專利名稱：凝血酶肽衍生物的藥物組合物的制作方法
相關申請本申請要求2003年12月31日申請的美國臨時申請系列No.60/533,730的權益，將其全部教導在此作為參考并入本文。
背景技術：
凝血酶為以前體，凝血酶原形式存在于血漿中的絲氨酸蛋白酶。已知凝血酶通過稱為非-蛋白酶解活化的凝血酶受體的特定細胞表面受體的激活而具有對來自不同組織的多種細胞的生長-促進活性。例如，已顯示凝血酶促進血管生成、新血管的生成以及刺激內皮細胞的增殖(參見，例如，美國專利5,352,664、5,500,412，其內容在此作為參考全部并入本文)。
凝血酶肽衍生物為合成的凝血酶類似物，其具有至少部分源自凝血酶的氨基酸序列并且對非蛋白酶解活化的凝血酶受體具有活性。例如，來自人凝血酶原氨基酸508-530的凝血酶肽衍生物已由本發明人描述用于促進凝血酶受體介導的細胞刺激和其在創傷的治療、刺激骨生長和軟骨生長或修復中的用途，以及用于促進心臟組織修復(參見，例如美國專利5,352,664、5,500,412、WO 02/07748、WO 02/005836、WO 02/004008和WO 03/013569，其內容在此作為參考全部并入本文)。
由于其對創傷治療、刺激骨生長和軟骨生長以及促進心臟修復的治療活性，凝血酶肽衍生物顯示作為藥物的巨大潛力。然而，令人遺憾的是，凝血酶肽衍生物對二聚作用高度敏感。例如，具有氨基酸序列H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO4)的凝血酶肽衍生物的一個實例TP508，隨著時間二聚化，并且在某些中性pH的緩沖溶液中具有約2至約4小時的半衰期以及在無菌鹽水中高肽濃度時約7天的半衰期(參見實施例1)。
因此有必要開發方法以在延長的時間內保持凝血酶肽衍生物的純度并且預防或降低二聚作用，以使凝血酶肽衍生物具有長的保存期限并且甚至在延長時間的保存后有可能遞送精確和可重現的劑量。
發明概述目前已發現包括凝血酶肽衍生物和二聚作用抑制劑的藥物組合物維持凝血酶肽衍生物的單體形式而基本無二聚物。二聚作用抑制劑為抑制或降低凝血酶肽衍生物二聚作用的化合物。二聚作用抑制劑包括螯合劑和/或含有巰基的化合物。在一個實施例中，螯合劑，乙二胺四乙酸(EDTA)存在時的TP508在4℃時維持其大于90％(重量)的單體形式2周時間(參見實施例3)。抗氧化劑也可與螯合劑和/或含有巰基的化合物聯合使用。根據此發現，本發明提供包含凝血酶肽衍生物和二聚作用抑制劑的新的藥物組合物，以及用于激活需要這種治療的患者中非蛋白酶解活化的凝血酶受體的方法。
本發明的一個實施方案為包含凝血酶肽衍生物和螯合劑和/或藥學可接受的含有巰基的化合物的藥物組合物。該藥物組合物此外可任選包含抗氧化劑。
本發明的另一個實施方案為用于激活需要這種治療的患者中非蛋白酶解活化的凝血酶受體的方法。該方法包括給予有效量的此處所述的藥物組合物的步驟。
本發明藥物組合物的優點包括凝血酶肽衍生物比以前可能的更長的保存期限。因此，甚至在保存長時期的時間后有可能遞送精確和可重現的凝血酶肽衍生物劑量。該藥物組合物可用于其中血管生成和細胞增殖可能有益的疾病和/或病癥的治療和/或預防。該藥物組合物可用于促進，例如骨生長、軟骨生長或修復和傷口如糖尿病性潰瘍的愈合以及刺激在缺乏治療時骨生長不會發生的部位的骨生長(例如，未愈合的骨折、骨或骨移植物中的空隙或間隙)。本發明的藥物組合物還可用于預防血管成形術后患者中的再狹窄和重現心臟組織中的血管。
附圖簡述
圖1為顯示TP508單體、二聚物，及其他(加合物等等)在與二聚作用抑制劑(硫代甘油(T)、EDTA(E)、硫代甘油和EDTA(TE)和N2下EDTA(EN))混合時(時間0)穩定性的圖。
圖2為顯示Pluronic凝膠中的TP508在二聚作用抑制劑(硫代甘油(T)、EDTA(E)、硫代甘油和EDTA(TE)和N2下EDTA(EN))存在時在4℃保存2周后穩定性的圖。
圖3為顯示Pluronic凝膠中的TP508在二聚作用抑制劑(硫代甘油(T)、EDTA(E)、硫代甘油和EDTA(TE)和N2下EDTA(EN))存在時在4℃保存2個月后穩定性的圖。
發明詳述申請人已發現凝血酶肽衍生物在二聚作用抑制劑如螯合劑或含有巰基的化合物存在時維持其單體形式而基本無二聚物例如在2個月的時間內單體的大于90％(重量)并且優選在2個月的時間內單體的大于95％(重量)(實施例3)。螯合劑和含有巰基的化合物可一起或分別使用以預防或降低凝血酶肽衍生物的二聚作用。任選抗氧化劑可與螯合劑和/或含有巰基的化合物聯合使用。
如此處所用的，″螯合劑″為具有可同時結合一個或多個金屬離子如舉例來說，鉛、鈷、鐵或銅離子的多個部位(2個、3個、4個或更多)的化合物。結合部位通常包括氧、氮、硫或磷。舉例來說，EDTA(乙二胺四乙酸)的鹽可形成至少4至6個通過四個乙酸部分(-CH2C(O)O-)的氧原子和EDTA乙二胺部分(＞N-CH2-CH2-N＜)的氮原子與一個金屬離子或多個金屬離子結合的鍵。當然螯合劑也包括具有結合一個或多個金屬離子的多個結合部位的聚合物。優選，本發明的螯合劑為無毒的并且在給藥劑量下不導致不可接受的副作用。作為本發明的螯合劑，銅-螯合劑為優選的。″銅-螯合劑″指的是可結合一個銅離子或多個銅離子的螯合劑。銅-螯合劑的實例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、青霉胺、三乙撐四胺、N，N′-二乙基二硫代氨基甲酸鹽(DDC)、2，3，2′-四胺(2，3，2′-tet)、新亞銅試劑、N，N，N′，N′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)、1，10-菲咯啉(PHE)、四亞乙基五胺(TEPA)、三亞乙基四胺和三(2-羧乙基)膦(TCEP)。另外的螯合劑為二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和紅菲繞啉二磺酸(BPADA)。EDTA為優選的螯合劑。本發明藥物組合物中存在的螯合劑的一般量為約0.00001％至約0.1％(重量)之間，優選約0.0001％至約0.05％(重量)之間。
如此處所用的，″藥物可接受的含有巰基的化合物″為包含至少一個巰基(-SH)基團并且其在給藥劑量下不導致不可接受的副作用的化合物。藥物可接受的含有巰基的化合物的實例包括硫代甘油、巰基乙醇、硫甘醇、硫二甘醇、半胱氨酸、硫葡糖、二硫蘇糖醇(DTT)和二硫-雙-馬來酰亞胺乙烷(DTME)。通常，本發明的藥物組合物中含有約0.001％至約5％(重量)之間，優選約0.05％至約1.0％(重量)之間的藥物可接受的含有巰基的化合物。
如此處所用的，″抗氧化劑″為用于預防或降低由氧化劑如氧引起的氧化反應的化合物。抗氧化劑的實例包括生育酚、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、生育三烯酚、二甲基甘氨酸、甜菜堿、丁基化羥基苯甲醚、丁化羥基甲苯、維生素E、抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酸酯、巰基乙酸和抗氧化肽如舉例來說，姜黃素(turmerin)。通常，本發明的藥物組合物中含有約0.001％至約10％(重量)之間，優選約0.01％至約5％之間，更優選約0.05％至約2.0％(重量)之間的抗氧化劑。
當然某些螯合劑或含有巰基的化合物也可起抗氧化劑作用，例如，三(2-羧乙基)膦、半胱氨酸或二硫蘇糖醇。然而，其他類型的常用抗氧化劑不含有巰基基團。還應理解的是某些含有巰基的化合物也可起螯合劑作用，例如二硫蘇糖醇。然而，其他類型的常用螯合劑不含有巰基基團。還應理解的是本發明的藥物組合物可包含一種以上螯合劑、含有巰基的化合物或抗氧化劑。也就是說，例如，螯合劑可單獨或與一種或多種其他合適的螯合劑聯合使用。
″凝血酶受體激動劑″指的是刺激或激活非蛋白酶解活化的凝血酶受體(NPAR)的化合物(R.Horvat，等，J.Cell Sci.108，1155-1164，1995)。刺激NPAR的化合物稱為NPAR激動劑。NPAR為大多數細胞表面上存在的高-親合力凝血酶受體。該NPAR組分主要負責凝血酶、蛋白酶解滅活的凝血酶和凝血酶衍生肽與細胞的高-親合力結合。NPAR看來介導許多由凝血酶起動的細胞信號而與其蛋白酶解活性無關。一種所述信號的實例為錨定蛋白V和其他通過扣除雜交法(參見Sower，等，Experimental Cell Research 247422(1999))鑒定的分子的上調。NPAR因此通過其與細胞表面凝血酶的高親合力相互作用和其通過凝血酶蛋白酶解無活性的衍生物和如下述凝血酶衍生肽激動劑的激活來表征。NPAR的激活可根據分子在凝血酶或如美國專利5,352,664和5,500,412中公開的激活蛋白激酶C的分子以亞促有絲分裂濃度存在時添加至成纖維細胞而刺激細胞增殖的能力來測定。這些專利的全部教導在此作為參考并入本文。NPAR激動劑可通過此激活或通過其與結合于細胞的125I-凝血酶競爭的能力來鑒定。凝血酶肽衍生物為凝血酶受體激動劑的實例。凝血酶肽衍生物為具有小于約50個氨基酸，優選小于約33個氨基酸的多肽并且具有與對應于凝血酶原氨基酸508-530的人凝血酶片段(Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-ValSEQ ID NO3)足夠的同源性，以使該凝血酶肽衍生物對NPAR具有至少25％的TP508活性，優選至少50％。此處所述的凝血酶肽衍生物優選具有約14至23個的氨基酸，更優選約19至23個的氨基酸。可任選地，此處所述的凝血酶肽衍生物可具有C末端酰胺和/或酰化的N-末端。
″酰化的N-末端″為其中N末端氨基酸殘基的氮被酰化的N-末端。例如，酰化的N末端氨基酸殘基具有式R3C(O)-NH-CHRaC(O)-。Ra為氨基酸側鏈，并且R3為氫(-H)或C1-C6烷基，優選甲基(-CH3)基團。優選的酰基基團為乙酰基。N-末端的″-H″表明N-末端為未被取代的；而N-末端未標示表明該末端為酰化的或未被取代的。
″C末端酰胺″為其中α羧酸由酰胺替代的C末端氨基酸殘基上的酰胺。例如，酰胺化的C末端氨基酸殘基具有式-NH-CH(Ra)C(O)-NR4R5。Ra為氨基酸側鏈，并且R4和R5分別為-H、C1-C6烷基，或與其所鍵合的氮原子一起形成雜環基團如哌啶基、嗎啉基、硫代嗎啉基或吡咯烷基。優選，C-末端酰胺為羧酰胺(-C(O)NH2)。如此處所用的，C-末端的″-NH2″表示C-末端羧酰胺；C-末端的″-OH″表明該肽具有游離的C-末端；而C-末端未標示表明該肽在C-末端為酰胺化的或具有游離的C-末端。
優選，凝血酶肽衍生物的N-末端為游離的(即，未被取代的)并且C-末端為游離的(即，未被取代的)或酰胺化的，優選羧酰胺(即，-C(O)NH2)。
用于所公開組合物中的優選的凝血酶肽衍生物由下列氨基酸序列組成R1-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2SEQ ID NO1。R1為-H或R3-C(O)-；R2為-OH或-NR4R5；R3為-H或C1-C6烷基(優選-CH3)；并且R4和R5分別為-H、C1-C6烷基或與其所鍵合的氮原子一起形成非芳香族的雜環基團如哌啶基、嗎啉基、硫代嗎啉基或吡咯烷基(優選R4和R5都為-H)。優選R1為-H并且R2為-NH2；或R1為-H并且R2為-OH。或者，可用于所公開制劑中的凝血酶肽衍生物具有SEQ ID NO5的氨基酸序列R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2。R1和R2如上所述。然而，應理解的是在該凝血酶肽衍生物的1-9和15-23位上的0個、1個、2個或3個氨基酸可不同于SEQ ID NO1中相應的氨基酸。還應理解的是在該凝血酶肽衍生物1-14和20-33位上的0個、1個、2個或3個氨基酸可不同于SEQ ID NO5中相應的氨基酸。優選，該凝血酶肽衍生物中不同于SEQ ID NO1或SEQ ID NO5中相應氨基酸的氨基酸為保守置換，并且更優選為高度保守置換。或者，具有至少14個氨基酸的SEQ ID NO1的凝血酶肽衍生物的N末端截短的片段或具有至少18個氨基酸的SEQ ID NO1的凝血酶肽衍生物的C末端截短的片段可用于該制劑中。另一種選擇是，具有至少19個氨基酸的SEQ ID NO5的凝血酶肽衍生物的N末端截短的片段或具有至少23個氨基酸的SEQ ID NO5的凝血酶肽衍生物的C末端截短的片段可用于該制劑中。
″C末端截短的片段″指的是從C-末端除去一個氨基酸或氨基酸的區組而剩余的片段。″N末端截短的片段″指的是從N-末端除去一個氨基酸或氨基酸的區組而剩余的片段。如上所述，應理解的是術語″C末端截短的片段″和″N末端截短的片段″包括N-末端的酰基化和/或C-末端的酰胺化。如上所述，還應理解的是本發明包括在截短之前對原始凝血酶肽衍生物中的氨基酸殘基進行了修飾的C末端截短的片段和N末端截短的片段。
用于所公開組合物中的另一種優選的凝血酶肽衍生物由SEQ IDNO2的氨基酸序列組成R1-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-R2。X1為Glu或Gln；X2為Phe、Met、Leu、His或Val；并且R1和R2如上所述。用于所公開組合物中的另一種優選的凝血酶肽衍生物由SEQ ID NO6的氨基酸序列組成R1-Asp-Asn-Met-Phe-Cys-AlaGly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-Met-Lys-Ser-Pro-Phe-R2。X1為Glu或Gln；X2為Phe、Met、Leu、His或Val；并且R1和R2如上所述。或者，具有至少14個氨基酸的SEQ ID NO2的凝血酶肽衍生物的N末端截短的片段或具有至少18個氨基酸的SRQ ID NO2的凝血酶肽衍生物的C末端截短的片段可用于該制劑中。另一種選擇是，具有至少19個氨基酸的SEQ ID NO6的凝血酶肽衍生物的N末端截短的片段或具有至少23個氨基酸的SEQ ID NO6的凝血酶肽衍生物的C末端截短的片段可用于該制劑中。
用于所公開組合物中的另一種優選的凝血酶肽衍生物包括SEQ IDNO3的氨基酸序列Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val。該肽優選為23個氨基酸的長度。
用于所公開組合物中的另一種優選的凝血酶肽衍生物為TP508。TP508為具有SEQ ID NO4氨基酸序列的凝血酶肽衍生物的實例H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2。凝血酶肽衍生物的另一個實例具有SEQ ID NO7的氨基酸序列H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-OH(″脫酰胺TP508″)。
由結構式(I)表示的，優選14至23個氨基酸長度的凝血酶肽衍生物也可用于所公開的制劑中Asp-Ala-R (I)，其中R為絲氨酸酯酶保守區域。絲氨酸酯酶，例如胰蛋白酶、凝血酶胰凝乳蛋白酶等等，具有高度保守的區域。″絲氨酸酯酶保守區域″指的是具有這些保守區域之一的氨基酸序列的多肽或與這些保守區域之一足夠同源而使得該凝血酶肽衍生物保留NPAR激活能力。在一個實施方案中，絲氨酸酯酶保守序列具有SEQ ID NO.8的氨基酸序列(Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val)或是具有SEQ IDNO.8氨基酸序列的多肽的C末端截短的片段。
可用于所公開制劑中的凝血酶肽衍生物的其他實例包括TP508(或脫酰胺TP508)N末端截短的片段、具有至少14個氨基酸的N末端截短的片段或TP508(或脫酰胺TP508)C末端截短的片段、具有至少18個氨基酸的C末端截短的片段。可任選地，這些肽在C-末端被酰胺化并且在N-末端未被取代。可任選地，在另一種選擇中，這些肽在C-末端被酰胺化為-C(O)-NH2并且在N-末端未被取代。
″保守置換″為一個氨基酸用具有相同凈電荷和大致相同大小與形狀的另一個氨基酸的替換。當其側鏈中碳和雜原子總數相差不超過約四個時，具有脂肪族的或取代的脂肪族的氨基酸側鏈的氨基酸具有大致相同的大小。當其側鏈中的分支數相差不超過一個時，其具有大致相同的形狀。其側鏈中具有苯基或取代的苯基的氨基酸被認為具有幾乎相同的大小與形狀。下列為5組氨基酸。將多肽中的一個氨基酸用來自相同組的另一個氨基酸替換導致保守置換I組甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸和具有C1-C4脂肪族或C1-C4羥基取代的脂肪族側鏈(直鏈或單支鏈)的非天然存在的氨基酸。
II組谷氨酸、天冬氨酸和具有羧酸取代的C1-C4脂肪族側鏈(無支鏈或一個分支點)的非天然存在的氨基酸。
III組賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸和具有胺或胍基取代的C1-C4脂肪族側鏈(無支鏈或一個分支點)的非天然存在的氨基酸。
IV組谷氨酰胺、天冬酰胺和具有酰胺取代的C1-C4脂肪族側鏈(無支鏈或一個分支點)的非天然存在的氨基酸。
V組苯丙氨酸、苯基甘氨酸、酪氨酸和色氨酸。
″高度保守置換″為一個氨基酸用側鏈中具有相同的官能團和大小與形狀幾乎相同的另一個氨基酸的替換。當其側鏈中碳和雜原子總數相差不超過兩個時，具有脂肪族的氨基酸或取代的脂肪族氨基酸側鏈的氨基酸具有幾乎相同的大小。當其側鏈中具有相同的分支數時，其具有幾乎相同的形狀。高度保守置換的實例包括亮氨酸用纈氨酸替代、絲氨酸用蘇氨酸替代、谷氨酸用天冬氨酸替代以及苯丙氨酸用苯基甘氨酸替代。非高度保守取代的實例包括纈氨酸用丙氨酸替代、絲氨酸用丙氨酸替代以及絲氨酸用天冬氨酸取代。
在一個實施方案中，該公開的藥物組合物包含凝血酶肽衍生物和螯合劑或藥物可接受的含有巰基的化合物。優選，該公開的藥物組合物包含凝血酶肽衍生物；螯合劑；和藥物可接受的含有巰基的化合物。作為本發明的螯合劑，如之前所述的銅-螯合劑為優選的。
或者，該公開的藥物組合物包含凝血酶肽衍生物和螯合劑，優選銅-螯合劑和/或藥物可接受的含有巰基的化合物，并且進一步包含抗氧化劑。
在一個優選的實施方案中，該公開的藥物組合物包含凝血酶肽衍生物和螯合劑，優選銅-螯合劑，以及抗氧化劑。在一個更優選的實施方案中，該公開的藥物組合物包含凝血酶肽衍生物和螯合劑，優選銅-螯合劑，以及甲硫氨酸。優選，螯合劑為EDTA。
優選，該公開的藥物組合物的pH范圍在約5至約6之間，更優選，在約5.5至約6之間。在一個實例中，包含凝血酶肽衍生物和螯合劑，優選銅-螯合劑以及抗氧化劑的藥物組合物的pH范圍在約5至約6之間，更優選，在約5.5至約6之間。在該組合物中，優選抗氧化劑為甲硫氨酸。
本發明的另一個實施方案為用于激活需要這種治療的患者中非蛋白酶解活化的凝血酶受體的方法。該方法包括給予有效量的此處所述的藥物組合物的步驟。
″患者″優選為人，但也可以是需要用凝血酶受體激動劑治療的動物，例如，陪伴動物(例如，狗、貓等)、家畜(例如，母牛、豬、馬等)和實驗動物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。
″需要用凝血酶受體激動劑治療″的患者為患有可用凝血酶受體激動劑和凝血酶肽衍生物治療以獲得有益的治療和/或預防效果的疾病和/或病癥的患者。有益的效果包括癥狀嚴重程度的降低或癥狀發作的延緩、增加的壽命和/或疾病或病癥更快或更完全的消退。例如，需要治療的患者需要涉及軟骨細胞的細胞增殖、血管生成、骨生長、心臟修復、傷口愈合、軟骨生長或修復或再狹窄的抑制。
已顯示凝血酶肽衍生物刺激內皮細胞、成纖維細胞和角質細胞的增殖(參見，例如，美國專利5,352,664、5,500,412，其內容在此作為參考全部并入本文)。凝血酶肽衍生物因此可用于促進急性傷口如舉例來說，燒傷、皮膚創傷、外科手術創傷和骨折的愈合。此外，凝血酶肽衍生物最近顯示在促進慢性傷口如，糖尿病性潰瘍、靜脈曲張性潰瘍和褥瘡的愈合中尤其有效(參見，例如，WO 03/013569，其內容在此作為參考全部并入本文)。還顯示凝血酶肽衍生物刺激軟骨的生長或修復以及軟骨細胞的生長(參見，例如，WO 02/07748，其內容在此作為參考全部并入本文)。因此，凝血酶肽衍生物可用于在例如患有骨關節炎或關節損傷的患者中刺激軟骨的生長或修復或軟骨細胞的生長和修復。凝血酶肽衍生物的其他用途包括刺激骨生長以促進單純骨折、未愈合骨折、骨和骨移植物中空隙和間隙的愈合，預防血管成形術后患者的再狹窄以及促進心臟組織的血管重現(參見，例如，WO 02/005836、WO 02/004008和美國專利申請公開2002/0128202，其內容在此作為參考全部并入本文)。
誘導的骨生長還可在患者內通常不會發現骨組織的某些部位，如需要骨移植或骨融合的部位(稱為″異位″部位)是治療上有益的。融合通常用于通過身體上使一個或多個椎骨與其相鄰椎骨連接來治療下背疼痛。通過這樣的融合產生的骨位于通常不被骨組織占據的部位。誘導的在這些異位部位的骨生長可充當″移植物替代物″，借此誘導的椎骨之間的骨生長代替移植物并且不需要第二次手術以獲得用于移植程序的骨。還需要骨生長的誘導用于治療后天性的和先天性的顱面及其他骨胳或牙齒異常(參見例如，Glowacki等，Lancet 1959(1981))；進行牙齒和牙周的重建，其中喪失的骨替換或骨增加例如在頜骨中是需要的；以及補充由牙周病引起的牙槽骨喪失以延緩或預防牙喪失(參見例如，Sigurdsson等，J.Periodontol.，66.511(1995))。
包含凝血酶肽衍生物的本發明藥物組合物因此可用于上述的這類治療。
″有效量″為與缺乏治療時相比，導致用凝血酶肽衍生物治療的病癥的臨床效果得到改善的本發明藥物組合物中凝血酶肽衍生物的量。給予的凝血酶肽衍生物的量取決于疾病或病癥的程度、嚴重程度和類型、所需治療的全部效果和藥物制劑的釋放特性。其也取決于患者的健康狀況、身材、體重、年齡、性別和對藥物的耐受性。通常，給予凝血酶肽衍生物足夠的時間以獲得所期望的治療效果。對于心臟修復的適應癥，通常將每一單次注射約0.1μM至10μM或更典型地約50至250μg的凝血酶肽衍生物給藥至損傷組織而用于修復速率令人滿意的提高。對于軟骨生長或修復的適應癥，通常給予每一單次用藥約0.1μg至每一單次用藥約1mg的，優選每20m3約25μ至約100μg的凝血酶肽衍生物。對于慢性皮膚潰瘍的治療，通常給予每一單次用藥約0.1μg至約1mg的，優選每一單次用藥約1μg至約100μg的凝血酶肽衍生物。尤其，對于慢性皮膚潰瘍的治療，給予每周一至七次用藥的凝血酶肽衍生物。對于骨生長的適應癥，通常給予每天約1μg至約1mg的，優選每天約5μg至約100μg的凝血酶肽衍生物。
在另一個實施方案中，該公開的藥物組合物進一步包含作為該藥物組合物一部分的藥物可接受載體。合適的藥物載體可含有惰性成分，其不抑制凝血酶肽衍生物的生物學活性以及螯合劑、含有巰基的化合物和抗氧化劑的功能。載體應該是生物相容的，即無毒的、無炎性的、無免疫原性的以及在給藥部位無其他不良反應的。藥物可接受載體根據所選擇的給藥途徑和所治療的適應癥而改變。藥物可接受載體的實例包括，例如鹽水、氣霧劑、市場上可買到的惰性凝膠或補充有白蛋白、甲基纖維素或膠原基質的液體。可使用標準的藥物制劑技術，例如Remington的Pharmaceutical Sciences，Mack PublishingCompany，Easton，PA中所述的那些。
本發明的組合物可以是溶液、懸浮液、乳劑、糖漿、凝膠、軟膏、洗劑、乳膏、糊劑、油灰、擠壓物、微粒、膠囊劑、片劑等等。
當凝血酶肽衍生物用于促進心臟修復和傷口愈合時通常使用凝膠制劑。凝膠由選自含油基質、水或乳劑-懸浮液基質的基質組成。含油基質含有固定油或烴類，例如白礦脂或礦物油，或吸收性基質，例如由一種或多種吸收性無水物質如無水羊毛脂組成。乳劑-懸浮液基質包含通常含有固定油、烴類等等，例如蠟、礦脂、礦物油等等的油相(分散相)，和包含水和任何水溶性物質例如添加的鹽的水相(連續相)。這兩相通過使用乳化劑，例如，如十二烷基硫酸鈉的表面活性劑，如阿拉伯膠膠態粘土、蜂膠等等的親水膠體而穩定。將膠凝劑添加至該基質中，其在基質中形成基體，提高其粘度至半固體的稠度。合適的膠凝劑的實例包括羥基丙基纖維素、丙烯酸聚合物、聚環氧乙烷的聚合物或乙烯和氧化丙烯的共聚物(參見Cao等，J.Biomater.Sci 9475(1998)和Sims等，Plast Reconstr.Surg.98843(1996)，其全部教導在此作為參考并入本文)。Pluronic凝膠為無毒的氧化乙烯和氧化丙烯的嵌段共聚物。其呈現熱固性，使得其能在室溫下以粘性液體存在，而在體溫下以凝膠存在。活性成分在凝膠劑的添加之前以所需的濃度添加至該制劑中或可在膠凝過程后混合。用于促進傷口愈合治療的凝膠可以局部外用形式給藥。凝膠的制備在實施例7中描述。
除了凝膠之外的用于局部外用給藥的制劑包括軟膏和乳膏。軟膏通常利用之前所述的含油基質制備。乳膏通常包含之前所述的乳劑-懸浮液基質。在基質形成后，活性成分以所需的濃度添加。
在另一個優選實施方案中，該公開的藥物組合物為凍干丸粒，其可在使用前重構。凍干丸粒通常用于如骨生長和心臟修復的適應癥。除了之前所述的其他活性成分外凍干組合物可任選地包含增量劑。合適的增量劑包括甘露糖醇、乳糖、纖維素、山梨糖醇、右旋糖、右旋糖酐、聚右旋糖、麥芽糖醇、木糖醇、異麥芽糖醇、赤蘚醇、甘油等等。凍干組合物可重構以形成溶液，并且根據給藥途徑和所需的制劑可含有輔助物質如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖劑、增粘添加劑、防腐劑等等。
本發明的藥物組合物通常為用于如骨生長、軟骨生長或修復以及心臟修復的持續釋放制劑。持續釋放制劑可用于藥物在數小時時間內的連續釋放。聚合物常常用于形成該持續釋放制劑。聚合物的實例包括聚α-羥基酯如聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)均聚物和共聚物、聚磷腈(PPHOS)、聚酐類和聚延胡索酸亞丙基酯(PPF)。
聚乳酸/聚乙醇酸(PLGA)均和共聚物作為持續釋放賦形劑在本領域中為大家所熟知。釋放速率可由熟練技術人員通過聚乳酸與聚乙醇酸的比例和聚合物分子量的改變而調整(參見Anderson，等，Adv.DrugDeliv.Rev.285(1997)，其全部教導在此作為參考并入本文)。在聚合物中摻入聚(乙二醇)作為共混物以形成微粒載體允許活性成分釋放特性的進一步的改變(參見，Cleek等，J.Control Release 48259(1997)，其全部教導在此作為參考并入本文)。陶瓷(Ceramics)如磷酸鈣和羥磷灰石也可摻入制劑中以改善機械性能。PLGA微粒也可與pluronic凝膠或膠原混合以防止聚集作用并且使該微粒適于直接注射。TP508的PLGA微球體的制備在WO 03/061690中詳細描述，其內容在此作為參考全部并入本文。
如下面結構式(I)所示，PPHOS聚合物在聚合物主鏈中包含交替的氮和磷而無碳 該聚合物的特性可通過鍵合于聚合物主鏈上的側基R和R′的合適改變來調節。例如，PPHOS的降解和由此引起的藥物釋放可通過改變水解不穩定性側基的數量來控制。例如，隨著咪唑基或乙基乙二醇取代的PPHOS的更多的摻入，觀察到降解速率的提高(參見Laurencin等，J Biomed Mater.Res.27963(1993)，其全部教導在此作為參考并入本文)，因此提高藥物釋放的速率。
結構式(II)中所示的聚酐類已經明確地限定了降解和釋放特性，這些特性可以通過改變疏水或親水單體如癸二酸和1，3-二(對-羧基苯氧基)丙烷的量來控制(參見Leong等，J.Biomed.Mater.Res.19941(1985)，其全部教導在此作為參考并入本文)。為了提高機械強度，酐類常常與酰亞胺共聚合以形成聚酐-共-酰亞胺。適合于整形外科應用的聚酐-共-酰亞胺的實例有聚(苯三酸基亞氨基-甘氨酸-共-1，6-雙(羧基苯氧基)己烷和焦苯三酸基亞氨基丙氨酸1，6-雙-(對-羧基苯氧基)己烷共聚物。
本發明的藥物組合物可通過任何合適的途徑，局部或全身給藥。通常，給藥途徑取決于所用制劑的類型和所治療的適應癥。局部給藥通常用于治療創傷。如之前詳細描述的，對于局部給藥，藥物組合物通常為乳膏、凝膠劑、軟膏或氣霧劑。對于某些適應癥如刺激骨生長、軟骨修復或生長以及心臟修復，直接將本發明的藥物組合物注射到或植入治療部位是有利的。
對于需要心臟修復、軟骨生長或修復以及骨生長的適應癥，本發明的藥物組合物通常為可注射的形式。例如，所公開的可注射的組合物可直接注射至需要骨生長的部位并且可方便地用于填充空隙和融合骨而無需侵入性的手術。″可注射的″指該物質可經注射器通過用于注射溶液、糊劑或凝膠劑的標準的注射針來注射。可注射的組合物可靜脈內或直接在需要治療的部位給藥。可注射的組合物可進一步包括生理鹽水、抑菌鹽水(包含約0.9％mg/mL苯甲醇的鹽水)、磷酸鹽緩沖鹽水、Hank′s溶液、Ringer′s乳酸鹽或補充有白蛋白、甲基纖維素或透明質酸的液體。可注射的組合物還可包括聚環氧乙烷的聚合物或乙烯和氧化丙烯的共聚物。如上所述，Pluronic凝膠為所述聚合物的實例并且呈現熱固性，允許其在室溫下以粘性液體存在，而在體溫下以凝膠存在。用于可注射遞送的組合物的其他成分包括聚延胡索酸亞丙基酯(PPF)共聚物的溶液和磷酸鈣陶瓷的糊劑(參見Schmitz等.，J.Oral Maxillofacial Surgery 571122(1999)，其全部教導在此作為參考并入本文)。
可植入的藥物組合物特別有益于如刺激骨生長、軟骨生長或修復和心臟修復的適應癥。″植入″或″部位給藥″指足夠接近需要治療的部位使得當凝血酶肽衍生物從藥物組合物中釋放時，在該部位發生所希望的愈合(例如，與缺乏藥物相比，藥物存在時所治療的病癥得到改善的臨床效果)。當然可植入的藥物組合物還可以是之前所述的持續釋放制劑或可注射的制劑。例如，可植入的藥物組合物還可包含持續釋放載體以在該植入部位獲得緩慢而持續的藥物治療。
可植入的藥物組合物可以按照手術預期的要求來成型或由醫師或技師在手術期間來成型。優選使基體成型以彌補組織缺陷和采取新組織所需的形狀。例如在未愈合缺陷的骨修復情況下，希望使用彌補未愈合的尺寸。在骨形成過程中，材料被身體緩慢吸收并且被具有該植入物形狀的或非常接近該植入物形狀的骨替代。
或者，可植入的藥物組合物可在給藥至例如需要骨生長的部位之前，部分地包嵌在支持性物理結構中，如網狀結構、金屬絲基質、不銹鋼支架、帶螺紋的介體融合支架等等。
在又一個選擇方案中，特別便于刺激骨生長和軟骨修復或生長的公開的藥物組合物包括含有多孔基質的載體，其因此能用作在其上骨祖細胞和成骨細胞可以遷移和附著的骨和組織生長的骨架。所述載體稱為骨傳導的。對于某些應用，載體應當具有足夠的機械強度以維持其立體結構并且輔助支持待聯合或嫁接在一起的骨或組織部分的固定。合適的骨傳導載體的實例包括膠原(例如牛膠原)、血纖蛋白、磷酸鈣陶瓷(例如羥磷灰石和磷酸三鈣)、硫酸鈣、胍提取的異體骨和其組合。許多合適的載體是市場上可買到的，如COLLAGRAFT(Cohension Technologies，Inc.，Palo Alto，CA)，其為羥磷灰石、磷酸三鈣和纖絲狀膠原的混合物，以及PRO OSTEON500TM(Interpore Cross International，Irvine，CA)，其為通過海洋珊瑚碳酸鈣轉化為晶狀羥磷灰石而形成的羥磷灰石生物基質。可用作具有持續釋放特性的骨傳導載體的合成的生物降解聚合物的記載可見于Behravesh等，Clinical Orthopaedics 367S118(1999)和Lichun等，″Controlled Drug Delivery-Designing Technologies for theFuture″中的Polymeric Delivery Vehicles for Bone Growth，Factors，Park和Mrsny eds.，American Chemical Society，Washington，DC(2000)。這些參考文獻的全部教導在此作為參考并入本文。生物降解聚合物的實例包括聚α-羥基酯如聚乳酸/聚乙醇酸均聚物和共聚物、聚磷腈(PPHOS)、聚酐類和聚延胡索酸亞丙基酯，其在上文有詳細描述。
或者，藥物組合物可以微粒或微球體的形式植入至該部位。例如，通過手術暴露需要心臟修復、骨生長或軟骨修復的部位并通過噴涂、移液、噴霧、注射等等將微粒施用至該部位上或緊靠該部位而使微粒接觸或緊靠該部位。微粒還可通過內窺鏡檢查或通過腹腔鏡檢查遞送至該部位。由于其為可注射的、可原位聚合的、可生物降解的材料，聚延胡索酸亞丙基酯(PPF)為用于修復骨缺陷的非常合乎需要的生物相容的可植入的載體。PPF，與乙烯基單體(N-乙烯基吡咯烷酮)和引發劑(過氧化苯甲酰)一起形成可原位聚合的可注射的溶液。其尤其適于填補多種大小和形狀的骨骼缺陷(參見Suggs等，Macromolecules304318(1997)，Peter等，J.Biomater.Sci.Poly，.Ed.10363(1999)和Yaszemski等，Tissue Eng.141(1995)，其全部教導在此作為參考并入本文)。固相組分如β-磷酸三鈣和氯化鈉的添加可提高PPF聚合物的機械性能(參見Peter等，J.Biomed.Mater.Res.44314(1999)，其全部教導在此作為參考并入本文)。用于將組合物裝入膠囊(如在硬的明膠或環糊精的包衣中)的方法為本領域所知(Baker，等，″Controlled Release of BiologicalActive Agents″，John Wiley和Sons，1986)。
用包含凝血酶肽衍生物的所公開的藥物組合物能治療的疾病和病癥，例如創傷和血管成形術常常伴有如疼痛和感染的癥狀和虛弱。在某些情況下，一種或多種另外的藥理學活性劑與本發明藥物組合物一起共同給藥來解決所述問題可能是有利的。例如，控制疼痛和炎癥可能需要與止痛劑或消炎劑的共同給藥。控制感染可能需要與抗微生物劑、抗生素或消毒劑的共同給藥。
凝血酶肽衍生物可通過固相肽合成(例如BOC或FMOC)方法，通過液相合成，或通過其他合適的技術包括上述方法的組合來合成。已建立并廣泛使用的BPC和FMOC方法在Mrrifield，J.Am.Chem.Soc.882149(1963)；Meienhofer，Hormonal Proteins and Peptides，C.H.Li，Ed.，Academic Press，1983，pp.48-267；以及Barany和Merrifield，The Peptides，E.Gross和J.Meienhofer，Eds.，AcademicPress，NewYork，1980，pp.3-285.中描述。固相肽合成的方法在Merrifield，R.B.，Science，232341(1986)；Carpino，L.A.和Han，G.Y.，J.Org.Chem.，373404(1972)；以及Gauspohl，H.等，Synthesis，5315(1992))中描述。這6篇文章的教導在此作為參考全部并入本文。
本發明通過下列實施例說明，這些實施例不以任何方式限制本發明。
范例實施例1.對照實驗無二聚作用抑制劑時TP508的穩定性將TP508溶于150mM無菌鹽水中以達到5mg/ml的終濃度。將樣品(100μl)轉移至2ml的無菌Cryo管中并且在4℃避光保存。將樣品稀釋至1mg/ml并且通過利用C18柱(Alltech Adsorbosphere XLcolumn C1890A 5μm 250×4.6mm)的反相HPLC在規定的時間點進行分析。進行梯度方法，其中流動相B在1-15分鐘內從20％增加至50％(流動相A-0.1％TFA水溶液；流動相B-0.1％TFA乙腈溶液)并且注射體積為10μl。根據色譜圖的面積鑒定和定量TP508、TP508二聚物和未鑒定的峰。
表1.無二聚作用抑制劑時TP508在4℃的穩定性平均峰面積，％
實施例2.螯合劑存在時TP508的穩定性在有或無EDTA時，將TP508以1mg/ml溶解于緩沖的或未緩沖的溶液中。溶液在室溫下溫育并且每隔一段時間取樣用于HPLC分析。二聚物形成的百分比根據得到的色譜圖計算。下列溶液用于溶解TP508(1mg/mL)PBS，pH7.4(用N2鼓泡30分鐘)10mM Hepes，150mM NaCl，pH7.010mM Hepes，150mM NaCl，5mM EDTA，pH 7.0將1mL的每種溶液置于1.5mL的聚丙烯微量離心管中，并且使其在室溫下靜置。在規定的時間間隔，取出100μL用于實施例1中提及的HPLC方法的分析。隨時間變化形成的二聚物的百分比概括在表2中。
表2.二聚物的百分比
在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)或Hepes/NaCl中二聚物形成的速率非常快。如所示，5mM EDTA的加入大大降低了二聚物形成的速率。這些結果表明，由于二聚物的形成被EDTA阻止或降低，二聚物形成可由痕量二價離子的存在促進。
實施例3.二聚作用抑制劑硫代甘油、EDTA或兩者的組合存在時TP508的穩定性如表3中所述制備的樣品通常包含50μg/mL溶于Pluronic凝膠中的TP508。樣品隨后在4℃貯存一段時間。用于分析，樣品用0.1％TFA稀釋十倍并且通過HPLC分析。通常，分析50μl稀釋的樣品。TP508的定量用外標物來進行。在樣品分析前分析雙重TP508標準品。分析表3中每組的一種樣品。
表3.樣品的組成
T-硫代甘油
E-EDTATE-硫代甘油/EDTAEN-含有N2的EDTA時間0如圖1所示，對于如表3中所述制備的所有樣品，在時間0觀察到極低濃度的二聚物。分別在含有硫代甘油(T組)和硫代甘油/EDTA(TE組)的樣品中觀察到包含約20％和6％的總樣品的未知峰。這些未知峰具有稍大于TP508的保留時間，表明其可能對應于TP508和硫代甘油的加合物，因為加合物形成的量與這兩種樣品中硫代甘油的含量稍微成正比。
4℃兩周的貯存在4℃貯存兩周的樣品顯示與如圖2中所示的在時間0的樣品基本上相同的二聚物濃度。在含有EDTA(E組)或EDTA w/N2(EN組)的樣品中，超過90％的TP508仍然保持其單體形式。
4℃兩個月的貯存如圖3中所示，含有二聚作用抑制劑(T、E、TE和EN組)的所有樣品相比無二聚作用抑制劑的樣品顯示提高的TP508穩定性。含有硫代甘油和EDTA(TE組)的樣品顯示與在時間0的樣品基本上相同的二聚物量，表明TP508甚至在硫代甘油和EDTA存在下貯存兩個月后仍保持其單體形式而基本上無二聚物，僅有10％的TP508-硫代甘油加合物。含有EDTA(E組)或EDTA w/N2(EN組)的樣品中大約80％的TP508仍為單體。凝膠劑制備期間具有氮氣層看起來不影響二聚作用。含有硫代甘油(T組)的樣品顯示大約60％的TP508保持其單體形式而剩下的大約40％的TP508形成了TP508-硫代甘油加合物。這些結果表明EDTA和含有巰基的化學品可用于穩定TP508免受二聚作用。
實施例4.EDTA和抗氧化劑存在時TP508的穩定性檢驗下列抗氧化劑與EDTA聯合抑制TP508二聚作用的能力。用于制劑中的正常的％在下列表4中顯示表4.樣品的組成
制備和使用凝膠基質(17％Pluronic，0.0004％EDTA和含有防腐劑的檸檬酸鹽緩沖液，pH5.0)。每種抗氧化劑(或低或高的％)以所需的濃度添加。隨后，將TP508添加至凝膠中以達到50μg/ml的濃度。樣品在4℃溫育3周。隨后，100μl樣品用900μl 0.1％的TFA稀釋并且根據實施例1中所述的方法通過HPLC分析。樣品分析之前分析雙重標準品。此外，分析含有防腐劑和抗氧化劑的空白凝膠。
結果在下面表5中顯示。簡言之，TP508在高濃度的抗氧化劑存在時在4℃三周都很穩定。除抗壞血酸外，低濃度的抗氧化劑也是有效的。
表5.TP508隨時間變化的濃度(μg/ml)
實施例5.TP508在螯合劑(EDTA)和抗氧化劑存在時在不同pH范圍內的穩定性檢驗含有10μM EDTA的緩沖樣品制劑在不同pH并且在pH5.5時隨抗氧化劑的加入抑制TP508二聚作用和其他分子形式形成的能力。在不同pH和抗氧化劑百分比下所檢驗的樣品在表6中顯示。
表6檢驗樣品的組成
在含有10μM EDTA的檸檬酸鹽緩沖液(50mM，pH4.5至6.0)中制備TP508。將樣品過濾滅菌并且在室溫下遠離任何光源進行溫育。在指定的時間點，通過HPLC分析每種樣品以測定TP508的單體濃度(表7)、二聚物百分比(表8)、加合物的百分比(表9)和未知的分子個體(表10)。
表7TP508從時間0到第28天的濃度(μg/mL)
表8從時間0到第28天的二聚物％
表9從時間0到第28天的其它％+加合物峰％
表10二聚物和未知物的形成速率
*最低值結果表明如表8所示相對于在pH范圍為4.5至6.0的檸檬酸鹽緩沖液中形成的二聚物，該研究中檢驗的所有抗氧化劑阻止或降低TP508的二聚作用。表9中的結果表明由于缺乏巰基基團甲硫氨酸不能產生TP508加合物。這些結果表明根據該無任何抗氧化劑的實驗，抑制TP508二聚物形成的最適pH為pH6.0。隨著在pH5.5時0.5％(w/v)甲硫氨酸的添加，獲得表10中所示的最慢速率(0.0183)。未知物形成的速率與4.5至6.0的pH成反比，表明TP508在該緩沖體系易于酸水解。此外，該實驗中甲硫氨酸并不阻止或導致未知物的形成。簡言之，甲硫氨酸看起來為阻止或降低TP508的二聚作用而不形成TP508加合物的最好的抗氧化劑并且該實驗中未知峰形成的最慢速率是在pH6.0時。
實施例6.二價螯合劑對TP508二聚作用的影響檢驗已知螯合銅離子的二價螯合劑，二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和紅菲繞啉二磺酸(BPADA)抑制TP508二聚物形成的能力。
條件A.50mM乙酸鹽/100mM NaCl，pH5.4B.50mM乙酸鹽/100mM NaCl，pH5.4，含有10μM DTPAC.50mM乙酸鹽/100mM NaCl，pH5.4，含有10μM BPADA
程序TP508(10μg/mL)在有或無螯合劑時室溫下在聚丙烯離心管中溫育并且通過毛細管電泳在指定的時間點進行分析以監測任何二聚物的形成。
結果表11.來自樣品A50mM乙酸鹽/100mM NaCl，pH5.4的二聚物百分比
表12.來自樣品B50mM乙酸鹽/100mM NaCl，pH5.4，含有10μMDTPA的二聚物百分比
表13.來自樣品C50mM乙酸鹽/100mM NaCl，pH 5.4，含有10μMBPADA的二聚物百分比
這些結果表明除EDTA之外的螯合劑也可穩定TP508以阻止或降低二聚物的形成。
實施例7.Pluronic凝膠中TP508的制備將TP508(3.60mg，Bachem Fmoc)加至Pluronic凝膠(72mL)，在100mL玻璃燒杯中用磁力攪拌棒得到50μg/mL的濃度。將凝膠在4℃攪拌1小時以促進徹底混合。對于樣品D，將凝膠在利用氮氣層的氮保護氣氛下攪拌。凝膠隨后填充至1mL聚丙烯小瓶的邊緣。小瓶用Teflon襯里的蓋子蓋上以防止任何氣泡引入凝膠中。樣品在4℃貯存或在抽屜中(25℃)避光貯存。
在一種商品化制劑中，TP508可加至充分配制的凝膠中或加至含有如實施例3、表3中所述的合適穩定劑的中間相中。
雖然本發明已經參考其優選的實施方案詳細說明和描述，但是本領域技術人員應該理解的是在不背離由附加的權利要求所涵蓋的本發明范圍的情況下可進行形式和細節上的各種改變。
序列表<110>The Board of Regents，The University of Texas SystemHobson，David W.
Crowther，Roger S.
Carney，Darrel H.
<120>凝血酶肽衍生物的藥物組合物<130>3033.1009-003<150>60/533,730<151>2003-12-31<160>8<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<221>變體<222>1<223>位置1的Ala可選地被N-酰化<221>變體<222>23<223>位置23的Val可選地被C-胺化<400>1Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly1 5 10 15Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val20<210>2<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<221>變體<222>1<223>位置1的Ala可選地被N-酰化<221>變體<222>15<223>Xaa＝Glu或Gln<221>變體<222>22<223>Xaa-Phe，Met，Leu，His或Val
<221>變體<222>23<223>位置23的Val可選地被C-胺化<400>2Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Xaa Gly1 5 10 15Asp Ser Gly Gly Pro Xaa Val20<210>3<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人凝血酶片段<400>3Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly1 5 10 15Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val20<210>4<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<221>變體<222>1<223>Ala為未取代的<221>變體<222>23<223>位置23的Val為用NH2胺化的<400>4Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly1 5 10 15Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val20<210>5<211>33<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<221>變體<222>1<223>位置1的Asp氨基酸可選地被N-酰化
<221>變體<222>33<223>位置33的Phe可選地被C-胺化<400>5Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly1 5 10 15Asp Ala Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val Met Lys Ser Pro20 25 30Phe<210>6<211>33<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<221>變體<222>1<223>位置1的Asp氨基酸可選地被N-酰化<221>變體<222>20<223>Xaa＝Glu或Gln<221>變體<222>27<223>Xaa＝Phe，Met，Leu，His或Val<221>變體<222>33<223>位置33的Phe可選地被C-胺化<400>6Asp Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly1 5 10 15Asp Ala Cys Xaa Gly Asp Ser Gly Gly Pro Xaa Val Met Lys Ser Pro20 25 30Phe<210>7<211>23<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成肽<221>變體<222>1<223>位置1的Ala為未取代的<221>變體
<222>23<223>位置23的Val為未取代的<400>7Ala Gly Tyr Lys Pro Asp Glu Gly Lys Arg Gly Asp Ala Cys Glu Gly1 5 10 15Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val20<210>8<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>絲氨酸酯酶保守序列的片段<400>8Cys Glu Gly Asp Ser Gly Gly Pro Phe Val1 5 10
權利要求
1.一種藥物組合物，包含a)凝血酶肽衍生物；和b)螯合劑和/或藥物可接受的含有巰基的化合物。
2.權利要求1的藥物組合物，另外包含抗氧化劑。
3.權利要求1的藥物組合物，其中螯合劑為銅-螯合劑。
4.權利要求3的藥物組合物，其中銅-螯合劑選自二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)和紅菲繞啉二磺酸(BPADA)。
5.權利要求3的藥物組合物，其中銅-螯合劑選自乙二胺四乙酸(EDTA)、青霉胺、三乙撐四胺、N，N′-二乙基二硫代氨基甲酸鹽(DDC)、2，3，2′-四胺(2，3，2′-tet)、新亞銅試劑、N，N，N′，N′-四(2-吡啶基甲基)乙二胺(TPEN)、1，10-菲咯啉(PHE)、四亞乙基五胺(TEPA)、三亞乙基四胺和三(2-羧乙基)膦(TCEP)。
6.權利要求1的藥物組合物，其中該藥物組合物包含藥物可接受的含有巰基的化合物，選自硫代甘油、巰基乙醇、硫甘醇、硫二甘醇、半胱氨酸、硫葡糖、二硫蘇糖醇(DTT)和二硫-雙-馬來酰亞胺乙烷(DTME)。
7.權利要求2的藥物組合物，其中抗氧化劑選自生育酚、半胱氨酸、甲硫氨酸、谷胱甘肽、生育三烯酚、二甲基甘氨酸、甜菜堿、丁基化羥基苯甲醚、丁化羥基甲苯、姜黃素、維生素E、抗壞血酸、棕櫚酸抗壞血酸酯和巰基乙酸。
8.權利要求1的藥物組合物，包含銅-螯合劑和藥物可接受的含有巰基的化合物。
9.權利要求2的藥物組合物，其中該組合物包含螯合劑和抗氧化劑。
10.權利要求9的藥物組合物，其中該抗氧化劑為甲硫氨酸。
11.權利要求1的藥物組合物，其中該凝血酶肽衍生物由下列氨基酸序列組成a)Rl-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-R2(SEQ ID NO1)，其中R1為-H或R3-C(O)-；R2為-OH或-NR4R5；R3為-H或C1-C6烷基；和R4和R5分別為-H、C1-C6烷基，或與其所鍵合的氮原子一起形成非芳香族的雜環基團；條件是該凝血酶肽衍生物1-9和15-23位上的0個、1個、2個或3個氨基酸為SEQ ID NO.1對應位置上的氨基酸的保守置換；b)具有至少14個氨基酸的凝血酶肽衍生物的N末端截短的片段；或c)具有至少18個氨基酸的凝血酶肽衍生物的C末端截短的片段。
12.權利要求1的藥物組合物，其中該凝血酶肽衍生物由下列氨基酸序列組成a)R1-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-X1-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-X2-Val-R2(SEQ ID NO2)，其中X1為Glu或Gln；X2為Phe、Met、Leu、His或Val；R1為-H或R3-C(O)-；R2為-OH或-NR4R5；R3為-H或C1-C6烷基；和R4和R5分別為-H、C1-C6烷基，或與其所鍵合的氮原子一起形成非芳香族的雜環基團；b)具有至少14個氨基酸的凝血酶肽衍生物N末端截短的片段；或c)具有至少18個氨基酸的凝血酶肽衍生物C末端截短的片段。
13.權利要求1的藥物組合物，其中該凝血酶肽衍生物為23個氨基酸的多肽，包括Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val(SEQ ID NO3)。
14.權利要求1的藥物組合物，其中該凝血酶肽衍生物為H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO4)。
15.權利要求14的藥物組合物，其中該組合物包含螯合劑和抗氧化劑。
16.權利要求15的藥物組合物，其中該抗氧化劑為甲硫氨酸。
17.權利要求1的藥物組合物，其中該凝血酶肽衍生物為具有至少14個氨基酸的H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO4)的N末端截短的片段或具有至少18個氨基酸的(SEQ ID NO4)的C末端截短的片段，可選在C-末端被酰胺化為C(O)-NH2。
18.權利要求1的藥物組合物，其選自片劑；膠囊劑；微粒制劑；溶液；懸浮液或酏劑；持續釋放的制劑；可注射的制劑；可植入的制劑和局部制劑。
19.一種用于激活需要這種治療的患者中非蛋白酶解活化的凝血酶受體的方法，所述方法包括將有效量的權利要求1的藥物組合物給藥于患者的步驟。
20.權利要求19的方法，其中所述患者需要治療以促進軟骨生長或修復。
21.權利要求19的方法，其中所述患者需要骨生長。
22.權利要求19的方法，其中所述患者需要治療以促進傷口愈合。
23.權利要求24的方法，其中該傷口為慢性傷口。
24.權利要求18的方法，其中所述患者需要治療以促進心臟修復或抑制再狹窄。
25.一種用于激活需要這種治療的患者中非蛋白酶解活化的凝血酶受體的方法，所述方法包括將有效量的藥物組合物給藥于患者的步驟，其中該藥物組合物為凝膠，包含a)由氨基酸序列H-Ala-Gly-Tyr-Lys-Pro-Asp-Glu-Gly-Lys-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-Glu-Gly-Asp-Ser-Gly-Gly-Pro-Phe-Val-NH2(SEQ ID NO.4)組成的凝血酶肽衍生物；b)螯合劑；和d)抗氧化劑。
26.權利要求25的方法，其中所述患者需要治療以促進軟骨生長或修復。
27.權利要求25的方法，其中所述患者需要骨生長。
28.權利要求25的方法，其中所述患者需要治療以促進傷口愈合。
29.權利要求28的方法，其中該傷口為慢性傷口。
30.權利要求25的方法，其中所述患者需要治療以促進心臟修復或抑制再狹窄。
全文摘要
公開了藥物組合物，包含凝血酶肽衍生物和螯合劑和/或藥物可接受的含有巰基的化合物。該藥物組合物可任選進一步包含抗氧化劑。還公開了用于激活需要所述治療的患者中非蛋白酶解活化的凝血酶受體的方法。該方法包括給予有效量的上述藥物組合物中的凝血酶肽衍生物的步驟。
文檔編號A61K31/4745GK1913917SQ200480041487
公開日2007年2月14日 申請日期2004年12月30日 優先權日2003年12月31日
發明者D·W·霍布森, R·S·克勞瑟, D·H·卡尼, A·P·K·唐 申請人:正統邏輯公司