專利名稱：減輕內毒素的效應的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于減輕病原體感染導致的腸毒素的效應的營養方法。
背景技術：
人和動物的胃腸道處于產生多種紊亂的危險之中，所述紊亂包括衰老、病毒、細菌和/或它們的毒素引起的紊亂，或者其它物理或化學物質濫用引起的紊亂等。
有幾種因素或者療法能夠減輕多種胃腸道紊亂的癥狀。其中土著菌群(稱作小型生物群)在調節腸道環境方面發揮著重要的作用。這些定居在腸道的非病原性微生物(稱作益生菌)與從所述微生物釋放或作為食物成分從膳食中攝取的益生分子一起提供了預防或治療胃腸紊亂(包括艱難梭菌(C.difficile)感染)的可能的手段。
已經證實，人的腸道細菌調控腸道中艱難梭菌毒素A的產生，并且比起常規小鼠，毒素A更容易結合從無菌小鼠分離的腸膜，這表明土著微生物在艱難梭菌的發病中起重要作用。用于檢測由艱難梭菌引起的大腸炎和腹瀉的營養方法的臨床研究表明乳桿菌(Lactobacillus GG)改善了入院的成人和嬰兒的大腸炎的癥狀。類似地，非病原性酵母(Saccharomycesboulardii)也在防止或治療成人和嬰兒中艱難梭菌引起的大腸炎和腹瀉中起積極作用。另外，RU 2168915公開了一種肉制品作為針對兒童和虛弱的人中胃腸紊亂的治療性或預防性食品的用途，該肉制品包含預決定比例的牛肉、豬肉、漂白的牛肝、南瓜和奶油。所有以上的觀察都表明，針對艱難梭菌感染的營養介入的領域仍然是開放的。
發明概述本發明是涉及包含酵母提取物的口服組合物用于治療病原體感染導致的腸毒素效應的用途。此類效應包括由于肌動蛋白絲分解引起的腸上皮完整性的破壞和所引起的緊密連接的破壞，以及毒素誘導的腸液分泌導致的腹瀉，和環加氧酶誘導作用介導的其它過程。
發明詳述在本發明中，“口服組合物”旨在表示任何可攝取的組合物，并且可以是營養組合物、營養補充物，或者藥物。例如，它也可以是藥物治療的佐劑。該口服組合物旨在應用于遭受病原體感染產生的腸毒素效應的人，包括嬰兒或早產嬰兒到老年人。它也可以用于遭受病原體感染產生的腸毒素效應的動物，如貓、狗、魚、兔、鼠、倉鼠等等，以及更加一般地人類飼養的任意動物，如馬、奶牛、家禽、綿羊等。
術語“酵母提取物”可以包括自溶酵母的水溶性部分，并優選地含有維生素B復合物。它還覆蓋包含自溶的面包酵母的可溶性和不溶性部分，并且在這種情況下，它優選還包含核黃素和泛酸。然而，在本發明的優選實施方案中，“酵母提取物”并包含該微生物并且不包含該微生物產生的酶。酵母提取物可能是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)提取物。用于本發明的適宜的、通過商業途徑可獲得的酵母提取物的實例是BectonDickinson and Company公司提供的BD Bacto Yeast Extract。
術語“肉膏”旨在包括任何肉類的提取物，例如牛肉、豬肉、羊肉、雞肉和/或火雞肉等等的提取物。它也可以來自上面提到的肉類的混合物。無論如何，它都將至少提供氮、氨基酸和碳。用于本發明的適宜的、通過商業途徑可獲得的肉膏的實例是由Becton Dickinson and Company提供的BD Bacto Beef Extract。
術語“蛋白胨”意思是蛋白質物質的部分酶促或酸水解產物的任何可溶性混合物。蛋白質起始材料的選擇并不關鍵，但是優選酪蛋白、乳清蛋白和肉類蛋白質。優選地，蛋白胨的分子量小于3kDa。用于本發明的適宜的、通過商業途徑可獲得的蛋白胨的實例是Becton Dickinson andCompany公司提供的BD Bacto Peptone。
腸毒素是對腸粘膜起作用的細菌外毒素。它們可以由致病性細菌在腸內產生。細菌腸毒素是有效的粘膜免疫原，其激活粘膜和系統免疫反應，從而導致多種疾病，包括食物中毒、普通腹瀉、大腸炎、慢性炎癥和痢疾。腸毒素也導致嚴重的粘膜潰瘍、出血性炎性滲出或者血性腹瀉。毒素誘導的疾病通常伴有腹部絞痛和直腸痛。腸毒素為液體分泌和腸炎的主要刺激物。它們在上皮細胞表面的結合導致絲狀肌動蛋白的解聚和緊密連接滲透性的增加，以及激活胞內途徑并隨后合成和釋放液體分泌活化劑。毒素還誘導嚴重的炎癥，通常特征為通過感覺腸神經的激活以及感覺神經肽的釋放在粘膜內嗜中性粒細胞的遷移以及腸細胞壞死，并伴有細胞因子的釋放和上皮細胞破壞。
致病性細菌可以是共生的微生物系統的一部分，即它們可以無害地存在于腸道，除非或者直到這個微生物系統的平衡遭到擾亂，例如，在用抗生素，尤其廣譜抗生素治療期間就可以發生所述擾亂。在此類情況下，這些“機會病原體”可以迅速生長，占據腸道微生物系統并產生引起腸炎的毒素。此類細菌的例子包括艱難梭菌和產氣莢膜梭菌(clostridiumperfringens)，并且本發明的組合物特別適于治療此類細菌產生的毒素效應。應當理解本發明尤其適用于治療醫院感染。
其它產生腸毒素的細菌的例子包括大腸桿菌(E.coli)、杜氏利什曼原蟲(Leishmania donovani)、霍亂弧菌(Vibrio cholera)、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)、志賀桿菌(Shigellae)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、或者產腸毒素的脆弱擬桿菌(Bacteroides fragilis)(ETBF)。
艱難梭菌感染是入院患者大腸炎和腹瀉的主要原因，由于抗生素攝入，這些患者的腸道小型生物群改變。艱難梭菌通過釋放兩種毒素毒素A和毒素B而引起腸炎。兩種毒素在人體都有強烈的細胞毒性作用，但是毒素A是液體分泌(從而導致腹瀉)和腸炎癥的主要刺激物。毒素A結合于上皮細胞表面，并通過有被小窩內化到細胞質。內化導致肌動蛋白張力絲的解聚、肌動蛋白結合的黏著斑的破壞、緊密連接的打開、細胞的脫離和液體分泌增加。這些效應已經在體外在培養的人上皮細胞系(例如T84結腸細胞系)中得到證明，其中在單細胞層上加入毒素A減小了跨上皮阻力并增加了單細胞層的通透性。艱難梭菌腸毒素在體內顯示出誘導嚴重炎癥，其特征是當豚鼠、兔或大鼠回腸暴露于毒素A時，粘膜中嗜中性粒細胞遷移和腸細胞。導致該急性炎癥反應的機制似乎是感覺腸神經的激活和感覺神經肽的釋放。最近的研究還提出毒素A上調腸內COX-2的表達。
胃腸病原體引起的損傷的最常見的后果之一是腹瀉。腹瀉是由致病性細菌(包括產生腸毒素的細菌)、寄生蟲或病毒可以引起的腸道內上皮細胞分泌的增加造成的。
COX-2是一種催化由花生四烯酸合成前列腺素的酶。COX-2的其它已知的催化底物包括二高-γ-亞麻酸(20∶3n∶6)和二十碳五烯酸(EPA，20∶5n-3)，分別產生PGE1和PGE3。已經克隆了人COX-2基因，并且已經描述了它的基因表達對不同元件，如cAMP、NF-κB和TGF-β、IL-1或TNF-α的應答。
COX-2與多種炎癥相關，所述炎癥包括過敏反應和腸炎癥。在其中涉及COX-2活性的腸炎癥腸紊亂中，有胃炎、炎性腸病、過敏性腸綜合征或腸癌。
優選地，酵母提取物以口服組合物的形式給藥，所述組合物按體積計包含0.01％到0.5％酵母提取物。另外，該組合物可包含優選0.3％到7％數量的蛋白胨。蛋白胨的合適來源包括乳清蛋白和充分水解的乳清蛋白，雖然也可以使用水解程度在15％到20％的乳清蛋白，但優選平均肽大小不超過5個氨基酸的乳清蛋白。肉類蛋白質是蛋白胨的備選來源，并且在肉類蛋白質中優選牛肉蛋白質。組合物還可包含肉膏，優選按體積計0.3％到7.0％的量。在優選的實施方案中，該口服組合物包含(按體積計)0.5％的酵母提取物、1％肉膏和1％的蛋白胨。
本發明的口服組合物可以采取多種不同的食品形式。例如，當目標群體是嬰兒群體，它可以是嬰兒配方粉劑。它也可以是脫水的食品，例如湯。它還可以是腸組合物或者補充配方。當遭受腸紊亂的個體是寵物時，該口服組合物可以是濕的或干的寵物食品。
當根據本發明的組合物摻入到藥物中時，它可以與任何合適的賦形劑摻和成任意藥用形式。
我們已經發現，對于遭受病原體感染(如通過腸道紊亂，腸上皮完整性的破壞和腹瀉證明)的個體攝取酵母提取物，與那些患有同樣疾病但是飲食中沒有添加酵母提取物的個體相比，有正常化的液體分泌，較小的細胞結構破壞，和減輕的炎癥。
在本發明的構架中，肉膏和/或蛋白胨也可以與酵母提取物結合從而對于遭受腸紊亂、損傷和應激的患者的腸完整性取得提高的效果。
實施例下面的實施例用來闡明本發明范圍內的一些產品和生產這些產品的方法。不認為它們以任何方式限制本發明。可以對本發明進行修改和修飾。也就是說，技術人員將認識到這些實施例中許多變通方案用以覆蓋寬范圍的配方、成分、加工和混合物用以對于多種應用合理地調節本發明化合物的天然發生的水平。
實施例1-組合物對緊密連接和肌動蛋白絲的作用材料和方法人結腸細胞系T84(ATCC，CCL-248)在DMEM∶F12 1∶1的培養基中培養，該培養基補充有20％FBS(胎牛血清)，2mM谷氨酰胺以及100U/ml青霉素-鏈霉素。人原代皮膚成纖維細胞在DMEM中培養，該培養基補充有10％FBS以及100U/ml青霉素-鏈霉素。
T84單細胞層以0.5×106個細胞/孔接種于六孔加樣板內并培養3周。測量TEER(跨上皮電阻)的基線值，然后將培養基換成含有20％deMan-Rogosa-Sharpe溶液的生長培養基(在PBS中含有0.5％酵母提取物與1％牛肉膏和1％肉蛋白胨的溶液，以后將其稱為“MRS”)。37℃1小時后，在單細胞層的頂面加入艱難梭菌毒素A至終濃度100ng/ml，接著在37℃下1、2、4、6和24小時后測量TEER。對照單細胞層只暴露于培養基。對于每一種情況使用一式三份的樣品。在每個時間點，收集1ml頂面和1ml底側培養基，并根據廠家說明書利用Cytotoxicity Detection Kit測量LDH釋放來評價細胞生活力。
將T84細胞或人原代成纖維細胞(2×105/室)接種在4室載玻片上，按照前述方法培養，與20％的MRS溶液孵育1小時后加入終濃度為500ng/ml的毒素A。6小時后，用PBS洗滌細胞，用3.7％的多聚甲醛固定，用PBS洗滌兩次，在-20℃用丙酮滲透5分鐘，以PBS-1％BSA(牛血清白蛋白)處理用來降低非特異標記。在用200U/ml的羅丹明標記的毒蕈肽標記細胞后，通過熒光顯微術評估肌動蛋白解聚和細胞變圓。
結果毒素A影響上皮細胞的緊密連接，該作用通過上皮單細胞層的跨上皮電阻(TEER)的降低來測量。為了評估MRS是否可以中和毒素A的毒性，在所述組合物存在或不存在的情況下，將T84單細胞層暴露于毒素A，并測量TEER。向T84單細胞層加入100ng/ml毒素A并孵育6小時后導致TEER減小到TEER對照值的1/3(309±8 vs.985±49Ωcm2)。加入20％的MRS溶液以及毒素A防止了TEER減小(1403±95 vs.309±8Ωcm2)，但是并不改變T84細胞的基線TEER值(1217±277Ωcm2vs.985±49Ωcm2)。沒有觀察到細胞生活力的變化，表明毒素A在6小時期限內沒有誘導細胞死亡。以上結果表明酵母提取物與蛋白胨和肉膏的混合物能夠中和毒素A并保護T84單細胞層免于毒素A誘導的TEER減小。
為了確定MRS針對毒素A誘導的TEER減小的保護作用是否與導致細胞變圓的細胞骨架改變有關，單獨用毒素A或者聯合20％的MRS溶液處理T84細胞，并通過免疫細胞化學分析細胞骨架肌動蛋白。加入500ng/ml毒素A誘導T84細胞變圓，其通過單細胞層的蜂窩外觀可以證明，該外觀是由于肌動蛋白解聚和包裝。組合加入20％的MRS溶液和毒素A部分地防止了由毒素A引起的肌動蛋白解聚和隨后的細胞變圓，但是單獨加入毒素A時不影響細胞的細胞骨架。由于T84單細胞層的空間結構，這些效應不容易被觀察到。為了更容易解釋，使用原代人皮膚成纖維細胞重復實驗，該細胞形成平面單細胞層。在毒素A存在下6小時后，所有成纖維細胞都呈現出圓的外觀，表明細胞骨架的完全破壞。組合加入20％的MRS溶液和毒素A部分防止了肌動蛋白解聚和細胞變圓。用毒素A和20％組合物處理過的成纖維細胞的形狀與對照成纖維細胞或者僅用所述組合處理的成纖維細胞的形狀相當但是不相同。因此MRS可以中和毒素A，部分防止由于肌動蛋白解聚引起的細胞骨架改變及隨后的細胞變圓。
然后用0.5％酵母提取物溶液的20％溶液代替20％MRS溶液重復這些實驗，得到與20％MRS溶液相似的結果。
討論這里觀察到的保護作用的機制并沒有清楚地闡明并且可能是不同的。毒素A誘導肌動蛋白絲聚合，導致細胞骨架肌動蛋白解聚。肌動蛋白破壞是體外觀察到的細胞變圓以及緊密連接通透性增加的原因。毒素A對肌動蛋白的作用是由于它對Rho家族蛋白質的葡糖轉移酶的活性。毒素A能夠酶促轉移UDP葡萄糖的葡萄糖殘基至Rho、Rac和Cdc-42的蘇氨酸37，導致肌動蛋白張力絲解聚、肌動蛋白結合的黏著斑的破壞、緊密連接的開放、細胞脫離以及增加的液體分泌。這些作用已經在體外用T84細胞得到證明，其中在單細胞層上加入毒素A減小了跨上皮阻力并增加了單細胞層的通透性，這是由于上皮細胞中Rho蛋白質的修飾。因此我們認為酵母提取物干擾了Rho蛋白質的信號通路，從而抑制了毒素A的作用。不希望被理論束縛，該干擾可以在葡萄糖殘基轉移至Rho蛋白質的上游或下游。
實施例2-組合物對產腸毒素的胃腸病原體引起的損傷的作用材料和方法
六周齡的雄性小鼠自由接受60mg/L慶大霉素、250mg/L萬古霉素、300mg/L阿莫西林和10mg/L兩性霉素處理一周以便消滅腸道小型生物群。將這些小鼠分成3組i)對照組；ii)自由接受持續一周飲用水中20％MRS溶液的組；iii)用管飼法每各兩天給予兩次500μl組合物的組。在處理結束后，用30mg/kg體重的戊巴比妥鈉將動物麻醉并放在溫暖的毯子(37℃)上，整個手術持續時間期間都在0.8-3％的異氟醚(isofiuoran)麻醉下進行。通過正中線切口開腹，暴露遠端空腸。將兩段5厘米長的空腸段用手術線進行兩端雙結扎，從而形成間隔2cm的兩個腸袢。在其中一個中注射600μl PBS作為對照，另一個中注射600μl含有20μg毒素A的PBS。然后，將腸袢返回腹腔，縫合切口。讓小鼠恢復并對它們連續追蹤。4小時后，安樂處死動物，分離腸袢，并記錄它們的重量與長度的比率(mg/cm)，用來評估液體分泌。接著用冰預冷的PBS洗滌腸袢兩次，浸入RNAlaterTM中，在液氮中迅速冷凍后保存于-80℃。
結果艱難梭狀芽孢桿菌感染可導致腹瀉和大腸炎，多數發生于醫院和家中的老年人患者，他們因服用抗生素而導致腸道小型生物群改變。為了評估本發明的組合物和其組分是否可以在體內中和毒素A的效應，使用了小鼠模型。為了模擬在人體引發艱難梭狀芽孢桿菌感染的條件，將小鼠用抗生素處理一周，目的是改變它們的腸道小型生物群。在抗生素處理結束后1天，一組小鼠自由接受20％的MRS溶液持續一周。在該期限結束時，形成腸袢并注射PBS或20μg毒素A。4小時的孵育后，對照小鼠的腸袢當注射毒素A時與注射PBS的腸袢相比顯示增加的液體分泌(121.9±31.7vs.64.6±13.5mg/cm)。相比，在接受MRS一周的小鼠中，注射毒素A或PBS的腸袢中沒有觀察到液體分泌的差異(73.6±8.3vs.66.8±10.8mg/cm)。當用管飼法對小鼠施用2劑500μl的20％MRS溶液時，得到相似的結果。這些結果表明，用酵母提取物、蛋白胨和肉膏處理可以防止毒素A在表現出腸道小型生物群受損的受試者中的不利效應。
為了確定該組合物是否通過直接失活毒素A來發揮其保護作用，將20％MRS溶液或作為對照的PBS與毒素A混合1小時后將混合物注射到用抗生素處理一周的小鼠的腸袢中。對照(PBS)與MRS注射的腸袢之間在毒素A誘導的液體分泌水平上沒有顯著差異。此結果表明，所述組合物不是通過直接結合和失活毒素A來中和毒素A的作用，所述直接結合和失活可以導致毒素切割或者毒素結合表位的掩蔽。
討論MRS組合物保護小鼠免于毒素A引起的腸液分泌。雖然不希望被理論束縛，但是我們相信酵母提取物的保護作用并不是因為切割毒素A的酶活性，有以下兩個主要原因i)所用的溶液總是高壓滅菌的，它將導致溶液中含有的任何酶(例如蛋白酶)的失活且ii)在注射入小鼠的腸袢前與毒素A混合并孵育的該組合物不能抑制腸液分泌。因此，我們相信酵母提取物的保護活性是因為該溶液存在游離分子(例如氨基酸或肽)，這些分子可以結合腸上皮細胞上的毒素A受體并防止毒素A的結合和激活相關的信號通路。
實施例3-組合物對COX-2表達的影響材料和方法用實施例2中描述的相同方法。從小鼠腸袢提取RNA，并通過RT-PCR評價COX-2mRNA表達。用200U Supercript II酶逆轉錄總RNA(1μg)。用5’-CACAGTACACTACATCCTGACC-3’作為正義引物，5’-TCCTCGCTTCTGATTCTGTCTTG-3’作為反義引物，擴增小鼠COX-2的400bp片段。用5’-ATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3’作為正義引物，5’-ATGGATGACGATATCGCT-3’作為反義引物從相同的RT混合物擴增β-肌動蛋白的700bp片段作為內部對照。為了排除DNA污染，直接對RNA樣品進行PCR。將PCR產物加入1％瓊脂糖凝膠，照相，相片用于條帶強度的光密度定量。根據內部對照β-肌動蛋白的表達進行標準化確定COX-2和對應的β-肌動蛋白mRNA信號的比值，并相對于“未處理樣品”(給予水并注射PBS)的比值表達，對未處理樣品設定分值1。
結果已知COX-2參與毒素A介導的液體分泌，為了確定COX-2是否也參與組合物的保護作用，通過RT-PCR評估COX-2mRNA表達。由于不同的處理導致COX-2表達的改變相對于β-肌動蛋白表示。在對照小鼠的腸袢內注射20μg毒素A誘導COX-2mRNA表達增加3.6倍。用該組合物處理小鼠一周導致毒素A引起的COX-2增加減小了一半。在蛋白胨或牛肉膏處理的情況下，毒素A誘導的腸COX-2表達完全正常化到基礎水平，而在酵母提取物處理下，毒素A誘導的腸COX-2表達減小到1/2.3。該組合物或其組分都不能顯著改變COX-2mRNA表達的基礎水平。當采用管飼法時，該組合物或它的組分也能抵消毒素A誘導的COX-2mRNA增加。
討論毒素A結合至上皮細胞后，它表現為引起炎癥，包括嗜中性粒細胞遷移和腸細胞壞死以及絨毛的破壞。這些效應是感覺腸神經激活后感覺神經肽(如物質P和降鈣素基因相關肽)的釋放介導的。除了在NK-1R的腸上皮上表達外，SP的受體在感染艱難梭狀芽孢桿菌的動物和人中顯著增加。近期的研究還提出艱難梭狀芽孢桿菌的毒素A上調腸內COX-2的表達。COX-2是環加氧酶的可誘導的同種型，它介導前列腺素E2(PGE2)(已知增加腸液分泌的物質)的合成，從而導致腹瀉。盡管不希望被理論束縛，但是我們相信酵母提取物抑制了這些途徑的任一種，從而中和毒素A。我們的結果表明，酵母提取物抑制了腸的毒素介導的COX-2誘導。如果我們的溶液抑制或減少毒素與它的腸細胞受體的結合，那么所述抑制可以是由于毒素A介導的信號轉導的抑制，其中所述信號轉導導致COX-2激活。
權利要求
1.酵母提取物的用途，用于生產治療產生腸毒素病原體的感染效應的口服組合物。
2.權利要求1的用途，其中所述效應包括腸上皮完整性的破壞、腹瀉和其他COX-2介導的效應。
3.權利要求1或2的用途，其中所述病原體是艱難梭菌、產氣莢膜梭菌、大腸桿菌、杜氏利什曼原蟲、霍亂弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、志賀桿菌、嗜水氣單胞菌、金黃色葡萄球菌和/或產生腸毒素的脆弱擬桿菌。
4.前述權利要求中任一項的用途，其中所述口服組合物包含按體積計0.01％到0.5％的酵母提取物。
5.前述權利要求中任一項的用途，其中所述口服組合物還包含蛋白胨，優選其量為按體積計0.3％到7％。
6.權利要求5的用途，其中所述蛋白胨為乳清蛋白的水解產物，其平均肽大小不超過5個氨基酸。
7.前述權利要求中任一項的用途，其中所述口服組合物還包含肉膏，優選其量為按體積計0.3到％7。
8.前述權利要求中任一項的用途，其中所述口服組合物是藥物治療的佐劑。
9.前述權利要求中任一項的用途，其中所述口服組合物是嬰兒配方或者腸組合物。
全文摘要
本發明涉及包含酵母提取物的口服組合物的用途，用于生產治療病原細菌(例如艱難梭菌)引起的感染效應的口服組合物。此類效應可以包括腸上皮完整性的破壞、腹瀉以及其他COX－2介導的效應。
文檔編號A61P1/00GK1889966SQ200480036943
公開日2007年1月3日 申請日期2004年10月13日 優先權日2003年10月13日
發明者I·科爾蒂希杜拉, G·福特保羅斯, G·貝爾貢澤利 申請人:雀巢技術公司