抑制癌的方法

專利名稱：抑制癌的方法
技術領域：
本發明涉及活化p53癌抑制基因或p53蛋白質，使p53蛋白質定位于核的方法。另外，本發明還涉及含有促進p53癌抑制基因或p53蛋白質活化的物質的醫藥組合物。
背景技術：
Synoviolin是作為在來源于風濕患者滑膜細胞過量表達的膜蛋白質而發現的新蛋白質(WO02/052007)。并且，經轉基因動物研究表明，Synoviolin是類風濕性關節炎發病的必需分子。
由蛋白質結構預測系統顯示Synoviolin具有RING finger基元。該基元常見于在蛋白質的泛素化中發揮重要作用的叫做E3泛素連接酶的酶中，事實上，證明Synoviolin具有E3泛素連接酶特征之一的自身泛素化活性(WO02/052007)。
要指出的是，p53基因定位于第17號染色體p13，是對癌細胞的產生和增殖非常重要的癌抑制基因。p53蛋白質識別DNA上的特異堿基序列[5′-(A/T)GPyPyPy-3′]，促進waf1/cip1、GADD45、BAX等特定基因的轉錄活化。而且，已知其具有下述生理活性(i)抑制其他多種基因的轉錄、(ii)與SV40大T抗原、腺病毒EIB蛋白質、人類乳頭瘤病毒E6等病毒性癌基因或mdm2等細胞性癌基因結合、(iii)與含有錯配的DNA特異結合等。
因此，為了發現抑制癌的物質，研究控制p53癌抑制基因或p53蛋白質功能的分子是重要的。

發明內容
本發明的目的在于提供促進p53癌抑制基因或p53蛋白質活化的方法，以及促進p53癌抑制基因或p53蛋白質活化的醫藥組合物。
為了解決上述課題，本發明人進行了深入研究。于是在詳細分析Synoviolin同源敲除動物時發現與野生型相比，觀察到更多發生調亡的細胞，而且，與調亡的誘導關系密切的p53蛋白質定位于核內，強表達。另外，發現通過抑制Synoviolin的功能，p53癌抑制基因或p53癌抑制蛋白質活化，阻止了癌細胞的增殖，由此完成了本發明。
即，本發明如下所述(1)醫藥組合物，其含有促進p53癌抑制基因活化或p53蛋白質活性的物質。
(2)(1)所述的醫藥組合物，其中，促進p53癌抑制基因或p53蛋白質活化的物質為抑制Synoviolin的表達和/或功能的物質。
(3)(2)所述的醫藥組合物，其中，抑制Synoviolin的表達和/或功能的物質為針對編碼Synoviolin的基因的siRNA或shRNA。
(4)(3)所述的醫藥組合物，其中，編碼Synoviolin的基因含有序列1所示的堿基序列。
(5)(3)所述的醫藥組合物，其中，siRNA以序列1所示的堿基序列中的一部分序列為靶。
(6)(1)～(5)中任意一項所述的醫藥組合物，其用于治療癌癥。
(7)p53癌抑制基因或p53蛋白質的活化方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能。
(8)使p53蛋白質定位于核的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能。
(9)癌的抑制方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能，使p53蛋白質定位于核。
(10)權利要求9所述的方法，其特征在于，對定位于核的p53蛋白質進一步進行放射線照射或紫外線照射。
(11)權利要求9所述的方法，其特征在于，使含有定位于核的p53蛋白質的細胞進一步與抗癌劑接觸，或對該細胞周圍的脈管實施栓塞。
(12)將p53蛋白質的氨基酸殘基的一部分磷酸化的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能。
(13)(12)所述的方法，其中，氨基酸殘基的一部分為第15位絲氨酸殘基。
(14)活化磷酸化酶的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能。
(15)(14)所述的方法，其中，磷酸化酶為ATM、ATR、或與它們具有同樣活性的酶等。
(16)誘導p21蛋白質表達的方法，其中p53蛋白質通過抑制Synoviolin的表達和/或功能而活化，由此誘導p21蛋白質表達。
(17)癌的抑制方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能，由p53蛋白質誘導p21蛋白質的表達。
(18)抑制p53蛋白質泛素化的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能。
(19)(7)～(18)中任意一項所述的方法，其中，Synoviolin表達的抑制利用針對編碼Synoviolin的基因的siRNA或shRNA進行。
(20)(7)～(18)中任意一項所述的方法，其中，抑制Synoviolin功能是抑制Synoviolin與p53蛋白質結合的功能。
(21)(19)所述的方法，其中，編碼Synoviolin的基因含有序列1所示的堿基序列。
(22)(19)所述的方法，其中，siRNA以序列1所示的堿基序列中的一部分序列為靶。


圖1為顯示Synoviolin同源敲除小鼠胎仔成纖維細胞(MEFs)的免疫組織染色結果的照片。
圖2為顯示syno-/-的胚胎的抗p53抗體免疫組織染色結果的照片。
圖3為顯示p53相關的蛋白質印跡法結果照片。
圖4為顯示鑒定syno-/-的MEF培養細胞中p53的磷酸化部位的結果的照片。
圖5為由針對Synoviolin的siRNA處理而亢進的Ser15的磷酸化因咖啡因的添加受到了怎樣的影響的蛋白質印跡法照片。
圖6為顯示由針對Synoviolin的siRNA處理，p53和p21的表達增多的蛋白質印跡法照片。
圖7為用流式細胞儀觀察細胞周期的結果圖。
圖8為用抗Synoviolin抗體(10Da)對組織陣列進行免疫染色的結果的照片。
圖9為用抗Synoviolin抗體(10Da)對組織陣列進行免疫染色的結果的照片。
圖10為觀察導入GFP野生型p53的細胞的p53定位的照片。
圖11為使GFP野生型p53和FLAG野生型Synoviolin強表達，用稀釋400倍的第一抗體α-FLAG抗體、稀釋200倍的第二抗體α-小鼠IgG-TRITC或1μM DAPI對核進行染色，觀察p53的定位的照片。
圖12為使GFP野生型p53和FLAG Synoviolin C307S強表達，用稀釋400倍的第一抗體α-FLAG抗體、稀釋200倍的第二抗體α-小鼠IgG-TRITC或1μM DAPI對核進行染色，觀察p53的定位的照片。
圖13為利用MBP-Synoviolin dTM-His的顯示GST-p53體外泛素化反應的照片。
圖14為利用Synoviolin RNAi的RA滑膜細胞中p53 mRNA量的曲線。
圖15為制備的p53結合區域缺失變異體的示意圖和進行結合分析的結果的圖。
圖16為對p53結合區域缺失變異體和通過35S-p53進行GSTpulldown assay的結果圖。
具體實施例方式
以下詳細說明本發明。
本發明的特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能，使p53(p53癌抑制基因或p53蛋白質)定位于核并活化，由此抑制癌。本發明是基于下述發現完成的如果抑制Synoviolin的表達和/或功能，則p53被磷酸化酶磷酸化，p53活化，于是作為依賴于細胞周期蛋白的磷酸化酶抑制劑的p21的表達提高，結果防止癌細胞由G1期向S期轉變，由此抑制癌的發生或增殖，以及Synoviolin通過泛素連接酶抑制p53的表達。
1.p53的活化(1)Synoviolin的表達和/或功能的抑制和p53的活化如將正常細胞暴露于紫外線等，則細胞內的p53活化，其結果是細胞增殖被抑制，因此可通過升高p53的濃度來阻止癌細胞增殖。也就是說，當p53不發揮作用時，癌細胞的增殖不停止，向癌發展。事實上，p53在正常個體的細胞中幾乎觀察不到，而在約半數的來源于癌患者的細胞中發生該p53的缺失變異。而且，如沒有發生這種變異，那么就是p53的控制機關發生某種變異而失去了癌抑制功能。因此，要抑制癌的發展，必須使p53有效發揮作用。
在本發明中，由于將p53的活化作為治療癌的有效方法之一，因此著眼于Synoviolin的功能。制備Synoviolin同源敲除動物，進行了詳細研究，結果觀察到比野生型更多的發生調亡的細胞。即，發現如果抑制Synoviolin的功能，則可促進與調亡密切相關的p53的活化，Synoviolin的功能抑制與癌抑制相關連。
在此，“Synoviolin的表達”是指編碼Synoviolin的基因的轉錄和翻譯，或由這些的轉錄、翻譯生成Synoviolin蛋白質。另外，“Synoviolin的功能”是指抑制p53的活化，上述Synoviolin的功能也包括Synoviolin與p53結合的功能和將p53泛素化的功能。因此，“抑制Synoviolin的表達和/或功能”是指與野生型Synoviolin基因或蛋白質的量、功能或活性相比，其量、功能或活性降低或消失。上述“抑制”包括抑制功能和表達二者、以及抑制任何一方。
由于Synoviolin促進p53的泛素化，因此可通過抑制Synoviolin與p53的結合抑制p53的泛素化，假如抑制了p53的泛素化，則p53被活化，進一步意味著癌將受到抑制。
另外，調亡是指細胞自身啟動的程序性細胞死亡，其特征是細胞核的染色體聚集、細胞核片段化、細胞表面微絨毛消失、細胞質聚集、Casp蛋白酶活化、線粒體膜電位消失等。當細胞產生上述特征時，判定為發生調亡。
在本發明中，如對胚胎(胎児胚)的p53進行免疫染色，則p53在Synoviolin homo剔除小鼠胚胎全身強表達。另外，從Synoviolin homo剔除小鼠胚胎分離的胎仔成纖維細胞(MEFs)與從野生型分離的相比表達也增強，而且p53在核內強勢定位。這種核定位在野生型中完全沒有觀察到。另外，如使Synoviolin和p53強表達，則p53與Synoviolin在細胞質內共定位。這說明通過抑制Synoviolin的表達和/或功能，可使p53向核內轉移。進一步，Synoviolin homo剔除小鼠胎仔MEFs表現強放射線敏感性、紫外線敏感性。因此，在本發明中，抑制癌細胞中Synoviolin的表達和/或功能，使p53向核內轉移后，如對p53進行放射線照射或紫外線照射、則可有效抑制癌細胞的增殖。對放射線照射方法沒有特別限定，可照射例如1～10Gy的γ線。另外，對于紫外線照射，可使用適當的紫外線照射裝置(FUNACOSHI公司、Derumara公司、KEYENCE公司等生產)照射紫外線(波長100～400nm、優選290～400nm)。
進一步，在本發明中，可使含有定位于核中的p53的細胞(特別是癌細胞)進一步與抗癌劑接觸，從而有效地抑制癌。或者，對上述含有定位于核中的p53的細胞的癌細胞周圍的脈管(例如血管或淋巴管)實施栓塞，由此可抑制癌。
“抗癌劑”包括烷基化劑、抗代謝藥、微管抑制劑、鉑配位化合物、分子靶向治療藥等。作為這些抗癌劑的具體例子，可列舉以下化合物，但并不限定于此。
<烷基化劑>
氮芥類環磷酰胺(Endoxan)、苯丙氨酸氮芥(Melphalan)等乙撐亞胺類塞替哌(Thiotepa)等烷基磺酸酯類白消安(Busulphan)等亞硝基脲類尼莫司汀(Nimustine)、洛莫司汀(Lomustine)等<抗代謝藥>
葉酸衍生物甲氨蝶呤等嘌呤類巰嘌呤(Mercaptopurine)、硫唑嘌呤(Azathioprine)等嘧啶類衍生物5-氟尿嘧啶、替加氟(Tegafur)、卡莫氟(Carmofur)等<微管抑制藥>
植物堿藥物(Vinca alkaloid)長春新堿、長春堿等紫杉烷(taxane)泰素、多烯紫杉醇(docetaxel)等<類激素藥>
他莫昔芬(Tamoxifen)、雌激素等<鉑配位化合物>
順鉑、卡鉑(Carboplatin)等<分子靶向治療藥>
伊馬替尼(Imatinib)、利妥希瑪(Rituximab)、吉非替尼(Gefitinib)等。
用于使癌細胞與抗癌劑接觸的方法可采用向含有定位于核中的p53的細胞或組織(癌細胞或癌組織)添加抗癌劑的方法、或向癌患者或患癌動物施用抗癌劑的方法等。此時對抗癌劑的處理量沒有特別限定，如為添加的情況，則為100pM～100μM，優選為1nM～10μM。向動物體內給藥時，例如使用Endoxan作為抗癌劑時，為0.1～100mg/kg/day，優選為2～25mg/kg/day。對于Endoxan以外的抗癌劑，本領域技術人員可適當設定給藥量和添加量。
對含有定位于核中的p53的細胞的癌細胞周圍的脈管實施栓塞，可使含有定位于核中的p53的癌細胞的細胞團或組織周圍形成血栓，對于血管或淋巴管也可以利用脂肪形成栓塞、也可以利用空氣、氣體形成栓塞。
(2)抑制Synoviolin表達和/或功能促使p53磷酸化和活化進一步，本發明的特征在于，通過將p53的氨基酸殘基的一部分磷酸化從而使p53活化。與p53的活化相關的作為磷酸化對象的氨基酸殘基優選為p53氨基酸序列中的絲氨酸殘基，進一步優選15位絲氨酸殘基(Ser15)。
如p53的Ser15被磷酸化，則p53的表達升高，轉錄活性增強，其結果是轉錄產物增加。ATM(共濟失調-毛細血管擴張突變)、ATR(共濟失調-毛細血管擴張相關的)等磷酸化酶與該p53 Ser15的磷酸化密切相關。ATM是人常染色體隱性遺傳疾病毛細血管擴張性運動失調癥的原因蛋白質，其具有感知DNA的損傷，將癌抑制基因p53磷酸化，從而控制細胞增殖的功能。ATR是ATM家族中的一員，其是被在很大范圍被化學療法藥物、紫外線照射、或蛋白質磷酸化酶的抑制誘導，且參與不涉及ATM的p53活化的磷酸化酶。
已知咖啡因抑制ATM和ATR的功能，在本發明中，在Synoviolin表達和/或功能抑制實驗中通過使用咖啡因，表明Synoviolin調節ATM和ATR的活化。
即，在咖啡因不存在時，如抑制Synoviolin表達和/或功能，則p53活化。而在咖啡因存在的情況下，如果抑制Synoviolin表達和/或功能，則p53的活化被抑制。另外，還已知咖啡因抑制ATM和ATR的活性(p53的磷酸化)。
因咖啡因抑制ATM和ATR的活性，即使抑制了Synoviolin的表達和/或功能，p53也不活化，由此可認為機理如下如果抑制Synoviolin的表達和/或功能，則ATM和ATR被活化，從而誘導p53活化。由此，可認為由于抑制了Synoviolin的表達和/或功能，這些磷酸化酶的活性提高。因此，本發明的特征在于通過抑制Synoviolin的表達和/或功能，促進磷酸化酶活化。與ATM和ATR具有同樣活性的酶等(磷酸化p53的酶等)，DNA-PK或GSK3β等也可以。
作為由p53 Ser15的磷酸化誘導表達的物質，已知有p21蛋白質。p21起周期蛋白依賴性磷酸化酶(CDK)活性抑制劑的作用，是通過抑制CDK活性調節細胞周期的蛋白質。CDK是抑制細胞周期的主要物質，與作為其伙伴的周期蛋白質共同發揮作用，例如，控制由細胞休眠狀態的G1期向DNA復制期的S期的順利轉變。在癌細胞中，如果p53活化，則作為CDK抑制劑的p21的表達升高，因此妨礙了癌細胞由G1期向S期的轉變，從而抑制癌。因此，如上所述，本發明的特征在于，通過抑制Synoviolin表達和/或功能，提高p53的活化，誘導p21的表達，引起CDK的抑制，由此抑制癌。
(3)p53泛素化的抑制和穩定化Synoviolin使p53泛素化。泛素化是指作為蛋白質降解標記分子的泛素對蛋白質翻譯后的修飾反應。以往認為該泛素化的生理意義在于用于送往蛋白體(proteosome)類蛋白質分解機構的標記物修飾。通過后來的研究，目前將泛素化的意義定位為控制蛋白質功能的可逆蛋白質修飾系統。
具體而言，泛素化是通過泛素活化酶(E1)、泛素結合酶(E2)和泛素連接酶(E3)等酶協同的級聯反應，在作為基體的蛋白質上鍵合枝狀泛素分子，形成聚泛素鏈的過程。該聚泛素鏈通過泛素分子內的48號賴氨酸殘基的ε-氨基而形成，成為26S蛋白酶體分解的信號，引導分解目標蛋白質。
本發明以通過抑制Synoviolin的表達和/或功能使p53活化為特征，這種p53的活化與上述p53的磷酸化機理不同，其著眼于抑制p53的泛素化這一機理。
(4)Synoviolin和p53結合部位的確定Synoviolin和p53結合部位通過下述方法確定例如，可制備多種Synoviolin氨基酸序列中某區域缺失的p53結合部位缺失突變體，通過對35S-p53進行GST Pull-down分析來確定。具體地，將上述Synoviolin的p53結合部位缺失突變體以GST融合蛋白質的形式在大腸菌等中表達，通過GST Pull-down分析法確定與35S-p53蛋白質的蛋白質蛋白質間結合。
由此，判定Synoviolin的p53結合部位為從Synoviolin蛋白質所含的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的第236號至第270號的35個氨基酸殘基。
如上所述，Synoviolin促進p53的泛素化。因此，通過抑制備為Synoviolin功能之一的與p53的結合功能，抑制了p53的泛素化，從而p53被活化。參與與p53結合的Synoviolin蛋白質區域優選為Synoviolin氨基酸序列的236號至第270號的區域。因此，優選主要選擇上述區域作為用于抑制結合的目標區域。為了抑制Synoviolin和p53的結合，可以例如使Synoviolin的拮抗劑(低分子化合物、肽等)作用，通過結合分析法(binding assay)、酵母雙雜交法或泛素化活性測定法進行評價。或者，也可以使識別Synoviolin的上述236號至第270號區域的抗體與Synoviolin反應，通過這些方法抑制Synoviolin和p53的結合。
2.Synoviolin表達和/或功能抑制以及活性抑制為了使p53活化，采用抑制Synoviolin表達和/或功能的方法。
對Synoviolin表達和/或功能的抑制沒有特別的限定，可以利用例如RNA干涉(RNAi)。設計和合成針對Synoviolin基因的siRNA(小分子干擾RNA)，將其導入細胞內，由此可引起RNAi。
RNAi是指dsRNA(雙鏈RNA)特異性且選擇性地與目標基因結合，并切斷該目標基因，由此有效抑制其表述的現象。例如，如將dsRNA導入細胞內，則抑制(敲減)與該RNA序列相同的基因的表達。
siRNA的設計可如下所述進行。
(a)只要是編碼Synoviolin的基因即可沒有特別限制，可將任意區域作為候補。例如，在人的情況下，可將GenBank登錄號AB024690(SEQ ID NO.1)的任意區域作為候補。
(b)從選擇的區域中選擇以AA開始的序列，該序列的長度為19～25個堿基，優選為19～21個堿基。可以選擇序列的GC含量例如為40～60％的序列。具體而言，可使用SEQ ID NO.1中所示的堿基序列中，含有選自下述堿基序列的至少一個序列的DNA作為siRNA的目標序列。特別優選將(i)(SEQ ID NO.3)、(ii)(SEQ ID NO.4)、(vi)(SEQ ID NO.8)、(vii)(SEQ ID NO.9)、(viii)(SEQ ID NO.10)作為目標。
(i)AA TGTCTGCATCATCTGCCGA GA(SEQ.ID.No.3)(ii)AA GCTGTGACAGATGCCATCA TG(SEQ.ID.No.4)(iii)AA AGCTGTGACAGATGCCATC AT(SEQ.ID.No.5)(iv)AA GAAAGCTGTGACAGATGCC AT(SEQ.ID.No.6)(v)AA GGTTCTGCTGTACATGGCC TT(SEQ.ID.No.7)(vi)AA CAAGGCTGTGTACATGCTC TA(SEQ.ID.No.8)(vii)AA ATGTTTCCACTGGCTGGCT GA(SEQ.ID.No.9)(vii)AA GGTGTTCTTTGGGCAACTG AG(SEQ.ID.No.10)(ix)AA CATCCACACACTGCTGGAC GC(SEQ.ID.No.11)(x)AA CACCCTGTATCCAGATGCC AC(SEQ.ID.NO.12)(xi)AA GGTGCACACCTTCCCACTC TT(SEQ.ID.NO.13)(xii)AA TGTTTCCACTGGCTGGCTG AG(SEQ.ID.NO.14)(xiii)AA GAGACTGCCCTGCAACCAC AT(SEQ.ID.NO.15)(xiv)AA CGTTCCTGGTACGCCGTCA CA(SEQ.ID.NO.16)將siRNA導入細胞可采用下述方法將在體外合成的siRNA與質粒DNA連接，將其導入細胞的方法、將2條RNA退火的方法等。
另外，本發明中，為了得到RNAi效果，可以使用shRNA。shRNA稱為短發夾RNA(short haipin RNA)，是一條鏈的一部分區域具有與其他區域形成互補鏈的莖環(stem-loop)結構的RNA分子。
shRNA可設計為其一部分形成莖環結構。例如，以某區域的序列作為序列A，與序列A互補的鏈作為序列B，則設計為以序列A、間隔區、序列B的順序使這些序列存在于一條RNA鏈上，整體為45～60個堿基的長度。序列A為目標Synoviolin基因(SEQ ID NO.1)的一部分區域的序列，對目標區域沒有特別限定，可將任意的區域作為候補。序列A的長度為19～25個堿基，優選為19～21個堿基。
3.藥物組合物本發明中制備的shRNA、siRNA是抑制Synoviolin表達和/或功能的物質，可作為活化p53的藥物組合物(特別是癌基因治療劑)使用。
將本發明的藥物組合物用作癌的基因治療劑時，對使用部位沒有特別限定，使用對象可以為腦癌、舌癌、咽喉癌、肺癌、乳癌、食道癌、胃癌、胰腺癌、膽道癌、膽囊癌、十二指腸癌、大腸癌、肝癌、子宮癌、卵巢癌、前列腺癌、腎癌、膀胱癌、橫紋肌肉瘤、纖維肉瘤、骨肉瘤、軟骨肉瘤、皮膚癌、各種白血病(例如急性骨髓性白血病、急性淋巴性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性淋巴性白血病、成人T細胞白血病、惡性淋巴瘤)等。上述癌可以為原發灶、可以為轉移的、也可以為與其他疾病并發的。
將本發明的藥物組合物用作基因治療劑時，除了通過注射將本發明的藥物組合物直接給藥外，還可列舉施用整合了核酸的載體的方法。作為上述載體，可列舉腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、皰疹病毒載體、痘苗病毒(vaccinia yirus)載體、逆轉錄病毒(retrovirus)載體、慢病毒(Lentivirus)載體等，可通過使用這些病毒載體更有效地施用。
另外，也可將本發明的藥物組合物導入核糖體等磷脂小胞體，施用該小胞體。將保有siRNA、shRNA的小胞體通過脂質轉染法導入規定的細胞。然后，將得到的細胞通過例如靜脈、動脈等施用于全身。也可以對腦等局部用藥。
本發明的藥物組合物的給藥量因年齡、性別、癥狀、給藥途徑、給藥次數、劑型而不同，例如為腺病毒時，給藥量為每日每次106～1013個左右，間隔1～8周給藥。
為了將siRNA或shRNA導入目的組織或器官，可以使用市售的基因導入試劑盒(例如アデノエクスプレスクロ一ンテツク公司)。
以下通過實施例進一步具體說明本發明。但是，本發明并不限于這些實施例。
MEF培養細胞p53活化的研究用蛋白質印跡法檢測Synoviolin剔除小鼠(syno-/-)胚胎成纖維細胞(MEFs)的p53，進一步將細胞通過免疫組織染色確認。
即，免疫染色法是將MEFs按照常規方法固定在載玻片上，用抗p53抗體(小鼠單克隆抗體BDBecton，Dickinson公司)進行免疫染色。用0.3％牛血清白蛋白(BSA)稀釋的抗p53抗體(BD10μg/ml)與用0.3％牛血清白蛋白(BSA)封閉了30分鐘的樣品在室溫下免疫反應60分鐘。將反應后的樣品用PBS洗滌后，將TRITC標記的抗小鼠IgG抗體(Dako公司)作為第二抗體進行免疫反應。用熒光顯微鏡確認與抗p53抗體免疫反應的抗原。
結果，確認syno-/-的MEFs培養細胞中發生p53活化的細胞與野生型相比要多(圖1，“MEF-/-”的圖)。
syno-/-小鼠p53活化的研究syno-/-小鼠p53活化的研究用胚胎通過免疫染色進行。
即，syno-/-胎仔的免疫染色是按照常規方法將組織固定在載玻片上，采用VECTASTAIN ABC試劑盒(VECTOR公司)進行的。稀釋為5μg/ml的抗p53抗體FL393在室溫下與用封閉劑封閉30分鐘的樣品免疫反應60分鐘。用PBS洗滌反應后的樣品，將HRP標記抗兔IgG抗體作為第二抗體進行免疫反應。與抗p53抗體免疫反應的抗原通過基于HRP活性的3，3′-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽的顯色進行確認。作為對比染色，進行甲基綠染色。
結果，確認syno-/-胚胎中的p53活化了(圖2)。
Synoviolin對p53的效果syno-/-的MEF培養細胞中的p53通過蛋白質印跡法檢測。
即，將各種細胞用細胞裂解液(50mM Tris-HCl(Ph8.0)、150mMNaCl、1％NP40、1mM PMSF、0.1％十二烷基硫酸鈉(SDS)、2μg/ml亮抑酶肽、2μg/ml抑蛋白酶肽、2μg/ml抑胃酶肽)制備破碎細胞組分。然后，用SDS聚丙烯酰胺電泳(SDS-PAGE)分離破碎的細胞部分。進行SDS-PAGE后，來自細胞的蛋白質通過電印跡法轉移至硝酸纖維素(NC)膜。對該NC膜用加入5％脫脂奶粉的Tris緩沖生理鹽水(TBS)在室溫下封閉1小時后，將抗p53抗體c-terminalaa；195-393或FL393用加入5％脫脂奶粉的TBS稀釋，在室溫免疫反應1小時。反應后的NC膜用0.1％Tween 20/TBS洗滌，將辣根過氧化物酶(HRP)標記抗兔IgG抗體作為第二抗體在室溫下免疫反應1小時，用0.1％Tween 20/TBS洗滌，檢測HRP活性，由此檢測目的抗原。HRP活性檢測使用ECL試劑盒(Amersham社)(ClinicalChemistry.25，p1531，1979)。
結果，通過蛋白質印跡法確認syno-/-的MEF培養細胞中的p53表達量增加(圖3)。
syno-/-的MEF培養細胞中的p53的磷酸化部位的鑒定在本實施例中，用抗p53抗體通過蛋白質印跡法對p53的磷酸化部位進行鑒定。
即，用識別p53(SEQ ID NO.17)的不同絲氨酸殘基的磷酸化的4種抗磷酸化p53單克隆抗體(Phospho-p53(ser15)、Phospho-p53(ser20)、Phospho-p53(ser37)和Phospho-p53(ser46)；Becton，Dickinson公司)，將MEF細胞的蛋白質用SDS-PAGE分離，實施蛋白質印跡法。蛋白質印跡法的操作，除了使用抗磷酸化p53單克隆抗體作為第一抗體，抗小鼠IgG山羊-HRP作為標記抗體以外，其他如實施例3所述。
結果，在syno-/-的MEF培養細胞中，p53的氨基酸序列(SEQ IDNO.17)中，第15位絲氨酸殘基的磷酸化顯著(圖4)。在圖4中，左上圖為第15位絲氨酸殘基磷酸化得到的。53kDa附近的帶明顯較濃。
Ser15磷酸化亢進的機理研究將確認表達野生型p53的RKO(來自人大腸癌的細胞株)作為細胞株，在60mm的板上以1.0×105細胞/板/2mL接種細胞，用Oligofectamine轉染GFP和針對Synoviolin siRNA后，在72小時后添加對Ser15的磷酸化很重要的ATM和ATR(ATM和Rad3相關的)的抑制劑咖啡因(10mM)，用針對磷酸化Ser15-p53的抗體Phospho-p53(Ser15)進行蛋白質印跡。
結果，由Synoviolin的siRNA促進的Ser15的磷酸化由于添加了咖啡因(添加后12小時，24小時)而被完全抑制(圖5)。因此，表明通常通過抑制ATM和ATR的功能，抑制p53。
Synoviolin對由p53誘導的p21表達的影響對RKO細胞進行針對Synoviolin的siRNA處理，用蛋白質印跡法研究作為p53轉錄產物的p21表達的變化。
即，用抗p21多克隆抗體(Santa Cruz公司)，將確認表達野生型p53的RKO(來自人大腸癌的細胞株)作為細胞株在60mm板上以1.0×105細胞/板/2mL接種細胞，用Oligofectamine轉染GFP和針對Synoviolin的siRNA后，用SDS-PAGE分離72小時后的蛋白質，實施蛋白質印跡法。蛋白質印跡法的操作除了使用抗p21多克隆抗體作為第一抗體，抗小鼠IgG山羊-HRP作為標記抗體以外，其他與實施例3所述相同。
結果，通過對Synoviolin siRNA處理，p53的表達升高的同時，p21的表達也增加了。該效果在72小時時明顯示出(圖6)。
Synoviolin的表達抑制對p53相關蛋白質的表達、細胞周期的影響等的研究在本實施例中，研究利用RNAi抑制滑膜細胞中的Synoviolin時對p53相關蛋白質的表達、細胞周期的影響。
將RA滑膜細胞以9.0×104細胞播種在10cm dish上，轉染Synoviolin siRNA(終濃度25Nm)后，用流式細胞儀觀察細胞周期。結果，在siRNA 25nM(No.589)觀察到細胞周期在G0/G1期的延遲(圖7)。
使用h589作為siRNA。
另外，h589是指將以下的有義鏈和反義鏈退火得到的雙鏈RNA。
有義鏈h589GGU GUU CUU UGG GCA ACU G TT(SEQ IDNO.18)反義鏈h589CAG UUG CCC AAA GAA CAC C TT(SEQ IDNO.19) 對癌組織的Synoviolin表達的研究將Tissue array(CHEMICON公司10個普通人癌組織和正常人組織)用抗Synoviolin抗體(10Da)進行免疫染色。
用于免疫染色的抗體濃度為8μg/ml，使用的試劑盒為Simple StainMAX(M)。
結果，對于正常組織，在大腸、腎、肺、卵巢、精囊、皮膚和乳腺確認了Synoviolin表達，而在神經和淋巴結沒有確認。另外，對于各癌組織，確認Synoviolin表達的、特別是判斷為表達明顯增進的組織為神經、淋巴結(圖8和圖9)。
培養細胞中Synoviolin和p53共表達時對各自的定位的影響將3種質粒，GFP-p53、FLAG-Synoviolin以及FLAG-SynoviolinC307S(無泛素(Ub)化活性)導入Saos 2細胞。
各質粒如下。
GFP-p53綠熒光蛋白和野生型p53的融合蛋白表達FLAG-SynoviolinFLAG標記野生型Synoviolin表達FLAG-Synoviolin C307S(無泛素(Ub)化活性)FLAG標記失活型Synoviolin表達用fuGENE6(Roche)進行轉染處理，24小時后用10％福爾馬林固定，用稀釋400倍的第一抗體α-FLAG抗體、稀釋200倍的第二抗體α-小鼠IgG-TRITC，1μM DAPI對核進行染色，觀察其定位。
結果，觀察到野生型p53的強表達和在核中的定位(圖10)。野生型Synoviolin強表達且在細胞質(特別是核周圍)定位。另外，如果使野生型p53和野生型Synoviolin強表達，則觀察到本來定位于核的p53在核周圍呈小點狀分布，與Synoviolin共定位(圖11)。如果野生型p53和Synoviolin C307S突變體強表達，則觀察到p53在細胞質內形成大點，與Synoviolin共定位(圖12)。
由上可知，Synoviolin和p53在一定條件下共定位。可以認為其定位形態因泛素化活性的有無而改變。
利用MBP-Synoviolin dam-His的GST-p53體外泛素化的研究觀察到p53的細胞內蛋白質的量因細胞內Synoviolin的增減而變化，說明p53受Synoviolin控制。因此，為了研究Synoviolin是否直接將p53泛素化(Ub)，用GST-p53和MBP-Synoviolin dTM-His進行體外Ub化反應的研究。
GST-p53將N末端融合了GST的p53在大腸菌內表達，生成得到的部分。
MBP-Synoviolin dTM-His將N末端融合了MBP、C末端融合了His標記的Synoviolin在大腸菌內表達，將其純化得到的部分。
將保有pGEX/p53的大腸菌(BL21)用500mL的LB培養基培養，用IPTG誘導后(1mM、30℃、6h)，用含有0.5％NP-40的緩沖液由培養液配制大腸菌提取液。
在0.1％NP-40存在下，用GSH-瓊脂糖凝膠樹脂由大腸菌提取液純化GST-p53。用該透析后的樣品，將用于MBP-Synoviolin dTM-His和其他體外Ub化反應的組合物(ATP、PK-his-HA-Ub、酵母E1、His-UbcH5c)組合進行反應(圖13)。反應后，用7.5％SDS-PAGE分離蛋白質，轉印至PVDF膜上，通過抗p53抗體(FL393或DO-1)檢測膜上的p53蛋白質。另外，改變GST-p53的添加量進行同樣的反應和檢測。
結果，添加含有GST-p53純化部分和MBP-Synoviolin dTM-His的全部組合物時，觀察到以約90kDa的位置為中心的p53來源的梯狀信號(圖13)。另外，這些信號依賴于GST-p53添加量而增強。由這些結果可以認為，Synoviolin直接參與p53的泛素化。因此，表明通過抑制Synoviolin的表達和/或功能，可以抑制p53的泛素化。
RNAi下的Synoviolin、p53mRNA量的研究在本實施例中，在Synoviolin RNAi條件下，對于Synoviolin和相關基因的mRNA量的經時變化進行研究，由此研究Synoviolin對細胞周期、凋亡等的影響。
以30000細胞/10cm dish接種RA滑膜細胞，按照規定方法轉染25nM siRNA(No.589)，細胞培養4天，在此期間經時回收細胞，得到mRNA。將1μg的mRNA作為模板，用隨機引物進行逆轉錄PCR，得到cDNA。對得到的cDNA，用ABI TaqMan Gene expression assay(GEX)進行定量。將18S rRNA作為對照基因，算出mRNA量。
GEX試劑target assay No.(assay ID)，Synoviolin為Hs00381211_ml，TP53為Hs00153340_ml。
結果，確認在Synoviolin siRNA存在下，Synoviolin mRNA量減少，但p53的mRNA量沒有變化(圖14)。
Synoviolin p53結合區域的確定GST-Synoviolin和p53在體外通過pulldown assay結合，對此，Synoviolin蛋白質的氨基酸序列(SEQ ID NO.2)的第236到第270號的35個氨基酸殘基是必要的。
進一步，在本實施例中，為了確定Synoviolin與p53結合的必要的區域，如圖15所示，制備Synoviolin的p53結合區域缺失突變體，對35S-p53如下進行GST pulldown assay(圖16)。
用1μL編碼各GST蛋白質的質粒轉化100μL的感受態細胞(BL-21株)。各GST蛋白質和質粒的名稱如下GST蛋白質質粒GSTpGEX-6P-1(Pharmacia Biotech)GST-SynoΔTM 236-617pGEX-5-1/SΔTMGST-SynoΔTM 236-270p6-3GST-SynoΔTM 271-617pST490接種于4mL的LB-Amp+，在37℃培養一晚。次日測定預培養的OD600。在15mL的LB-Amp+中接種達到OD600＝3.0(終濃度0.2)。在25℃恒溫槽中培養約2小時，確認OD600＝0.6～0.8后，向恒溫槽中加冰，冷卻至20℃，將培養容器用10分鐘冷卻至20℃。加入0.1M的IPTG 15μL(終濃度＝0.1mM，通常的1/1000)、1mM ZnCl2150μL(終濃度＝10μM)，在20℃振蕩培養4小時，誘導GST蛋白質的表達。誘導后，離心回收細胞(5000rpm，5min，4℃)。將細胞再懸浮于1mlPBS(-)，轉移至Enpendorf管，回收細胞(14000rpm，1min，4℃)。吸取全部上清后，再懸浮于500μL的PBS(-)/Z(PBS(-)/10μM ZnCl2)，用液氮冷凍，在-20℃下保存。次日，將-20℃的樣品置于37℃的恒溫槽中10min，使其溶解，接著放到冰水中冷卻至0℃。混合以下蛋白水解酶抑制劑，每個樣品加6.5μL。
100mM PMSF(Final 1mM)20μl抑蛋白酶肽(Final 0.1％) 2μl0.5mg/ml抑胃酶肽(Final 0.5μg/ml)2μl1mg/ml亮抑酶肽(Final 1μg/ml)2μl將各樣品進行超聲波破碎(Power Level 7、15秒，3次)。每次在冰水中冷卻30秒。接著加入500μl的2x GST Buffer/Z(2％TritonX-100，720mM NaCl、1x PBS(-)、10μM ZnCl2、10mMβ-巰基乙醇、2mM PMSF、0.1％抑蛋白酶肽)并混合后，進一步進行超聲波破碎(Power Level 7、15秒、1次)。將破碎的液體在14000rpm30min 4℃的條件下離心。在此期間用1ml的1x PBS(-)將200μl的80％-勻漿谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione Sepharose)珠洗滌3次，加入160μl的1x PBS(-)，調整至50％-勻漿。向1ml離心后的上清中加入80μl的50％-勻漿谷胱甘肽瓊脂糖凝膠珠，在4℃下旋轉2小時，使GST蛋白質結合于珠。用1mL的1x GST-Buffer/Z(1％TritonX-100，360mM NaCl、0.5x PBS(-)、5μM ZnCl2、5mMβ-巰基乙醇、1mM PMSF、0.05％抑蛋白酶肽)將珠洗滌4次。離心在2000rpm、1min、4℃的條件下進行。殘留的上清全部吸取后，加入60μL的1x GST-Buffer/Z，使合計為100μL。將其中10μL與等量的2xSDS Sample Buffer混合，在100℃下用加熱器(heatblock)加熱5min，每次10μl地加至10％凝膠中。同時還使用0.25～4μg的BSA。進行電泳(150V 50min)、CBB染色(用未使用的30min)、脫色(1小時2次)、甘油水(30～60min)、干燥凝膠(80℃、1小時)，檢測GST蛋白質表達、回收效率。次日，進行35S-p53的體外翻譯。首先，混合以下試劑。
TNT網織紅細胞裂解物(-80℃)25μlTNT網織紅細胞緩沖液(-80℃)2μl氨基酸混合物(蛋氨酸)(-80℃) 1μlDEPC-處理水 15μl
RNase抑制劑(培養室-20℃)1μlTNT聚合酶(培養室-20℃) 1μl35S-Met 4μl質粒(p53·HA) 1μl合計50μl在30℃恒溫槽中保溫1.5～2.5小時，進行體外翻譯。在此期間，將G-25柱的蓋(ふた)輕緩離心(2500rpm，1min，4℃)，加入100μl的pulldown Buffer V(20mM HEPES pH 7.9、150mM NaCl、0.2％TritonX-100)，進一步離心，洗柱。將50μl體外翻譯溶液全部加在該柱上，進行離心(2500rpm，1min，4℃)。再加200μl的pulldown BufferV，再次離心(2500rpm，1min，4℃)。將其用作體外翻譯產物(IvTL)。將其中的4μl與16μl的Milli-Q，20μl的2xSDS Buffer混合，作為On put10％。向含有結合有30μg GST蛋白質的珠的1ml pulldown Buffer V中加入120μl的IvTL，在4℃旋轉1小時。離心(10000rpm，1min，4℃)后，將上清每次以370μL的量加入含有GST、各GST-Synoviolin珠的1ml pulldown BufferV中，在4℃旋轉1小時。將該珠用1mlpulldown Buffer V洗滌4次。此時必須剩余上清100μl，使其不吸取珠。離心在2500rpm、1min、4℃的條件下進行。吸取上清后，加入40μl的1x SDS Sample Buffer，作為Pulldown樣品。將On put 10％和pulldown樣品在100℃加熱1小時，在-20℃保存。次日將樣品在37℃的恒溫槽中加熱10分鐘，每次以10μl的量加至10％凝膠。進行電泳(150V 50min)、CBB染色(30min)、脫色(1小時2次)、甘油水(30～60min)、干燥凝膠(80℃、1小時)后，對IP Plate曝光。14小時后，用BAS讀取曝光的IP Plate，用ImageGauge定量。另外用膜掃描儀(filmscanner)讀取C.B.B.染色的凝膠。
結果，p53結合區域缺失突變體幾乎完全失去了結合活性。另外，由圖15可知p53結合區域僅為從236開始到270氨基酸的35個氨基酸的一個部位。
產業實用性通過本發明提供促進p53癌抑制基因活性的物質。該物質由于可活化p53，使p53轉移至核，因此可用作癌治療用藥物組合物。在本發明中，通過抑制Synoviolin的表達和/或功能，可治療癌。
序列表free textSEQ ID NO.17合成的寡聚核苷酸(DNA/RNA混合物)SEQ ID NO.18合成的寡聚核苷酸(DNA/RNA混合物)
序列表<110>Locomogene，Inc<120>抑制癌癥的方法<130>P04-232PCT<150>JP2003-428300<151>2003-12-24<160>19<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>3374<212>DNA<213>(智人)Homo sapiens<220>
<221>CDS<222>(403)..(2256)<223>
<400>1gccctttctt atgagcatgc ctgtgttggg ttgacagtga gggtaataat gacttgttgg60ttgattgtag atatagggct ctcccttgca aggtaattag gctccttaaa ttacctgtaa120gattttcttg ccacagcatc cattctggtt aggctggtga tcttctgagt agtgatagat180tggttggtgg tgaggtttac aggtgttccc ttctcttact cctggtgttg gctacaatca240ggtggcgtct agagcagcat gggacaggtg ggtaagggga gtcttctcat tatgcagaag300tgatcaactt aaatctctgt cagatctacc tttatgtagc ccggcagtcg cgcggattga360gcgggctcgc ggcgctgggt tcctggtctc cgggccaggg ca atg ttc cgc acg 414Met Phe Arg Thrgca gtg atg atg gcg gcc agc ctg gcg ctg acc ggg gct gtg gtg gct 462Ala Val Met Met Ala Ala Ser Leu Ala Leu Thr Gly Ala Val Val Ala5 10 15 20cac gcc tac tac ctc aaa cac cag ttc tac ccc act gtg gtg tac ctg 510
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385 390<210>18<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸(DNA/RNA混合物)<400>18gguguucuuu gggcaacugt t21<210>19<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸(DNA/RNA混合物)<400>19caguugccca aagaacacct t2權利要求
1.醫藥組合物，其含有促進p53癌抑制基因或p53蛋白質活性的物質。
2.權利要求1所述的醫藥組合物，其中，促進p53癌抑制基因或p53蛋白質活化的物質是抑制Synoviolin的表達和/或功能的物質。
3.權利要求2所述的醫藥組合物，其中，抑制Synoviolin的表達和/或功能的物質是針對編碼Synoviolin的基因的siRNA或shRNA。
4.權利要求3所述的醫藥組合物，其中，編碼Synoviolin的基因含有SEQ ID NO.1所示的堿基序列。
5.權利要求3所述的醫藥組合物，其中，siRNA以SEQ ID NO.1所示的堿基序列中的一部分序列為靶。
6.權利要求1～5中任意一項所述的醫藥組合物，其用于治療癌。
7.p53癌抑制基因或p53蛋白質的活化方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能。
8.使p53蛋白質定位于核的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能。
9.癌的抑制方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能，使p53蛋白質定位于核。
10.權利要求9所述的方法，其特征在于，對定位于核的p53蛋白質進一步進行放射線照射或紫外線照射。
11.權利要求9所述的方法，其特征在于，使含有定位于核的p53蛋白質的細胞進一步與抗癌劑接觸，或對該細胞周圍的脈管實施栓塞。
12.將p53蛋白質的氨基酸殘基的一部分磷酸化的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能。
13.權利要求12所述的方法，其中，氨基酸殘基的一部分為第15位絲氨酸殘基。
14.活化磷酸化酶的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能。
15.權利要求14所述的方法，其中，磷酸化酶為ATM、ATR、或與它們具有同樣活性的酶等。
16.誘導p21蛋白質表達的方法，其通過抑制Synoviolin的表達和/或功能活化p53蛋白質，由此誘導21蛋白質表達。
17.癌的抑制方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能，由p53蛋白質誘導p21蛋白質的表達。
18.活化p53蛋白質的方法，其特征在于，抑制Synoviolin的表達和/或功能。
19.權利要求7～18中任意一項所述的方法，其中，Synoviolin表達的抑制利用針對編碼Synoviolin的基因的siRNA或shRNA進行。
20.權利要求7～18中任意一項所述的方法，其中，抑制Synoviolin功能為抑制Synoviolin與p53蛋白質結合的功能。
21.權利要求19所述的方法，其中，編碼Synoviolin的基因含有SEQ ID NO.1所示的堿基序列。
22.權利要求19所述的方法，其中，siRNA以SEQ ID NO.1所示的堿基序列中的一部分序列為靶。
全文摘要
本發明提供以將p53癌抑制基因或p53蛋白質活化，使其定位于核為特征的方法、以及含有促進p53癌抑制基因或p53蛋白質活化物質的醫藥組合物。
文檔編號A61K31/7088GK1909927SQ20048003883
公開日2007年2月7日 申請日期2004年12月24日 優先權日2003年12月24日
發明者中島利博, 山崎聰士, 八木下尚子 申請人:株式會社洛科摩基因