替加環素單獨或與利福平聯合治療骨髓炎和/或膿毒性關節炎的應用的制作方法

專利名稱：替加環素單獨或與利福平聯合治療骨髓炎和/或膿毒性關節炎的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及治療由細菌感染引起或導致的骨髓炎和膿毒性關節炎的新型方法。本發明還涉及治療骨、骨髓、關節和滑液的細菌感染。本發明還涉及治療這些疾病和組織中的抗生素耐藥性細菌的感染。
背景技術：
二十世紀后半葉在抗菌劑開發中出現了顯著進步。這一成功培養這樣的認識細菌疾病較任何其它主要的紊亂更易于治療，但在二十世紀九十年代出現的多藥-耐藥生物體導致了嚴重的公共健康問題。耐藥性已蔓延到先前敏感的生物體，并且一些生物體基本上對于所有批準的抗菌藥耐藥。
替加環素，其屬于甘氨酰環素類抗生素，繞過了現存的微生物耐藥機制。證明了其廣譜抗菌活性，抑制多藥耐藥性革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和厭氧菌。替加環素具有抵抗大多數常見病原體的活性。替加環素具有抵抗下列病原體的活性，比如甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌(MRSA)、萬古霉素耐藥性腸球菌(包括糞腸球菌)、青霉素耐藥性/大環內酯耐藥性肺炎雙球菌、普雷沃菌(Prevotellaspp.)、peptostreptococci、分枝桿菌和米諾環素耐藥性生物體(Boucher等，Antimicrob Agents Chemother.2000；44(8)2225-2229，Gales等，Antimicrob Agents Chemother.2000；4619-36，Goldstein等，Antimicrob Agents Chemother.2000；44(10)2747-2751)。替加環素適用于治療呼吸病原體比如肺炎鏈球菌(青霉素敏感性和青霉素耐藥性)、流感嗜血桿菌、肺炎衣原體、肺炎支原體、金黃色釀膿葡萄球菌(甲氧西林敏感性和甲氧西林耐藥性)、厭氧革蘭氏陰性桿菌和腸球菌(萬古霉素敏感性和萬古霉素耐藥性腸球菌)。體內結果非常令人振奮并較所預期的基于血清中最低抑制濃度(MIC)以上的時間更佳。觀察到替加環素是安全的抗菌藥。
甲氧西林-耐藥性葡萄球菌是骨和關節感染中最常見的生物體(Waldvogel，Infectious Diseases 19881339-1344)。治療因這些微生物引起感染的選擇是有限的臨床菌株對于喹諾酮、克林霉素、磺胺甲基異唑和利福平的敏感性是變化的，且該敏感性通常限于糖肽，其必需通過胃腸外途徑給藥。葡萄球菌對于糖肽類的耐藥性已有描述并代表了主要的憂慮，因為那些藥物被認為是治療由甲氧西林-耐藥性葡萄球菌引起嚴重感染的杰出標準物(Smith，等，N Engl J Med 1999；340493-501)。
近來已將治療甲氧西林-耐藥性葡萄球菌感染的新型藥物如奎奴普丁-達福普汀(quinupristin-dalfopristin)和利奈唑胺引入臨床實踐(Johnson，等，Lancet 1999；3542012-2013，Livermore，J AntimicrobChemother 2000；46347-350)。但是，對于治療骨髓炎尚未進行完整的臨床研究。
治療急性和慢性整形外科感染是困難的，部分原因是許多感染是由抗生素耐藥病原體引起的，部分是緣于感染部位。通常該療法需要長期抗生素療法和外科治療(Lazzarini等，Curr Infect Dis Rep 20024439-445)。已使用多種骨髓炎動物模型進行了若干研究(Rissing，Infect Dis Clin North Am 1990；4377-390)。盡管使用長期抗生素療法，在骨中仍發現了活細菌。從骨中根除更多細菌已與抗生素療法的延長期相關聯(Norden，Rev Infect Dis 1988；10103-110)。抗生素治療四周后，大多數抗生素方案不能從骨中根除葡萄球菌。
抗生素治療骨髓炎在常規上是通過靜脈內途徑給藥。但是，已在人類臨床試驗中成功地測驗了治療骨髓炎的口服方案(Bell，Lancet1968；10295-297，Feigin等，Pediatr 1975；55213-223，Slama等，Am J Med 1987；82(增刊4A)259-261)。不幸地，當處理多藥耐藥性生物體時口服抗菌劑的選擇受到限制，而且治療多藥耐藥性生物體可能需要使用腸胃外藥物(Tice，Infect Dis Clin North Am 1998；12903-919)。
因此仍需要治療由細菌尤其是抗生素耐藥性細菌菌株感染引起的骨髓炎和/或膿毒性關節炎的方法。本發明滿足了這些長期存在的需要。
發明簡述本發明提供了治療哺乳動物優選人體內骨或骨髓感染(通常是指骨髓炎)和/或關節感染以及周邊組織感染(通常是指膿毒性關節炎)的方法。本方法包括給予哺乳動物藥理學有效量的替加環素和/或選自利福霉素、利福平、利福噴丁、利福昔明或曲張鏈菌素的抗菌劑治療感染。優選的抗菌劑是利福平。
感染可以由選自革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、厭氧菌和需氧菌引起。示例性的細菌包括葡萄球菌、不動桿菌、分枝桿菌、嗜血桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、腸桿菌科、腸球菌、埃希氏桿菌、假單胞菌、奈瑟氏球菌、立克次氏體、肺炎球菌、普雷沃菌、peptostreptococci、軍團擬桿菌、β-溶血的鏈球菌、B組鏈球菌和螺旋體。優選地、該感染包括奈瑟氏球菌、分枝桿菌、葡萄球菌和嗜血桿菌且更優選腦膜炎奈瑟氏球菌、結核分枝桿菌、金黃色釀膿葡萄球菌、表皮葡萄球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌或麻風分枝桿菌。
在優選實施方案中，感染包括顯示抗生素耐藥性病原體。示例性的抗生素耐藥性包括甲氧西林耐藥性、糖肽類耐藥性、四環素耐藥性、土霉素耐藥性、強力霉素耐藥性；氯四環素耐藥性、米諾環素耐藥性、甘氨酰環素耐藥性、頭孢菌素耐藥性、環丙沙星耐藥性、呋喃妥因耐藥性、三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺藥耐藥性、哌拉西林/他唑巴坦耐藥性、莫西沙星耐藥性、萬古霉素耐藥性、替考拉寧耐藥性、青霉素耐藥性和大環內酯耐藥性。
優選的糖肽類耐藥性是萬古霉素耐藥性。在另一個優選實施方案中，感染包括顯示了選自糖肽類耐藥性、四環素耐藥性、米諾環素耐藥性、甲氧西林耐藥性、萬古霉素耐藥性以及除替加環素之外的甘氨酰環素抗生素耐藥性的金黃色釀膿葡萄球菌。
在另一個實施方案中，感染包括鮑氏不動桿菌，其可以顯示或不顯示選自頭孢菌素耐藥性、環丙沙星耐藥性、呋喃妥因耐藥性、三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺藥耐藥性和哌拉西林/他唑巴坦耐藥性的抗生素耐藥性。
在另一個實施方案中，感染包括可以顯示或不顯示莫西沙星耐藥性的膿腫分枝桿菌。在其它實施方案中，感染包括流感嗜血桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌、淋病奈瑟氏菌、普氏立克次氏體、斑疹傷寒立克次氏體或立氏立克次氏體。
本發明還提供了藥理學有效量的替加環素用于治療哺乳動物骨髓炎和/或膿毒性關節炎的應用。在另一個實施方案中，本發明提供了藥理學有效量的替加環素和選自利福霉素、利福平、利福噴丁、利福昔明或曲張鏈菌素的抗菌劑治療骨髓炎和/或膿毒性關節炎的應用。在另一個實施方案中，本發明提供了藥理學有效量的替加環素用于制備治療哺乳動物骨髓炎和/或膿毒性關節炎的藥物的應用。在另一個實施方案中，提供了藥理學有效量的替加環素和選自利福霉素、利福平、利福噴丁、利福昔明或曲張鏈菌素的抗菌劑用于制備治療哺乳動物骨髓炎和/或膿毒性關節炎的藥物的應用。
附圖簡介附圖舉例說明了本發明的某些實施方案并不意在限制本發明的范圍。


圖1表明替加環素在正常的新西蘭白兔體內的藥物動力學，經14mg/kg的替加環素治療后12小時內其體內建立了超過最低抑制濃度的血清水平。
圖2表明了研究者對于如X-射線影像所示的骨感染程度的分級。數據證明了替加環素以及替加環素與利福平聯合與對照組相比可有效地治療骨髓炎。
圖3表明了在各治療中每克骨髓和骨的集落生成單位，其證明替加環素以及替加環素與利福平聯合與對照組相比可有效地治療骨感染和骨髓感染。
圖4A提供了給予各種抗菌劑的整個過程中兔體重的圖示說明。
圖4B提供了給予各種抗菌劑的整個過程中兔體重變化的圖示說明。
圖5A和5B表明了給予各藥物后在受感染的兔血清內替加環素(14mg/kg每天兩次)以及萬古霉素(30mg/kg每天兩次)的峰值和谷值。數據證明在整個治療中抗生素的血清水平高于最低抑制濃度。
發明詳述本發明涉及治療哺乳動物骨和骨髓感染的方法。優選地，哺乳動物是人。在一個優選實施方案中，骨和骨髓感染引起骨髓炎。骨髓炎是骨和/或骨髓的急性或慢性感染，并包括由于化膿菌感染引起的骨及其結構的相關炎癥過程。與骨髓炎相關的感染可以是局部化的或者可以通過骨膜、皮質、髓和海綿狀組織散布。引起骨髓炎的普通細菌性病原體基于患者的年齡和感染機制而改變。急性骨髓炎包括兩種主要類型血原性(heamatogenous)骨髓炎和直接或鄰近接種(contiguousinoculation)骨髓炎。
血原性骨髓炎是由血液中撒播的細菌引起的感染。急性血原性骨髓炎的特征在于從遠端源將細菌撒播于骨內而引起的骨急性感染。血原性骨髓炎主要發生于兒童體內。最常見的位點為生長骨的快速生長且高度血管化的干骨后端。由于血管在遠干骺端成為銳角，血流明顯減慢或淤積使得血管形成血栓并使得骨本身局部化壞死和細菌撒播。在x-射線影像中可見這些骨結構改變。急性血原性骨髓炎，盡管其名稱為急性，但在臨床上發展緩慢并具有起病隱襲。
直接或鄰近接種骨髓炎是由在創傷或手術期間組織和細菌直接接觸而引起的。直接接種(鄰近-病灶)骨髓炎是繼發于通過直接創傷接種生物體的骨內感染，從鄰近感染灶散布或是外科操作后的膿毒癥。直接接種骨髓炎的臨床表現比血原性骨髓炎更局部化且傾向于包括多種生物體/病原體。
其它的類型包括慢性骨髓炎和繼發于周邊血管疾病的骨髓炎。慢性骨髓炎持續或重復發作，不管其起因和/或機理且不管攻擊性手段的介入。雖然列為病因學，但是周邊血管疾病事實上是誘病因素而不是真正的感染原因。
骨髓炎的癥狀通常包括高燒、疲勞、易怒和不適。通常，受感染的肢體或關節內的運動受到了限制。通常伴隨感染出現局部水腫、紅斑以及觸痛，且在受影響的區域可存在溫熱感。在感染后期還可出現竇道排膿。血原性骨髓炎通常伴隨出現緩慢的癥狀隱襲進展，而慢性骨髓炎可以包括非愈合潰瘍、竇道排膿、慢性疲勞和不適。直接骨髓炎通常在更加局部的區域伴隨出現顯著的體征和癥狀。
已知某些疾病狀態使患者易于感染骨髓炎。包括糖尿病、鐮狀細胞病、獲得性免疫缺損綜合征(AIDS)、IV藥物濫用、酒精中毒、慢性甾類應用、免疫抑制和慢性關節病。此外，存在的修復性整形外科裝置是另一種危險因素，其是任何最近的矯形外科術或開口裂縫。
通常已知若干細菌性病原體引起急性和直接骨髓炎。例如，新生兒(小于4個月)體內的急性血原性骨髓炎通常由金黃色釀膿葡萄球菌、腸桿菌以及A組和B組鏈球菌引起。在4個月至4歲的兒童中，急性血原性骨髓炎通常由金黃色釀膿葡萄球菌、A組鏈球菌、流感嗜血桿菌和腸桿菌引起。在4歲的兒童和青年至成年，急性血原性的骨髓炎通常由金黃色釀膿葡萄球菌(80％)、A組鏈球菌、流感嗜血桿菌和腸桿菌引起。在成人中，急性血原性骨髓炎通常由金黃色釀膿葡萄球菌以及偶而由腸桿菌或鏈球菌引起。在過去，主要的治療包括包括合用青霉素酶-抗性合成青霉素和第三代頭孢菌素。可供選擇的療法包括萬古霉素或克林霉素和第三代頭孢菌素。除這些上述抗菌藥物之外，環丙沙星和利福平已經用于聯合治療成年患者。在證實是革蘭氏陰性桿菌感染的情況中，通常給藥第三代頭孢菌素。
直接骨髓炎通常由金黃色釀膿葡萄球菌、腸桿菌和假單胞菌引起。通常，直接骨髓炎由穿過運動鞋的刺傷引起。在這些情況下，直接骨髓炎通常由金黃色釀膿葡萄球菌和假單胞菌引起。在這些情況下，主要的抗生素包括頭孢他定或頭孢平。環丙沙星經常被用作可供選擇的治療。在鐮狀細胞病患者中，直接骨髓炎通常由金黃色釀膿葡萄球菌和沙門氏菌引起，且主要的治療選擇是氟喹諾酮抗生素(不用于兒童)。第三代頭孢菌素(例如，頭孢曲松)是備選。
對于因創傷引起的骨髓炎患者，感染物通常包括金黃色釀膿葡萄球菌、大腸桿菌和銅綠色假單胞菌。主要的抗生素是萘夫西林和環丙沙星。替換物包括萬古霉素和具有抗假單胞菌活性的第三代頭孢菌素。
因此，如本文以及權利要求書中所用，術語“骨髓炎“包括血原性骨髓炎、直接或鄰近接種骨髓炎、慢性骨髓炎和繼發于外周血管疾病的骨髓炎。骨髓炎可以是任何上述病原體引發感染的結果，還包括具有感染骨、骨髓、關節和周邊組織能力的其它病原體。
術語“治療骨髓炎”包括根除引起與骨髓炎相關的潛在感染的病原體/細菌，抑制細菌生長，減少細菌濃度，減少從感染恢復的時間，改善、消除或減少感染的癥狀比如腫脹、壞死、發燒、疼痛、虛弱、以及本領域技術人員視情況而選擇的其它合適的測量指標。
目前，對于骨髓炎的主要治療是穿透骨和關節腔的腸胃外抗生素。治療需要至少4-6周。基于住院病人開始靜脈內注射抗生素后，根據感染的類型和部位以及基于門疹病人進行靜脈注射或口服抗生素以繼續治療。
例如，由金黃色釀膿葡萄球菌感染引起的骨髓炎通常每六小時經靜脈內或胃腸外給予2g的氯唑西林治療至少初始的14天或至多6周的整個療程。其它的治療是每8小時給予1-2g的頭孢唑啉持續6周或每八小時給予600mg的克林霉素持續6周。
由β-溶血鏈球菌引起的骨髓炎通常于每4-6個小時使用兩百萬國際單位(IU)的芐青霉素靜脈內或胃腸外治療2-4周。沙門氏菌spp.感染以每12小時口服750mg環丙沙星治療6周。
通常每4-6小時經靜脈注射或腸胃外給予25-50mg氯唑西林持續6天加上每24小時給予50-75mg/kg頭孢曲松持續4-6天治療兒童體內由流感嗜血桿菌引起的胃髓炎。該治療繼之以每8小時給予阿莫西林15mg/kg加上口服克拉維酸(最大500mg)持續四周。
在嬰兒中，每4-6小時經靜脈注射或腸胃外給予25-50mg/kg氯唑西林持續4-6天加上每8小時靜脈注射或腸胃外給予50-75mg/kg氨噻肟頭孢菌素持續4-6天而完成治療。該治療繼之以每8小時給予15mg/kg阿莫西林加上口服克拉維酸(最大500mg)持續四周。
通常每4-6小時經靜脈注射或腸胃外給予25-50mg氯唑西林持續6天加上每24小時給予50-75mg/kg頭孢曲松持續4-6天治療兒童體內的金黃色釀膿葡萄球菌感染。這些治療繼之以每6小時口服12.5mg/kg氯唑西林持續3-4周。
兒童體內沙門氏菌spp.感染的治療取決于病原體的敏感性。治療選擇包括氯唑西林加頭孢曲松繼之以每12小時口服20mg/kg磺胺甲基異唑和4mg/kg甲氧芐氨嘧啶持續6周或每12小時口服7.5-15mg/kg阿莫西林持續6周，或每4-6小時10-15mg/kg環丙沙星持續4-6天加上每8小時靜脈內給予50-75mg/kg氨噻肟頭孢菌素持續4-6天，繼之以磺胺甲基異唑和三甲氧芐二氨嘧啶或阿莫西林或者ciproflaxacin。
本發明另一個實施方案提供治療哺乳動物體內關節感染和/或周邊組織感染的方法。優選的哺乳動物是人。在優選實施方案中，關節感染和/或周邊組織感染引起膿毒性關節炎。
膿毒性關節炎是關節和周邊組織的感染并導致由所存在的關節內活微生物引起的關節炎癥。膿毒性關節炎最常繼發于骨髓炎，特別在孩童時期，并由細菌感染引起。
關節感染可通過若干途徑發生。最常見地，感染病原體的散布是血原性的。通常，膿毒性關節炎由皮膚感染或膿腫引起。口腔和牙齒膿毒癥或者牙科操作后或與呼吸道或泌尿生殖道感染相關的膿毒癥也可引起膿毒性關節炎。尖銳物體或重大跌打損傷對于關節的直接穿透性創傷同樣可引起關節感染。關節抽氣或注射以及外科操作比如關節置換也可導致關節感染。此外，骨髓炎經常蔓延包圍關節。這在年幼兒童中尤為普遍。最后，與關節相鄰接的軟組織感染比如炎性粘液囊或腱鞘，可以蔓延包圍關節空間。感染通過血原性途徑的散布仍是關節膿毒癥的最常見原因。
膿毒性關節炎的癥狀包括不適和發燒、與急性炎癥并發的急性熱關節腫脹和關節滲液、紅腫、疼痛和損失功能。
最常見的膿毒性關節炎的致病微生物是金黃色釀膿葡萄球菌。在新生兒膿毒性關節炎中，大腸桿菌和流感嗜血桿菌也是常見的病原體。在至多5歲的兒童中，流感嗜血桿菌是血原性性關節膿毒癥的最常見原因。在老年人和患有糖尿病或裝有假體關節的人中，革蘭氏陰性大腸菌是常見的病原體。在刺穿性損傷的情況下，以及在靜脈注射藥物上癮者中，通常發現銅綠色假單胞菌或表皮葡萄球菌感染。健康的年輕成人中，有時由奈瑟氏淋病雙球菌或腦膜炎球菌感染引起膿毒性關節炎。慢性輕度的膿毒性關節炎，特別是在脊柱中，可能由微生物如分枝桿菌或流產桿菌感染引起。此外，在獲得性免疫缺損綜合征患者中，關節病原體的范圍是不同的。
一些最常見的膿毒性關節炎病原體包括但是不局限于(1)革蘭氏陽性菌金黃色釀膿葡萄球菌(80％的情況)、釀膿鏈球菌/肺炎鏈球菌；(2)革蘭氏陰性菌流感嗜血桿菌，奈瑟氏淋病雙球菌/腦膜炎奈瑟氏菌、銅綠色假單胞菌、脆弱擬桿菌、布魯氏菌種、沙門氏菌種、梭形細菌；(3)耐酸桿菌結核分枝桿菌、非典型分支桿菌；和(4)螺旋菌出血性黃疸鉤端螺旋體。
因此，在此所用以及權利要求中的術語“膿毒性關節炎”包括由上示病原體以及具有感染關節和周邊組織能力的任何其它病原體引起的關節和周邊組織感染。周邊組織包括但是不局限于周邊肌肉、相關腱、連接骨、粘液囊、腱鞘、滑膜、滑液以及相關軟骨。
術語“治療膿毒性關節炎”包括根除引起與膿毒性關節炎相關的潛在感染的病原體/細菌，抑制的細菌生長，減少細菌濃度，減少從感染恢復的時間，改善、消除或減輕感染癥狀如腫脹、壞死、發燒、疼痛、虛弱以及視本領教技術人員測量情況而選擇的其它指征。
膿毒性關節通常經4-6周治療，而感染的關節成形術則經4-6周或更長時間的治療。(Calhoun等，Am.J.of Surgery 1989；157443-449，Calhoun等，Archives of Otolaryngology-Head and Neck Surgery 1988；1141157-1162，Gordon等，Antimicrob Agents Chemother 2000；44(10)2747-2751，Mader等，West J Med 1988；148(5)568，Mader等，Orthopaedic Review 1989；18581-585，Mader等Drugs &Aging 2000；16(1)67-80)。在存在耐藥菌如甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌時，這些漫長的抗生素治療更加成問題。
在表征病原體之前，成人體內膿毒性關節炎的治療在開始時通常每6小時靜脈內或肌內給予2克氯唑西林并聯合每24小時1-2克頭孢曲松。在大于兩個月的兒童中，治療包括每6小時靜脈內或肌內給予25-50mg/kg達最高2克的氯唑西林并聯合每24小時25-50mg/kg達最高2克的頭孢曲松。在嬰兒中，治療包括每八小時靜脈內或肌內給予50-75mg/kg達最高2克的氯唑西林。其它抗生素治療包括氨噻肟頭孢菌素、氟氯青霉素、芐基青霉素和青霉素。
一旦確定病原體，普通的療程基于存在的感染病原體。例如，當確定該感染包含金黃色釀膿葡萄球菌時，膿毒性關節炎經常經靜脈內每6小時給予氯唑西林或每8小時給予頭孢唑啉或每8小時給予克林霉素治療，所選擇治療持續2-3周。甲氧西林-耐藥的金黃色釀膿葡萄球菌通過胃腸外給予萬古霉素治療。
骨髓炎和膿毒性關節炎的抗生素治療對于醫師仍是挑戰。許多整形外科感染是在醫院環境中獲得的(Holtom等，Clin Orthop 2002；40338-44)。此外，這些感染的病原體通常是多藥耐藥性。葡萄球菌是最普通的醫院生物體且是耐藥性生物體，但同樣可包括革蘭氏陰性病原體(Cunha，Clin Infect Dis 2002；35287-293)。
與甲氧西林-敏感的金黃色釀膿葡萄球菌相比，由甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌引起的感染更難以治療并且預后較差(Cosgrove等，Clin Infect Dis 2003；3653-59)。對于這些感染的治療選擇受到限制。具有抵抗所有葡萄球菌菌株恒定效力并且已經在治療骨感染中進行了廣泛研究的唯一藥物是糖肽。不幸的是，已確認對于這些抗生素的耐藥性是治療革蘭氏陽性病原體中的主要問題。萬古霉素耐藥性腸道球菌在世界范圍內擴散，且這一耐藥性已在體外被證明可轉移至其它革蘭氏陽性生物體(Noble，等，FEMS Microbiology Letters 1992；72195-198)。此外，萬古霉素-耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌的散發性菌株已經在若干國家得到分離(Hiramatsu，Am J Med 1998；10475-10S，Hamilton-Miller，Infection 2002；30118-124)。因此，提供治療多藥耐藥性病原體的可供選擇抗菌劑是至關重要的。
替加環素(先前且經常被稱為″GAR-936″)是一類被稱為甘氨酰環素的新型抗生素9-叔丁基甘氨酰胺合成衍生物。已經證明這類新型四環素衍生物表現出出色的體外活性，可抵抗大量革蘭氏陽性和革蘭氏陰性、需氧的和厭氧生物體，包括甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌(MRSA)、萬古霉素耐藥性腸道球菌(包括糞腸球菌)、青霉素耐藥性/大環內酯耐藥性肺炎球菌、普雷沃菌，peptostreptococci和分枝桿菌spp.(Boucher等，Antimicrob Agents Chemother.2000；44(8)2225-2229，Gales等，Antimicrob Agents Chemother.2000；4619-36，Goldstein等，Antimicrob Agents Chemother.2000；44(10)2747-2751)。四環素是抑菌劑，其作用是抑制細菌蛋白合成。盡管還沒有確定它們的確切作用機理，但開發了甘氨酰環素以克服對于四環素耐藥的細菌機理(Rasmussen等，Antimicrob AgentsChemother 1995；381658-1660)。
替加環素集中于骨、骨髓、關節和滑液以及許多其它有意義的器官和組織中。此外，已經發現替加環素集中在上述組織的感染部分。在人體內靜脈內給予替加環素的藥物動力學研究表明存在快速分布期，具有延長的半衰期(40-60小時)且在穩態具有高分布容積(7至14L/kg)。使用放射標記的替加環素的動物研究表明這一快速分布階段和穩態的高分布容積代表替加環素滲透入包括肺和骨的組織。
例如，當通過30分鐘靜脈內輸注以3mg/kg的劑量給予[14C]替加環素時，已在Sprague Dawley大鼠體內顯示了替加環素在大鼠組織中的分布。通常，輻射性很好地分布于多數組織，且在骨中觀察到最高的總暴露量。顯示最高濃度暴露量的組織如下骨＞骨髓＞唾液腺，甲狀腺，脾和腎。在這些組織的每一個中，組織內濃度-時間曲線下面積(AUC)與血漿中AUC的比值大于10。在這一研究中，大鼠肺中AUC與血漿中AUC的比值為4.4。此外，已經證明在人體內靜脈內給予的替加環素穿透了人體內骨組織且靜脈給藥延伸了隨時間推移人滑液內替加環素的濃度。
本發明人已經發現替加環素適用于治療骨髓炎和膿毒性關節炎。其抗菌譜廣泛，包括在醫院內骨和關節感染中所發現的所有病原體。其藥物動力學性質是有利的，因為該藥物可以是每日給予兩次。此外，在所采集的幾乎每一樣品中均發現骨滲透和超過最低抑制濃度(MIC)的藥物水平。最低抑制濃度是確定化合物抑制細菌生長效力的方法。它是抗菌劑抑制微生物生長的最低濃度并應與哺乳動物血清中所需的最低治療濃度相對應。此外，替加環素在人體內提供良好的安全性分布，證明該抗菌素應適于整形外科感染的臨床研究。
因此，本發明一方面提供通過給予哺乳動物藥理學有效量的替加環素在哺乳動物體內治療骨、骨髓、關節和周邊組織感染的方法，以及治療骨髓炎和/或膿毒性關節炎的方法。骨、骨髓、關節和周邊組織感染以及骨髓炎和/或膿毒性關節炎可能由任何常見病原體引起，比如上述病原體，其包括革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌、厭氧菌和需氧菌。例如，該感染可以包括但不限于，葡萄球菌、不動桿菌、分枝桿菌、嗜血桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、腸桿菌科、腸球菌、埃希氏桿菌、假單胞菌、奈瑟氏球菌、立克次氏體、肺炎球菌、普雷沃菌、peptostreptococci、軍團擬桿菌、β-溶血的鏈球菌、以及B組鏈球菌。在優選實施方案中，該感染包括奈瑟氏球菌、分枝桿菌、葡萄球菌、以及嗜血桿菌。在更優選實施方案中，該感染包括大腸桿菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、奈瑟氏淋病雙球菌、結核分枝桿菌、金黃色釀膿葡萄球菌、表皮葡萄球菌、釀膿鏈球菌、肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、類腸球菌、普氏立克次氏體、斑診傷寒立克次氏體、立氏立克次氏體、麻風分枝桿菌、膿腫分枝桿菌或肺炎支原體。
在本發明一種實施方案中，提供了通過給予藥學上有效量的替加環素治療由證明為抗生素-耐藥性菌株(如上所述菌株)引起的骨、骨髓、關節和周邊組織感染以及骨髓炎和/或膿毒性關節炎的方法。例如，所表現的耐藥性可以是，但是不局限于，甲氧西林耐藥性、糖肽耐藥性、四環素耐藥性、土霉素耐藥性、強力霉素耐藥性；氯四環素耐藥性、米諾環素耐藥性、甘氨酰環素耐藥性、頭孢菌素耐藥性、環丙沙星耐藥性、呋喃妥因耐藥性、甲氧芐氨嘧啶-磺胺藥劑的耐藥性、哌拉西林/他唑巴坦耐藥性、莫西沙星、萬古霉素耐藥性、替考拉寧耐藥性、青霉素耐藥性和大環內酯耐藥性。
在優選實施方案中，糖肽耐藥性是萬古霉素耐藥性。
在另一個優選實施方案中，該感染包括表現出糖肽耐藥性、四環素耐藥性、米諾環素耐藥性、甲氧西林耐藥性、萬古霉素耐藥性以及除替加環素之外的甘氨酰環素抗生素耐藥性的金黃色釀膿葡萄球菌。
在另一個優選實施方案中，該感染包括鮑曼不動桿菌，其可表現出也可不表現抗生素抗性比如頭孢菌素耐藥性，環丙沙星耐藥性，呋喃妥因耐藥性，甲氧芐氨嘧啶-磺胺藥劑的耐藥性和哌拉西林/他唑巴坦耐藥性。在另一個實施方案中，該感染包括可表現也可不表現莫西沙星耐藥性的膿腫分枝桿菌。
在治療人類以及其它哺乳動物中，替加環素最常經靜脈內給藥，雖然本領域技術人員可以使用其它給藥途徑。在人受試者中，在一小時的輸液期間可忍受的給藥劑量最多為100mg。一天兩次持續九天在一小時內給予輸液前已進食30分鐘的受試者含有75mg或更多藥物的200ml輸液，導致所有受試者胃腸無法忍受，包括惡心和嘔吐。可以耐受一天兩次在一小時內給予25-50mg的200ml輸液。還可以耐受100mg的單次輸液，導致0.9-1.1微克/ml的平均峰血清濃度。
一天兩次向新西蘭白兔給藥14mg/kg導致高于最低抑制濃度的穩定水平。參見附圖1。替加環素對于該研究中所用的MRSA菌株的最低抑制濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)分別低于0.2μg/ml和0.2μg/ml。測量MBC提供了測定化合物殺菌效力的方法。MBC技術確定了殺菌劑殺滅標準培養液中至少99.9％的生物體的最低濃度。
Mercier等測定了替加環素抵抗萬古霉素耐藥性糞腸球菌的MIC和MBC分別為0.125μg/ml和16-32μg/ml。對于金黃色釀膿葡萄球菌，最低抑制濃度和最低殺菌濃度分別是0.25-1μg/ml和16-64μg/ml。在同情使用研究中，本發明人發現替加環素抵抗人類患者體內M.Abcessus的最低抑制濃度為0.25μg/ml。
在哺乳動物中，甲氧西林-耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌可經每天兩次給予5mg/kg-60mg/kg替加環素治療，更優選10mg/kg-40mg/kg，更加優選12mg/kg-20mg/kg。治療其它病原體的適當劑量對于本領域技術人員是顯而易見的。
在同情使用研究中，一位人類患者患spina bifada并導致截癱。該患者對磺胺類藥物嚴重過敏并且由于感染的腳跟褥瘡(decubitis)而存在甲氧西林耐藥性細菌。該患者的右坐骨還有表面裂紋。潰瘍被清除但沒有愈合。MRI揭示了骨髓炎且骨切面對于鮑曼不動桿菌感染為陽性。
鮑氏不動桿菌對于頭孢菌素、環丙沙星、呋喃妥因耐藥，并且證明對于甲氧芐氨嘧啶-磺胺藥以及哌拉西林/他唑巴坦中度耐藥。生物體對于亞胺培南、慶大霉素和托普霉素敏感。患者經美羅培南和托普霉素治療。后來由于嗜曙紅細胞增多而使用氨曲南替換美羅培南。后來由于持續嗜曙紅細胞增多而中止氨曲南。由于肌酸酐升高也中止了托普霉素。然后使用替加環素治療該患者兩個月，每12小時給藥50mg或每24小時給藥50mg。在接受替加環素治療的一個月內，MRI顯示骨髓炎消除且觀察到從右坐骨區域采集的液體有明顯的改進。使用替加環素治療后十周，報道該患者情況良好。
在另一同情使用研究中，患有無汗外胚葉發育不良和免疫缺陷的患者具有三年半膿腫分枝桿菌感染的脊椎骨髓炎史。感染一年后進行清創術植入硬器械。該患者通過使用cefoxitan，克拉仙霉素和氨丁卡霉素顯示了一定的改善。后來由于腎損害停止氨丁卡霉素。后來將利奈唑胺和阿齊霉素加到治療方案中。該生物體被確定對于莫西沙星耐藥。
后來在靠近該患者原先感染位點的上面出現了新的脊椎骨髓炎。進行活組織切片檢查并確定不需要額外的清創術。發現該生物體僅對于頭孢噻吩敏感。確定了其它抗菌劑將是有益的并發現該生物體對于替加環素敏感。給予替加環素直至MIC 0.25微克/ml。該患者的白血細胞數正常然而出現血內丙種球蛋白過少且淋巴細胞功能降低。該患者還經IL-12治療，但僅在抗生素治療期間持續使用IL-12。治療后一年，據報道該患者情況良好。
本發明的另一個實施方案提供治療哺乳動物優選人體內骨、骨髓、關節和周邊組織感染的方法，以及治療骨髓炎和/或膿毒性關節炎的方法，包括給予哺乳動物藥理學有效量的替加環素和選自安沙霉素家族的抗菌劑，其包括抗生素利福霉素和曲張鏈菌素組。利福霉素家族包括利福平、利福噴丁、利福昔明，并且優選利福平。由于它們與RNA聚合酶相結合的傾向，這些大環抗生素具有殺菌活性。這些抗生素可用于與替加環素聯合，因為它們影響細菌蛋白合成的不同步驟。利福霉素影響RNA聚合酶的活性并限制信使RNA的產生，同時替加環素影響核糖體的活性以及蛋白從信使RNA產生。替加環素的作用方式似乎與70S核糖體的失活相關，所述70S核糖體的失活通過以有些不同于四環素的方向結合于30S核糖體亞單位中的四環素結合位點而實現。(Bauers等，J.Antimicrob Chemother.2004；53(4)592-599).
本發明人已經發現替加環素與抗菌劑的利福霉素類抗生素的聯合在感染組織中提供了附加的抗菌作用。在使用甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌接種的兔脛骨研究中，使用替加環素與利福平聯合治療骨髓炎證明在10只兔的骨中沒有感染，而對照組則表明在15只兔中有11只感染。在骨髓中的治療還證明在10只兔中沒有感染，而在對照組中所測試的15只兔有5只感染。此外，單獨使用替加環素治療兔體內骨髓炎證明10只兔中有一只免的骨感染且骨髓中沒有感染。
在哺乳動物中，利福平治療可以為10mg/kg-100mg/kg每日兩次，更優選可為20mg/kg-70mg/kg每日兩次，更優選可為30mg/kg-50mg/kg每日兩次。在感染了MRSA的新西蘭白兔中，40mg/kg的治療導致殺菌活性。利福平抵抗MRSA菌株的最低抑制濃度和最低殺菌濃度水平分別是是0.78μg/mL和1.56μg/mL，比例為0.5。
人類口服利福平可采用150和300mg的膠囊。在健康人類成人中單次600mg劑量后，峰值血清濃度平均為7微克/ml但具有從4至32微克/ml的寬泛差異。
在30分鐘內靜脈內給予健康成人600mg導致平均峰值血清濃度約為17mcg/ml。
替加環素的給藥優選靜脈內或肌內給藥，而利福平可以是靜脈內、肌內、口服或本領域已知的其它方式給藥比如經口含化、肺內或透皮遞送系統。共同給藥可以包括任何方法的聯合。例如，替加環素可以經靜脈內給藥而利福平可以口服給藥。共同給藥包括同時或順序給藥，可以以任何順序，且不必意味著同時或同一天或相同的時間表給藥。優選地，替加環素和利福平的濃度同時維持在遠高于最低抑菌濃度的水平。
在本發明人進行的試驗中，與受感染、未經治療的對照組或者在治療末期使用萬古霉素治療的組相比，感染甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌并經替加環素治療的一組兔顯示在骨和骨髓中菌落數較少。替加環素(0.2μg/ml)的MIC和MBC較萬古霉素(0.39μg/ml和0.78μg/ml)更低，其更有助于消除骨髓炎感染。替加環素與利福平的結合可以從骨和骨髓徹底根除細菌，而在萬古霉素加利福平組中樣品仍然為陽性。參見附圖3。每日兩次皮下給予14mg/kg的替加環素并且每日兩次口服給予40mg/kg的利福平的治療獲得成功。這些數據證明兔體內甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌感染的骨髓炎經替加環素和利福平聯合治療是有效的。
因此，根據本文的公開內容，比如上述同情應用研究中所用的劑量和治療方案(即給藥的長短和方式，以及療法的時間過程)、為了治療所示病原體感染而給予患者普通抗生素的典型劑量和治療方案、以及在兔研究中所用的劑量和治療方案，本領域技術人員將知道適當的劑量和治療方案從而對哺乳動物給藥以達到藥理學有效量的替加環素和/或其它抗生素如利福平，從而治療骨髓炎和/或膿毒性關節炎。本領域技術人員將理解會影響所需劑量和治療方案的那些因素如患者感染的程度、總體健康水平、體重和年齡。
術語“藥理學有效量”意指，與本領域已知的考慮一致，有效地實現藥理學作用或治療改善而沒有過度不良副作用的抗菌劑的量，包括但不限于，抑制細菌生長、減少細菌濃度、減少從感染恢復的時間、改善、消除或減少感染癥狀或其它疾病如腫脹、壞死、發燒、疼痛、虛弱以及本領域技術人員視測量情況而定的其它指征。
本發明另一個實施方案提供了替加環素連同或不連同選自利福霉素、利福平、利福噴丁、利福昔明或曲張鏈菌素(優選利福平)的抗菌劑用于制備治療哺乳動物優選人體內的骨、骨髓、關節和周邊組織感染以及骨髓炎和/或膿毒性關節炎的藥物的應用。
另一個實施方案提供一種用于治療哺乳動物優選人體內骨、骨髓、關節和周邊組織感染以及骨髓炎和/或膿毒性關節炎的藥物組合物，含有替加環素，還含有或不含有選自利福霉素、利福平、利福噴丁、利福昔明或曲張鏈菌素(優選利福平)的抗菌劑，以及藥學上可接受的通常用于藥物和獸醫制劑中的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、助劑和/或載體。該藥物制劑可以被改造以適合給予人類和/或動物。
本發明另一個實施方案提供了替加環素連同或不連同選自利福霉素、利福平、利福噴丁、利福昔明或曲張鏈菌素(優選利福平)的抗菌劑用于制備治療哺乳動物優選人體內的骨、骨髓、關節和周邊組織感染以及骨髓炎和/或膿毒性關節炎的藥物的應用。
應理解為在本發明的各種實施方案中，替加環素和/或利福平或其它抗菌劑可以以其藥學上可接受的鹽存在。例如，這些鹽可包括但不限于鹽酸鹽、硫酸鹽或磷酸鹽。還可包括例如乙酸鹽、檸檬酸鹽或乳酸鹽。
該藥物或藥物組合物是以達到藥理學有效量的替加環素和藥理學有效量的選自利福霉素、利福平、利福噴丁、利福昔明或曲張鏈菌素(優選利福平)的抗菌劑給藥。該藥物組合物和/或藥物另外包含藥學上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、助劑和/或載體。可包括但不限于蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、卵磷脂、聚乙烯吡咯烷酮、微晶纖維素、甲基纖維素、羧甲基纖維素、羥乙基纖維素、羥丙基纖維素、淀粉、聚丙烯酸酯、乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素及其衍生物、甘油三乙酸酯、酞酸二丁酯、癸二酸二丁酯、檸檬酸酯、聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、乳糖、蔗糖、硬脂酸鎂、滑石或硅油。
對于口服給藥，該藥物制劑可以是作為例如片劑、膠囊、乳劑、溶液、糖漿或懸浮液使用。對于腸胃外給藥，該制劑可以作為安瓿使用，還可作為懸浮液、溶液或在水性或油性賦形劑中的乳劑。對于懸浮劑、穩定劑和/或分散劑的需要當然應考慮活性化合物在具體實施方案所用的賦形劑中的溶解度。該制劑還可包含生理學上相容的防腐劑和抗氧化劑。
該藥物制劑還作為栓劑使用，含有常規的栓劑基質比如可可脂或其它甘油酯。或者，該制劑可以被制備成有效的儲存形式，其將在體內在預定時間內釋放活性組合物。
為了說明本發明的各種實施方案給出了下面實施例，而不意在以任何方式限制本發明。
實施例實施例1在兔體內使用替加環素治療骨髓炎本實施例表明在兔體內使用替加環素以及替加環素與利福平的聯合治療骨髓炎。還進行了使用萬古霉素以及萬古霉素聯合利福平的比較研究。數據證明了使用替加環素較萬古霉素以及使用替加環素聯合利福平較萬古霉素聯合利福平改善了抗微生物效能。此外，在測試組內，替加環素聯合利福平提供了對抗甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌的完全保護作用。
擴散生物測定生成的標準曲線使用正常NZW兔血清(Fisher Sciontific)與正常的、未感染的兔脛骨生成替加環素(Wyeth-Ayerst Research，Pearl River，New York)、萬古霉素(Abbott Laboratories，Chicago，Illinois)和利福平(MerrellPharmaceuticals Inc.Kansas，Missouri)的標準曲線。使用各藥物進行生物測定以產生血清和/或脛骨中抗生素濃度標準曲線。
用于生物測定的生物體為臘樣芽胞桿菌ATCC11778。使用含有各抗生素的兩倍系列稀釋液制備血清標準品，使得正常NZW兔血清中的藥物濃度為25μg/ml至0.20μg/ml。在滅菌通風櫥中通過使用70％乙醇徹底清洗未感染的兔脛骨而制備替加環素的骨洗脫標準品。使用粉碎機將各脛骨粉碎成約0.5cm2的小碎片。將碎片置于無菌的50ml圓錐形離心管中并稱重。向每一克骨碎片加入一毫升無菌的0.9％生理鹽水。該溶液經充分渦流兩分鐘。允許將所得骨洗脫液在4℃冷室中于180rpm振動12小時。在測定之前，樣品以4000rpm離心3分鐘從而將碎片壓成小球。
測量圍繞各孔的生長抑制區域的直徑，單位為毫米。針對替加環素在血清和骨洗脫液中的濃度并針對血清中的萬古霉素，通過描繪已知抗生素濃度相對于其所得的抑制區域測量而生成標準曲線。
替加環素的藥物動力學每12小時經皮下給予6只未感染兔的基準組14mg/kg的替加環素，其在無菌水中重組，持續8天。以下面的大概間隔抽取血樣最初抗生素治療后的1小時、3小時、6小時、12小時、171小時和180小時(處死時間)。通過標準技術采集半毫升血。樣品立即被投入無菌的1.5毫升離心管中。安樂死并除去所有軟組織后，兩個脛骨均經70％乙醇充分清洗并收獲。將脛骨置于單獨的、無菌的50ml離心管中并于-70℃儲存。
血清樣品被儲存于-70℃直到進行生物測定。骨樣品的制備如前所述。制備排種的瓊脂平板并將樣品一式三份裝填到排種板中，于30℃培養18小時。測量圍繞各孔的生長抑制區域的直徑并根據標準曲線外推替加環素的濃度。
最低抑制濃度和最低殺菌濃度的確定使用抗生素兩倍管稀釋法測定替加環素、萬古霉素和利福平的最低抑制濃度(MIC)。也測定最低殺菌濃度。該方法靈敏度的極限是25μg/ml-0.20μg/ml。
脛骨骨髓炎的誘發在所有六個研究組內在所有兔左側脛骨干骺端中經皮誘發局部金黃色釀膿葡萄球菌骨髓炎。甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌菌株得自接受治療的骨髓炎患者。
感染性培養基的制備于37℃，在含有40μg/ml苯唑西林的Mueller Hinton Broth(Difco Laboratories，Detroit，Michigan)培養基中培養金黃色釀膿葡萄球菌過夜。將培養基的細菌濃度調整至107CFU/ml。
兔感染方法本研究使用8-12周齡且重2.0-3.5kg的新西蘭白兔(Ray Nicholl′s Rabbitry，Lumberton，Texas)。給予麻醉藥后，將18號針經皮插過左脛骨干骺端側面進入髓內腔。接著，相繼注射0.15ml5％魚肝油酸鈉(American Regent Laboratories，Inc.，Shirley，NewYork)，0.1ml金黃色釀膿葡萄球菌(107CFU/ml)以及0.2ml 0.9％無菌生理鹽水。允許該感染發展2周，此時經放射照射測定骨髓炎的嚴重程度(表1)。
治療組在感染后兩周末，將局部患鄰近脛骨髓炎(經射線照射確定為2-4級)的兔分成六個研究組。組1(對照組)感染了但在研究期間未治療。組2兔經皮下給予30mg/kg萬古霉素每天兩次治療4周。組3兔經皮下給予30mg/kg萬古霉素每天兩次加上口服0.5％甲基纖維素中40mg/kg的利福平每天兩次治療4周。組4兔經皮下給予14mg/kg替加環素每天兩次治療4周。組5兔經皮下給予與組4中兔相同劑量的替加環素加上口服40mg/kg利福平每天兩次治療4周，其中利福平為0.5％的甲基纖維素溶液。每天給予接受口服利福平的兔(組3和5)口服營養補充物(Ensure PlusAbbott Laboratories，Columbus，Ohio)和Lactobacillus spp.制劑(Kvvet Supply，3190NRoad，David City，Nebraska)。組6兔經皮下給予與組4劑量相同的替加環素治療1周，但在末次給藥后3小時處死。此時，采集血液和感染的骨樣品并測定替加環素濃度。在本試驗的治療期后，在2周內對組1-5不進行治療，在感染后8周處死動物。
放射照相評價在開始治療(感染后2周)時、在抗生素治療末期(感染后6周)以及處死(感染后8周)時進行雙側脛骨的放射照相。根據三名研究者的視覺分級給放射照相評分并取平均分，各研究者不知道試驗組別。
表1 兔體內放射照相的骨髓炎嚴重級別的標準
*視覺評價骨破裂百分比。
抗生素血清水平的測定開始抗生素給藥后于1小時(峰值)和12小時(谷值)測定組2和4的抗生素峰和谷水平。參見附圖5A和5B。通過生物測定的方法測定抗生素濃度。如上所述進行抗生素擴散測試。根據各標準曲線外推抗生素的濃度。
每克骨和骨髓中細菌濃度的測定處死后，對于左脛骨和右脛骨進行總體培養。測定所有研究組中左脛骨和骨髓的金黃色釀膿葡萄球菌定量計數，以CFU每克表示。
培養基的制備為了左脛骨的總體培養分析和右脛骨的品質確保檢查，使用滅菌棉花頭涂藥器拭抹雙邊脛骨骨髓和髓內管。將接種的涂藥器劃痕于血液平板上然后置于5ml無菌TSB中。然后于37℃培養該板和管24小時并記錄生長和/或濁度。
將骨髓置于無菌的50ml離心管中并稱重。將骨片段打碎成0.5cm2碎片，置于無菌的50ml離心管中，并稱重終產物。以3比1的比例加入0.9％的無菌生理鹽水(3ml鹽水/克骨和骨髓)并使懸浮液渦流2分鐘。使用0.9％的無菌生理鹽水制備各懸浮液的六個10倍稀釋液。將20微升的各稀釋液樣品，包括起始懸浮液，一式三份置于血瓊脂板上并于37℃培養24小時。計數各脛骨樣品最大稀釋液的CFU。以CFU每克骨和骨髓計算金黃色釀膿葡萄球菌濃度。對于骨樣品，將計算結果乘以3，對于骨髓乘以4，以說明它們在鹽水中的最初稀釋度以及說明骨髓吸附入鹽水中。計算各自金黃色釀膿葡萄球菌的平均對數值。
試驗數據的統計分析對于所有原始數據計算均值的標準偏差和標準誤差，包括盤擴散測定(disc diffusion measurements)、重量差異、放射照相等級以及細菌計數。對于利用抗生素濃度的以10為底的對數值繪制出濃度(μg/ml)與所測量抑制區域(mm)之間關系的抗生素擴散標準曲線進行線性回歸分析、最小二乘法。利用源于最小二乘法計算的斜率和Y-截距值由標準曲線將所有后來擴散測量值外推至微克/毫升的抗生素濃度。
最低抑制濃度和最低殺菌濃度對于本研究所用的甲氧西林-耐藥金黃色釀膿葡萄球菌(106CFU/毫升接種體)，替加環素的最低抑制濃度和最低殺菌濃度分別低于0.2μg/ml和0.2μg/ml。萬古霉素的最低抑制濃度和最低殺菌濃度分別是0.39μg/ml和0.78μg/ml，MIC/MBC比值為0.5。利福平的最低抑制濃度和最低殺菌濃度分別是0.78μg/ml和1.56μg/ml，MIC/MBC比值為0.5。
在骨和血清中的藥物動力學水平所有的抗生素濃度源于各自的標準曲線。未感染動物組的血清中替加環素濃度(14mg/kg，每日兩次)的對數趨勢示于附圖1中。替加環素，如同附圖1所示，緩慢地清除，維持高于MIC(0.2μg/ml)的穩定水平至12小時(谷值)。給予各藥物后受感染的兔血清中替加環素(14mg/kg，每日兩次)和萬古霉素(30mg/kg，每日兩次)峰值和谷值示于附圖5a和5b中。在治療末在受感染的脛骨內分別測量受感染兔組中替加環素(14mg/kg，每日兩次)的骨濃度，其均值為0.78μg/ml+/-0.01μg/ml，在未感染的脛骨內均值為0.49μg/ml+/-0.01μg/ml。該差別在統計學上顯著(p＜0.05)。
放射照相結果根據表1，將2-4級骨髓炎引入所有的受感染動物。各組間起始的放射照相等級相似。t＝14天時替加環素、替加環素+利福平以及萬古霉素+利福平組的平均等級顯著高于t＝56天的平均等級(p＜0.05)。與萬古霉素(0.5+/-0.2或25％)、與替加環素(0.9+/-0.1或40.9％)、萬古霉素+利福平(0.9+/-0.1或40.9％)或與替加環素+利福平(0.8+/-0.1或40.0％)組相比，對照組放射照相顯示了最低量的改善(0.2+/-0.2或9.1％)。
附圖2描述了t＝14和t＝56天各組的平均放射照相的嚴重程度。在本研究末(t＝56天)，比較不同組之間的平均放射照相等級。t＝56天時的替加環素組、替加環素+利福平組以及萬古霉素+利福平組的平均等級顯著低于t＝56天時的對照組平均等級(p＜0.05)。附圖2的關鍵詞如下對照＝對照組，未治療；萬古霉素＝皮下給予萬古霉素治療組；Van+Rifam＝皮下給予萬古霉素且口服利福平治療組；Gar-936＝皮下給予Gar-936治療組；Gar+Rifam＝皮下給予Gar-936且口服利福平治療組。
骨培養未治療的受感染對照組(n＝15)脛骨的高比率顯示了甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌陽性培養物(80％)的平均濃度為9.21×104CFU/g骨。當與未治療的對照組相比，萬古霉素組(n＝11)、替加環素組以及替加環素+利福平組均表明了陽性甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌感染率顯著下降。在萬古霉素組中，11個樣品中的2個(18.2％)為MRSA陽性，該組的平均細菌濃度為1.4×102CFU/克骨(p＜0.05)。在替加環素組中，10個樣品中有1個為甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌陽性且該組的平均細菌濃度為20CFU/克骨，其較對照組或萬古霉素組均更低(p＜0.05)。萬古霉素+利福平組中有一只兔顯示了高于對照組的細菌濃度。接受替加環素+利福平治療組的兔表明了完全根除脛骨細菌(在所有樣品中為0.0CFU/克骨)。附圖3比較了所有組之間的CFU/克骨髓和骨。附圖3證明了替加環素以及替加環素聯合利福平相對于對照組有效地治療骨感染和骨髓感染。
附圖3的關鍵詞如下對照＝對照組，未治療；萬古霉素＝皮下給予萬古霉素治療組；Gar-936＝皮下給予Gar-936治療組；萬古霉素+利福平＝皮下給予萬古霉素且口服利福平治療組；Gar+利福平＝皮下給予Gar-936且口服利福平治療組。
不良事件66只受感染的兔中，共有6只在完成治療之前死去。5只兔死于替加環素治療組中，其中1只因為營養狀況嚴重損害而在第19天被處以安樂死。另一只兔由于胃小腸結腸炎死于替加環素治療的第17天。本組中有三只由于胃小腸結腸炎和無法耐受麻痹而死于第28天。替加環素+利福平組中一只兔由于胃小腸結腸炎死于治療期間的第15天。
胃小腸結腸炎很可能是由大腸正常菌叢的變化而引起的。每周監測所有兔的重量變化。對照組顯示了最大的平均增重(0.58kg+/-0.27)，萬古霉素組第二(0.39kg+/-0.26)，萬古霉素+利福平組第三(0.21kg+/-0.32)。替加環素組(-0.05kg+/-0.32)和替加環素+利福平(-0.39+/-0.31)組均在抗生素治療后減重。啟用抗生素后約1.0-1.5周，替加環素組和替加環素+利福平組中幾乎所有兔均表現了輕度至嚴重的胃功能障礙癥狀，包括胃口減弱、脫水、腹瀉和/或減重。附圖4A和B表明了所有組之間的重量變化。附圖4A和B的關鍵詞如下對照＝對照組，未治療；萬古霉素＝皮下給予萬古霉素治療組；萬古霉素+利福平＝皮下給予萬古霉素且口服利福平治療組；Gar-936＝皮下給予Gar-936治療組；Gar+利福平＝皮下給予Gar-936且口服利福平治療組。
至于安全性，在使用替加環素治療的兔組中觀察到較大數目的死亡和副作用。由替加環素引發的小腸結腸炎可能是正常腸菌叢的廣泛破壞所導致。這些癥狀通過口服給予益生素而減弱。替加環素的寬廣抗菌譜，與萬古霉素的較窄譜相反，可幫助解釋在治療組之間所觀察到的差別。
結果各組織中各動物的計數數據列于表2中。表中計數是針對各組織一式三份測量的均值。檢查表2中計數顯示了在使用測試品治療的治療組中，大多數或者全部動物的計數是0。在對照組中，15只動物中有5只骨髓內測量為非零計數，15只動物中有11只骨內測量為非零計數。對照組中非零計數的大小存在相當大的變化，尤其對于骨而言。
在各治療組中，陽性和陰性培養物的數目以及與對照組相比較的p值如下
表2兔體內骨髓炎研究的每克骨和骨髓的菌落形成單位計數
替加環素、萬古霉素和利福平治療兔骨髓炎的比較數據在骨髓中，替加環素和替加環素+利福平治療組中陽性培養物的比例為0，其與對照組中0.33(5/15)的比例相比在常規的p＝0.05水平上幾乎有統計學上的顯著性(p＝0.06)。萬古霉素以及萬古霉素+利福平組中的比例相對于對照組沒有統計學上的顯著差異。在骨中。使用測試品治療的各組中陽性培養物的比例在統計學上顯著地低于對照組中的比例。
在甲氧西林耐藥性金黃色釀膿葡萄球菌的動物模型中，心內膜炎，14mg\kg每天兩次的替加環素顯示較40mg\kg萬古霉素更為有效(Murphy，Antimicrob Agents Chemother 2000；44(11)3022-3027)。在大鼠模型中，給予高達80mg\kg\天的劑量。但是，在本文說用的兔模型中，高于14mg/kg每天的給藥劑量在動物體內導致相應的發病率和死亡率(未顯示數據)。因此，在本研究中使用上述劑量。即使目標不是研究替加環素在兔子體內的藥物動力學，也進行多藥物水平的測量從而確保在動物模型中使用了足夠的劑量。數據證明末次給藥后12小時血清中藥物水平仍高于所用葡萄球菌株的MIC，而且，該藥物業示了相關的骨滲透，并在受感染或未感染的骨內發現治療水平的替加環素。另一個相關發現是在受感染的骨內發現較高濃度的藥物，其需要進一步研究。
實施例2靜脈內一次給藥100mg后替加環素在人組織內的分布。
本實施例表明了單次靜脈內給予替加環素后人類受試者體內所選組織的滲透。數據證明了快速分布期、具有延長的半衰期并在穩態時具有高分布容積。進一步證實了在人類受試者體內的骨、滑液、肺、膽囊和結腸的滲透。滲透改善了骨和關節感染的治療。
人體內靜脈內給予替加環素的藥物動力學研究已表明存在快速分布期、具有延長的半衰期(40-60小時)并在穩態時具有高分布容積。使用放射標記替加環素的動物研究表明該快速分布期和穩態時的高分布容積代表替加環素滲透入包括肺和骨的組織。以3mg/kg的劑量經30分鐘輸注給予Sprague-Dawley大鼠(18只雄性)碳-14替加環素。在輸注末以及輸注結束后1、8、24、72和168小時，各時間點測定3只大鼠組織內的放射能濃度。對于所有組織，于輸注結束時觀察到放射能峰濃度。通常，放射能良好地分布于大多數組織，最高濃度如下骨＞骨髓＞唾液腺，甲狀腺，脾和腎。在各組織中，組織內濃度-時間曲線下面積與血漿內濃度-時間曲線下面積的比值＞10。
本研究的目的在于確定在選定的時間點肺、結腸、膽囊組織、骨和滑液中的替加環素組織濃度以及相應的血清濃度。單次劑量靜脈內給予替加環素的受試者經預定的肺、結腸、膽囊或骨手術或者腰椎穿刺而取出樣品。
開始在30分鐘內給予單次劑量的100mg替加環素后，于4小時、8小時、12小時或24小時在手術期間針對各受試者采集預定的肺、結腸、膽囊、骨和滑液的組織/液體樣品。在0小時(首劑量之前)、大約30分鐘(輸注結束時)以及在相應于組織/液體采集的時間，從所有受試者采集血清。根據下面闡述的方法測定組織和血清濃度。
血清樣品的研究參數根據已驗證的方法分析來自接受替加環素的研究受試者的人類血清和組織。血清樣品和滑液(0.2ml)與0.6ml溶于乙腈中的內標混合，上清液蒸發至干和并使殘留物重新構成200微升的流動相。將重新構成的等分樣品(10微升)注射到LC/MS/MS中。
根據PE SCIEX″Analyst″1.3版軟件獲得并分析數據。具有1/x2權重的線性回歸用于獲得校準曲線的最匹配數據。定量的下限是10ng/ml血清和滑液樣品、10ng/ml結腸和膽囊樣品、以及30ng/ml骨樣品。
使用各組血清樣品分析在人血清中制備的低(25ng/ml)、中(500ng/ml)和高(1500ng/ml)定性對照樣品(2套)。
對于結腸、膽囊和肺樣品，使用各組組織樣品分析了25、500和1500ng/g的兩套定性對照樣品。對于骨，使用各套組織樣品分析了100、500和1500ng/g的兩組定性對照樣品。
血清和滑液的曲線在10-2000ng/ml范圍內是線性的，組織的曲線在定量下限至2000ng/ml范圍內是線性的。如果至多兩個定性對照樣品在目標的85-115％范圍外且沒有兩個相同濃度的定性對照樣品在該范圍外，那么該過程是成功的。如果兩個相同濃度的定性對照樣品在該范圍外，則僅報道剩余定性對照樣品之間的濃度。
血清樣品的材料和方法在人血清中使用LC/MS/MS法測量替加環素。通過溶解于甲醇中制備1mg/ml的替加環素初級儲備液。由初級儲備液通過使用乙腈稀釋至約40,000ng/ml的濃度制備二級儲備液。不用時，將儲備液置于-20℃儲存。在甲醇中制備濃度為1mg/ml的叔丁基-d9-替加環素的初級內標溶液。通過在乙腈中將初級儲備液稀釋至100微克/ml并加入0.1％三氟乙酸酯而制備二級內標標準儲備液。初級和二級儲備液于-20℃儲存。通過使用乙腈/0.1％三氟乙酸酯稀釋至容積而制備工作內標。不用時，該工作內標于4℃儲存。在分析當天，用于制備標準曲線操作溶液之前使二級儲備液升至室溫。通過系列稀釋于空白人血清于大約2000、1600、1000、500、250、100、50、20和10ng/ml制備標準曲線。
提取方法如下向200微升校準液、定性對照品或樣品，加入600微升內標工作液并渦流混合。樣品于13000rpm離心10分鐘以分離各層并將上清液轉移至培養管中。在Speed Vac中蒸發樣品至干。殘留物在200微升流動相中經超聲處理重新構成并向LC/MS/MS中注射10微升。
LC/MS/MS由HPLC(Agilent 1100)、質譜儀(Applied BiosystemsAPI3000)、柱(Aquasil C18，50×2.1mm i.s.，5微米(ThermoKeystone)組成，流動相為16％乙腈、6％甲醇、78％水和0.1％四氟乙酸酯，流速約為0.35ml/min，注射容積為10微升。檢測器條件周期內119次掃描、MRM掃描類型、正極性、渦輪離子噴霧源，低分辨率，使用6psi氮氣作為霧化氣、屏蔽氣和碰撞氣，具有4500mv的離子能，且離子噴霧的溫度為450℃。該檢測器監測替加環素和內標。
在三個分析流程中分析樣品。在樣品分析的各天，連同定性對照樣品和研究受試樣品一起運行完整的標準曲線。對測定濃度大于最高校準物的樣品進行稀釋，混合100微升樣品與900微升空白人血清并如前所述分析200微升該混合物。通過與在適當基質中得到并使用(1/濃度)2加權因子計算的標準曲線相比較從而量化血清中的替加環素。
替加環素的定量界限為10ng/ml。在任一預劑量樣品中，未檢測到干擾任一替加環素異構體測定的峰。所有校準物和定性控制樣品均在范圍之內(目標的85-115％)。樣品結果示于表1中。標準曲線和校準物的結果示于表4中。
組織樣品的研究參數根據上面的血清樣品調查研究參數制備儲備液和內標溶液。標準曲線工作溶液被配制為約10000、8000、5000、2500、500、250、100和50mg/ml。在分析當天，將40微升的工作溶液加入在200mg組織中以制備的2000、1600、1000、500、250、100、50、20和10μg/ml校準物。犬組織代替人類組織從而制備校準物和定性對照樣品。由于犬膽囊的可獲得性有限，犬結腸被用于制備分析人類膽囊的標準曲線。已證明結腸是分析膽囊樣品的適當替代基質。
提取方法如下向200mg校準物、定性對照品或樣品，加入3ml內標工作液，使用手動均勻器攪勻樣品。樣品于14000rpm離心10分鐘以分離各層并將上清液轉移至離心管中。樣品在Speed Vac中蒸發樣品至干。殘留物在200微升流動相中經超聲處理重新構成并向LC/MS/MS中注射10微升。LC/MS/MS的條件與分析血清樣品中所用的相同。以與血清樣品相同的方法萃取滑液樣品。
樣品經若干分析操作進行分析。在分析樣品的各天，連同定性對照樣品和組織一起運行完整的標準曲線。在與所分析的組織樣品相稱的替代基質中制備標準曲線。測定濃度大于最高校準物(200ng/g)的樣品與10或20倍濃度的內標進行均勻化以用于標準曲線。將等分樣品(300微升)(10倍稀釋液)蒸發至干且重新構成樣品以至峰面積比和峰面積在標準曲線范圍內。
通過與在適當基質中得到并使用(1/濃度)2加權因子計算的標準曲線相比較從而量化組織中的替加環素。對于滑液，在磷酸緩沖鹽水中制備校準物。在人造滑液中制備第二套校準物，人造滑液的組成為100mmol/L葡萄糖、2.03-2.26g/L透明質酸鹽以及約8g/L白蛋白并調整至pH 7.4。在PBS中制備的校準曲線和恢復，校正因子的計算是通過使用冪方程(y＝y0+axb)對于從PBS曲線測定的人造滑液樣品的濃度相對于那些樣品的理論濃度進行線性回歸。因為研究受試樣品的測定濃度在校準曲線的低范圍內，僅使用20-500ng/ml的校準物進行計算該回歸。該回歸的結果表明了高度相關(r2＝0.9996)，而且在標準曲線的整個范圍(20-2000ng/ml)內ASF校準物的回算濃度在它們目標值的94-122％之間。然后將該回歸方程用于來自PBS標準曲線的研究受試樣品濃度并確定滑液校品中替加環素的校正濃度。
替加環素的定量界限為10ng/ml。在分析的所有基質中均可測量出替加環素的濃度。濃度與該樣品相似的所有校準物和定性對照樣品均在范圍之內(目標的85-115％)。樣品結果示于表4(組織)和表5(滑液)中。
結果數據證明了快速分布期、具有延長半衰期并在穩態時具有高分布容積。還證實了在人受試者體內的骨、滑液、肺、膽囊和結腸滲透。因此，滑液中濃度表明了快速分布并且與處于相似時間的血清數據相比延長了替加環素的保留。
表3血清分析結果
1BQP＝低于定量界限表4計算的組織分析結果*BQP＝低于定量界限(＜33.2ng/ml)
表5滑液分析結果計算值
實施例3使用替加環素治療的大鼠體內的組織分布本研究旨在量化組織中[14C]-替加環素產生的放射能，在對于雄性Sprague-Dawley和Long-Evans大鼠單次的30分鐘3mg/kg靜脈輸注[14C]-替加環素后，使用熒光成像的整體放射自顯影法。
材料和方法替加環素由Analytical Department，Wyeth-Ayerst Research，Montreal，Canada提供。[14C]-替加環素由Amersham(Boston，MA)提供。主體[14C]-替加環素的放射化學純度和比放射性分別為98％和93.6微Ci/mg。
使用無菌水制備靜脈內給藥溶液。用于計數血漿和尿中放射能的液體閃爍混合物為Ultima Gold(Packard Instruments Co.，Meriden，CT)。
裝有Oximate-80 Robotic Automatic Sampler(Canberra-PackardCo.，Downers Grove，IL)的Model 3078 Tri-Carb Sample Oxidizer用于燃燒血樣。使用Permafluor E液體閃爍混合物(cocktail)(PackardInstruments Co.，Meridan，CT)、Carbo-Sorb-E(Packard InstrumentsCo.，Meridan CT)二氧化碳吸附劑和去離子水捕獲在氧化器中燃燒樣品所產生的放射性二氧化碳。將血液等分樣品轉移至combustocones并覆蓋墊子(Canberra-Packard Co.，Downers Grove，IL)進行燃燒。
使用具有Ultima Gold或甲苯標準曲線的Tri-Carb Model 2700 TR液體閃爍計數器(Canberra-Packard Co.，Downers Grove，IL)進行所有的放射能測定。通過應用已知放射能的外標將每分鐘計數(CPM)轉化為每分鐘衰變數(DPM)。通過外部放射性標準的轉換光譜指數(TSIE)確定每一標準的猝滅。檢測下限被定義為兩倍背景值。
雄性Sprague-Dawley和Long-Evans大鼠從Charles RiverBreeding Laboratories，Raleigh，NC獲得，并在開始研究前至少一周被隔離。通過在12ml無菌水中溶解6.90mg未標記的替加環素和5.30mg[14C]-替加環素而制備靜脈內給藥溶液(1.02mg/ml)。該給藥溶液經稀釋并在Ultima Gold閃爍計數混合物(Packard Inc.)中直接進行放射測定。使用Packard 2700 TR液體閃爍譜儀(Canberra-PackardCo.)進行總放射能的全部測定。
大鼠體重為0.206-0.301kg。所有大鼠經由頸靜脈插管接受單次30分鐘靜脈內輸注給藥[14C]-替加環素(3ml/kg，3mg/kg活性部分，40微Ci/kg)，使用Harvard輸注泵22(Harvard Apparatus，Southnatick，MA)。在給予化合物之前校正所有泵。在給藥預定時間之后穿心取血之前使用異氟烷麻醉大鼠。在給藥后0.5、8.5、24、72、168和336小時每一時間點處死一只Sprague-Dawley和Long-Evans大鼠。
從雄性Sprague-Dawley大鼠將對照全血采集入含有肝素鈉的管中。采集的血液用于制備校正標準物和定性對照樣品。該標準用來構建標準曲線以量化全血低溫切割的組織中放射標記藥物的分布。定性對照品，其被包埋在各大鼠的相同CMC塊中，用于評價大鼠整體低溫切片內部和之間的厚度變化。
使用來自雄性Sprague-Dawley大鼠的全血逐次稀釋200微Ci/ml的[14C]-葡萄糖儲備液(New England Nuclear，Boston，MA)得到如下十四個濃度的標準液832、485、250、122、48.6、24.3、12.0、4.72、2.36、0.853、0.638、0.405、0.327和0.221nCi當量/ml。低、中和高GC濃度為12.39、25.9和508nCi當量/ml。
安樂死后立即將各大鼠完全浸入己烷和干冰浴(-75℃)中直至冷凍。干燥各尸體并于-30℃儲存直至包埋。通過加入低粘度10％羧甲基纖維素(CMC)在模具(15cm×45cm)中包埋各尸體并置于己烷-干冰混合物中冷凍。
將凍塊轉移至Jung Cryomacrocut 3000(Leica InstrumentsGmbH，Nussloch，Germany)并在切片前允許過夜平衡至低溫切片機內部溫度至少12小時。
于-20℃將各冷凍大鼠矢向切片。采集足夠數目的切片以確保對所有目標組織采樣。切片在冷凍室內脫水過夜然后被快速地轉入包含CaSO4的干燥器中以防止濕氣凝結同時平衡至室溫。
將該切片安置于紙板上并使用[14C]-標記的黑墨水以唯一標識數字標記。放射性墨水由等量的印度墨汁和[14C]-CL-284846(100微Ci/ml)制備。將一小片Scotch膠帶置于干燥后的放射性墨水上以防止污染儲存熒光板。
將熒光成像板，BAS-SR 2025(Fuji Photo Film Co.，Japan)，置于亮可見光下照射20分鐘使用IP擦除器(Raytest，USA Inc.，NewCastle，DE)除去背景照射。使切片和校正血液標準同時與Ips直接接觸并照射7天。所有切片于室溫下儲存在鉛屏蔽盒中以使背景水平最小化。使用Fujifilm BAS-5000 Bio-Imaging Analyzer產生熒光成像并使用MCID M2軟件3.2版(Imaging Research Inc.，St.Catherines，Ontario，Canada)定量。使用環形取樣工具在MICD軟件程序中分析STD和QC。使用區域取樣工具手動描繪全血切片中的目標面積以產生計數數據。
在校準曲線的基礎上，通過數字分析所得放射自顯影圖確定所選組織中的放射性濃度。通過加權(1/x2)線性回歸分析產生各標準液的所述濃度(nCi/g)相對于MCID應答、光激發光/mm2(PSL/mm2-減去變換為nCi/g的背景值)的校準曲線。線性回歸曲線用于確定未知放射能的研究樣品的濃度。使用取樣工具分別列出或自動掃描在視覺上表現出放射能級的研究區(ROI)以獲得放射能濃度。為了確定QwBAR的定量界限，確定了來自所測試血液標準的變異系數，定量的界限被定義為變異系數不超過15％的最低濃度。
將血漿等分樣品與10ml Ultima GoldTM閃爍計數混合物(PackardInc.)合并并直接計數。使用Model 307樣品氧化器(Packard InstrumentCompany)燃燒血樣。使所得[14C]O2俘獲于Carbo-Sorb中，加入閃爍混合物(Perma FlourE+)并使用LSC定量樣品。
在Packard 2700 TR液體閃爍分光光度計(Canberra-PackardCo.)中計數樣品10分鐘或0.2sigma。通過使用已知放射能的外標生成的猝滅曲線將每分鐘計數轉變為每分鐘衰變數。通過全光譜位移確定各標準和樣品的猝滅。LSC定量的界限(LOQ)被定義為兩倍背景值。
使用靜脈內輸注(Model 202)，Non-Compartment Analysis Moduleof WinNonlin，1.1版，(Scientific Consultants，Inc.Research TrianglePark，NC)計算[14C]-GAR-936產生的放射能的藥物動力學參數，其采用與模型無關的方法且標準方法描述于Gibaldi和Perrier.Gibaldi，Pharmacokinetics，1982中。在測定平均濃度中，零替代低于定量下限(5.10ng當量/g)的任何值。對于靜脈內輸注給藥，C30分鐘為30分鐘時的濃度，其是第一個取樣點。靜脈內給藥后的最大血漿濃度(Cmax)和峰濃度的相應時間通過單獨的濃度-時間數據的數值檢查直接獲得。通過Cn2/λz的比值計算終點半衰期，其中λz來自濃度時間曲線的最終斜率。使用梯形規則計算血漿濃度對從零點至無限大的時間曲線下的面積，其中C最終是最終可測量的血漿濃度。根據如下方程計算組織與血漿濃度的比值C組織/C血漿，其中C組織等于組織中的藥物濃度(ng當量/g)，且C血漿等于血漿中的藥物濃度(ng當量/g)。
通過重量分析測試法測定[14C]-替加環素(基礎)的比放射性為43.94μCi/mg(表1)。劑量溶液的濃度為1.02mg/ml。與3mg/kg的目標劑量相比動物所接受的平均劑量為3.09±0.11/kg。
結果以3mg/kg靜脈內輸注[14C]-替加環素后Sprague-Dawley大鼠組織中總放射能的個體濃度(ng當量/g)示于表6中。組織中的藥物動力學參數示于表7中。組織與血漿的比值示于表8中。
實際上對于所有組織，總放射能的個體峰濃度(Cmax)均出現在輸注末期。放射能濃度最高的組織是腎(7601ng當量/g)、肝(7300ng當量/g)和脾(6627ng當量/g)(表7)。放射能峰濃度最低的組織是腦(54ng當量/g)和眼(108ng當量/g)(表7)。多數(70％)組織的Cmax高于2000ng當量/g。Cmax時血漿中替加環素產生的放射能低于除腦、眼、脂肪和睪丸以外的所有組織(表7)。經過24小時，除眼外所有組織中[14C]替加環素產生的放射能濃度(表6)均高于血漿。
對于除骨、腎、肝、皮膚、脾和甲狀腺外的多數組織，在168小時放射能的個體組織濃度降至它們Cmax的1％或更低(表6)。在336小時，除骨、腎、皮膚和甲狀腺外的多數組織中的濃度低于定量界限(5.10ng.當量/g)。然而，這些組織(骨、甲狀腺、腎和皮膚)中的濃度從Cmax顯著下降。通常，在336小時骨、腎、皮膚和甲狀腺中[14C]-替加環素產生的放射能的組織濃度分別為Cmax的19％、0.18％、0/43％和6％。
使用AUC作為組織負擔的指標，骨和甲狀腺較其它組織具有較高負擔。最高的AUC值出現在骨(794704ng當量·hr/g)、甲狀腺(330047ng當量·hr/g)、唾液腺(110979ng當量·hr/g)、腎(70704ng當量·hr/g)、甲狀腺(33047ng當量·hr/g)、脾(70522ng當量·hr/g)和肝(53527ng當量·hr/g)內。最低負擔的組織是腦(2865ng當量·hr/g)、脂肪(3500ng當量·hr/g)和睪丸(10303ng當量·hr/g)。骨內的AUC暴露量高于第二高組織(甲狀腺)兩倍。對于大部分組織而言組織血漿AUC比值高于1(表7)。-替加環素產生的放射能的最終半衰期在低至脂肪中的5小時高至骨和甲狀腺中超過200小時之間，相比血漿中的t1/2為24小時(表7)。具有最長清除半衰期的組織是甲狀腺(804小時)、骨(217小時)、皮膚(182小時)和腎(118小時)(表7)。
對于除了腦、眼、睪丸和脂肪的大部分組織而言，在0.5和8.5小時時間點組織血漿濃度比值(表8)高于1。在24小時，所有比值高于1。在72小時一些組織出現最高的組織與血漿比值骨(414)、甲狀腺(56)、皮膚(19.3)、脾(16.7)和腎(11.1)。血液血漿比值在所有時間點均高于1，表明[14C]-替加環素產生的放射能大量分配于血細胞中。
還評價了給藥后長達336小時，[14C]-替加環素產生的放射能向Long-Evans大鼠體內含有黑色素組織(皮膚和葡萄膜)的分布。Long-Evans大鼠體內[14C]-替加環素產生的放射能的血液和血漿濃度類似于Sprague-Dawley大鼠(表2和5)。在灌輸結束(0.5h)時，觀察到皮膚、葡萄膜、血漿和血液的放射能峰濃度(Cmax)(表9)。皮膚和葡萄膜中[14C]-替加環素產生的放射能的Cmax分別是1997和2502ng當量/g。皮膚和葡萄膜中[14C][14C]-替加環素產生的放射能的AUC分別為109296和233288ng當量·hr/g。皮膚和葡萄膜中的最終半衰期分別為473和20小時(表10)。半衰期值具有不可靠的含義，因為濃度-時間曲線中的清除期不具有必然性。這也反應在葡萄膜和皮膚AUC數據的外推中。
在所有時間點皮膚和葡萄膜的組織血漿濃度比值均高于1(表7)。皮膚(179)和葡萄膜(393)的總體最高的組織與血漿比值出現在72小時。皮膚和葡萄膜的組織血漿AUC比值分別是8.45和18.0，并表明這些組織選擇性保留顯著高濃度的[14C]-替加環素產生的放射能。數據表明放射能選擇性分配于大鼠眼中含有黑色素區域。在336小時，皮膚和葡萄膜的放射能平均組織濃度分別降至Cmax的8和1％。
表6單次30分鐘輸注[14C]-替加環素后雄性Sprague-Dawley大鼠體內組織中的總放射能平均濃度
表7單次30分鐘輸注[14C]-替加環素后雄性Sprague-Dawley大鼠組織內總放射能的藥物動力學參數
表8單次30分鐘輸注[14C]-替加環素后雄性Sprague-Dawley大鼠體內的組織血漿比值
表9單次30分鐘輸注[14C]-替加環素后雄性Long-Evans大鼠體內組織中的總放射能平均濃度(ng當量/g)
表10單次30分鐘輸注[14C]-替加環素后雄性Long-Evans大鼠組織內總放射能的藥物動力學參數
表11單次30分鐘輸注[14C]-替加環素后雄性Long-Evans大鼠體內的組織血漿比值
討論向Sprague-Dawley和Long-Evans大鼠單次三十分鐘靜脈內輸注(3mg/kg)[14C]-替加環素后評價放射能向組織的分布。放射能快速分布于組織，在輸注結束時(0.5hr)觀察到多數組織的Cmax。組織濃度與先前進行的組織切片法研究類似。替加環素向多種組織的廣泛分布表明了很大的分布容積。本發現證實了先前在大鼠和狗體內觀察到的高分布容積。通常，放射能從多數組織的清除慢于從血漿的清除。
在多數時間點，Sprague-Dawley大鼠組織內的[14C]-替加環素產生的放射能濃度高于血漿。在168小時，多數組織的放射能組織濃度降至其輸注結束值的1％或更低。經過336小時，骨、甲狀腺、腎和皮膚內的濃度分別降至Cmax值的19％、6.25％、0.18％和0.43％。
如平均AUC值所示，Sprague-Dawley大鼠體內具有最高暴露水平的組織是骨、甲狀腺、唾液腺、腎和脾。清除半衰期相當長(5-217小時)，骨、皮膚和甲狀腺具有最長的清除半衰期。甲狀腺組織的半衰期值具有不可靠的含義，因為濃度-時間曲線中的清除期不具有必然性。這還反應在由AUC數據外推AUC中。
所有時間點的組織與血漿以及血液與血漿的比值高于1表明[14C]-替加環素產生的放射能基本上分配進入組織和血細胞。根據本研究的組織與血漿比值結果類似于靜脈內給予米諾環素后大鼠的組織與血漿比值結果。
盡管不限于理論，骨內高放射能濃度可能是由于替加環素與鈣螯合。文獻已報道了四環素(米諾環素、choloretetracyclines)與鈣或其它金屬離子形成螯合復合物并由此粘附于骨的能力。在本研究中，[14C]-替加環素產生的放射能顯著地保留于骨內，AUC為794704ng當量·hr/g。該值約高出血漿75倍。還在骨中觀察到217小時的表觀清除半衰期。骨內保留的放射能可解釋靜脈內給藥5mg/kg后在雄性Sprague-Dawley大鼠體內質量平衡研究中觀察到的某些未完全回收(89.4+2.50％)的[14C]-替加環素。骨內的暴露量(AUC)高于第二高組織(甲狀腺)2.5倍。[14C]-替加環素產生的放射能還表現了對于骨和甲狀腺組織的強烈親和力以及長半衰期，這也類似于其它已知的四環素。
在腎中長達336小時內可檢測到[14C]-替加環素產生的放射能濃度且高于除骨和甲狀腺外的其它組織的濃度。但是，在質量平衡研究以及膽汁和尿排泄研究中，大部分[14C]-替加環素產生的放射能在開始的48小時被排泄，表明一些[14C]-替加環素產生的放射能可以以高親和力結合于腎組織。也已知四環素結合于腎組織。
如QWBAR所測定的，大鼠眼組織中的放射能僅選擇性分布于Long-Evans大鼠體內含有黑色素組織，即葡萄膜以及皮膚。在0.5小時后所有時間點，葡萄膜具有相對高濃度的放射能，表明了顯著的暴露水平和長半衰期。在先前進行的使用組織切割法的研究中，對完整眼球的評價揭示了該器官中存在放射能，但無法將該放射能定位于任一特定眼組織。
通過常規的液體閃爍計數(LSC)測定的14個標準液以及28個QCS濃度類似于對于這些相同標準液的QWVAR評價。這些標準液暴露于14個不同儲存熒光屏導致可靠的MCID應答，其與LCS測定的比活性相關，表明了不同天之間以及同一天之內的變化非常低。QWBAR法的CV和準確度在可接受界限內(≤20％)。MCID應答的再現性和常規LSC與QWBAR之間比活性的良好相關性證明了RBC標準是放射能的均勻濃度。本研究中觀察到的變化被認為與低溫切割、QWBAR技術以及顯像分析等多種方面相關。表明QWBAR是可重現的，其靈敏度為0.221nCi/g(定量的下限)。動態范圍在0.221-832nCi/g四個數量級是線性的。
因此，大多數組織中[14C]-替加環素產生的放射能的組織濃度高于血漿濃度。通常，放射能從大多數組織中的清除慢于從血漿中的速率。大多數組織中的AUC高于血漿，表明大多數組織緩慢地清除[14C]-替加環素產生的放射能。
權利要求
1.一種治療哺乳動物體內骨或骨髓感染的方法，包括給予哺乳動物藥理學有效量的替加環素。
2.根據權利要求1的方法，進一步包括給予選自利福霉素、利福平、利福噴丁、利福昔明或曲張鏈菌素的抗菌劑。
3.根據權利要求2的方法，其中抗菌劑是利福平。
4.根據權利要求1、2或3的方法，其中感染包括選自革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、厭氧菌和需氧菌的病原體。
5.根據權利要求4的方法，其中病原體選自包括葡萄球菌、不動桿菌、分枝桿菌、嗜血桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、腸桿菌科、腸球菌、埃希氏桿菌、假單胞菌、奈瑟氏球菌、立克次氏體、肺炎球菌、普雷沃菌、peptostreptococci、軍團擬桿菌、β-溶血的鏈球菌、B組鏈球菌和螺旋體的病原體。
6.根據權利要求5的方法，其中感染包括奈瑟氏球菌、分枝桿菌、葡萄球菌和嗜血桿菌。
7.根據權利要求6的方法，其中感染包括腦膜炎奈瑟氏球菌、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、金黃色釀膿葡萄球菌、表皮葡萄球菌或流感嗜血桿菌。
8.根據權利要求4的方法，其中病原體顯示抗生素耐藥性。
9.根據權利要求8的方法，其中抗生素耐藥性選自甲氧西林耐藥性、糖肽類耐藥性、四環素耐藥性、土霉素耐藥性、強力霉素耐藥性；氯四環素耐藥性、米諾環素耐藥性米諾環素耐藥性、甘氨酰環素耐藥性、頭孢菌素耐藥性、環丙沙星耐藥性、呋喃妥因耐藥性、三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺藥耐藥性、哌拉西林/他唑巴坦耐藥性、莫西沙星耐藥性、萬古霉素耐藥性、替考拉寧耐藥性、青霉素耐藥性和大環內酯耐藥性。
10.根據權利要求9的方法，其中糖肽類耐藥性是萬古霉素耐藥性。
11.根據權利要求5的方法，其中病原體選自金黃色釀膿葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌或釀膿鏈球菌。
12.根據權利要求11的方法，其中感染包括金黃色釀膿葡萄球菌。
13.根據權利要求12的方法，其中金黃色釀膿葡萄球菌顯示選自糖肽類抗生素耐藥性、四環素耐藥性、米諾環素耐藥性、甲氧西林耐藥性、萬古霉素耐藥性以及除替加環素之外的甘氨酰環素耐藥性的抗生素耐藥性。
14.根據權利要求5的方法，其中感染包括鮑氏不動桿菌。
15.根據權利要求14的方法，其中鮑氏不動桿菌顯示選自頭孢菌素耐藥性、環丙沙星耐藥性、呋喃妥因耐藥性、三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺藥耐藥性和哌拉西林/他唑巴坦耐藥性的抗生素耐藥性。
16.根據權利要求5的方法，其中感染包括膿腫分枝桿菌。
17.根據權利要求16的方法，其中膿腫分枝桿菌顯示莫西沙星耐藥性。
18.根據權利要求5的方法，其中感染包括流感嗜血桿菌。
19.根據權利要求5的方法，其中感染包括糞腸球菌。
20.根據權利要求5的方法，其中感染包括大腸桿菌。
21.根據權利要求5的方法，其中感染包括淋病奈瑟氏菌。
22.根據權利要求5的方法，其中感染包括普氏立克次氏體、斑診傷寒立克次氏體或立氏立克次氏體。
23.根據權利要求4的方法，其中感染引起骨髓炎。
24.一種治療哺乳動物體內關節感染或關節周邊組織感染的方法，包括給予哺乳動物藥理學有效量的替加環素。
25.根據權利要求1的方法，進一步包括給予選自利福霉素、利福平、利福噴丁、利福昔明或曲張鏈菌素的抗菌劑。
26.根據權利要求25的方法，其中抗菌劑是利福平。
27.根據權利要求24、25或26的方法，其中感染包括選自革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、厭氧菌和需氧菌的病原體。
28.根據權利要求27的方法，其中病原體選自包括葡萄球菌、不動桿菌、分枝桿菌、嗜血桿菌、沙門氏菌、鏈球菌、腸桿菌科、腸球菌、埃希氏桿菌、假單胞菌、奈瑟氏球菌、立克次氏體、肺炎球菌、普雷沃菌、peptostreptococci、軍團擬桿菌、β-溶血的鏈球菌、B組鏈球菌和螺旋體的病原體。
29.根據權利要求28的方法，其中感染包括奈瑟氏球菌、分枝桿菌、葡萄球菌和嗜血桿菌。
30.根據權利要求29的方法，其中感染包括腦膜炎奈瑟氏球菌、結核分枝桿菌、麻風分枝桿菌、金黃色釀膿葡萄球菌、表皮葡萄球菌或流感嗜血桿菌。
31.根據權利要求27的方法，其中病原體顯示抗生素耐藥性。
32.根據權利要求31的方法，其中抗生素耐藥性選自甲氧西林耐藥性、糖肽類耐藥性、四環素耐藥性、土霉素耐藥性、強力霉素耐藥性；氯四環素耐藥性、米諾環素耐藥性米諾環素耐藥性、甘氨酰環素耐藥性、頭孢菌素耐藥性、環丙沙星耐藥性、呋喃妥因耐藥性、三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺藥耐藥性、哌拉西林/他唑巴坦耐藥性、莫西沙星耐藥性、萬古霉素耐藥性、替考拉寧耐藥性、青霉素耐藥性和大環內酯耐藥性。
33.根據權利要求32的方法，其中糖肽類耐藥性是萬古霉素耐藥性。
34.根據權利要求28的方法，其中病原體選自金黃色釀膿葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌或釀膿鏈球菌。
35.根據權利要求34的方法，其中感染包括金黃色釀膿葡萄球菌。
36.根據權利要求35的方法，其中金黃色釀膿葡萄球菌顯示選自糖肽類抗生素耐藥性、四環素耐藥性、米諾環素耐藥性、甲氧西林耐藥性、萬古霉素耐藥性以及除替加環素之外的甘氨酰環素耐藥性的抗生素耐藥性。
37.根據權利要求28的方法，其中感染包括鮑氏不動桿菌。
38.根據權利要求37的方法，其中鮑氏不動桿菌顯示選自頭孢菌素耐藥性、環丙沙星耐藥性、呋喃妥因耐藥性、三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺藥耐藥性和哌拉西林/他唑巴坦耐藥性的抗生素耐藥性。
39.根據權利要求28的方法，其中感染包括膿腫分枝桿菌。
40.根據權利要求39的方法，其中膿腫分枝桿菌顯示莫西沙星耐藥性。
41.根據權利要求28的方法，其中感染包括選自流感嗜血桿菌、糞腸球菌、大腸桿菌、淋病奈瑟氏菌、普氏立克次氏體、斑診傷寒立克次氏體或立氏立克次氏體的病原體。
42.根據權利要求27的方法，其中關節感染或關節周邊組織的感染引起膿毒性關節炎。
43.藥理學有效量的替加環素用于治療哺乳動物體內骨、骨髓或關節感染的應用。
44.藥理學有效量的替加環素和選自利福霉素、利福平、利福噴丁、利福昔明或曲張鏈菌素的抗菌劑用于治療哺乳動物體內骨、骨髓或關節感染的應用。
45.藥理學有效量的替加環素用于制備治療哺乳動物體內骨、骨髓或關節感染的藥物的應用。
46.藥理學有效量的替加環素和選自利福霉素、利福平、利福噴丁、利福昔明或曲張鏈菌素的抗菌劑用于制備治療哺乳動物體內骨、骨髓或關節感染的藥物的應用。
47.根據權利要求43-45的應用，其中骨或骨髓感染引起骨髓炎。
48.根據權利要求43-45的應用，其中關節感染或關節周邊組織感染引起膿毒性關節炎。
全文摘要
本發明涉及治療骨或骨髓感染、關節感染或關節周邊組織感染的方法，包括單獨給予替加環素抗生素或聯合利福霉素抗生素。在優選實施方案中，骨或骨髓感染引起骨髓炎。在另一個優選實施方案中，關節感染或關節周邊組織感染引起膿毒性關節炎。本發明還涉及單獨使用替加環素或聯合利福平治療骨和/或骨髓感染、或關節感染和/或關節周邊組織感染的藥物的制備。
文檔編號A61K31/4745GK1889957SQ200480032755
公開日2007年1月3日 申請日期2004年9月7日 優先權日2003年9月5日
發明者R·T·特斯塔, J·卡爾霍恩, J·T·馬德爾 申請人:惠氏公司, 德克薩斯系統大學評議會