水凝膠用于培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的用途的制作方法

專利名稱：水凝膠用于培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及纖維素水凝膠用于軟骨細(xì)胞的三維培養(yǎng)和在軟骨位點(diǎn)用于其植入的用途。
背景技術(shù)：
軟骨是一種特殊的非血管化、非神經(jīng)支配的堅(jiān)固且彈性的支持性結(jié)締組織。其存在于肋骨、胸骨、鼻和耳中，也存在于關(guān)節(jié)中。軟骨包含被稱為軟骨細(xì)胞的特殊細(xì)胞和主要由膠原纖維和蛋白聚糖組成的胞外基質(zhì)(ECM)。
關(guān)節(jié)軟骨可能是炎性源(風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎)、創(chuàng)傷源或與衰老相關(guān)(關(guān)節(jié)病)的眾多損害的部位。這些軟骨病變的建立導(dǎo)致較長(zhǎng)期的胞外基質(zhì)劣化和細(xì)胞性降低。不存在血管化和軟骨細(xì)胞增殖使得這些組織具有低修復(fù)能力，這導(dǎo)致這些分解代謝過(guò)程成為不可逆過(guò)程。由于人口的老化，這些退化性病變目前影響了很大一部分比例的人口，因而其成為了一個(gè)主要的公共健康問題。在這方面，多年來(lái)科學(xué)界對(duì)再生功能性軟骨組織的方法很感興趣。
已經(jīng)提出打磨軟骨成形術(shù)、微骨折或者海綿化(spongialisation)外科技術(shù)，目的是刺激軟骨的差的自發(fā)修復(fù)性能(Hunziker，2002)。這些使得軟骨下骨來(lái)源的血凝塊形成的技術(shù)導(dǎo)致形成保持纖維性和暫時(shí)性(transitoire)的軟骨組織(Shapiro等，1993)。同時(shí)也已經(jīng)研究了用于移植具有軟骨形成性質(zhì)的組織的技術(shù)。使用骨膜或軟骨膜自體移植和骨軟骨組織(自體骨軟骨鑲嵌移植成形術(shù))已經(jīng)可以在植入后新生軟骨類型的組織(Hunziker，2002)。這些技術(shù)的眾多局限性(移植物的不穩(wěn)定性、鈣化、臨床效果的低再現(xiàn)性)和它們對(duì)修復(fù)病灶損傷的適應(yīng)癥的限制最近促使開發(fā)研究了新的組織工程技術(shù)，該技術(shù)適用于軟骨的創(chuàng)傷病癥。
Brittberg等首先提出了基于自體軟骨細(xì)胞移植的修復(fù)方法(Brittberg等，1994)。該方法以三個(gè)步驟來(lái)進(jìn)行首先從非承重區(qū)移出軟骨片段以分離軟骨細(xì)胞，其然后體外繁殖為單層，之后再植入損傷處的骨膜片下。其結(jié)果顯示出修復(fù)了軟骨缺損，但是患者必須忍受兩次大的外科手術(shù)操作。而且仍然要確定其單層擴(kuò)增后的細(xì)胞表型。
也已經(jīng)研究了大量的植物或動(dòng)物來(lái)源的三維基質(zhì)，例如膠原海綿、纖維蛋白、透明質(zhì)酸或藻酸鹽(Cancedda等，2003。與使用這些生物材料相關(guān)的病毒傳播的風(fēng)險(xiǎn)以及在臨床前試驗(yàn)期間觀察到的炎性反應(yīng)促使當(dāng)前研究朝著完全合成的生物材料的方向發(fā)展(Hunziker，2002)。已經(jīng)提出了使用聚合物，例如聚乳酸、聚乙醇酸、碳纖維、聚酯-氨基甲酸酯、達(dá)可綸和特氟隆，并且體外用于軟骨細(xì)胞或者間充質(zhì)細(xì)胞的3D培養(yǎng)。在軟骨位點(diǎn)植入后，這些合成聚合物中的一些已引起免疫響應(yīng)或炎癥(Cancedda等，2003)。
可注射的水凝膠組合物尤其描述于專利US 6,129,761中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明人目前已經(jīng)證實(shí)了在隨著pH而自交聯(lián)的水凝膠中三維培養(yǎng)軟骨細(xì)胞以便在軟骨位點(diǎn)中植入的益處。
所用水凝膠是隨著pH而自交聯(lián)的水凝膠，它由羥乙基纖維素(HEC)或羥丙基甲基纖維素(HPMC)水溶液形成，在該羥乙基纖維素(HEC)或羥丙基甲基纖維素(HPMC)上接枝有允許在HEC或HPMC鏈之間形成共價(jià)鍵的硅烷基團(tuán)。
在國(guó)際專利申請(qǐng)WO 97/05911中，這種類型的聚合物材料被描述為與無(wú)機(jī)填料相結(jié)合。
這種材料優(yōu)選由下述簡(jiǎn)化式的聚合物組成(HEC或HPMC)-O-X-Si(OZ)3其可以通過(guò)羥乙基纖維素(HEC)或羥丙基甲基纖維素與式(1)化合物反應(yīng)而獲得
XSi(OZ)3(1)其中X表示鹵原子或具有環(huán)氧官能團(tuán)的烴基，尤其是C2-20烴基，Z選自氫原子、堿金屬和烷基，尤其是C1-5烷基。
式(1)化合物例如可以是(3-縮水甘油氧基丙基)三甲氧基硅烷 在堿性介質(zhì)中，有機(jī)硅化合物接枝到HEC或HPMC上，環(huán)氧化物開環(huán)，并且甲氧基硅烷基團(tuán)水解形成下述簡(jiǎn)化式的聚合物 該聚合物優(yōu)選是硅烷化的HPMC聚合物。
這種聚合物在pH高于或等于約12.4的水溶液中是穩(wěn)定的。酸化該溶液導(dǎo)致粘度逐漸降低并且形成水凝膠。這種物理現(xiàn)象對(duì)應(yīng)于聚合物的交聯(lián)，該交聯(lián)通過(guò)下述步驟進(jìn)行(i)將硅烷醇鹽基團(tuán)轉(zhuǎn)化成硅烷醇基團(tuán) 然后通過(guò)下述步驟形成三維網(wǎng)絡(luò)(ii)一個(gè)硅烷醇與另一個(gè)硅烷醇的縮合 和/或(iii)硅烷醇與纖維素醚或取代基的環(huán)上羥基的縮合 這種由于聚合物水溶液中pH降低而引起的共價(jià)類型的交聯(lián)是可逆的，當(dāng)介質(zhì)的pH增加時(shí)，水凝膠再溶解。因此，在使用前，合成的聚合物可以是可溶解于堿性氫氧化鈉溶液中的粉末的形式。凝膠化pH為7至12，這取決于所希望的交聯(lián)速率。
得到的凝膠通過(guò)高壓滅菌法滅菌(例如，在121℃下20分鐘)。
在生物利用之前，堿性水溶液中的聚合物在交聯(lián)之前也可以與生理學(xué)緩沖溶液混合。在整個(gè)混合物的交聯(lián)之前，最終混合物的pH因而適應(yīng)于所希望的處理時(shí)間。這個(gè)交聯(lián)時(shí)間可通過(guò)振蕩流變測(cè)定法測(cè)定，并且可以隨著這種混合物的參數(shù)(主要是pH和溫度)而在5分鐘至5天之間變化(Bourges等，2002a；Bourges等，2002b)。
為了提供用于特定應(yīng)用的適宜的交聯(lián)速率，希望硅烷醇鹽或者硅烷醇?jí)A金屬或者銨鹽的前體類型的攜帶硅的側(cè)基占聚合物總干重的0.5％至5％。
本發(fā)明涉及隨著pH而自交聯(lián)的這種類型的硅烷化HEC或硅烷化HPMC水凝膠用于三維體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的用途。
所使用的水凝膠尤其具有下述優(yōu)點(diǎn)-其與被整合(intégré)到其內(nèi)部的軟骨細(xì)胞是生物相容的；-軟骨細(xì)胞緊密地整合到水凝膠中；-通過(guò)單層擴(kuò)增去分化的軟骨細(xì)胞在水凝膠內(nèi)再分化，并且保持軟骨細(xì)胞的特性；-所述交聯(lián)可通過(guò)添加到水凝膠和軟骨細(xì)胞的混合物中的生物緩沖液的pH來(lái)控制。
在水凝膠中培養(yǎng)的細(xì)胞優(yōu)選為人或動(dòng)物的軟骨細(xì)胞，優(yōu)選患有軟骨損傷的患者的自體軟骨細(xì)胞。這些細(xì)胞可以是例如取自軟骨組織，例如來(lái)自關(guān)節(jié)軟骨或者來(lái)自鼻軟骨的一部分。
在水凝膠中培養(yǎng)的這些細(xì)胞也可以是能夠進(jìn)行軟骨形成性分化的未分化細(xì)胞。因此也包括間充質(zhì)干細(xì)胞或來(lái)自脂肪組織的干細(xì)胞。前者特別地可以從骨髓中取出得到(通常通過(guò)使用注射器從骨小梁例如長(zhǎng)骨、髂嵴抽吸)，后者通過(guò)吸脂作用得到(通常是真空抽吸脂肪物質(zhì))。
然后，在存在水凝膠和允許軟骨細(xì)胞表型誘導(dǎo)的條件下，培養(yǎng)這些未分化的細(xì)胞。這些條件優(yōu)選為在常規(guī)培養(yǎng)基(DMEM或MEM)中的培養(yǎng)物，如果需要，給其中加入谷氨酰胺和抗生物，優(yōu)選自體的、動(dòng)物的或人類血清、或血清代用品和其它的軟骨形成添加劑。實(shí)例具體地包括胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、亞硒酸鈉、抗壞血酸、TGF-β、IGF-1、BMP(骨形態(tài)發(fā)生蛋白)、地塞米松、亞油酸、BSA(牛血清清蛋白)或丙酮酸酯。也可使用其它添加劑以誘導(dǎo)細(xì)胞的軟骨形成分化。培養(yǎng)物優(yōu)選在37℃下和濕潤(rùn)條件下產(chǎn)生，并存在需要時(shí)可改變的氧濃度。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)缺氧是軟骨細(xì)胞表型產(chǎn)生的重要原因。
本發(fā)明還涉及一種用于制備在水凝膠中整合的細(xì)胞的復(fù)合物(complexe)的體外方法，該復(fù)合物用于注入軟骨位點(diǎn)中，其中所述方法包括在具有適合水凝膠交聯(lián)的pH的生物緩沖液中，在適合軟骨細(xì)胞，任選地由所述未分化細(xì)胞的分化得到的軟骨細(xì)胞在水凝膠中整合和三維培養(yǎng)的條件和時(shí)間周期下，將軟骨細(xì)胞或能夠進(jìn)行軟骨形成性分化的未分化細(xì)胞與隨著pH變化而自交聯(lián)的硅烷化HEC或HPMC水凝膠進(jìn)行體外混合。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用任意的生物緩沖液。實(shí)例包括磷酸鹽緩沖液(PBS，磷酸鹽緩沖鹽溶液)、HEPES或TRIS緩沖液。也可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任意生物培養(yǎng)基，例如DMEM培養(yǎng)基或α-MEM培養(yǎng)基(α最低基礎(chǔ)培養(yǎng)基)。
優(yōu)選地，所述方法包括下述的體外步驟-在固體載體例如培養(yǎng)皿上的軟骨細(xì)胞的單層擴(kuò)增；-通過(guò)其單層擴(kuò)增而去分化的擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞的收集；-在具有適合水凝膠交聯(lián)的pH的生物緩沖液中將去分化的擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞與水凝膠混合，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞在水凝膠內(nèi)整合并導(dǎo)致其再分化。
由硅烷化HEC或HPMC形成的水凝膠的流變學(xué)性質(zhì)使得其能夠被注射到植入位點(diǎn)，由此促進(jìn)了非損傷外科手術(shù)的軟骨細(xì)胞的向量化(vectorisation)。
在其中培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的水凝膠可被植入通常被軟骨占據(jù)的損傷的位點(diǎn)。
目標(biāo)損傷可以是與創(chuàng)傷后遺癥相關(guān)的病灶軟骨物質(zhì)的損失，或者更一般地是任意骨關(guān)節(jié)的或人造的(plastique)軟骨病狀或損失。
本發(fā)明可應(yīng)用于所有軟骨組織的工程，所述軟骨組織包括下述的類型-透明軟骨(存在于鼻中隔、喉、氣管環(huán)、關(guān)節(jié)、或者肋骨的胸骨端)；-纖維軟骨(存在于椎間盤、特殊的關(guān)節(jié)軟骨和恥骨聯(lián)合)；-彈性軟骨(存在于耳廓、外耳道、會(huì)厭、咽鼓管和喉軟骨)。
椎間盤的修復(fù)是特別希望的。腰痛的病因未知，但可能歸因于椎間盤和其不可避免的和衰老有關(guān)的退化。椎間盤是纖維軟骨結(jié)構(gòu)，其由四個(gè)位于相鄰錐體之間的同心組織組成。外層是外部纖維環(huán)，其由明顯定向的膠原纖維組成。內(nèi)部纖維環(huán)具有較低膠原密度，比外部環(huán)的組織結(jié)構(gòu)差一些。過(guò)渡區(qū)是將內(nèi)部環(huán)與髓核分開的薄的纖維組織區(qū)，髓核為形成核心的膠性中央?yún)^(qū)。椎間盤為低血管化(hypovascularisé)的，具有有限的神經(jīng)分布。在成年人中，椎間盤依靠營(yíng)養(yǎng)物和代謝物的擴(kuò)散來(lái)提供養(yǎng)料。椎間盤包含在主要由水、蛋白聚糖、膠原和非膠原蛋白組成的大量胞外基質(zhì)中內(nèi)含的相對(duì)少量的細(xì)胞。椎間盤的細(xì)胞合成這些大分子，并維護(hù)和修復(fù)這些胞外基質(zhì)。在成年人中，軟骨細(xì)胞是唯一的髓核細(xì)胞。內(nèi)部纖維環(huán)、過(guò)渡區(qū)和相鄰錐體的軟骨板也包含軟骨細(xì)胞，而外部環(huán)主要包含成纖維類型的細(xì)胞。在所有個(gè)體中都存在一定程度的椎間盤退化。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了年齡與椎間盤退化之間的清楚的關(guān)聯(lián)性。從生命的第二個(gè)十年開始已經(jīng)觀察到了該退化。由于后天的和遺傳的因素，有椎間盤癥狀的人加速了正常衰老過(guò)程。
因此，本發(fā)明也涉及治療人體或動(dòng)物體的方法，包括通過(guò)注入如上所述的水凝膠來(lái)給藥，該水凝膠例如通過(guò)使用上述方法事先已經(jīng)體外植入了軟骨細(xì)胞。
可以使用包括可殺菌注射器和配有一次性注射器內(nèi)芯的連接件的系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行注射，例如使用HAWE NEOS DENTAL銷售的注射器，其包括通過(guò)高壓滅菌法滅菌的注射器(標(biāo)號(hào)440，注射器Hawe-Centrix C-RR，Mark III)和連接件(標(biāo)號(hào)445)。
下述的附圖和實(shí)施例用于闡述本發(fā)明，但不限制其范圍。


圖1A至1C示出了在對(duì)照條件下(不存在水凝膠)、或者與si-HPMC水凝膠對(duì)照，或者在存在放線菌素D(5μg/ml)下培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后軟骨細(xì)胞的MTS活性。SW1353(圖1A)、C28/I2(圖1B)和人類鼻軟骨細(xì)胞(圖1C)。在每個(gè)時(shí)期與對(duì)照組相比，*p＜0.001。
圖2A至2C示出了在對(duì)照條件下(不存在水凝膠)、或者與si-HPMC水凝膠對(duì)照，或者在存在放線菌素D(5μg/ml)下培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后軟骨細(xì)胞的計(jì)數(shù)。SW1353(圖2A)、C28/I2(圖2B)和人類鼻軟骨細(xì)胞(圖2C)。在每個(gè)時(shí)期與對(duì)照組相比，*p＜0.001。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例實(shí)施例1水凝膠的制備材料-HPMC E4M(Colorcon-Dow Chemical，法國(guó))-環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)(Acros，比利時(shí))-HEPES(Sigma-Aldrich，St Louis，USA)-NaOH(VWR Interna tional，F(xiàn)ontenay-sous-Bois，法國(guó))-NaCl(VWR International)-HCl 0.1M(Sigma Aldrich).
-胎兒腓腸血清(FCS)(Dominique Dutscher，Brumath，法國(guó)).
a)硅烷化羥丙基甲基纖維素(Si-HPMC)粉末的合成以用量為240克的HPMC進(jìn)行合成。所選的多糖是E4M。在6升燒瓶中，在有機(jī)溶劑中的非均相介質(zhì)中使用環(huán)氧丙氧丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)進(jìn)行合成(Bourges等，2002)。合成是在沸騰3小時(shí)下進(jìn)行的。硅烷化HPMC首先用烘箱干燥1夜，然后冷凍干燥(Christ Alpha 1-4ST)。
b)硅烷化羥丙基甲基纖維素溶液的制備將6克Si-HPMC粉末溶解在200ml的0.2M的NaOH溶液中。攪拌該混合物48小時(shí)。然后在0.09M的NaOH溶液中透析Si-HPMC溶液16小時(shí)。之后，在0.09M NaOH溶液中再透析2小時(shí)。再將該3％Si-HPMC溶液等分并蒸汽滅菌(121℃，30分鐘)。
c)誘導(dǎo)水凝膠交聯(lián)在層流凈化罩下，通過(guò)混合7.5ml的Si-HPMC溶液和7.5ml的HEPES緩沖液，并加入10％的FCS來(lái)即刻制備用于細(xì)胞培養(yǎng)的水凝膠。HEPES緩沖液通過(guò)將3.1g的HEPES和0.8g的NaCl溶解在0.03M HCl溶液中來(lái)制備。然后將該溶液等分并蒸汽滅菌(121℃，30分鐘)。
渦旋攪拌該HEPES/Si-HPMC混合物15秒，然后以1200rpm離心2分鐘。將該混合物轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中。1小時(shí)后加入培養(yǎng)基。
d)通過(guò)流變學(xué)物理表征水凝膠裝置和方法為了表征水凝膠的交聯(lián)，本發(fā)明人測(cè)量了兩個(gè)流變學(xué)參數(shù)分散模量G″(液體的特征)和保持模量G′(固體的特征)。通過(guò)使用裝備有直徑為60mm和角度為10的平面錐體(C60/1titan平面錐體，ThermoHaake)的流變儀來(lái)進(jìn)行這種測(cè)量。切斷面與板之間的間距為0.053mm。在37℃的溫度下，在振蕩模式下以3種振蕩頻率(1Hz，3.2Hz和10Hz)并在1帕斯卡的強(qiáng)加應(yīng)力下測(cè)量，時(shí)間為1,200,000秒(13.8天)。結(jié)果用Pa表示。
結(jié)果在水凝膠的制備過(guò)程中，其具有粘性液體的特性。在其交聯(lián)期間，它的物理特性朝著凝膠的特性發(fā)展。在實(shí)施例1中呈現(xiàn)的根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案制備的水凝膠在其交聯(lián)過(guò)程完成以后(10天)由1.5％的干聚合物和98.5％的水(水含量與軟骨的水含量相當(dāng))組成。水凝膠的計(jì)算的網(wǎng)格(maille)尺寸(0.22μm)看來(lái)小于細(xì)胞的尺寸。
為了確定水凝膠的物理性質(zhì)，例如與交聯(lián)過(guò)程的開始相對(duì)應(yīng)的凝膠點(diǎn)、交聯(lián)時(shí)間和水凝膠的網(wǎng)格尺寸，用三種不同的頻率測(cè)定液體分量(G″)和彈性分量(G′)隨時(shí)間的變化。G′/G″對(duì)因而對(duì)應(yīng)于每個(gè)頻率。描繪每對(duì)的TanΔ，這三個(gè)曲線相交于一點(diǎn)凝膠點(diǎn)。水凝膠的交聯(lián)在其制備后33分鐘開始，完成于244小時(shí)(10天)后，在該完成時(shí)間，彈性分量(G1)穩(wěn)定在數(shù)值為310Pa的水平。彈性分量的這個(gè)數(shù)值使得我們可以計(jì)算水凝膠的網(wǎng)格尺寸。
ξ=(KTG′)1/3=(1.38×10-23×300310)1/3=(4,14×10-21310)=23.7]]>納米在上述制備條件下，水凝膠的平均統(tǒng)計(jì)網(wǎng)格尺寸(Xi)為0.023μm。
表13％Si-HPMC水凝膠的流變學(xué)表征的結(jié)果

實(shí)施例2水凝膠的細(xì)胞毒性試驗(yàn)材料和方法2.1細(xì)胞培養(yǎng)a)軟骨細(xì)胞系材料-Dulbecco′s改性Eagle培養(yǎng)基(DMEM)(Invitrogen公司，Paisley，UK).
-Ham′s F12營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(Invitrogen公司).
-青霉素/鏈霉素(Invitrogen公司)-L-谷氨酰胺(Invitrogen公司)-胰蛋白酶/EDTA(Invitrogen公司)。
本發(fā)明人使用的人軟骨細(xì)胞系SW1353和C28/I2來(lái)自人軟骨肉瘤(Mengshol等，2000)和來(lái)自被類人猿病毒40的T抗原無(wú)限增殖化的人肋骨軟骨(Goldring等，1994)。在包含5％CO2的濕潤(rùn)氣氛和37℃下，在DMEM和Ham′s F12體積/體積混合物中培養(yǎng)這些細(xì)胞，向該混合物中添加10％的FCS、1％的青霉素/鏈霉素和1％的L-谷氨酰胺(完全DMEM/F12)。
每隔一天全部更新培養(yǎng)基。一旦細(xì)胞達(dá)到80至90％的匯合，則用2ml的胰蛋白酶(0.025％)/EDTA(0.01％)處理它們。接著，在37℃下培養(yǎng)3分鐘，收集胰蛋白酶/EDTA溶液，在8ml的完全DMEM/F12培養(yǎng)基存在下進(jìn)行離心處理(8分鐘，1200rpm)。在除去上清液后，用10ml的完全DMEM/F12重組細(xì)胞沉淀物(culot)。然后對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，并且以10,000細(xì)胞/cm2的密度分布于25cm2的瓶中。
b)初級(jí)軟骨細(xì)胞-人鼻軟骨細(xì)胞的分離材料-Hank′s平衡鹽(HBSS，Invitrogen公司)-蛋白酶(Pronase，Sigma-Aldrich)-IV型膠原酶(Sigma-Aldrich)。
得到經(jīng)過(guò)再造鼻整形術(shù)的患者通知許可后，取出人鼻軟骨。在層流凈化罩下，在Hank′s平衡鹽(HBSS)中洗滌鼻軟骨5次，切片。然后，于37℃下在包含1mg/ml蛋白酶的HBSS中培養(yǎng)軟骨切片30分鐘。隨后在HBSS中洗滌切片3次，再在包含0.625mg/ml的膠原酶的完全DMEM(10％FCS，1％青霉素/鏈霉素和1％L-谷氨酰胺)中攪拌培養(yǎng)4小時(shí)。將上清液以1400rpm離心5分鐘。在HBSS中洗滌沉淀物1次，離心(8分鐘，1200rpm)，并且再懸浮于10ml的完全DMEM中。對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到25cm2瓶中，細(xì)胞密度為10,000細(xì)胞/cm2。在37℃和含有5％CO2的濕氣氛中培養(yǎng)細(xì)胞。每隔一天更新培養(yǎng)基。一旦細(xì)胞達(dá)到80至90％的匯合，則用上面描述的胰蛋白酶/EDTA處理。
-兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離材料-透明質(zhì)酸酶(Sigma-Aldrich)-胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)
-溶組織梭菌(Clostridium histolyticum)的II型膠原酶(290U/mg，Sigma-Aldrich)-細(xì)胞篩(Falcon，F(xiàn)ranklin Lakes，USA)。
正如Ghayor等(2000)在以前所描述的，在麻醉后通過(guò)頸脫位法殺死12或13天齡的新生兔子。在層流凈化罩下，切下前爪和后爪，剝離它們的軟組織。然后使其膝關(guān)節(jié)和肩關(guān)節(jié)脫位。使用解剖刀將關(guān)節(jié)軟骨切成薄切片，得到的切片置于HBSS中。首先于37℃下在12ml包含0.05％透明質(zhì)酸酶的HBSS中培養(yǎng)這些切片10分鐘，然后于37℃下在6ml包含0.2％胰蛋白酶的HBSS中培養(yǎng)切片15分鐘。在HBSS中洗滌2次后，將切片轉(zhuǎn)移到包含0.2％膠原酶的HBSS中，在37℃下培養(yǎng)30分鐘。
在包含0.03％膠原酶的完全DMEM溶液中培養(yǎng)15小時(shí)，使切片經(jīng)過(guò)最后的消化(digestion)步驟。用細(xì)胞篩過(guò)濾消化產(chǎn)物，收集并離心(8分鐘，1200rpm)。再將細(xì)胞沉淀物懸浮于20ml的完全DMEM中。對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到25cm2瓶中，細(xì)胞密度為10,000細(xì)胞/cm2。最后，在37℃下和含有5％CO2的濕氣氛中培養(yǎng)細(xì)胞。每隔一天更新培養(yǎng)基。一旦細(xì)胞達(dá)到80至90％的匯合，則用上面描述的胰蛋白酶/EDTA處理。
2.2.水凝膠細(xì)胞毒性的研究a)試驗(yàn)條件材料-Corning-Costar 24-孔培養(yǎng)皿(Corning BV，Schiphol-Rijk，荷蘭)。
-放線菌素D(Sigma-Aldrich)-DMSO(Sigma-Aldrich)-甲基四唑鹽(MTS)(Cell Titer 96 MTS，Promega公司，Madison，WI)。
-苯基甲基亞砜(PMS)(Sigma-Aldrich)。
-磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，Invitrogen公司)
為了確定水凝膠的細(xì)胞毒性，將人初級(jí)軟骨細(xì)胞，SW1353和C28/I2細(xì)胞分布于24-孔培養(yǎng)皿中，密度為10,000細(xì)胞/cm2。在37℃和含有5％CO2的濕氣氛中培養(yǎng)24小時(shí)后，在存在(500μl Si HPMC/孔)或不存在(500μl完全培養(yǎng)基)水凝膠下培養(yǎng)細(xì)胞24、48和72小時(shí)。在不存在水凝膠下培養(yǎng)的細(xì)胞還用放線菌素D(5μg/ml)或其賦形劑(DMSO)處理，得到陽(yáng)性細(xì)胞毒性對(duì)照。
b)MTS試驗(yàn)這種比色試驗(yàn)用于測(cè)定活細(xì)胞的線粒體在甲中氧化四唑鹽MTS的能力。形成的有色產(chǎn)物與線粒體的脫氫酶活性成正比。因此，吸收度測(cè)定能夠定量細(xì)胞生存力。在上文描述的條件下培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后，用完全培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞，在37℃下，在包含48μg/ml PMS和2mg/ml MTS的100μl MTS試劑的存在下培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)。用微量培養(yǎng)板讀出器(MRX，Dynatech Laboratories，VWR International)在490nm進(jìn)行吸收度測(cè)定。結(jié)果以相對(duì)于對(duì)照條件(不存在水凝膠下培養(yǎng)的細(xì)胞)的MTS活性的百分?jǐn)?shù)來(lái)表示。
c)細(xì)胞計(jì)數(shù)在上面規(guī)定的條件下培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后，吸出含有或不含水凝膠的培養(yǎng)基，用200μl的胰蛋白酶/EDTA代替。在37℃下和含有5％CO2的濕氣氛中培養(yǎng)細(xì)胞2分鐘。然后收集細(xì)胞，并在2ml完全培養(yǎng)基中離心處理(8分鐘，1200rpm)。將沉淀物再懸浮于2ml完全培養(yǎng)基中。用臺(tái)盼藍(lán)溶液(在PBS中，0.04％)對(duì)Malassez細(xì)胞進(jìn)行活體染色后，對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。結(jié)果以每孔的細(xì)胞總數(shù)表示。
結(jié)果2.3人類鼻軟骨細(xì)胞的表征為了表征分離的人類鼻軟骨細(xì)胞的表型，本發(fā)明人在分離之后和單層培養(yǎng)期間通過(guò)RT/PCR研究軟骨細(xì)胞表型的特定標(biāo)記的表達(dá)。該研究表明新分離的鼻軟骨細(xì)胞(P0)表達(dá)膠原II、聚集蛋白聚糖和膠原X，以及膠原I。在不同的途徑中，本發(fā)明人觀察到這些各種基因表達(dá)的變體。在P0和P3之間，II型膠原的表達(dá)減少。在P0和P1之間，聚集蛋白聚糖的表達(dá)降低。新分離的軟骨細(xì)胞少量表達(dá)膠原X，在P3，不再能檢測(cè)到膠原X的表達(dá)。相反，在P2和P3之間，I型膠原的表達(dá)顯著增加。
這些結(jié)果表明新分離的鼻軟骨細(xì)胞表達(dá)膠原II、聚集蛋白聚糖和膠原X。在單層培養(yǎng)物中，這些軟骨細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)下降，其與I型膠原表達(dá)的明顯增加相關(guān)聯(lián)。
2.4水凝膠的細(xì)胞毒性a)測(cè)定受到凝膠影響后培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的MTS活性為了確定水凝膠對(duì)軟骨細(xì)胞的細(xì)胞毒性效果，本發(fā)明人分析在Si-HPMC水凝膠影響下培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后，SW1353和C28/I2細(xì)胞系和人類鼻軟骨細(xì)胞的MTS活性。
結(jié)果表明MTS活性沒有由于存在水凝膠而改變對(duì)于SW1353，C28/I2軟骨細(xì)胞和人類鼻軟骨細(xì)胞，在對(duì)照培養(yǎng)條件和在受到水凝膠影響后的培養(yǎng)條件之間，沒有觀察到明顯的不同。另一方面，在這種情況下作為陽(yáng)性細(xì)胞毒性對(duì)照使用的轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D從24小時(shí)開始引起MTS活性顯著降低。在存在放線菌素D的24小時(shí)后，SW1353和C28/I2軟骨細(xì)胞和從人類鼻軟骨分離的軟骨細(xì)胞的MTS活性分別降低了72％、69％和86％(圖1A至1C)。
這些結(jié)果表明水凝膠不影響SW1353和C28/I2軟骨細(xì)胞的MTS活性，也不影響人類鼻軟骨細(xì)胞的MTS活性。
b)臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)為了確定水凝膠對(duì)細(xì)胞增殖的影響，本發(fā)明人通過(guò)臺(tái)盼藍(lán)染色來(lái)進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。這種染色使得能夠區(qū)分活細(xì)胞(白色)和死細(xì)胞(藍(lán)色)。于水凝膠中培養(yǎng)SW1353和C28/I2細(xì)胞系及人類鼻軟骨細(xì)胞24小時(shí)、48小時(shí)和72小時(shí)后進(jìn)行計(jì)數(shù)(圖2A至2C)。
在對(duì)照條件下和在Si-HPMC影響下進(jìn)行培養(yǎng)期間，SW1353和C28/12軟骨細(xì)胞及人類鼻軟骨細(xì)胞的數(shù)目沒有觀察到顯著的不同。另一方面，從24小時(shí)開始，放線菌素D引起細(xì)胞數(shù)目的明顯降低。用放線菌素D培養(yǎng)24小時(shí)后，SW1353軟骨細(xì)胞的數(shù)目降低了88％，C28/I2軟骨細(xì)胞的數(shù)目降低了81％。在用放線菌素D處理24小時(shí)后，人類鼻軟骨細(xì)胞降低了43％。
這些結(jié)果表明水凝膠沒有改變SW1353軟骨細(xì)胞、C28/I2軟骨細(xì)胞或人類鼻軟骨細(xì)胞的增殖。
實(shí)施例3在水凝膠中培養(yǎng)軟骨細(xì)胞3.1三維培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的觀察材料和方法實(shí)驗(yàn)條件材料-細(xì)胞示蹤綠(CTG)(分子探針，Leiden，荷蘭)。
-乙啡啶(ethidium)同型二聚體-1(EthD-1)(分子探針)。
以1百萬(wàn)細(xì)胞/ml水凝膠的比例將兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、SW1353和C28/I2細(xì)胞懸浮在水凝膠中。將500μl的這種混合物放置在24-孔培養(yǎng)基的孔中。然后，在完全培養(yǎng)基存在下培養(yǎng)細(xì)胞48小時(shí)、96小時(shí)、1周和2周。同時(shí)，通過(guò)加入包含5μg/ml放線菌素D的溶液進(jìn)行陽(yáng)性細(xì)胞死亡對(duì)照。使用細(xì)胞示蹤綠(CTG)和乙啡啶同型二聚體1(EthD-1)觀察水凝膠內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞。CTG是無(wú)色產(chǎn)品，其可自由地?cái)U(kuò)散經(jīng)過(guò)細(xì)胞膜。其隨后在細(xì)胞質(zhì)中通過(guò)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化成不能離開細(xì)胞的熒光產(chǎn)物。在活細(xì)胞中，CTG產(chǎn)生綠色熒光。EthD-1是DNA插入試劑，與核酸結(jié)合后，其產(chǎn)生的熒光增加40倍。其僅能穿透具有細(xì)胞膜損傷的細(xì)胞。這兩類染色劑的組合使用可以使活細(xì)胞(綠色染色)和死細(xì)胞(紅色染色)共同定位(colocalisation)(Magne等，2003)。吸出培養(yǎng)基，用400μl的在完全培養(yǎng)基中的5μM的CTG溶液代替。在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞1小時(shí)。然后，用完全培養(yǎng)基代替CTG溶液，再次在37℃下培養(yǎng)細(xì)胞30分鐘。用PBS洗滌后，在室溫下和在黑暗中，用400μl的在完全培養(yǎng)基中的1μMEthD-1溶液(不含F(xiàn)CS)處理細(xì)胞1小時(shí)。最后移除培養(yǎng)基，吸出水凝膠，將其放置于載玻片和蓋玻片之間。通過(guò)落射熒光顯微鏡法(Axioplan，Zeiss，Iena，德國(guó))得到圖像，使用DC30數(shù)碼照相機(jī)記錄(Kappa opto-electronics Gmbh，Gleichen，德國(guó))。
如上詳細(xì)說(shuō)明的，在培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后，還用激光掃描的反向共聚焦顯微鏡方法(IFR 26，Caroline Vignes-Colombeix)顯示凝膠中的細(xì)胞。共聚焦顯微鏡通過(guò)消除不屬于焦平面的信號(hào)而產(chǎn)生清晰的圖象。這種顯微鏡具有能沿著Z軸移動(dòng)的載物臺(tái)，以允許焦平面改變，因而可顯示樣品的各個(gè)面。使用熒光素異硫氰酸酯檢測(cè)劑(FITCλex＝488nm；收集的λem＝490至560nm)追蹤C(jī)TG的熒光。通過(guò)玫瑰精檢測(cè)劑(TRITCλex＝568nm，收集的λem＝570至700mn)顯示EthD-1熒光。
結(jié)果為了觀察在水凝膠中三維培養(yǎng)期間軟骨細(xì)胞的變化，本發(fā)明人對(duì)SW1353和C28/I2軟骨細(xì)胞和兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進(jìn)行染色(CTG和EthD-1)。然后，他們用熒光顯微鏡方法觀察。在水凝膠內(nèi)，SW1353和C28/I2軟骨細(xì)胞或兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞是圓形的，被細(xì)胞示蹤綠染成明顯的綠色。很少有細(xì)胞顯示出染成紅色。在水凝膠中，SW1353、C28/I2和兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞三維發(fā)展，形成結(jié)節(jié)，其數(shù)目和尺寸隨培養(yǎng)時(shí)間而增加。
為了提供對(duì)水凝膠中培養(yǎng)的細(xì)胞的三維觀察，本發(fā)明人通過(guò)共聚焦顯微鏡方法輔助他們的觀察。在這些研究中，僅僅報(bào)道了對(duì)C28/I2細(xì)胞的觀察。共聚焦顯微鏡方法顯示了與以前采用常規(guī)熒光顯微鏡方法得到的相同結(jié)果。這些細(xì)胞以結(jié)節(jié)的形狀發(fā)展。用放線菌素D處理48小時(shí)后的細(xì)胞顯示出明顯的紅色染色。很少有細(xì)胞保持綠色染色。這些結(jié)果表明，在我們的培養(yǎng)條件下，細(xì)胞示蹤綠/乙啡啶同型二聚體-1雙重染色使得可以區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。當(dāng)前正在分析SW1353軟骨細(xì)胞、人類鼻軟骨細(xì)胞和兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的觀察結(jié)果。
所有這些結(jié)果表明在水凝膠中三維培養(yǎng)時(shí)，SW1353的C28/I2軟骨細(xì)胞及兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞保持它們的生存力。
3.2.軟骨細(xì)胞表型的分析為了分析軟骨細(xì)胞表型，用RT-PCR研究編碼特定軟骨細(xì)胞標(biāo)記的信使的表達(dá)。
(a)實(shí)驗(yàn)條件材料Trizol試劑(Invitrogen公司)。
為了表征從人類鼻軟骨分離的細(xì)胞的顯型，在存在Trizol(處理0，P0)下冷凍新分離的細(xì)胞的一部分。以10,000細(xì)胞/cm2的比例將其它部分的細(xì)胞分布于25cm2瓶中。每周在上述的條件下次培養(yǎng)細(xì)胞(項(xiàng)目a))。在一、二或三次處理后，在存在Trizol下于-80℃冷凍細(xì)胞(處理1(P1)，2(P2)和3(P3))。
從兔關(guān)節(jié)軟骨中新分離的軟骨細(xì)胞以1百萬(wàn)細(xì)胞/ml水凝膠的比例分布，將2ml這種混合物放置在六孔培養(yǎng)皿的孔中。然后在存在Trizol下冷凍之前培養(yǎng)細(xì)胞3周。
(b)總RNA的提取材料-氯仿(VWR)-異丙醇(Sigma Aldrich)-乙醇(VWR)-瓊脂糖(Promega公司)-溴化乙錠(EtBr)(Promega公司)-三硼酸EDTA(TBE)(Invitrogen公司)從冰中解凍并刮取細(xì)胞然后收集Trizol溶液，在4℃下以12,000rpm離心10分鐘。移除上面的相；加入200μl氯仿，旋渦攪拌混合物15秒。室溫培養(yǎng)樣品10分鐘后，在4℃下以12,000RPM離心15分鐘。移除水相，在存在500μl異丙醇下離心分離(12,000rpm，15分鐘，4℃)沉淀總RNA。移除上清液，用75％的乙醇洗滌沉淀物，然后干燥?？俁NA被置于20μl水中。然后在260nm測(cè)定吸收率來(lái)評(píng)價(jià)RNA的分離的量。最后調(diào)節(jié)RNA的濃度至1μg/μl。為了檢查提取的RNA的完整性，在包含EtBr的TBE緩沖液中的1％瓊脂糖上電泳分離500ng的總RNA。在100V下遷移進(jìn)行30分鐘。用UV透照儀顯示總RNA。
(c)通過(guò)RT-PCT的轉(zhuǎn)錄物的分析-DNA酶處理材料-脫氧核糖核酸酶I(DNA酶I)5U/μl(Invitrogen公司)-DNA酶I緩沖液10X(Invitrogen公司)-乙二胺四乙酸(EDTA)25mM(Invitrogen公司)。
移出2μg的RNA；加入1μl的DNA酶I 10X緩沖液和1μl的DNA酶I.(5U/μl)，用無(wú)菌水調(diào)節(jié)體積至10μl。然后，室溫下培養(yǎng)樣品15分鐘。加入1μl的25mM EDTA終止反應(yīng)，將反應(yīng)產(chǎn)物在65℃下放置10分鐘。
-逆轉(zhuǎn)錄(RT)材料-脫氧核苷酸三磷酸酯(dNTP)10mM(Invitrogen公司)-0.5μg/μl六核苷酸引物(隨機(jī)六聚體，Promega公司六引物C1181)-禽成髓細(xì)胞瘤病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(AMV-RT)10U/μl(Promega公司)-AMV-RT緩沖液5X(Promega公司)-RNA酶抑制劑(RNAsin)400U/μl(Promega公司)。
預(yù)先用DNA酶處理的每個(gè)樣品中加入3μl的10mM dNTP、3μl的六核苷酸引物、6μl的AMV-RT緩沖液、1μl的AMV-RT和1μl的RNAsin；用無(wú)菌水調(diào)節(jié)體積至30μl。用熱周期計(jì)(EppendorfMastercycler，VWR)在下述條件下進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄在25℃下10分鐘，在42℃下50分鐘，在95℃下10分鐘。然后，在-20℃下保存如此得到的單鏈互補(bǔ)DNA溶液(cDNA)，直到其被用于PCR反應(yīng)。
-聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)
材料-特定的低聚物引物(MWG Biotech，Courtaboeuf，法國(guó))-Taq聚合酶緩沖液10X(Invitrogen公司)-Taq聚合酶5U/μl(Invitrogen公司)-MgCl250mM(Invitrogen公司)。
通過(guò)使用向其中加入了0.5μl正義引物和0.5μl反義引物的2μl的cDNA溶液、5μl的Taq聚合酶緩沖液、1.5μl的MgCl2、0.5μl的Taq聚合酶和40μl的水來(lái)進(jìn)行PCR。在下述條件下用熱周期計(jì)(Eppendorf Mastercycler)進(jìn)行PCR反應(yīng)在94℃變性3分鐘，然后在94℃(變性)進(jìn)行20秒的30次循環(huán)，在60℃(雜交)20秒和在72℃伸長(zhǎng)(élongation)20秒。通過(guò)在72℃伸長(zhǎng)10分鐘來(lái)完成PCR反應(yīng)。該研究的結(jié)果表明得到的PCR產(chǎn)物處于指數(shù)式擴(kuò)增階段。引物的序列、雜交溫度和擴(kuò)增子的大小具體列在表2中(下文)。
表2參考基因的引物序列、雜交溫度和擴(kuò)增子的大小

(d)在瓊脂糖凝膠上的分離在三硼酸EDTA緩沖液(TBE)1X中于2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳分離。使用UV透照儀通過(guò)溴化乙錠顯示區(qū)帶。擴(kuò)增子的大小顯示在表2中。
(d)瓊脂糖凝膠的半定量密度測(cè)量分析使用Leica Q500軟件(Leica Imagine Systems，Cambridge，UK)估計(jì)在2％瓊脂糖凝膠上得到的區(qū)帶的強(qiáng)度，所述軟件使得能夠在各種試驗(yàn)條件下對(duì)擴(kuò)增的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行半定量的密度測(cè)量分析。結(jié)果表示為任意單位的相關(guān)基因/參考基因之比。
結(jié)果為了檢驗(yàn)在水凝膠內(nèi)三維培養(yǎng)時(shí)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的表型的保持，他們通過(guò)RT-PCR來(lái)評(píng)估編碼II型膠原、聚集蛋白聚糖和膠原X的轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)。同時(shí)也檢驗(yàn)I型膠原的表達(dá)。
在單層培養(yǎng)期間，本發(fā)明人觀察到II型膠原、聚集蛋白聚糖和膠原X的表達(dá)減少。三周后，II型膠原仍只有少量表達(dá)，而再也檢測(cè)不到X型膠原和聚集蛋白聚糖。同時(shí)，我們的結(jié)果表明，在三周單層培養(yǎng)后，I型膠原的表達(dá)增加。
相反，當(dāng)在水凝膠中三維培養(yǎng)細(xì)胞3周時(shí)，II型膠原、聚集蛋白聚糖和X型膠原的表達(dá)得以保持。I型膠原的表達(dá)不再受到刺激。
這些結(jié)果表明兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的三維培養(yǎng)使得軟骨細(xì)胞標(biāo)記(膠原II、聚集蛋白聚糖和膠原X)的表達(dá)得以保持。
實(shí)施例4三維培養(yǎng)中軟骨細(xì)胞的再分化的研究為了研究在實(shí)施例1中制備的水凝膠中三維培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的再分化，單層培養(yǎng)新分離的人和兔鼻和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞4周，然后在水凝膠中三維培養(yǎng)并且同時(shí)單層培養(yǎng)4周。
在單層培養(yǎng)和三維培養(yǎng)2、3、4周后的每個(gè)處理中抽取總RNA。用RT-PCR檢測(cè)II型膠原和聚集蛋白聚糖、軟骨細(xì)胞表型的特殊標(biāo)記和I型膠原、軟骨細(xì)胞分化的標(biāo)記。
結(jié)果表明新分離的軟骨細(xì)胞表達(dá)II型膠原、I型膠原和聚集蛋白聚糖。在單層培養(yǎng)期間，這些標(biāo)記的表達(dá)發(fā)生了改變；在各種處理期間，II型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)降低，直到其在三次處理結(jié)束時(shí)消失，而從第一次處理開始，I型膠原的表達(dá)明顯增加，并且在各種處理的過(guò)程中保持著明顯的表達(dá)。因此，在單層培養(yǎng)的三次處理結(jié)束時(shí)，軟骨細(xì)胞看起來(lái)是去分化的。然后，在水凝膠中三維培養(yǎng)軟骨細(xì)胞期間，結(jié)果表明II型膠原和聚集蛋白聚糖的表達(dá)增加，而且I型膠原的表達(dá)降低。這些結(jié)果說(shuō)明在水凝膠中細(xì)胞具有恢復(fù)的軟骨細(xì)胞表型。
這些結(jié)果表明所用的水凝膠可使以前去分化的軟骨細(xì)胞再分化。統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)所有的試驗(yàn)都進(jìn)行三份。每個(gè)試驗(yàn)進(jìn)行兩次。用平均+/-標(biāo)準(zhǔn)偏差表示結(jié)果。使用Anova試驗(yàn)進(jìn)行平均水平的比較研究。對(duì)于p＜0.05，結(jié)果被認(rèn)為是具有顯著差異。
實(shí)施例5鼻軟骨細(xì)胞的皮下植入按照前述實(shí)施例中的描述制備水凝膠，其整合了來(lái)自鼻軟骨(HNC)的人軟骨細(xì)胞。然后，將它們皮下植入裸鼠中，并保留3周。
在下述5個(gè)條件下進(jìn)行試驗(yàn)(1)植入前，在水凝膠中三維培養(yǎng)人類鼻軟骨細(xì)胞15天；(2)在通過(guò)水凝膠植入前，單層培養(yǎng)人類鼻軟骨細(xì)胞15天。
(3)新分離的人類鼻軟骨細(xì)胞，并通過(guò)水凝膠植入。
(4)在通過(guò)水凝膠植入前，單層培養(yǎng)人包皮成纖維細(xì)胞。
(5)僅僅水凝膠。
在回收植入劑期間，本發(fā)明人注意到植入后3周植入劑仍清楚可見。因此，在這三周中，水凝膠沒有被再吸收。組織學(xué)分析表明對(duì)于包含HNC的三種條件(條件1、2和3)來(lái)說(shuō)，存在陽(yáng)性軟骨細(xì)胞沉淀物，這是因?yàn)榘栃滤{(lán)在水凝膠中染色。因此，所有這些結(jié)果向我們表明Si-HPMC水凝膠使得能夠在活體內(nèi)3周后新生軟骨類型的組織。
參考文獻(xiàn)-Bourges et al.，2002a，General properties of silatedhydroxyethylcellulose for potential biomedical applications，Biopolymers63(4)232-8-Bourges X，Weiss P，Daculsi G，Legeay G，2002b Synthesis andgeneral properties of silated-hydroxypropyl methylcellulose in prospect ofbiomedical use.Adv Colloid Interface Sci 99(3)215-28-Brittberg M，Lindahl A，Nilsson A，Ohlsson C，Isaksson O，Peterson L1994 Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologouschondrocyte transplantation.N Engl J Med 331(14)889-95-Cancedda R，Dozin B，Giannoni P，Quarto R 2003 Tissue engineeringand cell therapy of cartilage and bone.Matri×Biol 22(1)81-91-Ghayor C，Herrouin JF，Chadjichristos C，Ala-Kokko L，Takigawa M，Pujol JP，Galera P 2000 Regulation of human COL2A1 gene expression inchondrocytes.Identification of C-Krox-responsive elements and modulation byphenotype alteration.J Biol Chem 275(35)27421-38-Goldring MB，Birkhead JR，Suen LF，Yamin R，Mizuno S，Glowacki J，Arbiser JL，Apperley JF 1994 Interleukin-1 beta-modulated gene expression inimmortalized human chondrocytes.J Clin Invest 94(6)2307-16-Hurziker EB 2002 Articular cartilage repairbasic science and clinicalprogress.A review of the current status and prospects.Osteoarthritis Cartilage10(6)432-63-Magne D，Bluteau G，F(xiàn)aucheux C，Palmer G，Vignes-Colombeix C，PiletP，Rouillon T，Caverzasio J，Weiss P，Daculsi G，Guicheux J 2003 Phosphate is aspecific signal for ATDC5 chondrocyte maturation and apoptosis-associatedmineralizationpossible implication of apoptosis in the regulation ofendochondral ossification.J Bone Miner Res 18(8)1430-42-Mengshol JA，Vincenti MP，Coon Cl，Barchowsky A，Brinckerhoff CE2000 Interleukin-1 induction of collagenase 3(matrix metalloproteinase 13)geneexpression in chondrocytes requires p38，c-Jun N-terminal kinase，and nuclearfactor kappaBdifferential regulation of collagenase 1 and collagenase 3.ArthritisRheum 43(4)801-11-Shapiro F，Koide S，Glimcher MJ 1993 Cell origin and differentiation inthe repair of full-thickness defects of articular cartilage.J Bone Joint Surg Am75(4)532-5權(quán)利要求
1.隨著pH而自交聯(lián)的硅烷化羥乙基纖維素(HEC)或硅烷化羥丙基甲基纖維素(HPMC)水凝膠用于三維體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的用途。
2.權(quán)利要求1的用途，其中水凝膠可通過(guò)HEC或HPMC與式(1)化合物的反應(yīng)而獲得XSi(OZ)3(1)其中X表示鹵原子或具有環(huán)氧官能團(tuán)的烴基，尤其是C2-20烴基，Z選自氫原子、堿金屬和烷基，尤其是C1-5烷基。
3.權(quán)利要求1或2所述的用途，其中HEC或HPMC攜帶占HEC或HPMC總干重的0.5％至5％的硅烷醇鹽側(cè)基或者硅烷醇?jí)A金屬鹽或者銨鹽的前體。
4.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的用途，其中水凝膠由下述簡(jiǎn)化式的聚合物形成
5.一種用于制備在水凝膠中整合的細(xì)胞的復(fù)合物的體外方法，該復(fù)合物用于注入軟骨位點(diǎn)中，其中所述方法包括在具有適合水凝膠交聯(lián)的pH的生物緩沖液中，在適合軟骨細(xì)胞在水凝膠中整合和三維培養(yǎng)的條件和時(shí)間周期下，將軟骨細(xì)胞與隨著pH而自交聯(lián)的硅烷化羥乙基纖維素(HEC)或硅烷化羥丙基甲基纖維素(HPMC)水凝膠進(jìn)行體外混合。
6.一種用于制備在水凝膠中整合的細(xì)胞的復(fù)合物的體外方法，該復(fù)合物用于注入軟骨位點(diǎn)中，其中所述方法包括在具有適合水凝膠交聯(lián)的pH的生物緩沖液中，在適合由所述未分化細(xì)胞的分化得到的軟骨細(xì)胞在水凝膠中整合和三維培養(yǎng)的條件和時(shí)間周期下，將能夠進(jìn)行軟骨形成性分化的未分化細(xì)胞與隨著pH而自交聯(lián)的硅烷化羥乙基纖維素(HEC)或硅烷化羥丙基甲基纖維素(HPMC)水凝膠進(jìn)行體外混合。
7.權(quán)利要求5的方法，包括下述的體外步驟-在固體載體上的軟骨細(xì)胞的單層擴(kuò)增；-通過(guò)其單層擴(kuò)增而去分化的擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞的收集；-在具有適合水凝膠交聯(lián)的pH的生物緩沖液中將去分化的擴(kuò)增的軟骨細(xì)胞與水凝膠混合，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞在水凝膠內(nèi)整合并導(dǎo)致其再分化。
8.權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)的方法，其中水凝膠可通過(guò)HEC或HPMC與式(1)化合物的反應(yīng)而獲得XSi(OZ)3(1)其中X表示鹵原子或具有環(huán)氧官能團(tuán)的烴基，尤其是C2-20烴基，Z選自氫原子、堿金屬和烷基，尤其是C1-5烷基。
9.權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)的方法，其中HEC或HPMC攜帶占HEC或HPMC總干重的0.5％至5％的硅烷醇鹽側(cè)基或者硅烷醇?jí)A金屬鹽或者銨鹽的前體。
10.權(quán)利要求5至9中任一項(xiàng)的方法，其中水凝膠由下述簡(jiǎn)化式的聚合物形成
全文摘要
本發(fā)明涉及隨著pH而自交聯(lián)的硅烷化羥乙基纖維素(HEC)或硅烷化羥丙基甲基纖維素(HPMC)水凝膠用于三維體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的用途。
文檔編號(hào)A61L27/50GK1897989SQ200480038360
公開日2007年1月17日 申請(qǐng)日期2004年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月4日
發(fā)明者P·韋斯, J·古伊克斯, G·德古爾西, G·格里曼迪, C·維納蒂埃爾 申請(qǐng)人:國(guó)家健康醫(yī)學(xué)研究所, 南特大學(xué)