活化進行測試。對A549細胞實施血清饑餓，在HGF存在下用遞增濃度的rSema孵育。回收細胞裂解物，用C-末端Met抗體免疫沉淀，然后用磷酸-酪氨酸抗體進行免疫印跡分析。與HGF單獨刺激相比，在HGF存在下加以遞增量的rSema處理，出現了Met磷酸化減少(圖5A和5B)。類似地，配體存在下用遞增量的rSema處理時，MAPK磷酸化也減少。另外以類似方式用rSema和HGF處理H441和MDA-MB-435細胞系，發現磷酸-MAPK呈現劑量依賴性減少(圖5A和5B)。此外，還對無HGF存在時rSema抑制Met活化進行了測試。作為對比，在功能試驗中使用了能作為Met受體拮抗體的抗-Met5D5-Fab。將A549細胞經受血清-饑餓，然后用抗-Met5D5-Fab或rSema進行處理。與模擬物處理的對照相比，用rSema或抗-Met5D5-Fab處理導致配體非依賴性的Met磷酸化及磷酸-MAPK水平的抑制(圖5C和5D)。類似地，H441和MDA-MB-435細胞系另外還在無HGF存在下用抗-Met5D5-Fab和rSema處理；MAPK磷酸化減少所遵循的趨勢與此前在A549細胞上觀察到的類似。這些結果表明rSema不僅能抑制配體依賴性及非依賴性的Met磷酸化，而且還能影響下游的MAPK信號轉導。另外還對Met缺失突變體減弱內源Met信號傳導的能力進行了測定。用所述Met缺失突變體轉染細胞(圖5E)；裂解物用C-末端Met抗體免疫沉淀，然后用磷酸-酪氨酸抗體作免疫印跡分析。與模擬物處理的對照相比，EC-WT轉染子表現出Met酪氨酸磷酸化和磷酸-MAPK的減少(圖5F和5G)。Sema缺失的轉染子盡管表現出了磷酸-Met一定程度的減少，但是并沒有出現下游的MAPK磷酸化的減少(圖5F和5G)。綜合來看，這些結果證實了Sema結構域是Met活化所必需的，進一步驗證了此前的rSema抑制Met信號轉導的試驗結果(圖5A-D)。細胞移動被rSema和抗-Met5D5-Fab抑制用H441細胞進行劃痕(Scrape)試驗，測量Met介導的細胞運動力(Lorenzatoetal.，2002)。在第0天對每一孔中高密度培養的H441細胞進行劃痕，試驗過程細胞維持在含0.5％BSA的無血清培養基中(圖6)。細胞用10μg/mlrSema或5D5或100ng/mlHGF處理作為陽性對照或者模擬物處理。第2天時，模擬物處理孔的裂隙完全閉合，而rSema處理的細胞中的裂隙仍然存在(圖6)。抗-Met5D5Fab處理的細胞中的裂隙變小，但仍然可見。HGF處理后的細胞到第1天時閉合了裂隙，在第2天仍然如此。這些觀察結果在4個獨立試驗中都一致。這些數據表明沒有HGF存在，rSema和抗-Met5D5-Fab都抑制內源性Met活化介導的細胞運動力。為了測試無配體存在下rSema對細胞運動力的影響，用0，0.1，0.5，或52μg/mlrSema加20ng/mlHGF處理細胞。單用HGF處理后的細胞第1天時裂隙完全閉合。相反，在HGF存在時用rSema處理的細胞呈劑量依賴性方式保持裂隙(數據未給出)。這些數據表明在HGF存在下，rSema抑制Met介導的細胞運動。用MDA-MB-435細胞檢測Met趨動的細胞遷移的跨孔實驗(transwellassay)。無HGF存在時，模擬物處理后細胞的移動情況如圖7所示。這種移動隨著rSema，和抗-Met5D5-Fab的加入程度變小。向這些細胞加入HGF導致移動增加了3倍。這些數據與H441細胞系的劃痕(Scrape)試驗結果相關。另外，還用細胞運動力及移動試驗對H441和MDA-MB-435細胞中Akt的活化進行了測試。試驗發現在HGF存在下，隨著rSema濃度的增大，Akt磷酸化呈劑量依賴性減少。這些數據與下列結果相關在配體存在下，rSema能夠抑制Met-介導的細胞運動力。總之，這些試驗結果都支持了下述結論Sema結構域拮抗劑，例如含Sema序列的重組多肽不僅能夠抑制Met活化，而且在配體依賴及非依賴環境下都能阻斷細胞運動力及移動的下游反應。討論Sema結構域位于semaphorins及其配體plexins的胞外區，充當受體/配體識別位點(Tamagnoneetal.，1999)。近期出版的Sema3A和Sema4D的晶體結構表明這些Sema結構域形成7葉片的(seven-bladed)β-螺旋(propeller)結構，該結構對于同源二聚化很重要(Antipenkoetal.，2003；Loveetal.，2003)。本申請提供的體外及體內試驗證據有力的支持了Sema結構域在Met受體二聚化中的作用。數據表明Met交聯只發生在Sema結構域存在的條件下，說明Sema結構域在受體二聚化中發揮著必不可少的作用。此外，無HGF存在時出現的Met交聯表明這些腫瘤細胞系中的Met受體在無配體刺激時也能二聚化。Sema3A晶體結構表明Sema結構域中的4個相互作用的“環”對于建立Sema3A二聚體之間的接觸面發揮重要作用(Antipenkoetal.，2003)。Sema3A序列與Met對齊結果顯示其中的1個“環”位置靠近MetSema結構域中R307和S308之間的蛋白水解切割位點，這表明了它在Met二聚化中的重要性。本申請提供的細胞試驗表明無HGF存在時，Sema結構域介導Met受體的同嗜的相互作用。值得注意的是，此前的報道認為Met還可與CD44v6，α6β4整聯蛋白和plexinB1相互作用(Giordanoetal.，2002；Orian-Rousseauetal.，2002；Trusolinoetal.，2001)。本申請所述結果為下列觀點提供了支持Met通過這些高度保守的Sema結構域與plexinB1結合在一起。此外，Met和semaphorins的過表達已發現于癌癥和侵入性轉移，因而可以進一步推定任一有效的相互作用都能由Sema結構域介導。但是，這些分子的作用以及這些病理環境中介導異聚相互作用的機制得益于進一步的研究。CD44v6和α6β4有無包含Sema結構域還不得而知。因此，通過Sema和/或PSI或IPT結構域與其他蛋白基序間的相互作用可能對于啟動特異性生物反應很重要(BertottiandComoglio，2003)，因此不能作為一種可能性被排除。對于RTKs例如成纖維細胞生長因子受體2(FGFR2)和RET，每一受體胞外結構域中半胱氨酸間的二硫鍵都與受體二聚化有關(Robertsonetal.，2000)。對于Met受體，本申請提供的數據表明無論是富含半胱氨酸PSI結構域還是四個IPT結構域在無Sema結構域時都沒有出現交聯，表明這些區域并非是Met二聚化所必需的。另外，盡管Met的PSI結構域缺失，Met與plexinB1間的相互作用都不改變(Giordanoetal.，2002)。盡管本申請的功能試驗中使用的rSema含有Sema和PSI結構域(參看材料和方法)，本申請的交聯試驗和報道的plexinB1中PSI結構域缺失(Giordanoetal.，2002)有力證明無PSI結構域時，Sema結構域在這些相互作用中發揮著主要作用。值得注意的是，制備內在PSI或IPT缺失的嘗試導致本發明試驗未使用的未-處理的Met的表達，因此，在Met二聚體形成或一些其他機制中，例如報道的EGFR二聚化自動抑制中，PSI和IPT結構域是否發揮作用還有待明確(Fergusonetal.，2003)。胞外Met晶體結構的解析將有助于更進一步了解這些復合體相互作用。RTKs的配體-受體復合體結晶圖研究已經提供了幾種框架性的觀點(structuralinsights)。Flt-1和TrkA都利用配體的二聚化達到受體的二聚化和活化(Wiesmannetal.，1997；Wiesmannetal.，1999)。對于FGFR，與FGF配體結合的肝素能驅動受體二聚化(Plotnikovetal.，1999)。相反，EGF:EGFR(表皮生長因子受體)復合體通過受體同源二聚化，與配體-配體間相互作用無關(Garrettetal.，2002；Ogisoetal.，2002)。Met與HGF的相互作用不甚清晰，盡管近期報道提出Met、HGF及肝素以1∶1∶1復合體存在(Gherardietal.，2003)。我們的細胞試驗與報道的這些體外試驗結果不同，由于細胞成分例如細胞外基質(ECM)存在于我們的實驗中，可能對體內受體二聚化有一定影響。由于ECM含有層粘連蛋白及其他參與細胞相互作用的成分(GiancottiandRuoslahti，1999)，因此很可能所有促進Met二聚化的蛋白還沒有得以鑒定。本發明證明，Sema結構域對于與HGF的相互作用已足夠，這與先前的觀察(Gherardi等，2003)一致，并且rSema能抑制配體驅動的Met活化。因此，很可能rSema可以通過結合HGF有效地抑制HGF-依賴性的Met活化。另外，還發現HGF依賴的Met過表達腫瘤會成為rSema的靶標，方式與RonSema結構域介導的配體-依賴性受體活化相似(Angelonietal.，2003)。本申請提供的數據表明Sema-HGF相互作用位點不同于Met二聚化界面，因為交聯試驗表明配體-非依賴性的Met二聚體當與HGF結合時進一步移動(圖4)。這些數據說明二聚化界面與HGF相互作用位點是不-重疊的。此外，本申請還發現Sema結構域對于已知c-met拮抗劑抗體，抗-Met5D5-Fab的結合是必需的。由于抗-Met5D5-Fab還能抑制配體-非依賴性的受體活化，如本申請試驗顯示那樣，所以除HGF競爭之外，抗-Met5D5-Fab可以通過空間位阻阻斷受體二聚化。同樣地，rSema也能抑制配體非依賴性及依賴性的Met活性，表明rSema可以用作有效的Met抑制劑。類似的抑制活性對c-kit受體已有報道(Levetal.，1992)。在本試驗提供的配體非依賴環境中，MetSema結構域在二聚化中的作用不同于Ronsema結構域的作用。盡管RonSema結構域能夠競爭結合MSP抑制Ron活性，但是它不能抑制Ron受體的二聚化(Angelonietal.，2003)。本申請的功能性試驗是在有或無HGF存在下進行的，說明MetSema結構域對配體依賴性和配體非依賴性的受體活化都能抑制。這些數據表明盡管Met與Ron的結構基元及結合相互作用類似，體內環境可能確定了不同的同嗜的相互作用。本申請證明MetSema結構域不僅是配體依賴性Met受體活化的強效抑制劑，而且也是配體非依賴性Met受體活化的強效抑制劑。本申請的數據表明Met的Sema結構域能阻止腫瘤細胞中的受體活化，從而抑制MAPK磷酸化、細胞運動力及遷移。這些試驗結果提供了通過定向Met的Sema結構域作用治療與HGF/c-met信號轉導軸失調相關腫瘤的可能性，包括但不限于使用Sema結構域自身作為生物治療藥物。部分參考文獻列表Angeloni，D.，Danilkovitch-Miagkova，A.，Miagkov，A.，Leonard，E.J.，andLerman，M.I.(2003).ThesolublesemadomainoftheRonreceptorinhibitsMSP-inducedreceptoractivation.JBiolChem.Antipenko，A.，Himanen，J.P.，vanLeyen，K.，Nardi-Dei，V.，Lesniak，J.，Barton，W.A.，Rajashankar，K.R.，Lu，M.，Hoemme，C.，Puschel，A.W.，andNikolov，D.B.(2003).Structureofthesemaphorin-3Areceptorbindingmodule.Neuron39，589-598.Bardelli，A.，Longati，P.，Gramaglia，D.，Stella，M.C.，andComoglio，P.M.(1997).Gab1couplingtotheHGF/MetreceptormultifunctionaldockingsiterequiresbindingofGrb2andcorrelateswiththetransformingpotential.Oncogene15，3103-3111.Bertotti，A.，andComoglio，P.M.(2003).TyrosinekinasesignalspecificitylessonsfromtheHGFreceptor.TrendsBiochemSci28，527-533.Bladt，F.，Riethmacher，D.，Isenmann，S.，Aguzzi，A.，andBirchmeier，C.(1995).Essentialroleforthec-metreceptorinthemigrationofmyogenicprecursorcellsintothelimbbud.Nature376，768-771.Blechman，J.M.，Lev，S.，Barg，J.，Eisenstein，M.，Vaks，B.，Vogel，Z.，Givol，D.，andYarden，Y.(1995).Thefourthimmunoglobulindomainofthestemcellfactorreceptorcouplesligandbindingtosignaltransduction.Cell80，103-113.Boix，L.，Rosa，J.L.，Ventura，F.，Castells，A.，Bruix，J.，Rodes，J.，andBartrons，R.(1994).c-metmRNAoverexpressioninhumanhepatocellularcarcinoma.Hepatology19，88-91.Bottaro，D.P.，Rubin，J.S.，Faletto，D.L.，Chan，A.M.，Kmiecik，T.E.，VandeWoude，G.F.，andAaronson，S.A.(1991).Identificationofthehepatocyte，growthfactorreceptorasthec-metproto-oncogeneproduct.Science251，802-804.Bussolino，F.，DiRenzo，M.F.，Ziche，M.，Bocchietto，E.，Olivero，M.，Naldini，L.，Gaudino，G.，Tamagnone，L.，Coffer，A.，andComoglio，P.M.(1992).Hepatocytegrowthfactorisapotentangiogenicfactorwhichstimulatesendothelialcellmotilityandgrowth.JCellBiol119，629-641.Coltella，N.，Manara，M.C.，Cerisano，V.，Trusolino，L.，DiRenzo，M.F.，Scotlandi，K.，andFerracini，R.(2003).RoleoftheMET/HGFreceptorinproliferationandinvasivebehaviorofosteosarcoma.FasebJ17，1162-1164.Cooper，C.S.，Park，M.，Blair，D.G.，Tainsky，M.A.，Huebner，K.，Croce，C.M.，andVandeWoude，G.F.(1984).Molecularcloningofanewtransforminggenefromachemicallytransformedhumancellline.Nature311，29-33.DiRenzo，M.F.，Olivero，M.，Giacomini，A.，Porte，H.，Chastre，E.，Mirossay，L.，Nordlinger，B.，Bretti，S.，Bottardi，S.，Giordano，S.，andetal.(1995).Overexpressionandamplificationofthemet/HGFreceptorgeneduringtheprogressionofcolorectalcancer.ClinCancerRes1，147-154.Ferguson，K.M.，Berger，M.B.，Mendrola，J.M.，Cho，H.S.，Leahy，D.J.，andLemmon，M.A.(2003).EGFactivatesitsreceptorbyremovinginteractionsthatautoinhibitectodomaindimerization.MolCell11，507-517.Furge，K.A.，Zhang，Y.W.，andVandeWoude，G.F.(2000).Metreceptortyrosinekinaseenhancedsignalingthroughadapterproteins.Oncogene19，5582-5589.Garrett，T.P.，McKern，N.M.，Lou，M.，Elleman，T.C.，Adams，T.E.，Lovrecz，G.O.，Zhu，H.J.，Walker，F.，Frenkel，M.J.，Hoyne，P.A.，etal.(2002).Crystalstructureofatruncatedepidermalgrowthfactorreceptorextracellulardomainboundtotransforminggrowthfactoralpha.Cell110，763-773.Gherardi，E.，Youles，M.E.，Miguel，R.N.，Blundell，T.L.，Iamele，L.，Gough，J.，Bandyopadhyay，A.，Hartmann，G.，andButler，P.J.(2003).FunctionalmapanddomainstructureofMET，theproductofthec-metprotooncogeneandreceptorforhepatocytegrowthfactor/scatterfactor.ProcNatlAcadSciUSA.Giancotti，F.G.，andRuoslahti，E.(1999).Integrinsignaling.Science285，1028-1032.Giordano，S.，Corso，S.，Conrotto，P.，Artigiani，S.，Gilestro，G.，Barberis，D.，Tamagnone，L.，andComoglio，P.M.(2002).Thesemaphorin4DreceptorcontrolsinvasivegrowthbycouplingwithMet.NatCellBiol4，720-724.Giordano，S.，DiRenzo，M.F.，Narsimhan，R.P.，Cooper，C.S.，Rosa，C.，andComoglio，P.M.(1989).Biosynthesisoftheproteinencodedbythec-metproto-oncogene.Oncogene4，1383-1388.Giordano，S.，Maffe，A.，Williams，T.A.，Artigiani，S.，Gual，P.，Bardelli，A.，Basilico，C.，Michieli，P.，andComoglio，P.M.(2000).Differentpointmutationsinthemetoncogeneelicitdistinctbiologicalproperties.FasebJ14，399-406.Hamanoue，M.，Takemoto，N.，Matsumoto，K.，Nakamura，T.，Nakajima，K.，andKohsaka，S.(1996).Neurotrophiceffectofhepatocytegrowthfactoroncentralnervoussystemneuronsinvitro.JNeurosciRes43，554-564.Hartmann，G.，Weidner，K.M.，Schwarz，H.，andBirchmeier，W.(1994).Themotilitysignalofscatterfactor/hepatocytegrowthfactormediatedthroughthereceptortyrosinekinasemetrequiresintracellularactionofRas.JBiolChem269，21936-21939.Jeffers，M.，Rong，S.，andVandeWoude，G.F.(1996).Enhancedtumorigenicityandinvasion-metastasisbyhepatocytegrowthfactor/scatterfactor-metsignallinginhumancellsconcomitantwithinductionoftheurokinaseproteolysisnetwork.MolCellBiol16，1115-1125.Jeffers，M.，Schmidt，L.，Nakaigawa，N.，Webb，C.P.，Weirich，G.，Kishida，T.，Zbar，B.，andVandeWoude，G.F.(1997).Activatingmutationsforthemettyrosinekinasereceptorinhumancancer.ProcNatlAcadSciUSA94，11445-11450.Jin，L.，Fuchs，A.，Schnitt，S.J.，Yao，Y.，Joseph，A.，Lamszus，K.，Park，M.，Goldberg，I.D.，andRosen，E.M.(1997).Expressionofscatterfactorandc-metreceptorinbenignandmalignantbreasttissue.Cancer79，749-760.Kuniyasu，H.，Yasui，W.，Yokozaki，H.，Kitadai，Y.，andTahara，E.(1993).Aberrantexpressionofc-metmRNAinhumangastriccarcinomas.IntJCancer55，72-75.Lev，S.，Yarden，Y.，andGivol，D.(1992).Arecombinantectodomainofthereceptorforthestemcellfactor(SCF)retainsligand-inducedreceptordimerizationandantagonizesSCF-stimulatedcellularresponses.JBiolChem267，10866-10873.Liu，C.，Park，M.，andTsao，M.S.(1992).Overexpressionofc-metproto-oncogenebutnotepidermalgrowthfactorreceptororc-erbB-2inprimaryhumancolorectalcarcinomas.Oncogene7，181-185.Lokker，N.A.，Mark，M.R.，Luis，E.A.，Bennett，G.L.，Robbins，K.A.，Baker，J.B.，andGodowski，P.J.(1992).Structure-functionanalysisofhepatocytegrowthfactoridentificationofvariantsthatlackmitogenicactivityyetretainhighaffinityreceptorbinding.EmboJ11，2503-2510.Lorenzato，A.，Olivero，M.，Patane，S.，Rosso，E.，Oliaro，A.，Comoglio，P.M.，andDiRenzo，M.F.(2002).NovelsomaticmutationsoftheMEToncogeneinhumancarcinomametastasesactivatingcellmotilityandinvasion.CancerRes62，7025-7030.Love，C.A.，Harlos，K.，Mavaddat，N.，Davis，S.J.，Stuart，D.I.，Jones，E.Y.，andEsnouf，R.M.(2003).Theligand-bindingfaceofthesemaphorinsrevealedbythehigh-resolutioncrystalstructureofSEMA4D.NatStructBiol10，843-848.Maina，F.，Casagranda，F.，Audero，E.，Simeone，A.，Comoglio，P.M.，Klein，R.，andPonzetto，C.(1996).UncouplingofGrb2fromtheMetreceptorinvivorevealscomplexrolesinmuscledevelopment.Cell87，531-542.Matsumoto，K.，andNakamura，T.(1993).RolesofHGFasapleiotropicfactorinorganregeneration.Exs65，225-249.Maulik，G.，Shrikhande，A.，Kijima，T.，Ma，P.C.，Morrison，P.T.，andSalgia，R.(2002).Roleofthehepatocytegrowthfactorreceptor，c-Met，inoncogenesisandpotentialfortherapeuticinhibition.CytokineGrowthFactorRev13，41-59.Meiners，S.，Brinkmann，V.，Naundorf，H.，andBirchmeier，W.(1998).Roleofmorphogeneticfactorsinmetastasisofmammarycarcinomacells.Oncogene16，9-20.Morello，S.，Olivero，M.，Aimetti，M.，Bernardi，M.，Berrone，S.，DiRenzo.M.F.，andGiordano，S.(2001).METreceptorisoverexpressedbutnotmutatedinoralsquamouscellcarcinomas.JCellPhysiol189，285-290.Naka，D.，Ishii，T.，Yoshiyama，Y.，Miyazawa，K.，Hara，H.，Hishida，T.，andKidamura，N.(1992).Activationofhepatocytegrowthfactorbyproteolyticconversionofasinglechainformtoaheterodimer.JBiolChem267，20114-20119.Naldini，L.，Weidner，K.M.，Vigna，E.，Gaudino，G.，Bardelli，A.，Ponzetto，C.，Narsimhan，R.P.，Hartmann，G.，Zarnegar，R.，Michalopoulos，G.K.，andetal.(1991).ScatterfactorandhepatocytegrowthfactorareindistinguishableligandsfortheMETreceptor.EmboJ10，2867-2878.Natali，P.G.，Prat，M.，Nicotra，M.R.，Bigotti，A.，Olivero，M.，Comoglio，P.M.，andDiRenzo，M.F.(1996).Overexpressionofthemet/HGFreceptorinrenalcellcarcinomas.IntJCancer69，212-217.Nguyen，L.，Holgado-Madruga，M.，Maroun，C.，Fixman，E.D.，Kamikura，D.，Fournier，T.，Charest，A.，Tremblay，M.L，Wong，A.J.，andPark，M.(1997).AssociationofthemultisubstratedockingproteinGab1withthehepatocytegrowthfactorreceptorrequiresafunctionalGrb2bindingsiteinvolvingtyrosine1356.JBiolChem272，20811-20819.Nusrat，A.，Parkos，C.A.，Bacarra，A.E.，Godowski，P.J.，Delp-Archer，C.，Rosen，E.M.，andMadara，J.L.(1994).Hepatocytegrowthfactor/scatterfactoreffectsonepithelia.Regulationofintercellularjunctionsintransformedandnontransformedcelllines，basolateralpolarizationofc-metreceptorintransformedandnaturalintestinalepithelia，andinductionofrapidwoundrepairinatransformedmodelepithelium.JClinInvest93，2056-2065.Ogiso，H.，Ishitani，R.，Nureki，O.，Fukai，S.，Yamanaka，M.，Kim，J.H.，Saito，K.，Sakamoto，A.，Inoue，M.，Shirouzu，M.，andYokoyama，S.(2002).Crystalstructureofthecomplexofhumanepidermalgrowthfactorandreceptorextracellulardomains.Cell110，775-787.Olivero，M.，Rizzo，M.，Madeddu，R.，Casadio，C.，Pennacchietti，S.，Nicotra，M.R.，Prat，M.，Maggi，G.，Arena，N.，Natali，P.G.，etal.(1996).Overexpressionandactivationofhepatocytegrowthfactor/scatterfactorinhumannon-small-celllungcarcinomas.BrJCancer74，1862-1868.Olivero，M.，Valente，G.，Bardelli，A.，Longati，P.，Ferrero，N.，Cracco，C.，Terrone，C.，Rocca-Rossetti，S.，Comoglio，P.M.，andDiRenzo，M.F.(1999).NovelmutationintheATP-bindingsiteoftheMEToncogenetyrosinekinaseinaHPRCCfamily.IntJCancer82，640-643.Orian-Rousseau，V.，Chen，L.，Sleeman，J.P.，Herrlich，P.，andPonta，H.(2002).CD44isrequiredfortwoconsecutivestepsinHGF/c-Metsignaling.GenesDev16，3074-3086.Park，M.，Dean，M.，Cooper，C.S.，Schmidt，M.，O′Brien，S.J.，Blair，D.G.，andVandeWoude，G.F.(1986).Mechanismofmetoncogeneactivation.Cell45，895-904.Peek，M.，Moran，P.，Mendoza，N.，Wickramasinghe，D.，andKirchhofer，D.(2002).Unusualproteolyticactivationofpro-hepatocytegrowthfactorbyplasmakallikreinandcoagulationfactorXIa.JBiolChem277，47804-47809.Pelicci，G.，Giordano，S.，Zhen，Z.，Salcini，A.E.，Lanfrancone，L.，Bardelli，A.，Panayotou，G.，Waterfield，M.D.，Ponzetto，C.，Pelicci，P.G.，andetal.(1995).ThemotogenicandmitogenicresponsestoHGFareamplifiedbytheShcadaptorprotein.Oncogene10，1631-1638.Plotnikov，A.N.，Schlessinger，J.，Hubbard，S.R.，andMohammadi，M.(1999).StructuralbasisforFGFreceptordimerizationandactivation.Cell98，641-650.Ponzetto，C.，Bardelli，A.，Zhen，Z.，Maina，F.，dallaZonca，P.，Giordano，S.，Graziani，A.，Panayotou，G.，andComoglio，P.M.(1994).Amultifunctionaldockingsitemediatessignalingandtransformationbythehepatocytegrowthfactor/scatterfactorreceptorfamily.Cell77，261-271.Ponzetto，C.，Zhen，Z.，Audero，E.，Maina，F.，Bardelli，A.，Basile，M.L.，Giordano，S.，Narsimhan，R.，andComoglio，P.(1996).SpecificuncouplingofGRB2fromtheMetreceptor.Differentialeffectsontransformationandmotility.JBiolChem271，14119-14123.Robertson，S.C.，Tynan，J.A.，andDonoghue，D.J.(2000).RTKmutationsandhumansyndromeswhengoodreceptorsturnbad.TrendsGenet16，265-271.Royal，I.，andPark，M.(1995).Hepatocytegrowthfactor-inducedscatterofMadin-Darbycaninekidneycellsrequiresphosphatidylinositol3-kinase.JBiolChem270，27780-27787.Schmidt，C.，Bladt，F.，Goedecke，S.，Brinkmann，V.，Zschiesche，W.，Sharpe，M.，Gherardi，E.，andBirchmeier，C.(1995).Scatterfactor/hepatocytegrowthfactorisessentialforliverdevelopment.Nature373，699-702.Schmidt，L.，Duh，F.M.，Chen，F.，Kishida，T.，Glenn，G.，Choyke，P.，Scherer，S.W.，Zhuang，Z.，Lubensky，I.，Dean，M.，etal.(1997).GermlineandsomaticmutationsinthetyrosinekinasedomainoftheMETproto-oncogeneinpapillaryrenalcarcinomas.NatGenet16，68-73.Schmidt，L.，Junker，K.，Nakaigawa，N.，Kinjerski，T.，Weirich，G.，Miller，M.，Lubensky，I.，Neumann，H.P.，Brauch，H.，Decker，J.，etal.(1999).NovelmutationsoftheMETproto-oncogeneinpapillaryrenalcarcinomas.Oncogene18，2343-2350.Suzuki，K.，Hayashi，N.，Yamada，Y.，Yoshihara，H.，Miyamoto，Y.，Ito，Y.，Ito，T.，Katayama，K.，Sasaki，Y.，Ito，A.，andetal.(1994).Expressionofthec-metprotooncogeneinhumanhepatocellularcarcinoma.Hepatology20，1231-1236.Tamagnone，L.，Artigiani，S.，Chen，H.，He，Z.，Ming，G.I.，Song，H.，Chedotal，A.，Winberg，M.L.，Goodman，C.S.，Poo，M.，etal.(1999).Plexinsarealargefamilyofreceptorsfortransmembrane，secreted，andGPI-anchoredsemaphorinsinvertebrates.Cell99，71-80.Tempest，P.R.，Stratton，M.R.，andCooper，C.S.(1988).Structureofthemetproteinandvariationofmetproteinkinaseactivityamonghumantumourcelllines.BrJCancer58，3-7.Trusolino，L.，Bertotti，A.，andComoglio，P.M.(2001).Asignalingadapterfunctionforalpha6beta4integrninthecontrolofHGF-dependentinvasivegrowth.Cell107，643-654.Uehara，Y.，Minowa，O.，Mori，C.，Shiota，K.，Kuno，J.，Noda，T.，andKitamura，N.(1995).Placentaldefectandembryoniclethalityinmicelackinghepatocytegrowthfactor/scatterfactor.Nature373，702-705.VanVactor，D.V.，andLorenz，L.J.(1999).NeuraldevelopmentThesemanticsofaxonguidance.CurrBiol9，R201-204.Weidner，K.M.，DiCesare，S.，Sachs，M.，Brinkmann，V.，Behrens，J.，andBirchmeier，W.(1996).InteractionbetweenGab1andthec-Metreceptortyrosinekinaseisresponsibleforepithelialmorphogenesis.Nature384，173-176.Wiesmann，C.，Fuh，G.，Christinger，H.W.，Eigenbrot，C.，Wells，J.A.，anddeVos，A.M.(1997).Crystalstructureat1.7AresolutionofVEGFincomplexwithdomain2oftheFlt-1receptor.Cell91，695-704.Wiesmann，C.，Ultsch，M.H.，Bass，S.H.，anddeVos，A.M.(1999).Crystalstructureofnervegrowthfactorincomplexwiththeligand-bindingdomainoftheTrkAreceptor.Nature401，184-188.權利要求1.一種能干擾c-met二聚化的c-met拮抗劑。2.權利要求1所述的c-met拮抗劑，其能干擾c-metSema結構域的二聚化功能。3.權利要求1所述的c-met拮抗劑，其能結合c-met從而干擾c-met二聚化。4.權利要求1所述的c-met拮抗劑，其結合c-met從而干擾c-metSema結構域影響c-met二聚化的能力。5.一種c-met拮抗劑，其能與c-metSema結構域中的序列特異性結合。6.權利要求1或5所述的拮抗劑，當與c-met分子結合時，其能抑制所述分子的二聚化。7.權利要求6所述的拮抗劑，其中所述的二聚化包括同源二聚化。8.權利要求1-7中任一項所述的拮抗劑，其不能與c-met上的HGF結合位點結合。9.權利要求1-8中任一項所述的拮抗劑，其基本上不能與肝細胞生長因子(HGF)競爭性結合c-met。10.權利要求1-9中任一項所述的拮抗劑，其基本上不能抑制肝細胞生長因子與c-met間的結合。11.權利要求1-8中任一項所述的拮抗劑，其能與HGF競爭性結合c-met。12.權利要求1-11中任一項所述的拮抗劑，其能與c-met上的表位結合，該表位不同于美國典型培養物保藏中心保藏號為ATCCHB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)雜交瘤制備的單克隆抗體所結合的表位。13.權利要求1-11中任一項所述的拮抗劑，其不是美國典型培養物保藏中心保藏號為ATCCHB-11894(雜交瘤1A3.3.13)或HB-11895(雜交瘤5D5.11.6)的雜交瘤細胞系制備的單克隆抗體。14.權利要求1-13中任一項所述的拮抗劑，其是一種抗體或其片段、肽，或其組合。15.權利要求1-14中任一項所述的拮抗劑，其中該拮抗劑與c-met的結合能抑制HGF依賴性或非依賴性的c-met活化。16.權利要求1-15中任一項所述的拮抗劑，其中該拮抗劑與細胞內c-met的結合能抑制該細胞的增殖，分散，形態發生和/或運動。17.權利要求1-16中任一項所述的拮抗劑，其中該拮抗劑包含其中含有至少一部分c-metSema結構域或其變體的肽。18.權利要求17所述的拮抗劑，其中所述肽含有至少一種選自下列的序列LDAQT(SEQIDNO1)，LTEKRKKRS(SEQIDNO2)，KPDSAEPM(SEQIDNO3)和NVRCLQHF(SEQIDNO4)。19.權利要求17所述的拮抗劑，其中所述肽基本上由至少一種選自下列的序列組成LDAQT(SEQIDNO1)，LTEKRKKRS(SEQIDNO2)，KPDSAEPM(SEQIDNO3)和NVRCLQHF(SEQIDNO4)。20.權利要求17所述的拮抗劑，其中所述肽含有序列LTEKRKKRS(SEQIDNO2)。21.權利要求17所述的拮抗劑，其中所述肽基本上由LTEKRKKRS(SEQIDNO2)組成。22.一種組合物，其中含有權利要求1-21任一項所述拮抗劑和載體。23.權利要求22所述的組合物，其中所述載體是藥物學上可接受的。24.一種編碼權利要求1-21任一項所述拮抗劑的核酸，其中所述拮抗劑包括多肽。25.權利要求24所述的核酸，其中所述拮抗劑包括抗體或其片段。26.一種載體，其中含有權利要求24或25所述的核酸。27.一種宿主細胞，其中含有權利要求26所述的載體。28.一種制品，其中包含一種容器；及裝在所述容器中的組合物，其中所述組合物含有權利要求1-21中任一項所述的拮抗劑。29.權利要求28所述制品，其中還包含用于指導向受試者施用所述拮抗劑的說明書。30.一種試劑盒，其中包含第一容器，其中裝有含權利要求1-21中任一項所述拮抗劑的組合物；及第二容器，其中含有緩沖液。31.權利要求30所述的試劑盒，其中所述緩沖液是藥物學上可接受的。32.權利要求30所述的試劑盒，其中還包含用于指導向受試者施用所述拮抗劑的說明書。33.一種篩選或鑒定c-met拮抗劑的方法，該方法包括讓侯選物質與一種其中含有至少一部分c-metSema結構域的靶分子接觸，從而將能特異性地結合所述靶分子的物質選定為c-met拮抗劑。34.權利要求33所述的方法，其中讓所選物質與表達c-met的細胞接觸，對所述細胞中c-met二聚化的抑制情況進行檢測或定量。35.權利要求34所述的方法，其中c-met二聚化的抑制用c-met活化量的減少指示。36.權利要求35所述的方法，其中c-met的活化量用c-met相關細胞信號轉導的量指示。37.權利要求36所述的方法，其中所述細胞信號轉導用蛋白質磷酸化指示。38.一種調節受試者體內c-met活化的方法，該方法包括向受試者施用c-metSema結構域調節物，從而調節c-met活性。39.一種能抑制c-met活化的細胞增殖的方法，該方法包括讓細胞或組織與權利要求1-21中任一項所述拮抗劑接觸，從而抑制與c-met活化相關的細胞增殖。40.一種治療受試者與c-met活化失調相關病理狀況的方法，該方法包括向所述受試者施用權利要求1-21中任一項所述的拮抗劑，從而抑制c-met活化。41.一種用于抑制表達c-met或肝細胞生長因子或兩者的細胞生長的方法，該方法包括讓所述細胞與權利要求1-21中任一項所述拮抗劑接觸，從而引發對所述細胞生長的抑制。42.一種對患有含表達c-met或肝細胞生長因子或兩者的細胞的癌性腫瘤的哺乳動物進行治療性處理的方法，該方法包括向所述哺乳動物施用治療有效量的權利要求1-21中任一項所述拮抗劑，從而有效治療所述哺乳動物。43.一種治療或防止細胞增殖病癥的方法，該細胞增殖病癥與c-met表達或活性升高或者肝細胞生長加快或者兩者相關，所述方法包括向確實需要治療的受試者施用有效量的權利要求1-21任一項所述c-met拮抗劑，從而有效治療或防止所述細胞增殖病癥。44.權利要求43所述的方法，其中所述的增殖病癥是癌癥。45.一種用于抑制細胞生長的方法，其中所述細胞的生長至少部分取決于c-met或肝細胞生長因子或兩者的生長加強作用，所述方法包括讓所述細胞與權利要求1-21中任一項所述拮抗劑接觸，從而有效地抑制所述細胞的生長。46.一種治療哺乳動物腫瘤的方法，其中所述腫瘤生長至少部分取決于c-met或肝細胞生長因子或兩者的生長加強作用，所述方法包括讓所述細胞與權利要求1-21中任一項所述拮抗劑接觸，從而有效地治療所述腫瘤。47.權利要求46所述的方法，其中所述的細胞是癌細胞。48.權利要求47所述的方法，其中所述癌細胞還進一步接受放療或化療。49.權利要求47所述的方法，其中所述癌細胞選自乳腺癌細胞、結腸直腸癌細胞、肺癌細胞、乳頭狀癌細胞、前列腺癌細胞、淋巴瘤細胞、結腸癌細胞、胰腺癌細胞、卵巢癌細胞、宮頸癌細胞、中樞神經系統癌細胞、骨肉瘤細胞、腎癌細胞、肝細胞癌細胞、膀胱癌細胞、胃癌細胞、頭及頸部鱗狀癌細胞、黑色素瘤細胞以及血癌細胞。50.權利要求47所述的方法，其中與相同組織來源的正常細胞相比，所述癌細胞以更高豐度表達c-met或肝細胞生長因子或者兩者。51.權利要求46所述的方法，其中所述肝細胞生長因子表達于不同的細胞。52.權利要求47所述的方法，其中與相同組織來源的正常細胞相比，所述癌細胞中的c-met活化增強。53.權利要求47所述的方法，該方法能引發所述細胞的死亡。54.權利要求40-53中任一項所述的方法，其中在無所述拮抗劑存在時c-met活化的發生不依賴于配體的存在。55.權利要求40-53中任一項所述的方法，其中在無所述拮抗劑存在時c-met的活化是配體依賴性的。全文摘要本發明提供了用于調節HGF/c－met信號傳導途徑的組合物和方法，具體而言，使用能夠干擾c－met多聚化的c－met拮抗劑調節c－met二聚化和/或配體與c－met的結合。文檔編號A61K38/08GK1922208SQ20048004157公開日2007年2月28日申請日期2004年12月10日優先權日2003年12月11日發明者戴尼利·M·威克拉馬辛格,莫妮卡·康－貝爾特蘭申請人:健泰科生物技術公司