專利名稱：用于光動力療法的非極性光敏劑制劑的制作方法
背景技術：
1.發明領域本發明涉及包含替莫泊芬(Temoporfin)或其他非極性光敏劑的脂質體制劑的制品以及其在治療，尤其使用靜脈注射中的應用。
2.發明公開陳述脂質體是用水-間隔隔離的同心脂雙層組成的人造囊且已經作為給藥介質而廣泛地研究。由于其結構、化學組成和膠體大小，所有的這些都可以通過制備方法很好地控制，脂質體表現出一些可用于不同應用的特性。最重要的特性是膠體的大小，即在20nm至10μm范圍內相當均勻的顆粒大小分布，以及特殊的膜和表面特性。
由于其可滿足一些不同的目的，脂質體被用作用于藥物和抗原的載體(Storm & Crommelin，Pharmaceutical Science & Technology Today，1，19-31 1998)。包封藥物的脂質體對于代謝酶是難以達到的。相反，人體組分(例如注射部位的紅細胞或組織)并不直接暴露于該足劑量的藥物。藥物作用的持續時間可通過脂質體得以延長，因為所述藥物在體內的緩釋。脂質體具有定向能力，其意味著靶向選擇改變了人體中藥物的分布。細胞利用內吞作用或吞噬作用機制攝取脂質體進入細胞溶質。此外脂質體可保護藥物免受降解(例如代謝降解)。盡管有時是成功的，脂質體還是有限制。脂質體不僅遞送藥物至疾病組織，而且快速進入肝臟、脾臟、腎和網狀內皮系統，并且在循環中泄漏藥物(Harris & Chess，Nature，March 2003，2，214-221)。
聚乙二醇化是克服這些不足的一個替代方法。首先，聚乙二醇化在治療的最佳時間內維持藥物水平比較久的時期并且提供藥物作為長久-循環的部分，其逐步降解為較小的、更具活性的和/或較易清除的碎片。其次，其能使包含微顆粒或大分子的藥物長久-循環在具有感染的脈管系統或受體表達的病理位置慢慢積累并且改善或增強那些區域中的藥物遞送。第三，其可促進那些靶藥物和藥物載體實現更好的靶向效應，其應當隨著減少的血流量或低濃度靶抗原而到達病理區域。聚乙二醇化的益處一般引起提高的穩定性(溫度、pH、溶劑等等)、明顯降低的免疫原性和抗原性、對蛋白酶類的抗性、催化活性的維持和溶解度的改善，以及其他一些特征，提高的產物液態穩定性和降低的刺激誘導的凝集。
包含雙層-親和種類的脂質體膜例如聚(乙二醇)-連接的類脂(PEG-類脂)或神經節苷脂正用于制備隱形脂質體(Papahadjopoulos等.，PNAS，88，11460-4 1991)。隱形脂質體在血液循環中具有比較長的半衰期并且在體內呈現改變的生物分布。Vaage等.(Int.J.of Cancer51，942-8，1992)制備了阿霉素的隱形脂質體并且利用其治療新近植入的和很好建立的正生長中的原發小鼠癌，并且用于抑制來自乳腺-內腫瘤植入物自發轉移的發展。他們推斷阿霉素制劑隱形脂質體的長循環時間證明了其優良的療效。立體穩定的脂質體雙層膜中來自MPEG(聚乙二醇化的)類脂的存在有效地提供了與血漿蛋白和細胞表面受體相互作用的空間位阻，所述細胞表面受體負責常規脂質體i.v.給藥后所見的快速血管內的去穩定作用/破裂以及RES的清除。因此，聚乙二醇化的脂質體具有延長的循環半衰期，并且任何所包含制劑的藥代動力學改變至與脂質體載體的一致而不是與截留的藥物一致(Stewart等.，J.Clin.Oncol.16，683-691，1998)。由于聚乙二醇化脂質體的腫瘤定位機制是依靠腫瘤中滲漏血管的外滲(Northfelt等.，J.Clin.Oncol.16，2445-2451，1998；Muggia等.，J.Clin.Oncol.15，987-993，1997)，延長的循環很可能通過提高聚乙二醇化脂質體通過腫瘤脈管系統的總數而利于在腫瘤中的累積。
光動力療法(PDT)是一種正被研究用于各種醫療應用的最有前途的新技術并且以用于腫瘤破壞的廣泛認可的療法而熟知(″Pharmaceutical development and medical applications ofporphyrin-type macrocycles″，T.D.Mody，J.Porphyrins Phthalocyanines，4，362-367 2000)。PDT另一個重要的應用為因致病微生物包括皮膚、牙齒、化膿性、呼吸、胃腸炎、生殖及其他感染的傳染病的治療。
傳染病治療中的常見問題是用于疾病治療的制劑特異性的缺乏，其導致患者從治療中獲得新的一組疾病。
由于光敏劑的固有特性，用于各種類型疾病治療的PDT的用途是有限的。其包括高成本、在宿主生物體中延長的滯留、相當的皮膚光毒性、本底毒性、生理溶液中的低溶解度(由于其可引起血栓意外而降低了用于血管內給藥的有效性)以及低的靶向有效性。這些缺點導致光敏劑極高劑量的給藥，其顯著提高光敏劑在非-損傷組織中累積的可能性以及伴隨的感染非-損傷部位的風險。
一種提高光敏劑特異性和PDT有效性的預期的方法為光敏劑與配體-載體的偶聯，所述配體-載體特異地結合至靶細胞表面上的受體。許多靶細胞識別的天然的或合成的分子可用作上述載體。該方法目前用于腫瘤治療的新一代光敏劑的設計(″Porphyrin-based photosensitizersfor use in photodynamic therapy″E.D.Sternberg，D.Dolphin，C.Brueckner，Tetrahedron，54，4151-4202 1998)。
通過將光敏劑靶向腫瘤細胞而提高腫瘤選擇性的另一個方法是利用脂質體，例如轉鐵蛋白-偶聯的脂質體(Derycke & DeWitte，Int.J.Oncology 20，181-187，2002)。由于非-偶聯的脂質體非常容易識別并且由網狀內皮系統清除，使用PEG-基化的脂質體(Woodle & Lasic，Sterically stabilized liposomes，Biochim Biophys Acta 1113，171-199，1992；Dass等.，Enhanced anticancer therapy mediated by specializedliposomes.J Pharm Pharmacol 49，972-975，1997)。
由于癌癥及其他疾病治療中光動力療法的應用的快速發展，因此存在對新光敏劑制劑的更大需求。這些新的光敏劑制劑必須更穩定、易于制造和運用。此外，特別是更疏水的非-極性光敏劑將能以有效的和選擇性的方式靶向至組織。
發明目的和概要本發明的一個目的是提供用于光動力療法(PDT)的改進的光敏劑制劑。
本發明的另一個目的是將非-極性的光敏劑摻入脂質體膜由此允許利用同樣的介質輸送非-極性的有極性的物質。
本發明進一步的目的是在冷凍干燥過程中通過添加單糖或多元醇作為防凍劑而保護含有摻入的非-極性光敏劑的脂質體構建體的結構和大小。
本發明的又一個目的是提供具有改良的藥代動力學特性的光敏劑制劑。
本發明還有的另一個目的是改善非極性光敏劑通過細胞膜的運輸并且由此提高PDT的效力。
本發明涉及包含非-極性卟啉光敏劑和一種或多種磷脂的用于光動力療法的藥物脂質體制劑，其在不需要冷凍干燥的條件下貯存就是穩定的。該脂質體制劑提供用于靜脈內給藥的治療有效量的光敏劑。該磷脂可通過聚乙二醇化修飾，即其包含聚乙二醇作為磷脂的組成部分。所形成的脂質體在膜內包含非-極性的光敏劑并且可用于非-極性的光敏劑和第二個極性物質的聯合靶向。當制劑包括單糖或多元醇存在時，其能以保留脂質體介質的大小和治療有效量光敏劑的含量而有效地冷凍干燥。本發明還涉及用水性介質重建形成的脂質體組合物。用合適的水性介質重建后的冷凍干燥制劑形成脂質體，其也可用于靜脈內給藥。
本發明的上述及其他目的、特性和優點將根據下列連同附圖的
的閱讀的而變得很明顯。
附圖簡述圖1是脂質體配制的mTHPC的凝膠過濾曲線。脂類組分和mTHPC在所有收集的級分中都呈現相同的分布。
圖2顯示用mTHPC、產物A和B以0.5mg/kg靜脈注射裸露的Swiss無胸腺(nu/nu)小鼠而作為注射后時間函數給出的在腫瘤中的累積的結腸癌(Colo)26腫瘤光-誘導熒光(LIF)的測量。
圖3顯示產品A、B和mTHPC靜脈注射后6h的PDT-效應。小鼠在PDT治療后立即用伊文思藍(Evansblue)(1％)經腹膜(i.p.)注射且在24h后處死。
優選實施方案的詳述如下描述包含非-極性卟啉光敏劑和一種或多種磷脂的用于光動力療法的藥物脂質體制劑，其在不需要冷凍干燥的條件下貯存就是穩定的。該脂質體制劑提供用于靜脈內給藥的治療有效量的光敏劑。該磷脂可通過聚乙二醇化修飾，即其包含聚乙二醇作為磷脂的組成部分。所形成的脂質體在膜內包含非-極性的光敏劑并且可用于非-極性的光敏劑和第二個極性物質的聯合靶向。
該制劑可通過利用單糖或多元醇的冷凍干燥過程保存，但并不需要具有很穩定的保存期限。加工周期保留了脂質體介質的大小以及光敏化合物的膜含量。
本發明中的非-極性光敏劑包括已知基于卟啉的化合物。尤其方便用于本發明實際中的光敏劑基于卟啉大環光敏劑，其包括次卟啉、本卟啉、原卟啉、血卟啉、脫鎂葉綠甲酯一酸和其衍生物，特別是二-四氫化卟啉，其具有最大范圍640-780nm的光吸收。
磷脂可經或不經聚乙二醇化修飾(包含聚乙二醇作為組成部分)。所形成的脂質體在膜內包含非-極性的光敏劑并且可用于非-極性的光敏劑和第二個極性物質的聯合靶向。
該光敏制劑可用于將非-極性的光敏劑分子靶向不需要的細胞或組織或其他不想要的材料且，用合適的光源照射后可破壞該靶目標。該光敏制劑也可用于通過在無或有該光敏劑有限的光化學激活時利用熒光成像方法監測不需要的細胞或組織或其他不想要的材料。
本發明的脂質體制劑尤其可用于運輸非-極性的光敏劑。非-極性的物質結合在介質的膜內，由此產生易于打開的結構，釋放光敏劑直接作用于細胞膜。該機制將光敏劑直接遞送至細胞膜系統，一個優選的作用位置。因此通過用合適的外界光源的照明有效活化的光敏劑可不可逆地破壞不需要的細胞、組織或其他的結構。
常規構建的脂質體制劑用于運輸截留在介質腔部分的一些化合物。本發明在于一個脂質體內兩個不同運輸部分的組合，允許非-極性和有極性物質的聯合運輸。以這種方法，通過將光敏劑駐留在膜內，光敏制劑有效地靶向至其作用位點，而脂質體顆粒內的腔部分保持空的用于容納其他物質，包括那些可能對治療有有利作用的藥物。
此外，單糖如葡萄糖和附著于磷脂的光敏劑的組合是一個很好的手段，用于在利用生理學上常見的碳水化合物代替二糖的冷凍干燥和再水化過程中保留脂質體的大小。
該可變的原理允許對治療有效的物質的添加。兩種或更多物質和一種介質內膜結合的光敏劑的組合將允許直接或間接地影響靶細胞的氧含量由此影響光動力療法的效力。例如，可通過添加酶活抑制劑如哺乳動物硫氧還蛋白還原酶(TrxR)的抑制劑而實現上述結果。因此，僅在有效達到靶細胞的細胞質后，通常充當抗氧化劑的抑制劑將阻斷Trx/TrxR途徑。
實施例1包含m-THPC的脂質體的制備mTHPC(替莫泊芬)如專利4,992,257和5,162,519中所述而合成，此處引入作為參考。
脂質體根據以下常規步驟制備非-極性的光敏劑，維生素棕櫚酸和磷脂溶于氯仿/甲醇中。隨后利用旋轉蒸發器真空干燥溶液直至通過氣相色譜法再也檢測不到氯仿/甲醇混合物。加入注射用水以在50℃再水化脂類膜至少2小時。混合物隨后經過使用100納米終孔徑大小的均質器過濾系統。可選的是，再水化的水添加單糖或多元醇。收集濾液，裝滿小瓶且可選擇凍干。給藥前凍干組合物用注射用水重建。
利用上述步驟，如下制備一些脂質體制劑的不同制品實施例1a組分 量％w/vmTHPC 0.05至0.15二棕櫚酰基磷脂酰膽堿 0.5至2.0二棕櫚酰基磷脂酰甘油 0.05至0.2聚乙二醇化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 0.05至0.2棕櫚酸抗壞血酸酯 0.002至0.004注射用水 根據需要達到上述所需的濃度實施例1b組分量％w/vmTHPC 0.05至0.15二棕櫚酰基磷脂酰膽堿0.5至2.0二棕櫚酰基磷脂酰甘油0.05至0.2棕櫚酸抗壞血酸酯0.002至0.004注射用水根據需要達到上述所需的濃度實施例1c組分量％w/vmTHPC 0.05至0.15二棕櫚酰基磷脂酰膽堿0.5至2.0二棕櫚酰基磷脂酰甘油0.05至0.2葡萄糖 2.0至12.0棕櫚酸抗壞血酸酯0.002至0.004注射用水根據需要達到上述所需的濃度在本發明的他們的使用中發現所有的都作用良好。
實施例2脂質體m-THPC的物理和化學穩定性該脂質體制劑的物理穩定性通過經光量子關聯能譜法監測顆粒大小分布而測定。
脂質體mTHPC的穩定性儲藏條件平均顆粒大小分布(nm)初始16623℃-1個月 17723℃-4個月 167
實施例3制劑脂質體雙層內mTHPC的定位在SephadexG50柱上進行脂質體制劑的凝膠過濾。如圖1所示，所有組分中脂類和mTHPC呈現相同的分布，表明兩種組分物理上的相互作用，即mTHPC整合入膜雙層。如表1和2所示，在經超聲破碎脂質體結構后該分布沒有明顯改變。
實施例4小鼠的藥代動力學特性使用Colo26，一種非-轉移的小鼠結腸直腸的腫瘤細胞系，與Balb/c小鼠同源。
95％空氣和5％CO2中，細胞在添加10％熱-滅活的胎牛血清、1％鏈霉素-青霉素和200mM L-谷氨酰胺的Roswell Park Memorial Institute(RPM1)-1640培養基中以單層培養物37℃下培養。
六個-星期的無胸腺雌性小鼠(Swiss，nu/nu)用2×106的Colo26細胞皮下接種入右后足中。兩周后，當腫瘤達到5-7mm直徑時，m-THPC制劑(0.5mg/kg)經靜脈注射。
非-侵襲性的LIF測量在三個不同的部位進行腫瘤皮上、左后足對稱的正常組織的皮上和藥物給藥后不同時期隆起的皮膚。在選定的時間點處死小鼠且以直接接觸測定來自腫瘤和正常組織的熒光信號。
圖2顯示在四個小鼠中測定的作為注射后時間函數的mTHPC、產物A和B在腫瘤中的累積。非-侵襲性測量證實了在第24小時相比正常組織的最佳比率(1.3)，腫瘤中mTHPC的更多累積的趨勢。在注射后24h和48h，以腫瘤和肌肉直接接觸進行的侵襲測量分別得到2.7和3.0的比率。
在一只小鼠中用藥后0.5h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h和72h進行產物A的測量。產品A顯示與mTHPC類似的藥代動力學性能。相比mTHPC，腫瘤組織中最高的熒光強度在注射后的4小時后達到。
在一只小鼠中用藥后0.5h、4h、6h、8h、12h、24h、36h、48h和72h進行產物B的測量。腫瘤中最高的熒光強度在i.v.注射后的8小時測到。與mTHPC相比產物B顯示完全不同的藥代動力學特性。腫瘤中產物B的濃度比mTHPC增加得更快(16h)。
實施例5脂質體m-THPC的抗癌活性使用Colo26，一種非-轉移的小鼠結腸直腸的腫瘤細胞系，與Balb/c小鼠同源。
95％空氣和5％CO2中，細胞在添加10％熱-滅活的胎牛血清、1％鏈霉素-青霉素和200mML-谷氨酰胺的Roswell Park Memorial Institute(RPM1)-1640培養基中以單層培養物37℃下培養。
六個-星期的無胸腺雌性小鼠(Swiss，nu/nu)用2×106的Colo26細胞皮下接種入右后足中。兩至三周后，當瘤達到10-13mm直徑時，經靜脈注射m-THPC制劑(0.5mg/kg)。除非另有陳述，每種產物的每組3只小鼠用于每次PDT后。
a.光動力治療對產物如mTHPC、產物A(脂質體和m-THPC)和產物B(PEG-化的脂質體和m-THPC)使用0.5h、4h、6h、72h的藥物-光照間隔(DLI)。每個動物經氯胺酮(12.5mg/ml)的i.m.注射而麻醉，隨后利用發光二極管激光在10J/cm2的652nm以100mW/cm2進行光輻照。
b.PDT效力的評估形態學方法使用伊文思藍染色的方法評估PDT處理后的腫瘤組織壞死。
PDT處理后立即用伊文思藍(1％)i.p.(0.25ml)注射小鼠。
24小時后小鼠以過量氟烷處死，摘除腫瘤且縱向切割。如圖3中例示的，拍取整個腫瘤和腫瘤切片的照片。
未染色的壞死區認為是腫瘤損傷i.藥物-光照間隔(DLI)＝0.5h，未觀察到與所用的產物無關的壞死。
ii.藥物-光照間隔(DLI)＝4h。用mTHPC-PDT處理的三只小鼠表明部分的腫瘤壞死。用產物A處理的兩只小鼠顯示部分的腫瘤壞死，而第三只小鼠的腫瘤完好無損。用產物B-PDT處理的三只小鼠顯示腫瘤壞死兩只小鼠中觀察到明顯的腫瘤壞死，而另一只中腫瘤壞死是部分的。
iii.藥物-光照間隔(DLI)＝6h；六只小鼠用于產物A。用產物A處理的兩只小鼠腫瘤中看到明顯的壞死而其它四只是完好的。對于產物B，在所有的小鼠中觀察到明顯的腫瘤壞死。用mTHPC-PDT處理的兩個腫瘤顯示明顯的壞死，另一個腫瘤無壞死。呈現壞死的mTHPC-PDT腫瘤經目測證實。
雖然已經參照附圖描述了本發明的優選實施方案，然而應當明白，本發明并不局限于這些明確的實施方案，對于本領域熟練技術人員來說，在不背離由所附權利要求限定的本發明的精神或范圍的情況下，能夠進行多種改變和修飾。
權利要求
1.一種包括脂質體雙層的用于光動力療法的藥物脂質體制劑，其基本上由磷脂和治療有效量的非-極性光敏劑組成。
2.根據權利要求1的脂質體制劑，其中所述磷脂選自二棕櫚酰基磷脂酰膽堿、二棕櫚酰基磷脂酰甘油、聚(乙二醇)-連接的磷脂和這三種材料的組合。
3.根據權利要求1所述的脂質體制劑，其中所述光敏劑為卟啉大環光敏劑。
4.根據權利要求1的脂質體制劑，其中所述卟啉大環光敏劑選自次卟啉、本卟啉、原卟啉、血卟啉、脫鎂葉綠甲酯一酸和其二-和四-氫化卟啉衍生物。
5.根據權利要求1的脂質體制劑，其已被凍干，進一步包括一種或多種單糖或多元醇，并且在凍干的制劑中添加了合適的水性介質后形成在脂質體雙層內包含治療有效量的非-極性光敏劑的脂質體。
6.根據權利要求5的脂質體制劑，其中所述單糖選自葡萄糖和果糖。
7.根據權利要求5的脂質體制劑，其中所述多元醇選自肌醇和甘露糖醇。
8.根據權利要求5的脂質體制劑，其中單糖和磷脂的濃度比在1∶2和1∶12之間。
9.根據權利要求5的脂質體制劑，其中多元醇和磷脂的濃度比在1∶2和1∶12之間。
10.根據權利要求5的脂質體制劑，用水性液體重建用于藥物給藥。
11.根據權利要求1的脂質體制劑，其中光敏劑的治療有效濃度為0.0001至0.15w/v百分比。
12.根據權利要求5的脂質體制劑，其中光敏劑的治療有效濃度為0.0001至0.15w/v百分比。
13.根據權利要求1的脂質體制劑，進一步包括選自2，6-二叔丁基對甲酚、棕櫚酸抗壞血酸酯及其二者的組合的組分。
14.根據權利要求5的脂質體制劑，進一步包括選自2，6-二叔丁基對甲酚、棕櫚酸抗壞血酸酯及其二者的組合的組分。
15.根據權利要求1的脂質體制劑，其中該制劑進一步包括至少一種其它藥學活性物質，尤其是極性的、適合在預選的療法中具有一些有利效果的物質。
16.根據權利要求5的脂質體制劑，其中該制劑進一步包括至少一種其它藥學活性物質，尤其是極性的、適合在預選的療法中具有一些有利效果的物質。
全文摘要
本發明描述了包含非極性卟啉光敏劑和一種或多種磷脂的用于光動力療法的藥物脂質體制劑，其在不需要冷凍干燥的條件下貯存就是穩定的。該脂質體制劑提供了用于靜脈內給藥的治療有效量的光敏劑。該磷脂可通過聚乙二醇化修飾，即其包含聚乙二醇作為磷脂的組成部分。所形成的脂質體在膜內包含非極性的光敏劑并且可用于非極性光敏劑和第二個極性物質的聯合靶向。當制劑包括單糖或多元醇時，其能以保留脂質體介質的大小和治療有效量光敏劑的含量而有效地冷凍干燥。本發明還涉及用水性介質重建后形成的脂質體組合物。用合適的水性介質重建的冷凍干燥制劑形成也可用于靜脈內給藥的脂質體。
文檔編號A61K41/00GK1842322SQ200480024452
公開日2006年10月4日 申請日期2004年6月23日 優先權日2003年8月26日
發明者福爾克爾·阿爾布雷希特, 阿爾弗雷德·法爾, 迪特里希·舍格爾曼, 蘇珊娜·格拉費, 沃爾夫岡格·諾伊貝格爾 申請人:塞拉莫普泰克工業公司