用作靶向線粒體的抗氧化劑的線粒體醌衍生物的制作方法

專利名稱：用作靶向線粒體的抗氧化劑的線粒體醌衍生物的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有親脂性陽離子基團的兩親性抗氧化化合物，以及這些化合物之有利于它們用作例如藥物的合成、組合物及理化性質。
背景技術：
氧化應激導致許多人類與衰老有關的退化性疾病(degenerativedisease)，如帕金森病、阿爾茨海默病以及亨庭頓氏舞蹈病(Huntington’sChorea)和弗里德賴希氏共濟失調(Friedreich’s Ataxia)，且導致隨衰老累積的非特異性損害(non-specific damage)。氧化應激還導致中風及心臟病發作時、以及器官移植和手術過程中的炎癥和缺血-再灌輸組織傷害。已經研發出許多抗氧化療法(antioxidant therapies)以預防氧化應激導致的損害。然而，這些療法中的多數并非靶向于細胞內，因而不能達到最佳療效。此外，許多這種抗氧化劑具有限制例如其生物利用度和其滲透至靶器官以發揮治療效果的能力的理化性質。
線粒體是負責能量代謝的細胞內細胞器。因此，線粒體缺陷損害特別是能量需求高的神經和肌肉組織。其還是在多數細胞內導致氧化應激的自由基和活性氧類的主要來源。因而，申請人認為將抗氧化劑選擇性地遞送至線粒體會比應用非靶向抗氧化劑更有效。從而，本發明的目的是提供可靶向于線粒體的抗氧化劑。
親脂性陽離子因其具有正電荷從而可在線粒體基質內累積(Rottenberg，1979 Methods Enzymol 55，547.Chen，1988 Ann Rev CellBiol 4，155)。倘若這種離子具有足夠高的親脂性以屏蔽(screen)正電荷或使其在較大的表面區域離域(delocalise)，同時倘若不存在有效的流出通道且該陽離子不會被代謝或立即對細胞產生毒性，則它們得以累積。
因此，本發明的中心是一種途徑，通過該途徑可應用線粒體富集特定親脂性陽離子而吸收(take up)其連接的抗氧化劑的能力以使抗氧化劑靶向于導致氧化應激的自由基和活性氧類的主要來源。
在體內表現良好的抗氧化劑活性但卻對體內目標隔室(targetcompartment)抗氧化劑功能差的抗氧化化合物的實例包括輔酶Q(CoQ)和艾地苯醌。這兩種化合物都具有低的生物利用度，要發揮功效必須以非常高的劑量率給藥，因此與所給藥的劑量率相比，其治療效能低。
不期望受任何理論所限，我們認為對于抗氧化化合物而言，體外的活性(如抗氧化活性或線粒體累積)決不是體內抗氧化功能和/或效能(如治療效能)的唯一決定因素。同時，要用作本發明靶向線粒體的抗氧化化合物，抗氧化化合物必須顯示適宜的體外抗氧化劑活性；并且，要在體內具有效能，該靶向線粒體的抗氧化化合物必須顯示其它理想的理化性質，例如適宜的生物利用度、在目標線粒體內的適當定位和分布、和/或適宜的穩定性。
不期望受任何理論所限，我們認為本發明靶向線粒體的抗氧化化合物之所以顯示出有利的抗氧化功能、包括生物利用度和/或體內靶向線粒體和累積，至少部分是由于它們的理化性質，舉例而言，它們的兩親性、它們的物理結構和/或大小、和/或低至中等的疏水性和/或分配系數。從而，這些化合物在相對其它抗氧化化合物較低的劑量率下具有治療效能。
在以化合物線粒體醌醇(mitoquinol)和線粒體醌(mitoquinone)(此處統稱為線粒體醌/線粒體醌醇)作為例證的美國專利No.6331532中公開了抗氧化劑依賴共價地結合至抗氧化部分的親脂性陽離子而靶向于線粒體的前景。其中的示例化合物(不管橋長概括為多少)是具有碳橋長為10(即C10橋)的如下結構式的化合物線粒體醌。
其還原形式線粒體醌醇也是C10橋連的。
盡管線粒體醌/線粒體醌醇在體內及體外具有優異的抗氧化活性和線粒體內靶向及累積，但是我們發現其溴化物鹽有些不穩定。我們還發現美國專利No.6,331,532中公開的線粒體醌/線粒體醌醇的理化性質不適用于藥物劑型，例如口服給藥或胃腸道外給藥的藥物劑型和/或使化合物靶向內部器官(如腦、心臟、肝臟或其它器官)組織內的線粒體的藥物劑型。
本發明化合物的實例適于藥物劑型。盡管它們可為晶體和/或固體形式以外的形式，但是可通過與其它物質如載體、賦形劑、復合劑(complexation agent)或其它添加劑等如環糊精混合形成固體形式。有利的是，這些物質是藥物學可接受的。
我們已決定期望提供本發明的兩親性靶向線粒體的抗氧化化合物的實例，其正電荷與適宜的陰離子結合以提供總體而言中性的鹽形式的化合物，包括固體或晶體產品。然而，在上述鹽形式中，我們發現某些成鹽陰離子(salt forming anion)應最好避免，因為它們顯示出不利于抗氧化化合物的活性，如不利于抗氧化部分、不利于連接部分或不利于親脂性陽離子部分的活性，和/或可導致抗氧化部分處或抗氧化部分的裂解。其它成鹽陰離子被認為是不適于藥物學應用的。例如，由于藥物學或環境不可接受，制藥公司一般認為硝酸鹽部分不適用，同時，我們發現通常用于上述化合物成鹽的溴化氫具有親核性質，可導致不利于抗氧化部分的反應性，例如甲基從此處通式II化合物的抗氧化部分裂解、和/或總化合物穩定性的某些整體上的降低。例如，我們已經確定線粒體醌的溴鹽有些不穩定。
因此，我們認為靶向線粒體的抗氧化劑的鹽形式，包括液體、固體或晶體形式的鹽形式，最好與陰離子部分或不親核的類似部分連接、和/與不顯示以下反應性的部分連接，該反應性不利于任何構成抗氧化化合物或復合物的部分。還優選該陰離子是藥物學可接受的。
發明目的因此，本發明的目的是提供藥物學可接受的兩親性抗氧化化合物以及依靠所述化合物的、可例如用于治療與氧化應激相關的疾病或病癥的組合物、劑型和方法，或向公眾提供一種有益的選擇。

發明內容
第一方面，本發明在于一種化合物，其包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中所述陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
在一個具體實施方案中，抗氧化部分是醌或醌醇。
在另一具體實施方案中，抗氧化部分選自包括以下物質的組中維生素E和維生素E衍生物、鏈斷裂抗氧化劑(chain breaking antioxidant)包括丁基化的羥基苯甲醚、丁基化的羥基甲苯、常規自由基捕獲劑包括衍生化的富勒烯、自旋捕獲劑包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亞硝基苯、tert-亞硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相關化合物的衍生物。
在一個具體實施方案中，親脂性陽離子部分是取代或未取代的三苯基鏻陽離子。
在一個具體實施方案中，化合物如通式I和/或其醌醇形式所示， 其中R1、R2和R3可相同或不同，選自(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是從約2到約20的整數，其中Z是非反應性的陰離子。
優選地，Z選自以下組中烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
優選地，(C)n橋中的各個C都是飽和的。
在一個優選的具體實施方案中，化合物如下式和/或其醌醇形式所示， 其中Z是非親核性陰離子。
更優選地，化合物如式III所示
另一方面，本發明提供一種包括以下化合物的藥物組合物，該化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中所述陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
在一個具體實施方案中，抗氧化部分是醌或醌醇。
在另一具體實施方案中，抗氧化部分選自包括以下物質的組中維生素E和維生素E衍生物、鏈斷裂抗氧化劑包括丁基化的羥基苯甲醚、丁基化的羥基甲苯、常規自由基捕獲劑包括衍生化的富勒烯、自旋捕獲劑包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亞硝基苯、tert-亞硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相關化合物的衍生物。
在一個具體實施方案中，親脂性陽離子部分是取代或未取代的三苯基鏻陽離子。
在一個具體實施方案中，化合物如通式I和/或其醌醇形式所示，
其中R1、R2和R3可相同或不同，選自(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是從約2到約20的整數，其中Z是非反應性陰離子。
優選地，Z選自以下組中烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
優選地，(C)n橋中的各個C都是飽和的。
在另一具體實施方案中，化合物如下式和/或其醌醇形式所示， 其中Z是非親核性陰離子。
在另一具體實施方案中，組合物包含如式II和/或其醌醇形式所示的化合物，其中Z是非親核性陰離子，并且其中所述組合物中包含環糊精。
在不同的實施例中，化合物與環糊精的摩爾比是約10∶1到約1∶10、約5∶1到約1∶5、約4∶1到約1∶4、約2∶1到約1∶2或約1∶1，例如化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
更優選地，組合物包含如式III所示的化合物， 其中環糊精為β-環糊精，更優選地，化合物與環糊精的摩爾比為約1∶2。
在一個具體實施方案中，藥物組合物被配制用于口服給藥。
在另一具體實施方案中，藥物組合物被配制用于胃腸道外給藥。
另一方面，本發明提供一種包含以下化合物以及任意的藥物學可接受的稀釋劑和/或載體和/或賦形劑的劑量單位，該化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中所述陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
在一個具體實施方案中，抗氧化部分是醌或醌醇。
在另一具體實施方案中，抗氧化部分選自包括以下物質的組中維生素E和維生素E衍生物、鏈斷裂抗氧化劑包括丁基化的羥基苯甲醚、丁基化的羥基甲苯、常規自由基捕獲劑包括衍生化的富勒烯、自旋捕獲劑包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亞硝基苯、tert-亞硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相關化合物的衍生物。
在一個具體實施方案中，親脂性陽離子部分是取代或未取代的三苯基鏻陽離子。
在一個具體實施方案中，化合物如通式I和/或其醌醇形式所示， 其中R1、R2和R3可相同或不同，選自(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是從約2到約20的整數，其中Z是非反應性陰離子。
優選地，Z選自以下組中烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
優選地，(C)n橋中的各個C都是飽和的。
在另一具體實施方案中，化合物如下式和/或其醌醇形式所示， 其中Z是非親核性陰離子。
在另一具體實施方案中，劑量單位包含如式II和/或其醌醇形式所示的化合物，其中Z是非親核性陰離子，并且其中該組合物含有環糊精。
在不同的實施例中，化合物與環糊精的摩爾比是約10∶1到約1∶10、約5∶1到約1∶5、約4∶1到約1∶4、約2∶1到約1∶2或約1∶1，例如化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
更優選地，該劑量單位包含如式III所示的化合物， 其中環糊精為β-環糊精，更優選地，化合物與環糊精的摩爾比為約1∶2。
在一個具體實施方案中，劑量單位適于口服給藥。
在另一具體實施方案中，劑量單位適于胃腸道外給藥。
另一發面，本發明提供通過向哺乳動物給藥本發明化合物或其鹽以用于預防或治療所述哺乳動物氧化應激的本發明的化合物或其藥物學可接受的鹽、組合物或劑型。
在一個具體實施方案中，化合物是如式II所示的化合物或其藥物學可接受的鹽。
在另一具體實施方案中，所述給藥在第一天的劑量為日常維持劑量的約1.02到約2.0倍，隨后在后續日中以日常維持劑量給藥所述化合物或其鹽。
優選地，所述鹽為甲磺酸鹽，且所述化合物與環糊精結合。
更優選地，所述化合物如下式所示
優選地，所述環糊精為β-環糊精，更優選地，所述化合物與環糊精的摩爾比為約1∶2。
另一發面，本發明提供通過向哺乳動物給藥本發明化合物或其鹽以用于預防或治療所述哺乳動物衰老癥狀的本發明化合物或其藥物學可接受的鹽、組合物或劑型。
在一個具體實施方案中，所述化合物是如式II所示的化合物或其藥物學可接受的鹽。
在另一具體實施方案中，所述給藥在第一天的劑量為日常維持劑量的約1.02到約2.0倍，隨后在后續日中以日常維持劑量給藥所述化合物或其鹽。

優選地，所述鹽為甲磺酸鹽，且所述化合物與環糊精結合。
更優選地，化合物如下式所示 優選地，所述環糊精為β-環糊精，更優選地，所述化合物與環糊精的摩爾比為約1∶2。
另一方面，本發明在于一種包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分和所述陽離子部分的陰離子補體的穩定的化合物，其中所述陽離子部分可使抗氧化劑靶向于線粒體，且所述陰離子補體不為鹵素離子，且所述陰離子補體是非親核性的，和/或所述陰離子補體不顯示不利于陽離子部分、連接部分或抗氧化部分的反應性。
在一個具體實施方案中，所述抗氧化部分是醌或醌醇。
在另一具體實施方案中，抗氧化部分選自包括以下物質的組中維生素E和維生素E衍生物、鏈斷裂抗氧化劑包括丁基化的羥基苯甲醚、丁基化的羥基甲苯、常規自由基捕獲劑包括衍生化的富勒烯、自旋捕獲劑包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亞硝基苯、tert-亞硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相關化合物的衍生物。
在一個具體實施方案中，所述親脂性陽離子部分是取代或未取代的三苯基鏻陽離子。
在一個具體實施方案中，所述化合物如通式I和/或其醌醇形式所示， 其中R1、R2和R3可相同或不同，選自(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是從約2到約20的整數，其中Z是非反應性的陰離子。
優選地，Z選自以下組中烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
優選(C)n橋中的每個C是飽和的。
在一個優選的具體實施方案中，所述化合物如下式和/或其醌醇形式所示， 其中Z是非親核性陰離子。
更優選地，所述化合物如式III所示 另一方面，本發明提供包含或包括一種穩定的化合物的藥物組合物，該穩定的化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的為親脂性陽離子部分的陽離子和所述陽離子部分的陰離子補體，其中所述陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，且所述陰離子補體不為鹵素離子，且所述陰離子補體是非親核性的，和/或所述陰離子補體不顯示不利于陽離子部分、連接部分或抗氧化部分的反應性。
在一個具體實施方案中，所述抗氧化部分是醌或醌醇。
在另一具體實施方案中，所述抗氧化部分選自包括以下物質的組中維生素E和維生素E衍生物、鏈斷裂抗氧化劑包括丁基化的羥基苯甲醚、丁基化的羥基甲苯、常規自由基捕獲劑包括衍生化的富勒烯、自旋捕獲劑包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亞硝基苯、tert-亞硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相關化合物的衍生物。
在一個具體實施方案中，所述親脂性陽離子部分是取代或未取代的三苯基鏻陽離子。
在一個具體實施方案中，所述化合物如通式I和/或其醌醇形式所示， 其中R1、R2和R3可相同或不同，選自(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是從約2到約20的整數，其中Z是非反應性的陰離子。
優選地，Z選自以下組中烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
優選地，(C)n橋中的各個C都是飽和的。
在另一具體實施方案中，所述化合物如下式和/或其醌醇形式所示， 其中Z是非親核性陰離子。
在另一具體實施方案中，所述組合物包含如式II和/或其醌醇形式所示的化合物，其中Z是非親核性陰離子，且其中所述組合物含有環糊精。
在不同的實施例中，化合物與環糊精的摩爾比是約10∶1到約1∶10、約5∶1到約1∶5、約4∶1到約1∶4、約2∶1到約1∶2或約1∶1，例如化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
更優選地，所述組合物包含如下式所示的化合物， 其中所述環糊精為β-環糊精，更優選地，所述化合物與環糊精的摩爾比為約1∶2。
在一個具體實施方案中，所述藥物組合物被配制用于口服給藥。
在另一具體實施方案中，所述藥物組合物被配制用于胃腸道外給藥。
另一方面，本發明由包含或包括一種穩定的化合物以及藥物學可接受的稀釋劑和/或載體和/或賦形劑的劑量單位組成，所述穩定的化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中所述陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，且所述陰離子補體不為鹵素離子，且所述陰離子補體是非親核性的，和/或所述陰離子補體不顯示不利于陽離子部分、連接部分或抗氧化部分的反應性。
在一個具體實施方案中，所述抗氧化部分是醌或醌醇。
在另一具體實施方案中，所述抗氧化部分選自包括以下物質的組中維生素E和維生素E衍生物、鏈斷裂抗氧化劑包括丁基化的羥基苯甲醚、丁基化的羥基甲苯、常規自由基捕獲劑包括衍生化的富勒烯、自旋捕獲劑包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亞硝基苯、tert-亞硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮以及相關化合物的衍生物。
在一個具體實施方案中，所述親脂性陽離子部分是取代或未取代的三苯基鏻陽離子。
在一個具體實施方案中，所述化合物如通式I和/或其醌醇形式所示， 其中R1、R2和R3可相同或不同，選自(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是從約2到約20的整數，其中Z是非反應性陰離子。
優選地，Z選自以下組中烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
優選地，(C)n橋中的各個C都是飽和的。
在另一具體實施方案中，所述化合物如下式和/或其醌醇形式所示，
其中Z是非親核性陰離子。
在另一具體實施方案中，所述劑量單位包含如式II和/或其醌醇形式所示的化合物，其中Z是非親核性陰離子，且其中所述組合物含有環糊精。
在不同的實施例中，化合物與環糊精的摩爾比是約10∶1到約1∶10、約5∶1到約1∶5、約4∶1到約1∶4、約2∶1到約1∶2或約1∶1，例如化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
更優選地，所述劑量單位包含如下式所示的化合物， 其中所述環糊精為β-環糊精，更優選地，所述化合物與環糊精的摩爾比為約1∶2。
在一個具體實施方案中，所述劑量單位適于口服給藥。
在另一具體實施方案中，所述劑量單位適于胃腸道外給藥。
另一方面，本發明在于適于口服給藥的劑量單位，其包括本發明化合物作為有效成分，所述化合物為或被配制成晶體形式和/或非液體形式。
另一方面，本發明在于包括本發明化合物作為有效成分的適于胃腸道外給藥的劑量單位。
另一方面，本發明提供一種適于治療可受益于氧化應激減少或衰老癥狀減少的患者的藥物組合物，其包括或包含與一種或多種藥物學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑結合的有效量的本發明化合物。
在一個具體實施方案中，所述化合物是式I的化合物。
在一個實施例中，所述化合物與環糊精復合。
在不同的實施例中，所述化合物與環糊精的摩爾比是約10∶1到約1∶10、約5∶1到約1∶5、約4∶1到約1∶4、約2∶1到約1∶2或約1∶1，例如所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
更優選地，所述化合物是式(III)的化合物且所述環糊精為β-環糊精，更優選地，所述化合物與環糊精的摩爾比為約1∶2。
另一方面，本發明提供減少細胞內氧化應激的方法，其包括使所述細胞接觸本發明化合物的步驟。
在一個具體實施方案中，該化合物是式I的化合物。
在一個實施例中，該化合物與環糊精復合。
在不同的實施例中，所述化合物與環糊精的摩爾比是約10∶1到約1∶10、約5∶1到約1∶5、約4∶1到約1∶4、約2∶1到約1∶2或約1∶1，例如化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
更優選地，所述化合物是如式(III)所示的化合物，且所述環糊精為β-環糊精，更優選地，所述化合物與環糊精的摩爾比為約1∶2。
在一個具體實施方案中，所述藥物組合物被配制用于口服給藥。
在另一具體實施方案中，藥物組合物被配制用于胃腸道外給藥。
另一方面，本發明提供一種適于治療患有或易患帕金森病、阿爾茨海默病、亨庭頓氏舞蹈病或弗里德賴希氏共濟失調的患者的藥物組合物，其包括或包含與一種或多種藥物學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑結合的有效量的本發明化合物。
優選地，所述治療是對患有或易患弗里德賴希氏共濟失調的患者的治療。
另一方面，本發明提供治療或預防可受益于氧化應激減少的患者的方法，其包括或包含向所述患者給藥本發明化合物的步驟。
在一個具體實施方案中，該化合物是式I的化合物。
在一個實施例中，該化合物與環糊精復合。
在不同的實施例中，所述化合物與環糊精的摩爾比是約10∶1到約1∶10、約5∶1到約1∶5、約4∶1到約1∶4、約2∶1到約1∶2或約1∶1，例如所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
更優選地，所述化合物是式(III)的化合物，且所述環糊精為β-環糊精，更優選地，所述化合物與環糊精的摩爾比為約1∶2。
在一個具體實施方案中，所述的給藥是口服給藥。
在另一具體實施方案中，所述的給藥是胃腸道外給藥。
另一方面，本發明提供治療或預防可受益于氧化應激減少或衰老癥狀減少的患者的方法，其包括向患者給藥本發明化合物的步驟。
另一方面，本發明提供一種治療或預防患有或易患帕金森病、阿爾茨海默病、亨庭頓氏舞蹈病或弗里德賴希氏共濟失調的患者的方法，其包括或包含向所述患者給藥本發明化合物的步驟。
優選地，所述治療或預防方法是對患有或易患弗里德賴希氏共濟失調患者的治療或預防的方法。
另一方面，本發明提供減少細胞內氧化應激的方法，其包括向所述細胞給藥本發明的化合物。
另一方面，本發明提供如前所述的化合物在制備或制造可有效用于減少患者氧化應激的藥物、劑量單位或藥物組合物中的應用。
另一方面，本發明提供如前所述的化合物在制備或制造可有效用于減少患者衰老癥狀的藥物、劑量單位或藥物組合物中的應用。
另一方面，本發明提供本發明化合物在制備或制造可有效用于治療或預防患有或易患帕金森病、阿爾茨海默病、亨庭頓氏舞蹈病或弗里德賴希氏共濟失調的患者的藥物、劑量單位或藥物組合物中的應用，其包括或包含向所述患者給藥本發明化合物的步驟。
優選地，所述藥物、劑量單位或藥物組合物可有效用于治療或預防患有或易患弗里德賴希氏共濟失調的患者。
另一方面，本發明提供如前所述的化合物在制備或制造可有效用于減少細胞內氧化應激的藥物、劑量單位或藥物組合物中的應用。
優選地，所述制備或制造采用其它一種或多種物質，更優選地采用藥物學可接受的稀釋劑、賦形劑和/或載體。
另一方面，本發明在于合成具有式I(和/或其醌形式)的部分的化合物或式I(和/或其醌形式)的部分的方法， 其中R1、R2和R3可相同或不同，選自(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分，并且其中n是從約2到約20的整數，所述方法包含或包括與環糊精相混合。
優選地，(C)n橋中的各個C都是飽和的。
另一方面，本發明在于合成如下式所示的化合物的方法， 所述方法包含或包括與環糊精相混合。
另一方面，本發明在于基本上如此處所述的合成具有以下結構式的化合物的方法。
任何對本申請已包括的文獻、文字記錄(act)、物質、裝置、論文(article)等的討論目的只是為本發明提供背景。但不可因為其在本申請各權利要求優先權日之前存在就理解為承認任何或所有的這些內容構成本發明相關領域的現有技術基礎(prior art base)或公知常識的一部分。
貫穿這項申請的詞語“包括”，或其單數第三人稱或動名詞變體可理解為指含有所宣稱的要素、整數或步驟、或者要素組、整數組或步驟組，但并非排除任何其它的要素、整數或步驟、或者要素組、整數組或步驟組。
貫穿這項申請的術語“醌”，無論是單獨應用還是以其它術語作前綴用以描述化合物的氧化形式，都應理解為將該化合物的還原形式，即醌醇形式包括在其范圍內。類似地，例如通過結構描述提及的醌也將醌醇形式包括在其范圍內。
貫穿這項申請的術語“醌醇”，無論是單獨應用還是以其它術語作前綴用以描述化合物的還原形式，都應理解為將化合物的氧化形式，即醌形式包括在其范圍內。類似地，例如通過結構描述提及的醌醇也將醌形式包括在其范圍內。
此處所用的術語“和/或”包括作為選擇的“和”以及“或”。
此處所用的術語“分配系數”和“分配系數(辛醇∶水)”是指在25℃或37℃測定的辛-1-醇/磷酸鹽緩沖鹽溶液分配系數(參見Kelso，G.F.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，Hughes，G.Porteous，W.K.，Ledgerwood，E.C.，Smith，R.A.J.和Murphy，M.P.2001 J Biol Chem 276 4588.Smith，R.A.J.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.和Murphy，M.P.1999 Eu.J Biochem 263，709.Smith，R.A.J.，Porteous，C.M.，Gane，A.M.和Murphy，M.P.2003 Proc NatAcad Sci 100，5407.)，或是如Jauslin，M.L.，Wirth，T.，Meier，T.，和Schoumacher，F.，2002，Hum Mol Genet 11，3055所述采用AdvancedChemistry Development(ACD)Software Solaris V4.67所計算出的辛醇/水分配系數。
本文所用的短語“藥物制劑可接受的”其含義不僅包括有關藥事管理(phamaceutical administration)方面的可接受性，還涉及劑型的如可接受的穩定性、貯存期限、吸濕性、制備等。
此處所用的“非反應性陰離子”是指不顯示不利于抗氧化部分、親脂性陽離子或連接部分的反應性的陰離子。例如，若某該化合物部分包含親核進攻的目標，則所述陰離子是非親核性的。
雖然如上加以概括地定義，但是本發明并不僅限于此，其還包括以下說明書提供了實施例的具體實施方案。
特別地，在參考附圖后會更透徹地理解本發明。


圖1描述線粒體對兩親性抗氧化化合物的吸收，圖中所示為線粒體醌-C10被吸收至加以電壓的(energised)線粒體內。
圖2描述A線粒體醌-C3、B線粒體醌-C5、C線粒體醌-C15的合成途徑。
圖3描述線粒體醌抗氧化化合物及相關化合物TPMP的結構。以相同比例(the same scale)畫出的磷脂與線粒體醌抗氧化化合物排成一列以說明泛醌醇側鏈滲透至磷脂雙層的單層的潛在最大深度。ATPMP；B線粒體醌-C3；C線粒體醌-C5；D線粒體醌-C10；E線粒體醌-C15；F磷脂。
圖4所示圖顯示了使用離子選擇電極測量的線粒體對抗氧化化合物的吸收和結合。A線粒體醌-C3；B線粒體醌-C5；C線粒體醌-C10；D線粒體醌-C15。在左手邊(in the left hand panel)，在魚藤酮存在下提供線粒體(1mg蛋白/ml)，然后連續5次每次加入1μM(黑箭頭)抗氧化化合物以校準電極反應。在右手邊，首先通過連續5次每次加入1μM(黑箭頭)校準電極，然后加入線粒體(1mg蛋白/ml)。在所有情形下都加入琥珀酸鹽以產生膜電位，而加入FCCP消除膜電位。數據是重復至少2-3次的試驗的典型描繪圖(typical trace)。
圖5所示圖顯示了所述抗氧化化合物的抗氧化效能。A用琥珀酸鹽(黑色柱)加以電壓或者用由ATP、磷酸烯醇丙酮酸和丙酮酸激酶組成的ATP再生系統通過溫育(白色柱)向線粒體施以電壓。在與各種線粒體醌類似物、TPMP或載體預溫育30秒后，通過添加50μMFeCl2和300μM H2O2誘導氧化應激。在37℃下溫育15分鐘后，通過測量TBAR估計脂質過氧化作用。數據為兩次獨立試驗的平均值±極差(range)。線粒體醌-C5在ATP存在下對脂質過氧化作用具有輕微保護作用是因為一些添加自貯備液中的線粒體醌-C5以泛醌醇的形式存在。B由[3H]TPMP的累積測量由琥珀酸鹽或ATP再生系統誘導的線粒體膜電位。數據為對25分鐘溫育的兩次測定的平均值±極差。5分鐘溫育后的膜電位相同(數據未出示)。C測量抗氧化化合物抑制TBAR累積的濃度依賴性。所有的溫育在如A所述的琥珀酸鹽存在下進行。結果表達為TBARS形成的抑制％，取線粒體醌類似物不存在的情況下暴露于FeCl2/H2O2的樣品的值為0％抑制，及對照品(未加入FeCl2/H2O2)的值為100％。顯示的數據是用各濃度重復測定3次的典型滴定值±SD。D抑制脂質過氧化作用的IC50濃度。數據為從如C所示的三次獨立滴定所估計的平均值±標準誤差。應用Student雙側檢驗確定相對線粒體醌-C3的IC50的統計學顯著性*p＜0.05；**p＜0.005。
圖6顯示了線粒體醌-C10和線粒體醌-C3對冠狀竇血流量的作用。
圖7顯示了線粒體醌-C10和線粒體醌-C3對左室舒張壓的作用。
圖8顯示了線粒體醌-C10和線粒體醌-C3對心率的作用。
圖9顯示了左心室的變化率。
圖10顯示了線粒體醌-C10和線粒體醌-C3對缺血后線粒體呼吸功能的作用。
圖11顯示了透明玻璃瓶內的純線粒體醌-C10(批號No.3)在40℃，75％RH；25℃，50％RH和5℃硅石上的穩定性。
圖12圖示了線粒體醌-C10(批號No.4)在25℃，50％RH的穩定性。
圖13圖示了線粒體醌-C10與β-環糊精復合物(1∶1)在4℃硅石上；25℃，50％RH和40℃，75％RH的穩定性。
圖14圖示了線粒體醌-C10與β-環糊精復合物(1∶2)在4℃硅石上；25℃，50％RH和40℃，75％RH的穩定性。
圖15圖示了線粒體醌-C10與β-環糊精復合物(1∶4)在4℃硅石上；25℃，50％RH和40℃，75％RH的穩定性。
圖16顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽在水中的穩定性。
圖17顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽在0.01M HCl中的穩定性。
圖18顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽在pH 7.4的IPB中的穩定性。
圖19顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽在50％MeOH中的穩定性。
圖20顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽在40℃，75％RH；25℃，50％RH和藍硅膠上4℃的固態穩定性。
圖21顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物在水中的穩定性。
圖22顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物在0.01MHCl中的穩定性。
圖23顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物在pH7.4的IPB中的穩定性。
圖24顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物在50％MeOH中的穩定性。
圖25顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物在40℃，75％RH；在25℃，50％RH和藍硅膠上4℃的固態穩定性。
圖26顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物在水中的穩定性。
圖27顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物在0.01MHCl中的穩定性。
圖28顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物在pH7.4的IPB中的穩定性。
圖29顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物在50％MeOH中的穩定性。
圖30顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物在40℃，75％RH；25℃，50％RH和藍硅膠上4℃的固態穩定性。
圖31圖示了在向大鼠單次靜脈注射(A)(10mg/kg)和口服(B)(50mg/ml)給藥線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物中的線粒體醌-C10甲磺酸鹽后，線粒體醌-C10的大鼠血漿濃度-時間曲線。
具體實施例方式
如上所述，本發明的中心是主要用于治療和/或預防目的以減少氧化應激的靶向線粒體的化合物。
橫跨其內膜，線粒體具有最高達180mV的高的(substantial)膜電位(內部為負)。由于這種電位，透膜體(membrane permeant)親脂性陽離子在線粒體基質內累積數百倍。
申請人已發現，通過將親脂性陽離子(如親脂性三苯基鏻陽離子)偶聯至抗氧化部分，所得的兩親性化合物可被遞送至完整細胞內的線粒體基質。抗氧化劑從而得以靶向于細胞內自由基和活性氧類的主要產生部位，而不是隨機分散。
目前申請人還確定了所述抗氧化化合物的性質，如抗氧化部分的特性、連接部分的物理和化學特征如連接部分的長度和親脂性、和/或親脂性陽離子的特性有利于抗氧化化合物在體內的功效，并有利于所述化合物的抗氧化功能。對本發明抗氧化化合物而言，體內功效可部分地包括適宜的生物利用度、適宜的穩定性、適宜的藥動學、適宜的抗氧化活性、和/或適宜的線粒體靶向性和/或累積性。
原則上，能夠被轉運至和/或通過線粒體膜、并在完整細胞的線粒體處或之內累積的任何親脂性陽離子以及任何抗氧化劑都能夠用于形成本發明化合物。
然而，優選的親脂性陽離子是本文作為實例的三苯基鏻陽離子。可共價地偶聯至本發明的抗氧化劑的其它親脂性陽離子包括三芐基銨和鏻陽離子。在本發明抗氧化化合物的一些實施例中，所述親脂性陽離子通過具有1到約30個碳原子如2到約20個、約2到約15個、約3到約10個或約5到約10個碳原子的飽和直鏈碳鏈偶聯至抗氧化部分。在一個特別優選的實施例中，所述直鏈碳鏈含有10個碳原子。
雖然碳鏈優選地是亞烷基(例如，C1-C20或C1-C15)，但是任選地包括一個或多個雙鍵或三鍵的碳鏈也在本發明范圍內。還包括在內的是含一個或多個取代基(如羥基、羧酸或酰胺基)、和/或含一個或多個側鏈或支鏈的碳鏈，如那些選自未被取代或被取代的烷基、烯基或炔基的碳鏈。還包括含有超過約30個碳原子、但其長度相當于具有1到約30個碳原子的直鏈飽和碳鏈的碳鏈。
本領域技術人員將理解，除直亞烷基外的部分例如被取代的或支鏈的烷基、肽鍵等可用于將抗氧化部分共價地偶聯至親脂性陽離子。
在一些具體實施方案中，親脂性陽離子通過具有1至10個碳原子的直鏈亞烷基如亞乙基、亞丙基、亞丁基、亞戊基或亞癸基連接至抗氧化部分。
可用于本發明的抗氧化部分包括那些需要與還原劑相互作用以獲得起始抗氧化活性或抗氧化活性的再生或這兩者的抗氧化劑。例如，本發明包含醌醇部分作為活性抗氧化部分的抗氧化化合物可以醌的形式給藥。要起抗氧化劑的作用，即具有抗氧化活性，該醌必須通過與還原劑線粒體還原劑如復合物II相互作用從而還原為醌醇以獲得起始抗氧化活性。被氧化的醌形式與還原劑在之后的相互作用可導致抗氧化活性的再生。
可用于本發明的抗氧化部分的其它實例包括那些原本就以還原形式存在且不需與還原劑相互作用以獲得起始抗氧化活性的抗氧化劑。盡管如此，但是該抗氧化部分的氧化形式與線粒體還原劑在之后的相互作用可導致抗氧化活性的再生。舉例而言，抗氧化部分維生素E可以還原形式給藥，所以不需要與還原劑相互作用以獲得起始抗氧化活性，但是可隨后與還原劑如內源性的醌池(quinone pool)相互作用以使抗氧化活性再生。
可用于本發明的抗氧化部分的其它實例包括那些不通過與線粒體還原劑相互作用而再生的抗氧化劑。
可用于本發明的抗氧化劑的實例包括維生素E和維生素E衍生物、鏈斷裂抗氧化劑如丁基化的羥基苯甲醚、丁基化的羥基甲苯、醌醇以及常規自由基捕獲劑如衍生化的富勒烯。此外，還可應用可與自由基反應以產生穩定的自由基的自旋捕獲劑。這些包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亞硝基苯、tert-亞硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相關化合物的衍生物。
可容易地通過下列反應制備包括此處通式I和II化合物的那些優選的抗氧化化合物 總合成方案是在氬氣下將含有適宜離去基團的前體，優選為烷基磺酰基、溴或碘前體與大于1當量的三苯基膦加熱數天。然后將磷鎓以其鹽的形式分離。為此，將產物用二乙醚反復研磨直至只剩下米黃色(off-white)固體。然后將其溶于氯仿或二氯甲烷，用二乙醚沉淀以除去過量的三苯基膦。重復此步驟直至固體不再溶于氯仿。此刻，將該產物從適宜的溶劑如氯仿、丙酮、乙酸乙酯或高級醇中重結晶數次。
此處實施例1中建立了可用于制備優選的式III的靶向線粒體的抗氧化化合物的穩定形式(此處還稱作線粒體-C10甲磺酸鹽或線粒體-C10甲基磺酸鹽)的優選的合成方法。
還應理解的是，若需要或必須的話，可應用離子交換或其它本領域公知的技術容易地以其它藥物學或藥理學可接受的陰離子交換由此制備的抗氧化化合物的陰離子。
申請人已確定當陰離子不顯示與抗氧化部分、連接部分或親脂性陽離子部分的反應性時可增強抗氧化化合物鹽形式的穩定性。例如，在本發明抗氧化化合物優選的實例的情況下，所述陰離子是非親核性的。同樣有利的是所述陰離子是藥物學可接受的陰離子。對于藥物組合物而言，還優選該陰離子不對任何其它構成該組合物的物質顯示反應性。
非親核性陰離子的實例包括六氟銻酸根、六氟砷酸根或六氟磷酸根，或者四苯基硼酸根、四(全氟苯基)硼酸根或其它四氟硼酸根、三氟甲基磺酸根、芳基磺酸根和烷基磺酸根如甲基磺酸根以及對-甲苯磺酸根以及磷酸根。
藥物學可接受的陰離子的實例包括鹵離子如氟離子、氯離子、溴離子和碘離子；無機酸鹽陰離子如硝酸根、高氯酸根、硫酸根、磷酸根和碳酸根；低級烷基磺酸鹽如甲基磺酸鹽和乙基磺酸鹽的藥物學可接受的陰離子；芳基磺酸鹽如苯磺酸鹽、2-萘磺酸鹽和對-甲苯磺酸鹽的藥物學可接受的陰離子；有機酸鹽如三氯乙酸鹽、三氟乙酸鹽、羥基乙酸鹽、苯甲酸鹽、苦杏仁酸鹽、丁酸鹽、丙酸鹽、甲酸鹽、延胡索酸鹽、琥珀酸鹽、檸檬酸鹽、酒石酸鹽、草酸鹽、馬來酸鹽、乙酸鹽、蘋果酸鹽、乳酸鹽和抗壞血酸鹽的藥物學可接受的陰離子；以及酸性氨基酸鹽如谷氨酸鹽和天冬氨酸鹽的藥物學可接受的陰離子。
在本發明抗氧化化合物優選的實例的情況下，鹵素陰離子前體被交換為芳基或烷基磺酸根陰離子。實例包括但不限于苯磺酸根、對-甲苯磺酸根、2-萘磺酸根、甲基磺酸根、乙基磺酸根和丙基磺酸根。特別優選的陰離子是甲基磺酸根陰離子。如上所述，其中陰離子是甲基磺酸根的本發明抗氧化化合物實例是特別優選的式III抗氧化化合物，此處稱作線粒體醌-C10甲基磺酸鹽或線粒體醌-C10甲磺酸鹽。
該相同的總工藝可用于制備具有不同的抗氧化部分R連接至一個或多個三苯基鏻(或其它親脂性陽離子)部分的許多不同的靶向線粒體的化合物。這些包括一系列維生素E衍生物，其中將維生素E官能團與三苯基鏻(或其它親脂性陽離子)部分偶聯的橋長是變化的。其它可用作R的抗氧化劑包括鏈斷裂抗氧化劑如丁基化的羥基苯甲醚、丁基化的羥基甲苯、醌醇、以及常規的自由基捕獲劑如衍生化的富勒烯。此外，還可合成可與自由基反應以產生穩定的自由基的自旋捕獲劑。這些包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亞硝基苯、tert-亞硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮以及相關化合物的衍生物。
應理解的是，就本發明抗氧化化合物而言，正如就任何藥物而言，體外活性決不是體內功能或功效的唯一決定因素。本發明抗氧化化合物的抗氧化活性可通過如此處所述的那些采用如離體線粒體和/或離體細胞的方法測定。同時事實上，要用作本發明的靶向線粒體的抗氧化化合物，則抗氧化化合物必須在這種試驗中顯示適宜的高的抗氧化活性，而要在體內有效，該靶向線粒體的抗氧化化合物必須顯示其它所需的理化性質，如適宜的生物利用度、穩定性或抗氧化功能。
具有良好的抗氧化活性而對于體內目標隔室卻顯示出差的抗氧化功能的抗氧化化合物的實例包括輔酶Q(CoQ)和艾地苯醌。即使要在人類患者中獲得極低的臨床效果，都必須以非常高的劑量率(如0.5-1.2g)給藥這兩種化合物。
本發明靶向線粒體的抗氧化化合物的實例顯示良好的抗氧化活性和生物利用度，并從而在低劑量率下于體內有效。此處實施例11給出對本發明優選的兩親性靶向線粒體的抗氧化化合物線粒體醌-C10甲磺酸鹽和其環糊精復合物的生物利用度的測定。我們認為本發明的抗氧化化合物可有效地將抗氧化活性靶向于線粒體，并同時顯示出一種或多種額外的益處可以晶體或固體形式應用或可配制成固體形式、穩定性更高、生物利用度更高和/或抗氧化功能更高。仍不受任何理論所限，我們認為，本發明抗氧化化合物的物理和化學特征賦予本發明抗氧化化合物優選的特征，從而使它們可用于現有抗氧化化合物因其化學和物理性質而不適用的組合物、劑型和方法以及其它應用中。
在本發明的一些具體實施方案中，所述抗氧化化合物是如上所定義的式II的醌醇衍生物。舉例而言，本發明的醌醇衍生物是如上所定義的化合物線粒體醌-C10(式III化合物是其的特定鹽形式)。本發明化合物的另一實例是其中(C)n是(CH2)5、且醌醇部分與線粒體醌-C10的相同的式I化合物，此處稱作線粒體醌-C5(見圖3C)。本發明化合物的另一實例是其中(C)n是(CH2)3、且醌醇部分與線粒體醌-C10的相同的式I化合物，此處稱作線粒體醌-C3(見圖3B)。本發明化合物的另一實例是其中(C)n是(CH2)15、且醌醇部分與線粒體醌-C10的相同的式I化合物，此處稱作線粒體醌-C15(見圖3E)。
一旦得以制備，被制備成任何藥物學適宜的形式且任選地包含藥物學可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、復合劑或添加劑的本發明化合物即可向需要治療和/或預防的患者給藥。一旦被給藥，該化合物即將抗氧化活性靶向于患者細胞內的線粒體。
本發明抗氧化化合物可通過口服和/或胃腸道外途徑向患者給藥。
所述抗氧化化合物必須被配制成穩定、安全的藥物組合物向患者給藥。該組合物可根據傳統方法、通過將一定量的抗氧化化合物成分溶解或懸浮于稀釋劑中制備。該量介于每ml稀釋劑含0.1mg至1000mg抗氧化化合物。可添加乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽或谷氨酸鹽緩沖液使最終組合物的pH為5.0到9.5；還可任選地添加糖類或多元醇等滲劑(tonicifier)和選自由間甲酚、芐醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯、對羥基苯甲酸丙酯及對羥基苯甲酸丁酯以及苯酚組成的組中的防腐劑。使用足量的注射用水以獲得所需的溶液濃度。若需要，也可使用其它的等滲調節劑(tonicifying agent)如氯化鈉以及其它賦形劑。然而，這些賦形劑必須維持抗氧化化合物的總滲透壓。
當涉及氫離子濃度或pH時應用術語緩沖劑、緩沖溶液和緩沖的溶液，是指系統、特別是水溶液系統抵抗添加酸或堿或者用溶劑稀釋時pH發生變化的能力。當在添加酸或堿時經歷pH微小變化的緩沖的溶液的特征是存在弱酸和弱酸鹽，或者弱堿和弱堿鹽。前述系統的實例是乙酸和乙酸鈉。只要添加的氫氧根離子的量不超過緩沖系統中和它的容量，pH的變化就是微小的。
通過維持組合物的pH在約5.0到9.5范圍內可增強本發明胃腸道外劑型的穩定性。其它的pH范圍如包括5.5到9.0、或6.0到8.5、或6.5到8.0、或7.0到7.5。
用于實施本發明的緩沖液任選自下列緩沖液，如乙酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液或谷氨酸鹽緩沖液，最優選的緩沖液是磷酸鹽緩沖液。
還可應用載體或賦形劑以促進該化合物的給藥。載體或賦形劑的實例包括碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖如乳糖、葡萄糖、或蔗糖，或各種淀粉、纖維素衍生物、明膠、聚乙二醇和生理學相容的溶劑。
本發明可包括穩定劑，但重要的是這不是必需的。然而，若包括的話，可用于實施本發明的穩定劑是糖類或多元醇。所述多元醇包括如山梨醇、甘露醇、甘油和聚乙二醇(PEG)的化合物。糖類包括如甘露糖、核糖、海藻糖、麥芽糖、肌醇、乳糖、半乳糖、阿拉伯糖或乳糖。
適宜的穩定劑包括例如多元醇，如山梨醇、甘露醇、肌醇、甘油、木糖醇和聚丙二醇/聚乙二醇共聚物，以及各種分子重量為200、400、1450、3350、4000、6000和8000的聚乙二醇(PEG)。
美國藥典(USP)規定，多劑量容器內的制劑中必須添加抑制細菌或抑制真菌濃度的抗微生物劑。在用皮下注射針和注射器抽出部分內容物、或使用其它侵入式(invasive)方式如筆式注射器(pen injector)傳遞時可能無意中將微生物引入制劑中，上述抗微生物劑在用以抑制這些微生物的繁殖時必須存在足夠的濃度。應評價抗微生物劑以確保其與配方中的其它成分相容，并評價它們在總配方中的活性以確保在一種劑型中有效的特定物質在另一劑型中也有效。在一種劑型中有效而在另一劑型中無效的特定物質并非罕見。
就常規藥物學意義而言，防腐劑是預防或抑制微生物生長、且可被添加至藥物組合物中用于該目的以避免隨后微生物對組合物的酸敗。雖然防腐劑的量不大，但卻可能影響抗氧化化合物的總體穩定性。因此，甚至對防腐劑進行選擇也可是困難的。
雖然用于實施本發明的防腐劑可在0.005到1.0％(w/v)的范圍內，但是各種防腐劑單獨或與其它防腐劑組合的優選的范圍是芐醇(0.1-1.0％)、或間甲酚(0.1-0.6％)、或苯酚(0.1-0.8％)、或者對羥基苯甲酸甲酯(0.05-0.25％)與對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸丙酯或對羥基苯甲酸丁酯(0.005-0.03％)的組合。對羥基苯甲酸酯類是對-羥基苯甲酸的低級烷基酯。
“Remimgton’s Pharmaceutical Sciences”以及Pharmaceutical DosageFormsParenteral Medications，卷1，1992，Avis等記載了各種防腐劑的詳細說明。用于這些目的時，晶體曲恩汀二鹽酸鹽可以在包含常規的無毒的藥物學可接受的載體、佐劑和賦形劑的劑量單位劑型中經胃腸道外給藥(包括皮下注射、靜脈內、肌內、皮內注射或輸注技術)或通過噴霧吸入給藥。
還可能需要根據所選擇的等滲劑加入氯化鈉或其它鹽以調整所述藥物劑型的滲透壓。然而這是任選的，且取決于所選擇的特定劑型。胃腸道外劑型必須等滲或基本上等滲，否則給藥部位會出現明顯的刺激和疼痛。
所需的等滲性可應用氯化鈉或其它藥物學可接受的物質如葡萄糖、硼酸、酒石酸鈉、丙二醇、多元醇(如甘露醇和山梨醇)、或者其它無機或有機溶質獲得。通常，所述組合物與個體的血液等滲。
若需要，胃腸道外劑型可用增稠劑如甲基纖維素增稠。所述劑型可制備成油包水或水包油的乳化的形式。可應用多種多樣的藥物學可接受的乳化劑中的任意乳化劑，包括例如金合歡粉(acacia powder)、非離子型表面活性劑或離子型表面活性劑。
還可能需要向藥物劑型中添加適宜的分散劑或助懸劑，舉例而言，這些可包括含水懸浮液如合成和天然的樹膠，即黃蓍膠、阿拉伯膠、海藻酸鹽、葡聚糖、羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或明膠。
胃腸道外產品最重要的載體是水。用于胃腸道外給藥的適宜質量的水必須通過蒸餾或通過反滲透制備。唯有如此才可能從水中充分地分離各種液體、氣體和固體雜質。注射用水是用于本發明藥物劑型的優選的水性載體。可用氮氣吹洗水而從水中除去所有氧氣或氧自由基。
其它成分可存在于本發明胃腸道外藥物劑型中。這些額外的成分可包括潤濕劑、油(例如植物油如芝麻油、花生油或橄欖油)、鎮痛劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、滲透壓調節劑、金屬離子、油質載體、蛋白質(如人血清白蛋白、明膠或蛋白質)和兩性離子(例如氨基酸如甜菜堿、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、賴氨酸和組氨酸)。當然，這些額外的成分不應對本發明藥物劑型的總穩定性產生不利的影響。
由于不存在完全不溶或完全不在某些方面影響其所容納的液體、特別是水性液體的容器，因此容器也是注射劑劑型不可缺少的部分并且可視為一種成分。因此，為特定注射劑選擇容器必須基于對容器以及溶液的組成、以及容器將接受的處理的考慮。
為允許皮下注射器針頭進入多劑量瓶，并且在注射針一抽出就重新密封，每個瓶子用被鋁帶固定位置的橡膠蓋密封。
玻璃瓶塞如West 4416/50、4416/50(表面涂覆特氟隆)和4406/40、Abbott 5139或任何相當的塞子都可用作劑量瓶的蓋子。這些塞子通過了采用患者使用的方式進行的完整性檢驗，如塞子可耐受至少約100次注射。
上述藥物劑型的各種成分都為本領域技術人員所周知且記載于Pharmaceutical Dosage FormsParenteral Medications，卷1，2nd ed.，Avis等Ed.，Mercel Dekker，New York，N.Y.1992中，其全文并入此處作為參考。
上述劑型的生產過程包括混合、無菌過濾和填充步驟。混合工藝可例如包括以特定順序溶解成分，如首先溶解防腐劑，隨后是穩定劑/等滲劑、緩沖液，然后是抗氧化化合物，或者同時溶解組成胃腸道外劑型的所有成分。一種制備胃腸道外給藥劑型的方法的實例是將抗氧化化合物形式如線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)溶解于水中，并于磷酸鹽緩沖溶液中稀釋所得混合物。
或者，本發明胃腸道外劑型可通過根據公認的工藝將各成分混合而制備。例如，所選擇的化合物可用攪拌器或其它標準裝置混合以產生濃混合物，然后通過添加水、增稠劑、緩沖液、5％人血清白蛋白或其它控制等滲的溶質至最終的濃度和粘度。
或者，可將抗氧化化合物作為干燥固體和/或粉末包裝，該干燥固體和/或粉末可用溶劑復原(reconstitute)以得到可在復原時應用的本發明胃腸道外劑型。
此外，生產過程可包括任何形成本發明胃腸道外劑型時適宜的滅菌過程。典型的滅菌過程包括過濾、蒸汽(濕熱)、干熱、氣體(如環氧乙烷、甲醛、二氧化氯、環氧丙烷、β-丙內酯(propiolacctone)、臭氧、三氯硝基甲烷、過乙酸、甲基溴等)、暴露于輻射和無菌處理。
胃腸道外給藥的適宜途徑包括靜脈內、肌內、皮下、皮內、皮膚下(sub dermal)、關節內、鞘內、腹腔內等。優選靜脈內給藥途徑。還允許粘膜遞藥。劑量和劑量方案將取決于受試者的體重和健康狀況。
可選擇藥物學可接受的載體、賦形劑、稀釋劑、復合劑或添加劑，從而例如提高抗氧化化合物的穩定性、便于合成或配制成藥物劑型、和/或提高抗氧化化合物的生物利用度。
本領域技術人員公知，載體分子如環糊精及其衍生物具有可用作能夠改變藥物分子理化屬性的復合劑的潛力。舉例而言，環糊精可穩定(就熱力學和氧化性質而言)其復合的活性物質、降低該活性物質的揮發性、并改變該活性物質的溶解度。環糊精是由形成環形結構的吡喃型葡萄糖組成的環狀分子。環糊精分子內部疏水而外部親水，使環糊精分子可溶于水。可通過取代環糊精外部的羥基而改變可溶性的程度。類似地，雖然內部的疏水特性通常允許相對疏水的客體容于腔內，但是也可通過取代改變內部的疏水性。一個分子容于另一分子內稱作復合，并且所得產物稱為包合復合物。環糊精衍生物的實例包括磺基丁基環糊精、麥芽糖基環糊精(maltosylcyclodexin)、羥丙基環糊精和它們的鹽。
本文實施例1和實施例7公開了形成包括靶向線粒體的抗氧化化合物、在此為β-環糊精與線粒體醌-C10復合的包合復合物的藥物學可接受的組合物的方法。本文實施例9和實施例10公開了形成包括優選的靶向線粒體的抗氧化化合物線粒體醌-C10甲磺酸鹽與β-環糊精相復合的包合復合物的藥物學可接受的組合物的方法。
抗氧化化合物-環糊精復合物的理化性質，包括例如藥物學性質，可因抗氧化化合物與環糊精的摩爾比的變化或環糊精自身的變化而變化。例如，對優選的通式I抗氧化化合物而言，抗氧化化合物與環糊精的摩爾比(抗氧化化合物環糊精)可為約10∶1到約1∶10、約5∶1到約1∶5、約4∶1到約1∶4、約2∶1到約1∶2、或約1∶1。在另一實施例中，優選的抗氧化化合物實例線粒體醌-C10與環糊精的摩爾比是1∶2，且環糊精是β-環糊精。
或者，可將抗氧化化合物配制成適合的藥物制劑形式以提高該抗氧化化合物的穩定性和生物利用度。例如，片劑可包有腸衣以防止抗氧化化合物在胃內釋放，從而可減少不良的副作用的風險、或維持否則會因暴露于胃環境而被降解的抗氧化化合物的穩定性。許多用于此目的聚合物是多酸，它們通過其在水性介質中的溶解度是pH依賴性的，并且它們需要高于通常在胃里遇到的pH值條件的事實起作用。
一種優選的口服控釋結構是固體劑型的腸溶包衣。腸溶包衣有助于化合物在暴露于胃液時在特定時期內保持物理地結合于劑型內，但腸溶包衣被設計為在腸液里崩解以迅速吸收。吸收的延遲取決于通過胃腸道的轉運速率，因此胃排空速率是重要的因素。對一些給藥而言，多單位型(mutiple-unit type)劑型如顆粒劑可能優于單一單位型(single-unittype)。因此，在一個具體實施方案中，本發明的抗氧化化合物可包含于包有腸溶衣的多單位劑型中。在一個更優選的具體實施方案中，通過生成具有存在于惰性核心材料之上的抗氧化化合物-腸溶包衣劑固體的顆粒從而制備抗氧化化合物的劑型。這些顆粒可使抗氧化化合物的吸收延長，并具有良好的生物利用度。
典型的腸溶包衣劑包括但不限于羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、聚乙烯乙酸酯-鄰苯二甲酸酯和乙酸纖維素鄰苯二甲酸酯。
本發明抗氧化化合物和/或其劑型和/或復合物的優選的實例顯示出有利的藥物學性質。例如，它們易于配制、化學和物理穩定、易溶于水、具有低的吸濕性和具有適宜的貯存期。
現在將參考下列非限制性的試驗部分對本發明進行更詳細的說明。
實施例實施例1.線粒體醌-C10的合成下文描述靶向線粒體的抗氧化化合物線粒體醌-C10的實例——線粒體醌-C10甲磺酸鹽和其環糊精復合物的優選的穩定鹽形式的優選的合成方法。
階段1路線圖
步驟1.將艾地苯醌(A1，0.25kg，0.74mol)溶于2.5L反應級(reactiongrade)DCM中，然后將該混合物在惰性氣氛下冷卻至10±3℃。
2.在環境溫度下一次性加入三乙胺(0.152kg，1.5mol)，并且允許該混合物再平衡至10±3℃。
3.然后以能夠維持內部溫度為約10-15℃的速度逐漸加入甲磺酰氯(0.094kg，0.82mol)在0.5L DCM中的溶液(在此規模下，添加在75分鐘后結束)。
4.進一步將反應混合物攪拌15-30分鐘，5.通過TLC檢查IPC而確定反應完全(Rf0.65 5％乙醇/二氯甲烷)。
6.然后用水(0.85L)和飽和碳酸氫鈉水溶液(0.85L)洗滌該混合物。
7.在40-45℃減壓蒸發有機層至成為紅色液體。在環境溫度下于高真空干燥額外2-4小時后，直接將由此所獲得的粗品A2用于下一步驟。因溶劑截留于液體內，因此產率未知。
階段2路線圖
步驟1.將艾地苯醌甲磺酸酯(A2，假定自最后一步的產率為100％，0.31kg，0.74mol)溶于2L甲醇中，并隨后在惰性氣氛下將該混合物冷卻至0-5℃。
2.以能夠確保內部溫度不超過15℃的速度逐份加入硼氫化鈉(0.03kg，0.79mol)。反應完全會伴隨顏色變化紅色→黃色(在此規模下，添加在20分鐘后結束)。
3.進一步將該反應混合物攪拌10-30分鐘，4.通過TLC檢查IPC以確定反應完全(A3 Rf0.60 5％乙醇/二氯甲烷，A2 Rf0.65)。
5.然后用2L 2M的鹽酸溶液使混合物淬滅并用1.2L的二氯甲烷萃取三次。
6.然后用1.2L的水將合并的有機相洗滌一次，并用無水硫酸鎂(0.24kg)干燥。
7.在40-45℃下減壓蒸發有機相至成為黃/棕色漿液(syrup)。環境溫度下于高真空下干燥額外的2-8小時后，得到0.304kg的粗產品A3，產率為98％，直接將由此所獲得的產物用于下一步驟。
階段3路線圖
步驟1.將三苯基鏻厚塊(0.383kg，1.46mol)加入置于適宜大小的圓底燒瓶中的艾地苯醌甲磺酸酯內。
2.然后將燒瓶與旋轉式汽化器連接，并在真空下以80-85℃的浴溫加熱內容物。
3.在此溫度下混合物應形成均勻的熔化物。一旦熔化物已形成而且脫氣不再明顯，就用惰性氣氛替代真空，并將混合物在設為80-85℃的浴中溫和地旋轉約3天。
4.通過1H和31P NMR檢查IPC以確定反應完全。在純化前轉化率最少應為95％。
5.然后將混合物冷卻至近室溫，并溶于0.8L的二氯甲烷。
6.溫和加熱下逐份地加入3.2L乙酸乙酯，以將所需的產物從過量的三苯基膦中沉淀出來。
7.減壓蒸發除去少量的溶劑(以除去DCM)，然后將剩余的混合物冷卻至近環境溫度并慢慢傾析。
8.然后將剩余的漿狀殘余物用相同的洗滌方法再洗滌2次，并且最后在高真空下干燥至恒重以獲得0.441kg的褐色泡沫，產率89％(注產物仍含有某些溶劑，見NMR)。將如此獲得的A4直接用于下一步。
階段4
路線圖 步驟1.將粗品線粒體醌甲磺酸鹽(0.44kg，假定為0.65mol)溶于6L無水DCM中，并用氧氣吹洗燒瓶。
2.氧氣氛下劇烈攪拌燒瓶內容物30分鐘以確保溶劑中的氣體飽和。
3.快速一次性加入0.65M NO2在無水DCM中的0.1L的溶液(2mol％NO2)，并于環境溫度下于氧氣氛下劇烈攪拌混合物4-8小時。
4.然后實施IPC檢查以確定反應完全(通過1H和任選地31P NMR)5.若氧化作用不完全則進一步加入2mol％NO2在DCM中的溶液。其應促使反應完全。進行如上所述的IPC檢查。在此規模下，需要8mol％NO2在DCM中的溶液以使反應完全。
6.然后減壓蒸發除去溶劑以獲得紅色的漿狀殘余物。將該殘余物在40-45℃下溶于2L的二氯甲烷中。
7.溫和加熱下逐份加入3.2L的乙酸乙酯以沉淀所需產物。減壓蒸發除去少量溶劑(以除去DCM)，隨后將剩余的混合物冷卻至近環境溫度并傾析。
8.最后將油狀殘余物在高真空下干燥至恒重以獲得紅色玻璃狀產物(419g，產率94％)。將如此獲得的A5直接用于下一步。
階段5路線圖
步驟1.于40-43℃溫和加熱下，將粗品線粒體醌甲磺酸鹽(A5 0.419kg)溶于6L的水中。
2.于60℃加熱下，將β-環糊精1.24kg單獨地溶于20L水中。
3.將這兩份溶液冷卻至近室溫，并合并成均勻的混合物。該溶液應在＜5℃貯藏。
4.然后將此橙黃色溶液于-20℃下冷凍，并分批凍干至恒重(至少48小時)。
5.將所得固體輕輕壓碎而形成均勻的自由流動的黃色/橙黃色粉末(1.433kg)。
還實施了一種可供選擇的方法，其中上述合成方法階段4的氧化步驟3通過氧氣形成氣泡穿過溶液實現，顯示可通過用NO2氧化之外的氧化方式而促使該氧化反應基本反應完全。
實施例2.靶向線粒體的抗氧化化合物的合成圖2為線粒體醌-C3、線粒體醌-C5和線粒體醌-C15的化學合成方法的略圖，以下加以說明。使用Varian 300 MHz儀器獲得核磁共振波譜。1H-NMR中CDCl3內的四甲基硅烷為內標。31P NMR中85％磷酸為外標。化學位移(δ)表示為相對于基準的ppm。元素分析由Otago大學Campbell微量分析實驗室完成。使用Shimadzu LCMS-QP800X液相色譜質譜聯用儀完成電噴霧質譜測定(electrospray mass spectrometry)。在無水乙醇中制備貯備液并于-20℃下避光(in the dark)保存。
線粒體醌-C3(6).圖2A顯示線粒體醌-C3的合成路徑。通過將2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌(CoQ0)還原成醌醇(Carpino，L.A.，Triolo，S.A.和Berglund，R.A.(1989)J.Org.Chem.54，3303-3310)，然后甲基化以獲得1(Lipshutz，B.H.，Kim，S.-k.，Mollard，P.和Stevens，K.L.(1998)Tetrahedron54，1241-1253)而制備起始物質2，3，4，5-四甲氧基甲苯(1)(Lipshutz，B.H.，Kim，S.-k.，Mollard，P.和Stevens，K.L.(1998)Tetrahedron 54，1241-1253)。氮氣下將1(6.35g，29.9mmol)在無水己烷(80ml)和N，N，N’，N’-四甲基乙二胺(8.6ml)中的溶液用烘干的(flame-dried)攪拌棒置于烘干的Schlenk管中。室溫下緩慢加入正丁基鋰的己烷溶液(1.6M，26.2mL)，并將混合物冷卻并在0℃下攪拌1小時。冷卻至-78℃后，加入無水四氫呋喃(THF；250mL)并取出少量等分反應混合物，用D2O淬滅，并用1H NMR檢查以確保完成金屬化。然后將黃色的混懸液在氮氣、-78℃下轉移至另一烘干的含有CuCN(0.54g，6.03mmol)的Schlenk管中。將混合物加熱到0℃10分鐘，然后冷卻至-78℃并加入烯丙基溴(3.62mL)，攪拌反應過夜(19小時)并使溫度升至室溫。用10％的NH4Cl水溶液(75mL)淬滅反應，并用醚(2×200mL)萃取。用水(2×150mL)、10％的NH4OH水溶液(200mL)和飽和的NaCl水溶液(200mL)洗滌合并的醚萃取液。用MgSO4干燥有機溶劑，過濾并在真空下旋轉蒸發除去溶劑而獲得粗產物(7.25g)。用硅膠柱色譜采用20％乙醚/己烷洗脫得到1，2，3，4-四甲氧基-5-甲基-6-(2-丙烯基)苯(2)(Yoshioka，T.，Nishi，T.，Kanai，T.，Aizawa，Y.，Wada，K.，Fujita，T.和Horikoshi，H.(1993)，Eur.Pat.Appl.EP549366 A1)(6.05g，83.5％)。1H NMRδ5.84-5.98(1H，m，-CH＝C)，4.88-5.03(2H，m，＝CH2)，3.78，3.80，3.90，3.92(12H，s，OMe)，3.38(2H，d，J＝7.0Hz，Ar-CH2)，2.14(3H，s，Ar-Me)ppm。
在25℃、氬氣下將2(8.0g，33.05mmol)的無水THF(45mL)溶液于20分鐘內逐滴加入攪拌下的9-硼二環[3.3.1]壬烷(79mL，39.67mmol，0.5M)在THF中的混懸液內。將所得溶液在室溫下攪拌過夜，并在65℃、氬氣下進一步攪拌2小時。然后將混合物冷卻至0℃，并在逐滴加入3M NaOH(53mL)后加入30％的H2O2水溶液(53mL)。室溫下攪拌30分鐘后，水相用NaCl飽和并用THF萃取3次。用飽和的NaCl水溶液洗滌、干燥(Na2SO4)、過濾和蒸發合并的有機部分得到油狀殘余物(11.5g)，通過硅膠(200g，以乙醚/己烷1∶9填充)柱色譜純化。用乙醚/己烷1∶4洗脫得到純3-(2，3，4，5-四甲氧基-6-甲基-苯基)-丙-1-醇(3)(6.85g，80％)，為粘稠的無色油狀物。1H NMRδ3.91，3.90，3.84，3.79(12H，s，OMe)，3.56(2H，t，J＝7.0Hz，-CH2-OH)，2.72(2H，t，J＝7.0Hz，Ar-CH2)，2.17(3H，s，Ar-Me)，1.74(2H，五重峰，J＝7.0Hz，-CH2-)ppm。C14H22O5分析計算C，62.2；H，8.2。實測C，62.2；H，8.4％。
室溫下攪拌3(3.88g，15mmol)和三乙胺(3.0g，30mmol，4.2mL)在CH2Cl2(50mL)中的溶液10分鐘。20分鐘內逐滴加入在CH2Cl2(50mL)中的甲磺酰氯(1.8g，1.20mL，15.75mmol)，并于室溫下攪拌反應混合物1小時。然后用CH2Cl2(50mL)稀釋該混合物并將有機層用水(5×100mL)、10％的NaHCO3水溶液(100mL)洗滌、干燥(MgSO4)、、過濾，并且在真空下通過旋轉蒸發除去溶劑獲得液體1-(3-甲磺酰基氧基丙基)-2-甲基-3，4，5，6-四甲氧基苯(4)(4.8g，95％)。1H NMRδ4.27(2H，t，J＝7.0Hz，-CH2-O-SO2-Me)，3.91，3.89，3.82，3.78(12H，s，OMe)，3.03(3H，s，-O-SO2-Me)，2.70(2H，t，J＝7.0Hz，Ar-CH2-)，2.17(3H，s，Ar-Me)，1.9(2H，m，-CH2-)ppm。
通過與置于Kimax管并在氬氣下密封的三苯基膦(4.08g，15.6mmol)和NaI(7.78g，51.9mmol)的新研磨的混合物相混合，將粗品甲磺酸酯4(3.30g，9.8mmol)直接用于隨后的反應。然后將混合物維持在70-74℃下，磁力攪拌3小時，期間混合物從軟化的粘稠液體變成玻璃態固體。將試管冷卻至室溫并用CH2Cl2(30mL)攪拌殘余物。然后過濾混懸液并真空蒸發濾液。將殘余物溶于極少量CH2Cl2并用過量的乙醚(250mL)研磨以沉淀出白色固體。將該固體過濾并用乙醚洗滌、真空干燥，得到純[3-(2，3，4，5-四甲氧基-6-甲基-苯基)-丙基]三苯基碘化鏻(5)(5.69g，90％)。1H NMRδ7.82-7.65(15H，m，Ar-H)，3.88，3.86，3.74，3.73(12H，s，OMe)，3.76-3.88(2H，m，CH2-P+)，2.98(2H，t，J＝7.0Hz，CH2-Ar)，2.13(3H，s，Ar-Me)，1.92-1.78(2H，m，-CH2-)ppm。31P NMR(121.4MHz)δ25.32ppm。C32H36IO5P分析計算C，59.8；H，5.7；P，4.8；實測C，59.8；H，5.8；P，4.5％。
在分液漏斗內將5的碘化物形式(4.963g，7.8mmol)在CH2Cl2(80mL)中的溶液與10％的NaNO3水溶液(50mL)振搖5分鐘。將有機層分離、干燥(Na2SO4)、過濾并真空蒸發，得到5的硝酸鹽(4.5g，7.8mmol，100％)，將其溶于CH3CN和H2O的混合物(73，38mL)并在0℃、于冰浴下攪拌。然后加入吡啶-2，6-二甲酸(6.4g，39mmol)，隨后在5分鐘內逐滴加入硝酸高鈰銨(21.0g，39mmol)在CH3CN/H2O(1∶1，77mL)中的溶液。0℃下攪拌反應混合物20分鐘，然后室溫下再攪拌10分鐘。然后將混合物倒入水中(200mL)并用CH2Cl2(200mL)萃取、干燥(Na2SO4)、過濾和真空蒸發，得到粗品[3-(4，5-二甲氧基-2-甲基-3，6-二氧代-1，4-環己二烯-1-基)丙基]三苯基硝酸鏻(6)。將總產物溶于CH2Cl2(100mL)并與20％的KBr水溶液(50mL)振搖10分鐘。將有機層分離、干燥以及真空蒸發，得到6的溴鹽(4.1g，93.6％)。1H NMRδ7.90-7.65(15H，m，Ar-H)，4.15-4.05(2H，m，CH2-P+)，3.96，3.95，(6H，s，OMe)，2.93(2H，t，J＝7.0Hz，CH2-Ar)，2.15(3H，s，Ar-Me)，1.85-1.70(2H，m，-CH2-)ppm。31P NMRδ25.29ppm。
在分液漏斗內將6的溴化物(3.65g，6.5mmol)在CH2Cl2(75mL)中的溶液與10％w/v的甲基磺酸鈉水溶液(100mL)振搖5分鐘。將CH2Cl2層分離、干燥(Na2SO4)、過濾和真空蒸發，得到[3-(4，5-二甲氧基-2-甲基-3，6-二氧代-1，4-環己二烯-1-基)丙基]三苯基鏻甲基磺酸鹽(6)(3.7g，98％)。1H NMRδ7.88-7.60(15H，m，Ar-H)，3.93，3.92，(6H，s，OMe)，3.90-3.78(2H，m，CH2-P+)，2.85(2H，t，J＝7.0Hz，CH2-Ar)，2.70(3H，s，OSO2CH3)，2.09(3H，s，Ar-Me)，1.82-1.68(2H，m，-CH2-)ppm。31P NMR(121.4MHz)δ25.26ppm。C31H33O7PS分析計算C，64.1；H，5.7；P，5.3；S，5.5。實測C，63.8；H，5.9；S，5.3；P，5.2％。
線粒體醌-C5(14).圖2B顯示線粒體醌-C5的合成路徑。將二氫吡喃(46.83g，0.55mol)加入溶于乙酸(500mL)中的2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌醇(CoQ0)(50g，0.275mol)中，并在室溫下攪拌10分鐘。向該溶液中加入BF3.Et2O(38.57g，0.271mol)。將所得溶液在室溫下攪拌18小時。之后將粗反應混合物倒至冰水中(500mL)并用氯仿(1000mL)萃取。將有機萃取物用鹽水(500mL)洗滌并干燥(MgSO4)。真空除去溶劑得到紅色油狀粗品2，3-二甲氧基-5-甲基-6-(四氫吡喃-2-基)-4-(四氫吡喃-2-基氧基)苯酚(7)(115g)，其未進一步純化即經應用。在大氣壓力及室溫下于5％鈀/炭(5.42g)上氫化粗品7(110g)在乙酸/高氯酸(97.5∶2.5，500mL)混合液中的溶液直至氫的吸收停止(3天)。然后將反應混合物通過硅藻土墊過濾并用乙醇(500mL)洗滌固體殘余物。將合并的濾液分成三等份，將各份加入蒸餾水(1000mL)中并用CH2Cl2(2×200mL)萃取。用鹽水(500mL)、飽和的碳酸氫鈉(500mL)、鹽水(300mL)洗滌、然后干燥(MgSO4)合并的有機萃取物。然后過濾混合物并真空除去溶劑，獲得紅色油狀粗品4-乙酰氧基-3-(5-乙酰氧基-戊基)-5，6-二甲氧基-2-甲基-苯基乙酸酯(8)(110g)，其不經進一步純化即用于下一步驟。1H NMRδ4.0-4.15(2H，m，-CH2-O)，3.86(6H，s，2×OMe)，2.58(2H，t，J＝7.0Hz，-CH2-Ar)，2.12(3H，s，Ar-Me)，2.06(6H，s，2×CH3-C＝O)，2.02(3H，s，CH3-C＝O)，1.35-1.70(6H，m，-CH2CH2CH2-)ppm。
將氫化鋰鋁(8.0g，0.21mol)加入置于裝有磁力攪拌器、回流冷凝器的、并由室溫水浴環繞著的1L的圓底燒瓶內的無水THF(500mL)中。在25-30分鐘期間內將粗品8(74g)在無水、新蒸餾的THF(100mL)中的溶液逐滴加入THF/LiALH4混合物中。為了便于攪拌加入額外的無水THF(200mL)，并使其在室溫下攪拌反應3小時。然后在緩慢加入蒸餾水(70mL)前通過逐滴添加3M HCl(20mL)淬滅反應。然后過濾反應混合物并將濾液用鹽水(2×300mL)洗滌、干燥(MgSO4)、過濾以及真空除去溶劑。用15％HCl(500mL)溶解殘存在過濾漏斗內的綠色殘余物并用CH2Cl2(1×300mL，2×200mL)萃取。合并有機部分并用鹽水(400mL)洗滌、干燥(MgSO4)、過濾和真空蒸發。此萃取物與來自濾液純化的物質合并得到紅色油狀粗品2-(5-羥基戊基)-5，6-二甲氧基-3-甲基-苯-1，4-二醇(9)(68.3g)。產物9用硅膠(600g，用10％乙醚/CH2Cl2填充)柱色譜純化。用10％乙醚/CH2Cl2洗脫得到一些未反應的8和2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯氫醌起始材料。用20％乙醚/CH2Cl2洗脫得到9和醌10(14.14g，19％自2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌醇)的混合物。化合物9在空氣中放置緩慢轉變成醌10，從而不能獲得令人滿意的元素分析。1H NMRδ5.41(1H，s，Ar-OH)，5.38(1H，s，Ar-OH)，4.88(6H，s，2×Ar-OMe)，3.65(2H，t，J＝6.3Hz，CH2-OH)，2.61(2H，t，J＝6.4Hz，Ar-CH2)，2.14(3H，s，Ar-Me)，1.42-1.68(6H，m，3×-CH2-)ppm。
大氣壓力下用氧氣飽和醌醇9(7.5g，27.7mmol)在CH2Cl2(150mL)中的溶液，并且加入NO2在CH2Cl2中的溶液(1mL，1.32M)。于室溫、氧氣氛下攪拌反應18小時，至此TLC(40％乙醚/CH2Cl2)顯示醌2-(5-羥基戊基)-5，6-二甲氧基-3-甲基-[1，4]苯醌(10)生成完全。然后真空除去溶劑獲得紅色油狀產物10(Yu，C.A.和Yu，L.(1982)Biochemistry 21，4096-4101)(7.40g)。1H NMRδ3.99(6H，s，2×Ar-OMe)，3.65(2H，t，J＝6.3Hz，CH2-OH)，2.47(2H，t，J＝6.3Hz，Ar-CH2)，2.01(3H，s，Ar-Me)，1.52-1.60(2H，m，-CH2-)，1.37-1.43(4H，m，-CH2CH2-)ppm。
制備10(7.40g，27.3mmol)在CH2Cl2(150mL)和三乙胺(5.46g，5.46mmol)中的溶液，并在攪拌下于30分鐘內加入甲磺酰氯(2.48g，30mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液。室溫下額外攪拌1.5小時后用蒸餾水(5×100mL)、飽和碳酸氫鈉(150mL)洗滌反應混合物并干燥(MgSO4)。過濾混合物并在真空下除去溶劑得到紅色油狀粗品甲磺酸鹽(9.03g)。1H NMRδ4.19(2H，t，J＝7.5Hz，-CH2-OMs)，3.95(6H，s，2×Ar-OMe)，2.98(3H，s，OSO2CH3)，2.44(2H，t，J＝7.5Hz，Ar-CH2-)，1.98(3H，s，Ar-Me)，1.75(2H，五重峰，J＝7.5Hz，-CH2-)，1.38-1.48(4H，m，-CH2CH2-)ppm。將甲磺酸酯溶于10％(w/v)的NaI在丙酮內的溶液(100mL)中，并在室溫下攪拌44小時。然后真空下濃縮該混合物并向殘余物中添加水(100mL)。用CH2Cl2(3×70mL)萃取該混合物并將合并的有機萃取物用鹽水洗滌、干燥(MgSO4)、過濾并真空下除去溶劑，獲得粗品2-(5-碘代戊基)-5，6-二甲氧基-3-甲基-[1，4]苯醌(11)。通過硅膠(150g)柱色譜純化該產物。用CH2Cl2和10％乙醚/CH2Cl2洗脫得到紅色油狀純11(7.05g，69％)。1H NMRδ3.99(6H，s，2×Ar-OMe)，3.18(2H，t，J＝6.9Hz，CH2-I)，2.47(2H，t，J＝7.2Hz，Ar-CH2)，2.02(3H，s，Ar-Me)，1.85(2H，五重峰，J＝7.5Hz，-CH2-)，1.38-1.48(4H，m，-CH2-CH2-)ppm。C14H19IO4分析計算C，44.5；H，5.1；I，33.6。實測C，44.6；H，5.1；I，33.4％。
用NaBH4(0.16g，4.3mmol)處理11(1.14g，2.87mmol)在甲醇(20ml)中的溶液，1分鐘內混合物變為無色。5分鐘后，室溫下加入5％的HCl水溶液(100mL)并用CH2Cl2(2×50mL)萃取該溶液。將有機部分合并、干燥(MgSO4)、過濾并真空除去溶劑，獲得對氧敏感的黃色油狀12(1.15g，100％)，其被立即使用。1H NMRδ5.36，5.31(2H，s，Ar-OH)，3.89(6H，s，2×Ar-OMe)，3.20(2H，t，J＝7.5Hz，-CH2-I)，2.62(2H，t，J＝7.5Hz，-CH2-Ar)，2.15(3H，s，Me)，1.82-1.92(2H，m，-CH2-)，1.45-1.55(4H，m，-CH2-CH2-)ppm。將12(1.15g，2.87mmol)和三苯基膦(1.2g，4.31mmol)的混合物置于具有攪拌棒的Kimax管中。將試管用氬氣充盈，于70℃密封、加熱并攪拌14小時。將形成的暗色固體溶于CH2Cl2(10mL)并在乙醚(200mL)中研磨并迅速過濾形成的白色沉淀。將在暴露于空氣中時變得粘稠的沉淀物復溶于CH2Cl2并真空蒸發，得到棕色油狀粗產物[5-(2，5-二羥基-3，4-二甲氧基-6-甲基-苯基)-戊基]三苯基碘化鏻(13)(2.07g，115％)。該物質長期保存不穩定，因此盡早地用于了下一步反應。1H NMRδ7.84-7.68(15H，m，Ar-H)，5.45(1H，s，Ar-OH)，5.35(1H，s，Ar-OH)，3.89(3H，s，Ar-OMe)，3.87(3H，s，Ar-OMe)，3.65(2H，m，-CH2-+PPh3)，2.54(2H，t，J＝7.0Hz，Ar-CH2)，2.08(3H，s，Ar-Me)，1.65-1.75(2H，m，-CH2-)，1.45-1.55(4H，m，-CH2CH2-)ppm。31P NMRδ25.43ppm。
用氧氣飽和13(2.07g)在CH2Cl2(50mL)內的溶液，并且加入NO2在CH2Cl2內的溶液(0.5mL，1.32M)。然后于室溫、氧氣氛下攪拌反應18小時。真空除去溶劑以獲得紅色油狀粗產物[5-(4，5-二甲氧基-2-甲基-3，6-二氧代-1，4-環己烯-1-基)戊基]三苯基碘化鏻(14)。將殘余物復溶于CH2Cl2(10mL)并用乙醚(200mL)研磨以得到最初的黃色沉淀，其在數分鐘內便凝結成紅色油狀物。傾析出溶劑并將沉淀溶于CH2Cl2，并真空除去溶劑以得到紅色油狀產物(14)(1.866g)。將等分試樣(0.880g)14用硅膠(20g)柱色譜純化。用CH2Cl2洗脫得到不明紫色物質。用5％乙醇/CH2Cl2洗脫得到紅色油狀純碘化物產品14(0.606g)。1H NMRδ7.84-7.68(15H，m，Ar-H)，3.98(6H，s，2×Ar-OMe)，3.65(2H，m，CH2-P+)，2.40(2H，t，J＝7.5Hz，Ar-CH2)，2.00(3H，s，Ar-Me)，1.71(4H，m，-CH2-)，1.43(2H，m，-CH2-)ppm。31P NMR(121.4MHz)δ25.47ppm。C32H36IO4P分析計算C，59.8；H，5.7；I，19.8；P，4.8；實測C，60.0；H，5.3；I，19.7；P，4.7％。
線粒體醌-C15(16).圖2C顯示線粒體醌-C15的合成路徑。于2.5小時內將K2S2O8(0.450g，1.66mmol)在水(25mL)中的溶液逐滴加入攪拌下的、維持于75℃的、AgNO3(0.262g，1.54mmol)、16-羥基十六酸(0.408g，1.50mmol)及2，3-二甲氧基-5-甲基-1，4-苯醌(0.271g，1.49mmol)在H2O∶CH3CN(1∶1，36mL)中的混懸液內。攪拌30分鐘后冷卻并用乙醚(4×30mL)萃取混合物。用H2O(2×100mL)、NaHCO3(1M，2×50mL)和飽和NaCl(2×50mL)洗滌合并的有機相。將有機相干燥(Na2SO4)、過濾及真空濃縮得到紅色油狀物(0.444g)。粗品油用柱色譜(硅膠，15g)并用CH2Cl2和乙醚(0％，5％20％)的混合物洗脫得到紅色油狀2-(15-羥基十五烷基)-5，6-二甲氧基-3-甲基-[1，4]苯醌(15)(0.192g，33％)。1H NMRδ3.99，3.98(6H，s，OMe)，3.64(2H，t，J＝6.5Hz，-CH2OH)，2.45(2H，t，J＝7.5Hz，-CH2-環)，1.4-1.2(26H，m，-(CH2)13-)。C24H40O5分析計算C，70.6；H，9.9；實測C，70.5；H，9.8％。
將三苯基膦(0.066g，0.25mmol)、Ph3PHBr(0.086g，0.25mmol)和15(0.101g，0.25mmol)于70℃氬氣下在密封的Kimax管內攪拌24小時，至此其變成粘稠的紅色油狀物。將殘余物溶于極少量的CH2Cl2(0.5mL)中并倒至乙醚(10mL)中以產生紅色油狀沉淀。傾去溶劑，將殘余物溶于CH3OH(0.5mL)并用含48％HBr(1滴)的H2O(10mL)稀釋。形成紅色沉淀，在沉淀沉降后倒出上清液并用H2O(5mL)洗滌殘余物。然后將殘余物溶于乙醇(5mL)并真空除去溶劑。將殘余物復溶于CH2Cl2(0.5mL)，用乙醚(5mL)稀釋并傾去溶劑，將殘余物置于真空系統(0.1mbar)24小時獲得[15-(4，5-二甲氧基-2-甲基-3，6-二氧代-1，4-環己二烯-1-基)十五烷基]三苯基溴化鏻(16)(0.111g，61％)，其為接觸空氣便變成紅色油狀物的黃色泡沫。1H NMR(299MHz)δ7.6-8.0(15H，m，Ar-H)，3.89(6H，s，OMe)，3.9(2H，m，-CH2-P)，2.6(2H，m，-CH2-環)，1.7-1.1(26H，m，-(CH2)13-)ppm。31P NMR(121.4MHz)δ25.71ppm。電噴霧質譜儀實測(M+)653，C42H54O4P+計算值653。由于包含溶劑的水平不一致，因此燃燒分析結果不理想。
實施例3.靶向線粒體的抗氧化化合物實例的性質為了適應多種不同的應用，例如如片劑的劑型的配制，本發明認為能夠形成靶向線粒體的抗氧化化合物的晶體或固體形式是有利的。類似地，不期望受任何理論所限，本發明認為本發明化合物的抗氧化功能至少部分取決于其理化性質。
表1所示為各種抗氧化化合物的分配系數。通過將400nmol的化合物加入至2ml PBS-飽和的辛-1-醇中并于37℃下與2ml辛-1-醇飽和的PBS混合30分鐘，從而測定辛-1-醇/PBS分配系數。由268nm的紫外吸收測量化合物在兩相中的濃度，并通過化合物在辛-1-醇飽和的PBS或PBS-飽和的辛-1-醇中的標準曲線定量(Kelso，G.F.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，Hughes，G.，Porteous，W.K.，Ledgerwood，E.C.，Smith，R.A.J.，和Murphy，M.P.，2001，J Biol Chem 276，4588；Smith，R.A.J.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，和Murphy，M.P.，1999，Eur J Biochem 263，709)。在無水乙醇中制備化合物的貯備液并于-20℃下避光保存。[3H]TPMP來自美國Radiolabelled Chemicals Inc，(MO，USA)。
需要特別注意的是，橋連抗氧化部分和鏻的碳原子數量少的化合物的分配系數低。例如，在本發明范圍內的化合物，此處是指具有3碳橋的線粒體醌-C3的分配系數比相關化合物線粒體醌-C10所觀察到的分配系數低約50倍(表1)。
表1.抗氧化劑和相關化合物的分配系數

數據a-c是如上所述于25℃或37℃測定的辛-1-醇/磷酸鹽緩沖液的分配系數，或者是使用如Jauslin，M.L.，Wirth，T.，Meier，T.，和Schoumacher，F.，2002，Hum Mol Genet 11，3055所述的Advanced ChemistryDevelopment(ACD)Software Solaris V4.67計算所得的辛醇/水的分配系數d。
aKelso，G.F.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，Hughes，G.，Porteus，W.K.，Ledgerwood，E.C.，Smith，R.A.J.，和Murphy，M.P.，2001，J Biol Chem 276，4588。
bSmith，R.A.J.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，和Murphy，M.P.1999 Eur JBiochem 263，709。
cSmith，R.A.J.，Porteous，C.M.，Gane，A.M.，和Murphy，M.P.2003 Proc NatAcad Sci 100，9，5407。
從它們的辛-1-醇/PBS分配系數中明顯看出，線粒體醌-C3、線粒體醌-C5、線粒體醌-C10和線粒體醌-C15跨越了的疏水性差異很大。線粒體醌-C3的辛-1-醇/PBS分配系數類似于簡單的、相對可溶于水的TPMP陽離子，而線粒體醌-C15的辛-1-醇/PBS分配系數顯示其具有非常低的水溶性。據報道，烷基三苯基鏻陽離子如線粒體醌被吸附至磷脂雙層上，其中陽離子位于羧酸基團水平，而疏水性烷基基團穿透至膜的疏水性核。據信，亞甲基橋越長，則抗氧化泛醌醇穿透至膜的疏水性核越深。圖3所示為我們認為這些化合物會穿透至膜單層的最大程度。這個模型顯示線粒體醌-C3的泛醌醇部分僅穿透至近膜表面處，而線粒體醌-C10和線粒體醌-C15的泛醌醇部分則穿透至近磷脂雙層的核處。
我們已經合成一系列具有不同疏水性和可穿透至磷脂雙層不同深度的抗氧化化合物。
實施例4.線粒體對靶向線粒體的化合物的吸收為了證明靶向線粒體是有效的，測定了線粒體反應膜電位而對抗氧化化合物實例線粒體醌-C3、線粒體醌-C5、線粒體醌-C10和線粒體醌-C15的吸收。
為了測量被施以電壓的線粒體對抗氧化化合物的吸收，建立了離子選擇電極(Smith，R.A.，Kelso，G.F.，James，A.M.和Murphy，M.P.(2004)Meth.Enzymol.382，45-67；Davey，G.P.，Tipton，K.F.和Murphy，M.P.(1992)Biochem.J.288，439-443；Kamo，N.，Muratsugu，M.，Hongoh，R.和Kobatake，Y.(1979)J.Membr.Biol.49，105-121)。將電極及Ag/AgCl參比電極穿過氣密的Perspex蓋、于30℃插入攪拌下的、恒溫的3ml溫育室內，其配有添加底物的注射口。為了測量抗氧化化合物的吸收，在30℃下將大鼠肝臟線粒體(1mg蛋白/ml)在KCl培養基(120mM KCl，10mMHEPES，pH為7.2，1mM EGTA)和尼日利亞菌素(1μg/ml)以及魚滕酮(8μg/ml)內溫育。將琥珀酸鹽(10mM)和FCCP(500mM)加入所示部位。離子選擇電極的輸出經前端的pH放大器被傳輸入PowerLabData采集器系統，并且使用Chart軟件進行分析，所有這些均來自ADInstruments。
通過勻漿化、隨后通過在含有250mM蔗糖、5mM Tris-HCl、1mM的EGTA、pH為7.4的冰冷的緩沖液中差速離心制備大鼠肝臟線粒體(Chappell，J.B.和Hansford，R.G.(1972)在Subcellular componentspreparation and fractionation，pp.79-91(Brinie，G.D.，Ed.)Butterworths，London)。通過采用以BSA作為標準的縮二脲試驗測定蛋白含量(Gornall，A.G.，Bardawill，C.J.和David，M.M.(1949)J.Biol.Chem.177，751-766)。通過于25℃將補充有50nCi[3H]TPMP的500nM TPMP加至混懸于KCl培養基(120mM KCl，10mM HEPES，pH7.2，1mM EGTA)的線粒體中測量線粒體膜電位(Brand，M.D.(1995)Bioenergetics-a practicalapproach，pp.39-62(Brown，G.C.和Cooper，C.E.，Eds.)IRL，Oxford)。溫育后，線粒體通過離心形成顆粒(pelleted)，用閃爍計數測定上清液和顆粒中[3H]TPMP的量，并且在假定線粒體體積是0.5μl/mg線粒體蛋白和TPMP結合校正值是0.4的情況下計算膜電位(Brown，G.C.和Brand，M.D.(1985)Biochem.J.225，399-405)。
我們建立離子選擇電極以測量它們的穩態濃度(Smith，R.A.，Kelso，G.F.，James，A.M.和Murphy，M.P.(2004)Meth.Enzymol.382，45-67；Davey，G.P.，Tipton，K.F.和Murphy，M.P.(1992)Biochem.J.288，439-443；Kamo，N.，Muratsugu，M.，Hongoh，R.和Kobatake，Y.(1979)J.Membr.Biol.49，105-121)。這些電極對簡單的三苯基鏻陽離子如TPMP的反應是Nerstian反應，30℃時電極電壓對log10[陽離子濃度]的反應呈線性，且斜率為～60mV(Davey，G.P.，Tipton，K.F.和Murphy，M.P.(1992)Biochem.J.288，439-443；Kamo，N.，Muratsugu，M.，Hongoh，R.和Kobatake，Y.(1979)J.Membr.Biol.49，105-121)。最親水的化合物線粒體醌-C3在高于10μM濃度時也可給出具有接近60mV斜率的Nernstian電極反應。對此，圖4A右側通過在不存在線粒體時電極對連續加入的1pM線粒體醌-C3的反應的對數加以說明。對線粒體醌-C5、線粒體醌-C10和線粒體醌-C15而言，在不存在線粒體時電極都能對該連續的加入快速并穩定地反應(分別為圖4B、4C和4D右側組)。然而，在這些情況下電極反應不是Nernstian反應，我們認為這歸因于這些化合物具有更高的疏水性。即使如此，對于全部四種抗氧化化合物而言，離子選擇電極能夠測量這些化合物的游離濃度，從而能夠測量線粒體對它們的實時吸收。
為了測量抗氧化化合物的吸收，在魚滕酮存在下將線粒體加入電極室以防止膜電位的形成(圖4左側)。然后我們連續5次添加1μM抗氧化化合物以校正電極反應，隨后添加呼吸基質琥珀酸鹽以產生膜電位。對線粒體施以電壓導致線粒體快速吸收所有抗氧化化合物變體(variants)，而接下來添加的解偶聯劑FCCP消除了該膜電位并導致它們從線粒體快速釋放(圖4A-D，左側)。這些試驗清楚地表明，線粒體對線粒體醌-C3、線粒體醌-C5和線粒體醌-C10的吸收是膜電位依賴性。雖然在誘導膜電位時線粒體醌-C15也被線粒體吸收，但是在線粒體存在下電極對線粒體醌-C15的反應很弱、噪音強且更易于漂移。這與不存在線粒體時線粒體醌-C15的電極反應(參見右側組)相反，且歸因于在線粒體存在下其游離濃度低。
然后測定抗氧化化合物結合至未加電的線粒體的程度(圖4，右側)。這些試驗中，首先將抗氧化化合物變體加至電極室，然后在魚滕酮存在下加入線粒體以防止膜電位形成。由于抗氧化化合物結合至未加電的線粒體，因此在添加線粒體時抗氧化化合物的濃度降低。接下來添加琥珀酸鹽以產生膜電位表明化合物吸收依賴于膜電位，然后該吸收通過加入FCCP消除膜電位而被逆轉。
線粒體醌-C3的游離濃度不受線粒體加入的影響，這表明線粒體醌-C3結合至未加電的線粒體的量可以忽略(圖4A，右側)。用琥珀酸鹽施以電壓時對FCCP敏感的線粒體醌-C3的吸收是約3.7nmol線粒體醌-C3/mg蛋白，對應于～2×103的累積比率。考慮到線粒體內結合的校正值，這與由Nernst方程以及約為180mV的線粒體膜電位所預期的相一致。
對線粒體醌-C5而言，該化合物與未加電的線粒體存在相當的結合(～0.6nmol/mg蛋白)，然而相對其之后在用琥珀酸鹽施以電壓時的吸收而言，這是可忽略的，該吸收為約2.8nmol線粒體醌-C5/mg蛋白，對應于～1.4×103的累積比率(圖4B，右側)。
對線粒體醌-C10而言，約2.6nmol線粒體醌-C10與未加電的線粒體大量結合，并且隨后在添加琥珀酸鹽時進一步吸收約1nmol/mg蛋白(圖4C，右側)。
幾乎全部的游離線粒體醌-C15都結合至未加電的線粒體，但是在用琥珀酸鹽施以電壓時還存在一定的進一步吸收。圖4D左側清楚地表明線粒體醌-C15的吸收是膜電位依賴性，其中當在線粒體的存在下對電極進行校正時電極反應高度靈敏，使得能夠測量少量的游離線粒體醌-C15。與此相反，圖4D右側中難以看出線粒體醌-C15的吸收，其中在不存在線粒體時電極反應非常不靈敏，從而不能測得線粒體醌-C15。
這些試驗表明，抗氧化化合物的亞甲基橋至少部分決定其吸收至線粒體膜的程度(圖4右側)。吸收從線粒體醌-C3的可忽略到線粒體醌-C15的幾乎完全結合不等。在將線粒體醌-C15加至未加電的線粒體時基本上所有化合物都結合，跨越內膜和外膜表面分布。我們認為，當誘導膜電位時將出現化合物從內膜外表面及外膜大量地再分布至朝向基質(matrix-facing)的內膜表面。總之，膜電位驅使所有抗氧化化合物變體都被吸收至線粒體，并且亞甲基橋越長其至磷脂雙層的吸收越強。
實施例5.靶向線粒體的化合物的實例的抗氧化效能本發明化合物還可高度有效地對抗氧化應激。為了測量抗氧化效能，通過測量在暴露于亞鐵離子和過氧化氫的線粒體內TBARS的累積測量抗氧化化合物抑制線粒體內脂質過氧化反應的能力(圖5)。
采用TBARS試驗定量脂質過氧化反應。將大鼠肝臟線粒體(2mg蛋白/ml)于37℃在補充有10mM琥珀酸鹽及8mg/ml魚滕酮或包含2.5mM ATP、1mM磷酸烯醇丙酮酸和4U/ml丙酮酸激酶的ATP再生系統的0.8ml含100mM KCl、10mM Tris-HCl、pH為7.6的培養基中溫育。然后于37℃通過添加50mM FeCl2/300mM H2O2將線粒體暴露于氧化應激15分鐘。溫育后，添加64ml 2％(w/v)丁基化的羥基甲苯在乙醇中的溶液，然后添加200ml 35％(v/v)HClO4和200ml 1％(w/v)硫代巴比土酸。然后將樣品于100℃下溫育15分鐘、離心(12,000×g，5分鐘)、并將上清液轉移至玻璃試管。添加3ml水和3ml丁-1-醇后，渦旋樣品并使兩相分離。然后用熒光讀板器(fluorometric plate reader)(λEx＝515nm；λEm＝553nm)分析有機層的200ml等分試樣以測量硫代巴比土酸反應物(TBARS)并與從0.01-5mM 1，1，3，3-四乙氧基丙烷制備的丙二醛(MDA)標準曲線作對比(Kelso，G.F.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，Hughes，G.，Porteous，W.K.，Ledgerwood，E.C.，Smith，R.A.J.和Murphy，M.P.(2001)J.Biol.Chem.276，4588-4596)。
對于以琥珀酸鹽施以電壓的線粒體而言，雖然TBARS的背景水平可以忽略，但是在暴露于氧化應激時其增加至約3.75nmol MDA/mg蛋白(圖5A；實心柱)。高濃度(5μM)的任何抗氧化化合物很大程度上抑制了TBARS的累積，而簡單的陽離子TPMP沒有。這證實了是線粒體醌抗氧化化合物的泛醌醇側鏈而不是陽離子與線粒體的任何非特異性的相互作用導致了該抗氧化作用。
在這些試驗中，琥珀酸鹽既維持膜電位以驅使陽離子吸收至線粒體，又將線粒體醌抗氧化化合物的泛醌形式再生成活性抗氧化泛醌醇形式(Kelso，G.F.，Porteous，C.M.，Coulter，C.V.，Hughes，G.，Porteous，W.K.，Ledgerwood，E.C.，Smith，R.A.J.和Murphy，M.P.(2001)J.Biol.Chem.276，4588-4596)。為了觀察線粒體醌抗氧化化合物的抗氧化效能是否需要其被呼吸鏈還原，我們將線粒體在ATP和ATP再生系統存在下溫育。ATP水解和線粒體ATP合酶的逆轉導致大范圍的可建立類似由琥珀酸鹽產生的膜電位的質子泵(proton pumping)(圖5B)。這將導致與由琥珀酸鹽施以電壓的線粒體相同的對線粒體醌抗氧化化合物的吸收，但是現在線粒體醌抗氧化化合物卻不再通過呼吸鏈再生成它們的活性泛醌醇形式。與通過琥珀酸鹽施以電壓的線粒體中所見的驚人的保護作用(圖5b，黑色柱)相比，線粒體醌抗氧化化合物對抑制由ATP水解施以電壓的線粒體內的脂質氧化反應無效(圖5a，白色柱)。因此，線粒體醌抗氧化化合物的抗氧化效能要求呼吸鏈還原線粒體醌抗氧化化合物并通過線粒體膜電位累積。
用琥珀酸鹽適宜電壓的線粒體的對照樣品所觀察到的脂質過氧化反應水平相對用ATP施以電壓的那些而言更低(圖5A)。這是由于在琥珀酸鹽存在時維持被還原的卻在ATP存在時為被氧化的內源性線粒體輔酶Q池的保護性抗氧化效應(Jame，A.M.，Smith，R.A.和Murphy，M.P.(2004)Arch.Biochem.Biophy.423，47-56；Ernster，L.，Forsmark，P.和Nordenbrand，K.(1992)Biofactor 3，241-8)。總之，全部線粒體醌抗氧化化合物需要經呼吸鏈激活為有效的抗氧化劑。
圖5A中所有線粒體醌抗氧化化合物都使用單一濃度5pM。為了比較它們的相對抗氧化效能，我們在琥珀酸鹽的存在下滴定這些化合物圖5C所示為典型的滴定。這個試驗表明，這些化合物的抗氧化效能與亞甲基橋長相關。為了對其定量，我們計算了四種線粒體醌抗氧化化合物實例抑制脂質過氧化反應的IC50值(圖4D)。這些測量證實，抗氧化效能的次序為線粒體醌-C15＞線粒體醌-C10＞線粒體醌-C5＞線粒體醌-C3。
所有的線粒體醌抗氧化化合物都被線粒體膜電位驅使至線粒體內累積。對最疏水的化合物線粒體醌-C15而言，該作用由于其廣泛結合至磷脂雙層而在很大程度上被掩蓋。全部化合物都是有效的抗氧化劑，并且要獲得15分鐘以上的持久抗氧化活性，它們都需要呼吸鏈的作用以在已除去脂質過氧化反應中間體的毒性后使線粒體醌抗氧化化合物再生為其活性形式。
實施例6.靶向線粒體的抗氧化化合物對心臟血液動力學和線粒體功能的作用。
使用Langendorf離體心臟灌流模型評價給藥靶向線粒體的抗氧化化合物特別是線粒體醌-C10和線粒體醌-C3對心臟功能的作用。將大鼠分成下列四組給藥對照組(安慰劑)、TPMP(甲基三苯基鏻)、線粒體醌-C10和線粒體醌-C3。處理期后人道地處死大鼠并將離體心臟連接至Langendorf離體灌流系統。該系統在測量心臟功能時采用通過主動脈的反向灌流以維持心臟。用左室氣囊測量左室壓。還測量了冠狀血流量。
圖6描述左室壓為10mmHg時各處理組的冠狀血流量。在局部缺血前和誘導局部缺血后的0分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘測量冠狀血流量。進行具有Bonferroni事后檢驗(post hoc test)的單因素ANOVA。相對局部缺血前對照的顯著性*P＜0.01；**P＜0.01；***P＜0.001。各時間組間的顯著性p＜0.05；p＜0.01；p＜0.001。
結果表明，用線粒體醌-C10處理能顯著地減輕局部缺血誘導的冠狀血流減少。在后來的時間點線粒體醌-C3具有相對差但仍顯著的作用。給藥TPMP未發生任何作用表明導致所觀察到的靶向線粒體的抗氧化化合物的作用的是線粒體醌-C10和線粒體醌-C3的抗氧化部分而不是三苯基鏻陽離子。
圖7描述在10mmHg時處理對左室舒張壓的作用。在誘導局部出血前測量左室舒張壓并于誘導局部缺血后0分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘再次測量。統計分析是具有Dunns事后檢驗的基于秩的ANOVA。相對局部缺血前對照的顯著性*P＜0.05。代表相對60分鐘缺血后對照P＜0.05。結果表明，用線粒體醌-C10處理導致相對未接受處理的大鼠左室舒張壓統計學顯著性地增加，減輕了局部缺血誘導的左室舒張壓降低。給藥TPMP未發生任何作用表明造成所觀察到的靶向線粒體的抗氧化化合物的作用的是線粒體醌-C10的抗氧化部分而不是三苯基鏻陽離子。
然后測定了給藥線粒體醌-C10和線粒體醌-C3對心率的作用。圖8描述各處理組局部缺血前以及誘導局部缺血后0分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘的心率。所示的結果是單因素ANOVA以及隨后的bonferroni事后檢驗。***代表相對局部缺血前對照p＜0.001。代表相對各缺血后對照p＜0.05。結果表明相對對照組大鼠，用線粒體醌-C10處理能顯著地減輕局部缺血誘導的心率降低。給藥TPMP未發生任何作用，表明造成所觀察到的靶向線粒體的抗氧化化合物的作用的是線粒體醌-C10的抗氧化部分而不是三苯基鏻陽離子。
還通過測定給靶向藥線粒體的抗氧化化合物對心臟收縮和舒張率的作用評價心臟功能。圖9A描述四個處理組每組中局部缺血前和誘導局部缺血后0分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘的收縮率(contraction rate)。圖9B描述四處理組每組中局部缺血前和誘導局部缺血后0分鐘、20分鐘、40分鐘和60分鐘的舒張率(ralaxation rate)。所有情況下，對秩進行具有Dunns事后檢驗的單因素ANOVA。*代表相對局部缺血前對照P＜0.05。代表相對各缺血后時間對照P＜0.05。代表相對各缺血后時間對照P＜0.01。
結果表明當與對照大鼠相比時，給藥線粒體醌-C10具有統計學顯著的減輕局部缺血誘導的左室收縮和舒張率降低的作用。
以上數據清晰地表明，給藥靶向線粒體的抗氧化化合物對心臟功能具有有利作用。為了確定所觀察到的對心臟功能的作用是否歸因于靶向線粒體的抗氧化化合物對線粒體功能的作用，因此評價各處理組局部缺血前和局部缺血后的線粒體活性。圖10A描述局部缺血前和局部缺血后四組處理組各組的線粒體的NAD+相關的呼吸功能(NAD+linkedrespiratory function)。圖10B代表局部缺血前和局部缺血后四組處理組中各組的FAD相關的呼吸功能。***代表相對局部缺血前對照顯著性p＜0.001。代表相對缺血后對照的顯著性是p＜0.001。
這些數據表明，相對對照大鼠，線粒體醌-C10對局部缺血后的線粒體呼吸功能具有統計學顯著的有益作用。這些結果支持給藥靶向線粒體的抗氧化化合物對心臟功能的作用歸因于對線粒體功能的保護作用的結論。
實施例7.線粒體醌-C10與β-環糊精復合物的穩定性在處方前研究中發現線粒體醌-C10的溴鹽的在固態下于25℃、50％RH和40℃、75％RH保存時隨時間降解。本試驗的目的是證實線粒體醌-C10的固態穩定性是否因與β-環糊精復合而改善。
Industrial Research Limited(新西蘭)提供批號為6的線粒體醌-C10和艾地苯醌。β-環糊精(批號70P225)購自ISP technologies Inc。NaCl、NaH PU和甲醇(HPLC)購自BDH。
純線粒體醌-C10的固態穩定性將線粒體醌-C10樣品(約5mg)精密稱定于透明瓶中并暴露于25℃，50％RH；40℃，75％RH；以及4℃于硅石上。于1、2、4、8、16、32和64天后除去瓶子，并通過經驗證的HPLC方法以于硅石上-20℃保存的線粒體醌-C10為對照進行分析。
線粒體醌-C10β-環糊精復合物的制備使用批號為6的線粒體醌-C10制備三種具有不同摩爾比的(線粒體醌-C10溴化物β-環糊精為1∶1、1∶2和1∶4)的復合物。
制備β-環糊精的水溶液將β-環糊精(1.1397g，水分含量校正后等于1.0361g)精密稱重并超聲10分鐘使其溶于重蒸水中。補水至100ml體積。
線粒體醌-C10β-環糊精(1∶1摩爾比)復合物的制備氮氣下將線粒體醌-C10溴化物(90mg，相當于59.95mg的線粒體醌-C10)的乙醇溶液置于維持于40-50℃的熱板上蒸發8分鐘。將β-環糊精溶液(10ml)和重蒸水(30ml)加入燒杯中，然后超聲40分鐘。
線粒體醌-C10β-環糊精(1∶2摩爾比)復合物的制備氮氣下將線粒體醌-C10溴化物(89.8mg，相當于59.82mg的線粒體醌-C10)的乙醇溶液置于維持于37-45℃的熱板上蒸發10分鐘，隨后于50℃蒸發3分鐘。將β-環糊精溶液(20ml)和重蒸水(20ml)加入燒杯中，然后超聲30分鐘。
線粒體醌-C10β-環糊精(1∶4摩爾比)復合物的制備氮氣下將線粒體醌-C10溴化物(90mg，相當于59.95mg的線粒體醌-C10)的乙醇溶液置于維持于37-50℃的熱板上蒸發12分鐘。將β-環糊精溶液(40ml)加入燒杯中，然后超聲20分鐘。
通過于-18℃下保存過夜使上述全部溶液凍結。使用LABCONO冷凍干燥器凍干凍結的溶液2天。將凍干的化合物于-20℃下保存。
凍干線粒體醌-C10β-環糊精復合物的差示掃描量熱法測定使用Perkin Elmer Differential Scanning Calorimeter PYRIS-1對三種凍干的復合物進行差示掃描量熱法測定。通過在氮氣下于35-50℃蒸發其乙醇溶液10分鐘制備線粒體醌-C10樣品。
使用鋁皿(No.0219-0041，由Perkin-Elmer提供)。分析在氮氣吹掃下進行。應用空鋁皿設置基線。
掃描溫度范圍是50-160℃，剛開始在50℃維持1分鐘，隨后以10℃/min速率增加直至160℃。
HPLC測定建立線粒體醌-C10的HPLC方法，使用甲醇和0.01M磷酸二氫鈉(85∶15)作為流動相，流速為1ml/min并且應用265nm處的UV-VIS檢測器。內標物是艾地苯醌。色譜柱是粒徑為5μ的Prodigy ODS3100A(Phenomenex)。以后在新柱子來后修改了此方法。在修改后方法中所使用的流動相是甲醇和0.01M磷酸二氫鈉(80∶20)。這個方法已經過驗證。在測定線粒體醌-C10β-環糊精復合物前，檢查在此HPLC方法中β-環糊精的干擾。結果顯示β-環糊精不干擾線粒體醌-C10的HPLC測定。
線粒體醌-C10β-環糊精復合物的穩定性研究由于存在三種線粒體醌-C10和β-環糊精的復合物，所以5mg不同復合物的樣品中的線粒體醌-C10的量不同。為了在不同的復合物中得到等量的線粒體醌-C10，取了不同重量的復合物4mg含1.473mg線粒體醌-C10的1∶1復合物、6.5mg含1.469mg線粒體醌-C10的1∶2復合物和11.5mg含1.467mg線粒體醌-C10的1∶4復合物，并依照標準操作規程用于穩定性研究。
向各樣品瓶中加入等分試樣的HPLC水(1.5ml)以完全溶解線粒體醌-C10β-環糊精復合物。用水將這些溶液的等分試樣(50μl)稀釋至1ml。將這些稀釋的線粒體醌-C10β-環糊精復合物的等分試樣(100μl)與200μl甲醇中的10μg/ml內標溶液渦旋。然后將這些樣品以10000rpm離心10分鐘，并將50μl上清液注入HPLC系統。使用濃度范圍為2.5到120μg/ml含5mg/ml的β-環糊精的線粒體醌-C10溶液制備標準曲線。
所有的化合物都為淺桔黃色且外觀非常蓬松。顏色不均一且朝向凍干瓶的底部更濃。
DSC的結果如下所示線粒體醌-C10當測定純線粒體醌-C10樣品時，120℃以上觀察到峰。一種線粒體醌-C10樣品可觀察到介于130℃和140℃之間的兩個主峰。當分析另一種樣品時，觀察不到這樣的主峰但是在120℃以上觀察到一些小峰。分析后，剪開皿并檢查樣品。兩種情況下樣品顏色都是暗綠至黑色。
β-環糊精在70℃和85℃間有一寬峰。
線粒體醌-C10β-環糊精(1∶1)復合物未觀察到明顯的峰。分析后剪開皿并檢查。樣品顏色輕微變化至淺棕色(無明顯變化)。
線粒體醌-C10β-環糊精(1∶2)復合物未觀察到明顯的峰。分析后觀察到樣品顏色無明顯變化。
線粒體醌-C10β-環糊精(1∶4)復合物未觀察到明顯的峰，但在120℃觀察到一非常小的放熱峰。分析后觀察到樣品顏色無明顯變化。
線粒體醌-C10純樣品峰的外觀表明樣品內正隨溫度發生變化。然而，由于樣品中有許多峰以及樣品顏色改變，因此可能由于是降解導致它們的發生。當分析另一份線粒體醌-C10樣品時，其給出與第一份樣品的不同的熱分析圖。在復合物情況下，無明顯的峰和任何顏色變化。
表2和圖11所示為純線粒體醌-C10(批號No.3)的固態穩定性研究結果。
表2.線粒體醌-C10(批號No.3)的固態穩定性


線粒體醌-C10(批號No.3)在避光下于40℃，75％RH；25℃，50％RH以及5℃于藍硅膠上的固態穩定性。數據是表達為最初含量百分比的兩個值的平均值。
由于與40℃，75％RH相比在25℃，50％RH下時顯著不穩定，因此用線粒體醌-C10批號No.4在25℃，50％RH下重復進行穩定性試驗。該第二次穩定性試驗同時在透明的和琥珀色瓶中進行，并且結果如表3和圖12中所示。
表3.線粒體醌-C10(批號No.4)的固態穩定性

避光測量線粒體醌-C10(批號No.4)在25℃，50％RH下的固態穩定性。數據為表達為最初含量的百分比的三個值的平均值。
Chemistry Department提供的兩批次(批號No.3和4)的線粒體醌-C10在16天后含量突然下降。然而，與批號No.3相比，批號No.4在32至64天后的降解不如批號No.3強烈。還觀察到無論瓶子是透明還是琥珀色都不影響線粒體-C10的穩定性。
將IRL提供的線粒體醌-C10用于制備線粒體醌-C10β-環糊精復合物。IRL提供的線粒體醌-C10是乙醇溶液中的紅-黃色漿。表4和圖13、14及15所示為線粒體醌-C10β-環糊精復合物的穩定性。由于可用于研究的線粒體醌-C10β-環糊精復合物量少，因而沒有第一天和第四天的結果。
表4.線粒體醌-C10β-環糊精復合物的固態穩定性

線粒體醌-C10β-環糊精復合物在避光下40℃，75％RH；25℃，50％RH和5℃于藍硅膠上的固態穩定性。數據為表達為百分比的兩個值的平均值。
結果顯示線粒體醌-C10可有效地與β-環糊精形成復合物，并且可通過與β-環糊精復合而被穩定化。這些結果表明在1∶1和1∶2的β-環糊精復合物中的線粒體醌-C10在各種條件下均穩定。結果還表明在1∶4復合物中的線粒體醌-C10的穩定性與1∶1和1∶2的β-環糊精復合物中的線粒體醌-C10的穩定性相比有所降低。
實施例8.線粒體醌-C10甲磺酸鹽的穩定性研究線粒體醌-C10甲磺酸鹽的溶液穩定性在兩種溫度25℃和40℃、兩種氣氛條件空氣和氮氣下依照申請人的標準操作規程測定了線粒體醌-C10甲磺酸鹽在五種溶劑水、0.01MHCl、0.01M NaOH、IPB(pH 7.4)和50％MeOH中125天的溶液穩定性。
通過稀釋1mg/ml線粒體醌-C10甲磺酸鹽水中的貯備液制備五種溶劑中的線粒體醌-C10甲磺酸鹽溶液(100μg/ml)。將溶液(5ml)置于玻璃瓶中，用空氣或氮氣吹掃，密封并放置儲藏。于第0、1、2、4、8、16、32、64和125天收集等分試樣(0.25ml)并用HPLC測定線粒體醌-C10的濃度。
表5所示為試驗結果。因為線粒體醌-C10甲磺酸鹽在0.01M NaOH中15分鐘內就分解，所以未包括線粒體醌-C10甲磺酸鹽在該溶劑中的穩定性。結果表明(a)溶液穩定性與溶液上的氣氛無關，以及(b)溫度對除HCl外的所有溶劑中線粒體醌-C10的穩定性有顯著的影響。
表5.線粒體醌-C10甲磺酸鹽在四種不同的溶劑中在不同條件下的溶液穩定性


數據是表達時間為0時的值的百分比的兩個值的平均值。
圖16、17、18和19中也顯示了線粒體醌-C10甲磺酸鹽在四種溶劑中的穩定性。
線粒體醌-C10甲磺酸鹽的固態穩定性依照申請人的標準操作規程在避光的三種不同條件下進行線粒體醌-C10甲磺酸鹽的固態穩定性研究40℃，75％RH；25℃，50％RH和4℃于藍硅膠上。
將已知重量的線粒體醌-C10甲磺酸鹽置于透明玻璃瓶中，并在不同條件下保存。于第1、2、4、8、16、32、64和125天取出雙份樣品并在將樣品溶于水后通過HPLC測定線粒體醌-C10甲磺酸鹽的濃度。結果如表6和圖20所示。
線粒體醌-C10甲磺酸鹽在4℃于硅膠上在125天期間且在25℃/50％RH條件下60天期間穩定(＜10％分解)。
表6.線粒體醌-C10甲磺酸鹽在40℃，75％RH；25℃，50％RH和藍硅膠上4℃的固態穩定性。

數據是表達為時間為0時的值的百分比的兩個值的平均值。
實施例9.線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物的穩定性研究線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物的溶液穩定性在兩種溫度25℃和40℃、兩種氣氛條件空氣和氮氣下依照申請人的標準操作規程測定了線粒體醌-C10甲磺酸鹽在五種溶劑水、0.01MHCl、0.01M NaOH、IPB(pH 7.4)和50％MeOH中64天的溶液穩定性。
通過稀釋線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物(線粒體醌-C10甲磺酸鹽1mg/ml)水中的貯備液制備五種溶劑中的線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物溶液(線粒體醌-C10甲磺酸鹽100μg/ml)。將溶液(5ml)置于玻璃瓶中，空氣或氮氣吹掃，密封并放置儲藏。于第0、1、2、4、8、16、32、64和125天收集等分試樣(0.25ml)并用HPLC測定濃度。
表7和圖21、22、23及24所示為試驗結果。因為線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物在0.01M NaOH中15分鐘內就分解，所以其中未包括線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物在該溶劑中的穩定性。結果表明(a)溶液穩定性與溶液上的氣氛無關以及(b)溫度對除HCl外的所有溶劑中線粒體醌-C10甲磺酸鹽在1∶2的β-環糊精復合物中的穩定性有顯著的影響。
表7.線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物在不同條件下四種不同溶劑中的溶液穩定性


數據是表達時間為0時的值的百分數的兩個值的平均值。線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物的固態穩定性依照申請人的標準操作規程在避光的以及三種不同條件下對線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物的固態穩定性進行研究40℃，75％RH；25℃，50％RH和藍硅膠上4℃。
將已知重量的線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物置于透明玻璃瓶中，并在不同條件下保存。于第1、2、4、8、16、32、64和125天取出雙份樣品，并在將樣品溶于水后通過HPLC測定線粒體醌-C10甲磺酸鹽的濃度。結果如表8和圖25所示。結果顯示，線粒體醌-C10甲磺酸鹽在1∶2的β-環糊精復合物中在4℃藍硅膠上以及25℃/50％RH穩定。在40℃、75％RH下保存64天時線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物中37％線粒體醌-C10甲磺酸鹽降解。
表8.線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物在40℃，75％RH；25℃，50％RH和4℃藍硅膠上的固態穩定性。

數據是表達為時間為0時的值的百分數的兩個值的平均值。*代表差異很大的兩個值的平均值(71.9和31.1％)。
實施例10.線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物的穩定性研究溶液穩定性在兩種溫度25℃和40℃、兩種氣氛條件空氣和氮氣下依照申請人的標準操作規程測定線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物在五種溶劑水、0.01M HCl、0.01M NaOH、IPB(pH 7.4)和50％MeOH中64天的溶液穩定性。
通過稀釋線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物(線粒體醌-C10甲磺酸鹽1mg/ml)水中的貯備液制備線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物在五種溶劑中的溶液(線粒體醌-C10甲磺酸鹽100μg/ml)。將溶液(5ml)置于玻璃瓶中，空氣或氮氣吹掃，密封并放置儲存。于第0、1、2、4、8、16、32、64和125天收集等分試樣(0.25ml)并用HPLC測定濃度。
表9和圖26、27、28及29所示為試驗結果。因為線粒體醌-C10在0.01M NaOH中15分鐘內就分解，所以其中未包括線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物在該溶劑中的穩定性。結果表明(a)溶液穩定性與溶液上的氣氛無關以及(b)溫度對水和IPB中與β-環糊精的1∶1復合物內的線粒體醌-C10甲磺酸鹽的穩定性有顯著的影響，但是對HCl或50％MeOH中的沒有。
表9.線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物在四種不同的溶劑中在不同條件下的溶液穩定性。

數據是表達為時間0時的值的百分數的兩個值的平均值。
固態穩定性依照申請人的標準操作規程在避光的三種不同條件下對線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物的固態穩定性進行研究40℃，75％RH；25℃，50％RH和4℃藍硅膠上。
將已知重量的線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物置于透明玻璃瓶中并在不同條件下保存。于第1、2、4、8、16、32、64和125天取出雙份樣品，并在將樣品溶于水后通過HPLC測定線粒體醌-C10甲磺酸鹽的濃度。結果如表10和圖30所示。結果顯示，線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物在4℃藍硅膠上以及25℃、50％RH條件下儲存125天線粒體醌-C10甲磺酸鹽穩定，但是在40℃、75％RH下儲存125天37％的線粒體醌-C10甲磺酸鹽降解。
表10.線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶1)復合物在40℃，75％RH；25℃，50％RH和4℃藍硅膠上的固態穩定性。

數據是表達為時間為0時值的百分數的兩個值的平均值。
實施例11.大鼠單次注射和口服給藥線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物的藥動學研究(P2&P3)基于之前線粒體醌-C10溴化物的藥動學研究以及線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物的急性口服毒性試驗的結果，確定用于藥動學研究的線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物的劑量是口服給藥50mg/kg線粒體醌-C10甲磺酸鹽、靜脈注射給藥10mg/kg線粒體醌-C10甲磺酸鹽。
試驗前48小時在氟烷麻醉下將硅橡膠管插入雌性Wistar大鼠(均重約236g)的右頸靜脈。新鮮制備線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物水溶液(線粒體醌-C10甲磺酸鹽10mg/ml)并通過口服(n＝5)或靜脈注射(n＝5)途徑給藥。于靜脈注射給藥后0、5、10、20、30、45、60、90、120、180、240、360、720和1440(24小時)分鐘采集血樣(0.2ml)，在口服給藥后0、15、30、60、90、120、150、180、240、300、420、540、720和1440(24小時)分鐘采集血樣(0.2ml)。將血樣離心并將血漿樣品(0.1ml)于-20℃的制冷器內保存。還采集24小時的尿液和糞便樣品。
應用LC/MS通過ESR測定線粒體醌-C10甲磺酸鹽的血漿濃度(表12)。
藥動學分析采用MINIM通過迭代的未加權的非線性最小二乘法回歸分析線粒體醌-C10的藥動學。將靜脈注射數據用一、二和三室模型擬合。最適合的模型是根據Akaike信息準則(A.I.C)具有最小值的模型。據發現，可用如下方程所述的三室開放式模型最佳及充分地擬合給藥后的血漿藥物濃度-時間曲線C＝Ae-αt+Be-βt+Ce-γt其中C是血漿藥物濃度，A、B和E是數學系數，α是分布相的速率常數、β是中間相(分布或清除)的速率常數，而γ是終末緩慢消除相的速率常數。終末期的藥物清除半衰期(t1/2)經計算為t1//2＝0.693/γ。口服數據(4小時后)經擬合為一室模型。可直接從濃度-時間曲線獲得達峰濃度(Cmax)和到達Cmax的時間(tmax)。采用線性梯形法則逼近法(lineartrapezoidal rule)，將最后測量的濃度外推至通過使用終末消除速率常數(γ)確定的無窮大，以估計血漿濃度-時間曲線(AUC)下的面積。靜脈(CL)和口服(CL/F)給藥后的總血漿清除率用CL＝劑量/AUC估算。分布容積用Vβ＝劑量/(AUC·β)和Vγ＝劑量/(AUC·γ)計算。絕對生物利用度(F)用F＝AUCpo×劑量iv/AUCiv×劑量po計算。平均滯留時間用AUMC/AUC計算。穩態時的表觀分布容積(Vss)用劑量iv×AUMC/(AUC)2計算。
結果與討論圖31所示為IV和口服給藥線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物后的線粒體醌-C10甲磺酸鹽的平均血漿濃度-時間曲線，表11所列為平均藥動學參數。所附為線粒體醌-C10甲磺酸鹽血漿水平的原始數據(表12)。
表11.大鼠單次靜脈注射(10mg/kg)和口服(50mg/kg)以線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物給藥線粒體醌-C10甲磺酸鹽的藥動學參數

*t1/2值得自時間＞4小時的平均濃度**t1/2值得自時間＞4小時的平均濃度表12.用于P2-IV和P3-PO研究的線粒體醌-C10的大鼠血漿濃度

靜脈注射給藥后，非常快速的分布相后是較慢的分布或者初始消除相，隨后在約4小時時是延長的消除相。用三室模型擬合線粒體醌-C10的濃度-時間曲線，終末半衰期是1.8小時，但是基于所謂的“4小時后”劑量的數據的半衰期為14.3小時(表13)。
口服給藥后，線粒體醌-C10從大鼠胃腸道快速吸收。口服給藥1小時內達到了線粒體醌-C10的峰值血漿濃度，并且隨后隨時間緩慢降低，基于4小時后數據的清除半衰期約為14小時。F值經估算為12.4％。
表13.線粒體醌-C10甲磺酸鹽-β-環糊精(1∶2)復合物的IV(P2)和口服(P3)藥動學

***此處所參考和提及的全部專利、出版物、科學論文以及其它文獻和材料表現出本發明所屬領域的技術人員的技術水平，并且在此并入各篇文獻和材料作為參考，該并入與分別并入其整體作為參考或在此處分別列出其整體相同。申請人保留將任意或全部材料和信息從任何這些專利、出版物、科學論文、網站、電子信息(electronially available information)和其它所參考的材料或文獻中實體地并入至此說明書中的權利。
此處所述的特定方法和組合物是各種具體實施方案或優選的具體實施方案的代表，且僅用作舉例說明，而并非意欲限制本發明的范圍。其它目的、方面、實施例和具體實施方案是本領域技術人員在思考此說明書時將會想到的，并且都包含于如權利要求所定義的本發明精神范圍內。在不脫離本發明范圍和精神下對此處所公開的發明作種種的取代和修改對本領域技術人員而言是顯而易見的。此處經舉例說明的本發明可在缺少未于此處明確地公開為必不可少的一個或多個組成部分或者一個或多個限制條件下適當地實施。因此，例如，在此于各種情況下，本發明各實施例、具體實施方案中，任何術語“包括/包含”、“基本上由…組成”和“由…組成”可用說明書中的其它兩個術語中的任意一個代替。同樣，術語“包含”、“包括”、“含有”等應被認為具有廣泛的含義而并非用于加以限制。此處經舉例說明的方法和過程可以不同的步驟順序實施，并且它們不受此處或權利要求中所示的步驟順序的約束。并且，除非上下文中明確指出，否則如此處及所附權利要求書中所用的單數形式“一”、“一個”和“所述/該”包括復數涵義。因此，舉例而言，所述的“一個主體細胞”包括多個(例如培養物或種數)的這種主體細胞，等等。在任何情況下都不能理解為本發明受本發明具體公開的特定實施例或具體實施方案或者方法所限。在任何情況下都不能理解為本專利受限于任何審查員或任何其它專利和商標管理局的官員或職員的任何陳述，除非在申請人的書面答復中具體地、毫無條件或毫無保留地、確切地采用了該陳述。
所采用的術語和表達方式均是說明性，而并非對本發明的限制，并且應用這些術語和表達方式并非有意地將所示或所述的特征的等同物或其部分排除在外，而應認為在如所要求保護的本發明范圍內的各種變化都是可能的。因此，應理解為盡管本發明通過優選的具體實施方案以及任選的特征而具體地公開，但由于此處所公開的概念的變化或改變可能為本領域技術人員的常規應用，因此理應認為這些變化和改變被涵蓋在如所附權利要求書所述的本發明范圍之內。
此處寬廣并概括地描述了本發明。所有的落入上位公開范圍的窄的具體種類或較下位的分類同樣構成本發明的一部分。這包括采用限制性條文或負限定(negative limitation)對本發明的概括說明，且與所排除的內容是否在此處具體地列舉無關。
其它的具體實施方案在以下權利要求書范圍內。此外，當本發明的特征和方面以馬庫什組的方式加以說明時，本領域技術人員會認識到，本發明同樣由此以各馬庫什組中成員或成員的亞組的形式加以說明。
本發明的化合物可用于人類患者的選擇性抗氧化治療以抑制線粒體損傷。其可用以抑制與特定疾病如帕金森病或與線粒體DNA突變有關的疾病相關的線粒體氧化應激升高。它們還可用于神經退化性疾病的細胞移植療法，以增加所移植細胞的成活率。
此外，這些化合物可用作預防用藥以在移植過程中保護器官或緩解外科手術過程中發生的缺血一再灌注損傷。本發明化合物還可用于緩解中風和心臟病發作后的細胞損傷，或可預防性地向易患腦缺血的早產兒給藥。本發明方法與現有的抗氧化物療法相比主要的優點是它們能夠使抗氧化劑選擇性地于線粒體內累積。而線粒體是細胞中氧化應激最激烈的部分。該優點將極大地增加抗氧化療法的有效性。
本領域技術人員將認識到，上述說明書僅是采用舉例的方法進行說明，且可采用不同的親脂性陽離子/抗氧化劑組合而不脫離本發明的范圍。
權利要求
1.一種化合物，其包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中所述陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
2.一種穩定的化合物，其包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中所述陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且其中所述陰離子補體不是鹵素離子且所述陰離子補體是非親核性的和/或所述陰離子補體不顯示不利于陽離子部分、連接部分或抗氧化部分的反應性。
3.如權利要求1或2所述的化合物，其中所述抗氧化部分是醌或醌醇。
4.如權利要求1或2所述的化合物，其中所述抗氧化部分選自包括以下物質的組中維生素E和維生素E衍生物、鏈斷裂抗氧化劑包括丁基化的羥基苯甲醚、丁基化的羥基甲苯、常規自由基捕獲劑包括衍生化的富勒烯、自旋捕獲劑包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亞硝基苯、tert-亞硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相關化合物的衍生物。
5.如權利要求1至4之一所述的化合物，其中所述親脂性陽離子部分是取代或未取代的三苯基鏻陽離子。
6.如權利要求5所述的化合物，其中所述化合物如通式I和/或其醌醇形式所示， 其中R1、R2和R3可相同或不同，選自(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是從約2到約20的整數，其中Z是非反應性的陰離子。
7.如權利要求6所述的化合物，其中Z選自以下組中烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
8.如權利要求6或權利要求7所述的化合物，其中(C)n橋的C是飽和的。
9.如權利要求8所述的化合物，其中化合物如下式和/或其醌醇形式所示， 其中Z是非親核性陰離子。
10.如權利要求9所述的化合物，其中化合物如下式所示
11.一種包括以下化合物的藥物組合物，該化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
12.一種包括以下穩定的化合物的藥物組合物，該化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且其中的陰離子補體不是鹵素離子，且所述陰離子補體是非親核性的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
13.如權利要求11或12所述的組合物，其中所述抗氧化部分是醌或醌醇。
14.如權利要求11或12所述的組合物，其中所述抗氧化部分選自包括以下物質的組中維生素E和維生素E衍生物、鏈斷裂抗氧化劑包括丁基化的羥基苯甲醚、丁基化的羥基甲苯、常規自由基捕獲劑包括衍生化的富勒烯、自旋捕獲劑包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亞硝基苯、tert-亞硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相關化合物的衍生物。
15.如權利要求11至14之一所述的化合物，其中所述親脂性陽離子部分是取代或未取代的三苯基鏻陽離子。
16.如權利要求15所述的組合物，其中所述化合物如通式I和/或其醌醇形式所示， 其中R1、R2和R3可相同或不同，選(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是從約2到20的整數，且其中Z是非反應性的陰離子。
17.如權利要求16所述的組合物，其中Z選自以下組中烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
18.如權利要求16或權利要求17所述的組合物，其中(C)n橋的C是飽和的。
19.如權利要求18所述的組合物，其中所述化合物如下式和/或其醌醇形式所示， 其中Z是非親核性陰離子。
20.如權利要求11至19之一所述的組合物，其中所述組合物包括環糊精。
21.如權利要求20所述的組合物，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約10∶1到約1∶10。
22.如權利要求21所述的組合物，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約5∶1到約1∶5。
23.如權利要求22所述的組合物，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約4∶1到約1∶4。
24.如權利要求23所述的組合物，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約2∶1到約1∶2。
25.如權利要求24所述的組合物，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶1。
26.如權利要求24所述的組合物，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
27.如權利要求20至26之一所述的組合物，其中所述化合物如下式所示
28.如權利要求11至27之一所述的組合物，其中所述環糊精是β-環糊精。
29.如權利要求28所述的組合物，其中所述化合物如式III所示， 并且所述化合物比環糊精的摩爾比是約1∶2。
30.如權利要求11至29之一所述的組合物，其中所述組合物被配制用于口服給藥。
31.如權利要求11至29之一所述的組合物，其中所述組合物被配制用于胃腸道外給藥。
32.一種包含以下化合物以及任意的藥物學可接受的稀釋劑和/或載體和/或賦形劑的劑量單位，該化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中所述陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
33.一種包含以下穩定的化合物的劑量單位，該化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且其中的陰離子補體不是鹵素離子，且所述陰離子補體是非親核性的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于陽離子部分、連接部分或抗氧化部分的反應性。
34.如權利要求32或33所述的劑量單位，其中所述抗氧化部分是醌或醌醇。
35.如權利要求32或33所述的劑量單位，其中所述抗氧化部分選自包括以下物質的組中維生素E和維生素E衍生物、鏈斷裂抗氧化劑包括丁基化的羥基苯甲醚、丁基化的羥基甲苯、常規自由基捕獲劑包括衍生化的富勒烯、自旋捕獲劑包括5，5-二甲基吡咯啉-N-氧化物、叔丁基亞硝基苯、tert-亞硝基苯、α-苯基叔丁基硝酮和相關化合物的衍生物。
36.如權利要求32至35之一所述的劑量單位，其中所述親脂性陽離子部分是取代或未取代的三苯基鏻陽離子。
37.如權利要求36所述的劑量單位，其中所述化合物如通式I和/或其醌醇形式所示， 其中R1、R2和R3可相同或不同，選自(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是從約2到20的整數，且其中Z是非反應性的陰離子。
38.如權利要求37所述的劑量單位，其中Z選自以下組中烷基或芳基磺酸根或烷基或芳基硝酸根。
39.如權利要求37或權利要求38所述的劑量單位，其中(C)n橋的C是飽和的。
40.如權利要求39所述的劑量單位，其中所述化合物如下式和/或其醌醇形式所示， 其中Z是非親核性陰離子。
41.如權利要求32至40之一所述的劑量單位，其中所述劑量單位包括環糊精。
42.如權利要求41所述的劑量單位，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約10∶1到約1∶10。
43.如權利要求42所述的劑量單位，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約5∶1到約1∶5。
44.如權利要求43所述的劑量單位，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約4∶1到約1∶4。
45.如權利要求44所述的劑量單位，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約2∶1到約1∶2。
46.如權利要求45所述的劑量單位，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶1。
47.如權利要求45所述的劑量單位，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
48.如權利要求40至47之一所述的劑量單位，其中所述化合物如下式所示
49.如權利要求41至48之一所述的劑量單位，其中所述環糊精是β-環糊精。
50.如權利要求49所述的劑量單位，其中所述化合物如式III所示， 并且所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
51.如權利要求32至50之一所述的劑量單位，其中所述劑量單位被配制用于口服給藥。
52.如權利要求32至50之一所述的劑量單位，其中所述劑量單位被配制用于胃腸道外給藥。
53.如權利要求1至10之一所述的化合物或其藥物學可接受的鹽，其是用于通過向哺乳動物給藥該化合物或其鹽以預防或治療所述哺乳動物中的氧化應激。
54.如權利要求1至10之一所述的化合物或其藥物學可接受的鹽，其是用于通過向哺乳動物給藥該化合物或其鹽以預防或治療所述哺乳動物的衰老癥狀。
55.如權利要求53或54所述的化合物或其藥物學可接受的鹽，其中所述的給藥在第一天的劑量為日常維持劑量的約1.02到約2.0倍，隨后在后續日中以日常維持劑量給藥所述化合物或其鹽。
56.如權利要求53至55之一所述的化合物或其藥物學可接受的鹽，其中所述化合物如下式和/或其醌醇形式所示， 其中Z是非親核性陰離子。
57.如權利要求53至56之一所述的化合物或其藥物學可接受的鹽，其中所述鹽是其甲磺酸鹽。
58.如權利要求53至56之一所述的化合物或其藥物學可接受的鹽，其中所述化合物與環糊精組合。
59.如權利要求58所述的化合物，其中所述化合物如式III所示， 其中所述環糊精是β-環糊精，而所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
60.一種適于口服給藥的劑量單位，其包括如權利要求1至10之一所述的化合物作為活性成分，該化合物為或被配制為晶體形式和/或非液體形式。
61.一種適于胃腸道外給藥的劑量單位，其包括如權利要求1至10之一所述的化合物作為活性成分。
62.一種適于治療可受益于氧化應激減少或衰老癥狀減少的患者的藥物組合物，其包括或包含與一種或多種藥物學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑組合的有效量的如權利要求1至10之一所述的化合物。
63.如權利要求62所述的組合物，其中所述化合物是如通式I和/或其醌醇形式所示的化合物， 其中R1、R2和R3可相同或不同，選自(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是從約2到20的整數，且其中Z是非反應性的陰離子。
64.如權利要求63所述的組合物，其中所述化合物如下式和/或其醌醇形式所示， 其中Z是非親核性陰離子。
65.如權利要求62至64之一所述的組合物，其中所述組合物包括環糊精。
66.如權利要求65所述的組合物，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約10∶1到約1∶10。
67.如權利要求66所述的組合物，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約5∶1到約1∶5。
68.如權利要求67所述的組合物，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約4∶1到約1∶4。
69.如權利要求68所述的組合物，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約2∶1到約1∶2。
70.如權利要求69所述的組合物，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶1。
71.如權利要求69所述的組合物，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
72.如權利要求65至71之一所述的組合物，其中所述化合物如下式所示
73.如權利要求65至72之一所述的組合物，其中所述環糊精是β-環糊精。
74.如權利要求73所述的組合物，其中所述化合物如下式所示， 并且所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
75.如權利要求61至74之一所述的組合物，其中所述組合物被配制用于口服給藥。
76.如權利要求61至74之一所述的組合物，其中所述組合物被配制用于胃腸道外給藥。
77.一種減少細胞內氧化應激的方法，其包括使所述細胞接觸一種化合物的步驟，該化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
78.一種減少細胞內氧化應激的方法，其包括使所述細胞接觸一種穩定的化合物的步驟，該穩定的化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且其中陰離子補體不是鹵素離子且所述陰離子補體是非親核性的和/或所述陰離子補體不顯示不利于陽離子部分、連接部分或抗氧化部分的反應性。
79.如權利要求77或78所述的方法，其中所述化合物是如通式I和/或其醌醇形式所示的化合物， 其中R1、R2和R3可相同或不同，選自(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是從約2到20的整數，且其中Z是非反應性的陰離子。
80.如權利要求79所述的方法，其中所述化合物如下式和/或其醌醇形式所示， 其中Z是非親核性陰離子。
81.如權利要求77至80之一所述的方法，其中所述化合物與環糊精復合。
82.如權利要求81所述的方法，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約10∶1到約1∶10。
83.如權利要求82所述的方法，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約5∶1到約1∶5。
84.如權利要求83所述的方法，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約4∶1到約1∶4。
85.如權利要求84所述的方法，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約2∶1到約1∶2。
86.如權利要求85所述的方法，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶1。
87.如權利要求85所述的方法，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
88.如權利要求81至87之一所述的方法，其中所述化合物如下式所示 89.如權利要求81至88之一所述的方法，其中所述環糊精是β-環糊精。
90.如權利要求89所述的方法，其中所述化合物如下式所示， 并且所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
91.一種治療或預防可受益于氧化應激減少和/或衰老癥狀減少的患者的方法，其包括向所述患者給藥一種化合物、組合物和/或劑型的步驟，其中該化合物是如下化合物或者該組合物或劑型包含如下化合物，其包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
92.一種治療或預防可受益于氧化應激減少和/或衰老癥狀減少的患者的方法，其包括向所述患者給藥一種化合物、組合物和/或劑型，其中該化合物是如下穩定的化合物或者該組合物或劑型包含如下穩定的化合物，其包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且其中陰離子補體不是鹵素離子且所述陰離子補體是非親核性的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于陽離子部分、連接部分或抗氧化部分的反應性。
93.如權利要求91所述的方法，其中所述組合物是如權利要求11至31之一所述的組合物。
94.如權利要求91所述的方法，其中所述劑型是如權利要求32至52之一所述的劑型。
95.如權利要求91或92所述的方法，其中所述靶向線粒體的抗氧化化合物是式I和/或其醌醇形式的化合物， 其中R1、R2和R3可相同或不同，選自(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是從約2到20的整數，且其中Z是非反應性的陰離子。
96.如權利要求95所述的方法，其中所述化合物與環糊精復合。
97.如權利要求96所述的方法，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約10∶1到約1∶10。
98.如權利要求97所述的方法，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約5∶1到約1∶5。
99.如權利要求98所述的方法，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約4∶1到約1∶4。
100.如權利要求99所述的方法，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約2∶1到約1∶2。
101.如權利要求100所述的方法，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶1。
102.如權利要求100所述的方法，其中所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
103.如權利要求95至102之一所述的方法，其中所述化合物如下式所示
104.如權利要求95至103之一所述的方法，其中所述環糊精是β-環糊精。
105.如權利要求104所述的方法，其中所述化合物如下式所示， 并且所述化合物與環糊精的摩爾比是約1∶2。
106.如權利要求91至105之一所述的方法，其中所述的給藥是口服給藥。
107.如權利要求91至105之一所述的方法，其中所述的給藥胃腸道外給藥。
108.如下的化合物在制備或制造可有效用于減少患者氧化應激的藥物、劑量單位或藥物組合物中的應用，該化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
109.如下的化合物以及其它的一種物質或多種物質在制備或制造可有效用于減少患者衰老癥狀的藥物、劑量單位或藥物組合物中的應用，該化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
110.如下的化合物在制備或制造可有效用于減少細胞內氧化應激的組合物中的應用，該化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
111.一種合成如式I所示的化合物(和/或其醌形式)的方法， 其中R1、R2和R3可相同或不同，選自(任選地被取代的)C1至C5的烷基部分或H，并且其中n是從約2到20的整數，所述方法包括混入環糊精。
112.一種合成如式III所示的化合物的合成方法， 所述方法包括混入環糊精。
113.一種基本上如此處所述的合成如下式所示的化合物的方法。
114.一種適于治療患有或易患帕金森病、阿爾茨海默病、亨庭頓氏舞蹈病或弗里德賴希氏共濟失調的患者的藥物組合物，其包括與一種或多種藥物學可接受的載體、賦形劑或稀釋劑組合的有效量的化合物，該化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
115.如權利要求114所述的組合物，其適用于治療患有或易患弗里德賴希氏共濟失調的患者。
116.一種治療或預防患有或易患帕金森病、阿爾茨海默病、亨庭頓氏舞蹈病或弗里德賴希氏共濟失調的患者的方法，其包括向所述患者給藥化合物的步驟，該化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
117.如權利要求116所述的方法，其中所述的治療或預防是針對患有或易患弗里德賴希氏共濟失調的患者。
118.如下的化合物在制備或制造可有效用于治療或預防患有或易患帕金森病、阿爾茨海默病、亨庭頓氏舞蹈病或弗里德賴希氏共濟失調的患者的藥物、劑量單位或藥物組合物中的應用，該化合物包括由連接部分連接至抗氧化部分的親脂性陽離子部分以及所述陽離子部分的陰離子補體，其中陽離子部分可使抗氧化部分靶向于線粒體，并且該鹽形式是化學穩定的和/或所述陰離子補體不顯示出不利于抗氧化部分、陽離子部分或連接部分的反應性。
119.如權利要求118所述的應用，其中所述藥物、劑量單位或藥物組合物可有效用于治療或預防患有或易患弗里德賴希氏共濟失調的患者。
全文摘要
本發明涉及藥物學可接受的兩親性抗氧化化合物、所述化合物的組合物和劑型、以及依賴于所述化合物的方法和應用。所述化合物的實例都是線粒體醌衍生物，為甲氧基苯基烷基三苯基鏻或甲氧基二氧代環己二烯基烷基三苯基鏻衍生物。舉例而言，這些化合物、組合物、劑型、應用和方法可有效于治療與氧化應激相關的疾病或癥狀。
文檔編號A61K33/42GK1839142SQ200480024155
公開日2006年9月27日 申請日期2004年8月23日 優先權日2003年8月22日
發明者肯尼思·馬丁·泰勒, 羅賓·史密斯 申請人:澳新制藥公司