生產神經元的方法

專利名稱：生產神經元的方法
技術領域：
本發明涉及細胞組合物的生產，更特別的是涉及含有神經元的組合物。
背景技術：
考慮到神經組織康復的效率低且緩慢，現迫切需要開發一種生產可移植或可植入的神經元組合物的方法。當然，在所有器官、組織或細胞移植中，避免神經元植入物的免疫排斥是至關重要的。
發明概述本發明人發現，在血漿凝塊中培養未分化的間充質細胞(UMC)的結果是在血漿凝塊中神經元的生長。因此本發明公開了一種涉及在血漿凝塊中培養UMC來生產神經元群的方法。本發明也提供了用這種方法生產的分離的神經元和含有包括由本發明的方法產生的神經元的分離的細胞群的組合物。在另外一個實施方案中，本發明包括將神經組織缺損或損傷修復為神經組織的方法。
更特別的是，本發明公開了生產神經元的方法。該方法包括如下連續步驟(a)提供未分化的間充質細胞(UMC)來源；(b)提供含有約6mM到約18mM Ca2+的血漿凝塊；(c)將UMC從來源加入到血漿凝塊中；和(d)孵育血漿凝塊。在孵育期間，血漿凝塊中的UMC亞群分化為神經元，從而在血漿凝塊中產生了包括神經元的細胞群。該方法可進一步涉及將細胞群從血漿凝塊中分離，并且任選地在沒有血清的培養基中培養被分離的細胞群。
任選地，UMC的來源可以從被給予細胞群的個體獲得。UMC的來源可以是例如哺乳動物的皮膚碎片或是哺乳動物脂肪組織碎片。
此外，UMC的來源可以是含有UMC的不貼壁的衍生細胞群，不貼壁的衍生細胞是由包括如下步驟的程序生產的(a)提供含有未分化的間充質細胞(UMC)的組織碎片以獲得起始細胞；(b)從所述碎片中分離起始細胞；(c)培養起始細胞；并且(d)從所述培養物中收獲不貼壁的衍生細胞群，其中所述的不貼壁的衍生細胞包括UMC。生產含有UMC的細胞群的這個程序可以進一步包括一輪或多輪衍生，包括利用從前一輪收獲的不貼壁衍生細胞群作為起始細胞重復步驟(c)和(d)。一輪或多輪額外衍生作用可以是一到二十輪。含有UMC的組織可以是但不限于真皮組織、脂肪組織、結締組織、筋膜、固有層或骨髓。該程序可進一步包括在酸性成纖維細胞生長因子存在下培養所述不貼壁的細胞。
本發明也提供了(i)用上述方法生產的神經元；(ii)包含神經元的細胞群，該細胞群通過上述方法生產。組合物可以進一步含有藥學上可接受的載體，和/或無細胞的生物可降解基質，其中細胞群的細胞被整合到基質內或基質上，和/或無細胞的生物可降解填料。在與細胞組合之前，無細胞的生物可降解基質和無細胞的生物可降解填料由任何物質或物質的組合物組成，在這里列舉用于無細胞的生物可降解基質和無細胞的生物可降解填料。另外，該組合物可以基本上不含有源自培養基血清的蛋白質。
本發明的另一個方面是在哺乳動物受試者中修復損傷或缺損的神經組織的方法。該方法涉及將本發明的組合物注射入、移植或植入神經組織。神經組織可以是中樞神經系統(CNS)組織，例如脊髓組織或腦組織。神經組織也可以是外周神經系統(PNS)組織。哺乳動物受試者可以是人患者。哺乳動物受試者可具有脊髓損傷或疾病或缺損，例如阿耳茨海默氏病、帕金森病、亨廷頓病、泰氏-薩氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化、中風、面神經退化、手的外周損傷、神經纖維瘤病、纖維肌痛、脊髓空洞癥、神經系統的自身免疫疾病、以及神經組織腫瘤。在該方法中，組合物的細胞群可以是自體的。
除非另外定義，這里所使用的技術和科學術語和本領域所屬普通技術人員所通常理解的意思一樣。盡管與這里所描述的相似或等同的方法和材料可以用來實施本發明，但合適的方法和材料在下面描述。這里所提到的所有出版物、專利申請、專利和其它參考資料以它們整體的形式被引入作為參考。如果沖突，本說明書包括定義將起決定性作用。另外，材料、方法和實施例僅僅是說明性的，并不打算限制。
本發明的一個或多個實施方案的詳細內容在下面的附圖
和說明書中被闡述。本發明的其它公開內容、目的和益處從說明書和權利要求來看將是顯而易見的。
發明詳述本發明提供了在體外從未分化間充質細胞(UMC)生產神經元的方法。這些神經元可用于治療多種類型的神經組織缺損或損傷，例如中樞神經系統(CNS)(如脊髓或腦)組織或外周神經系統(PNS)(如感覺-軀體神經系統(如顱神經或脊神經)或植物神經系統)的組織。這樣，含有用本發明的方法產生的神經元的組合物可用于治療例如脊髓損傷、阿耳茨海默氏病、帕金森病、亨廷頓病、泰氏-薩氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化、中風，包括因中風而引起的肌肉癱瘓、面神經退化、手的外周損傷、神經纖維瘤病、纖維肌痛、脊髓空洞癥、神經系統的自身免疫疾病(如多發性硬化)、以及惡性或良性神經組織腫瘤(如星形細胞瘤或成膠質細胞瘤)，例如作為外科切除這種腫瘤后的替代治療。
UMC和源自它們的神經元與神經元受體共有至少一種主要組織相容性復合體(MHC；人HLA)單倍型。UMC供體和神經元受體優選MHC一致的。最理想的是受體和供體是純合配對的或是同一個體。在生物成分(如組織、細胞或諸如蛋白質、核酸、糖或脂的生物分子)被移植或植入獲得它們的受體或獲得所述生物成分的前體的受體時，生物成分就被稱為是自體的。
生產含有神經元的組合物的方法未分化的間充質細胞這里所使用的術語“UMC”指的是處于一個早于完全分化的如成纖維細胞的結締組織的分化階段的細胞。因為UMC不能分化成為每種類型的體細胞，故UMC不同于多能干細胞。除了成纖維細胞外，UMC還能分化成脂肪組織、軟骨、腱、骨、肌肉細胞和神經元。盡管神經元不被認為是間充質組織，顯然神經元可由UMC生產。其發生機理是不清楚的。一種可能性就是，經由特定分化途徑的前體細胞(如UMC)在它們能夠發育成的完全分化的細胞范圍方面顯然并不限于以前所想的那些；例如公知神經嵴細胞不但可以發育成神經元，而且也可以發育成例如PNS的支持細胞、色素細胞、平滑肌細胞、面部和顱的軟骨和骨。或者，可能至少一些部分分化的細胞類型(如UMC)在一定的環境下(如在血漿凝塊中發生的那些)能夠去分化，然后沿不同的分化途徑(如神經)再分化。本發明不受限于從UMC發育成神經元的任何特定機制。
本發明的方法涉及在用作基本上是UMC任何來源的神經元前體細胞來源的血漿凝塊中生長神經元。UMC可以在之前沒有被培養過的新鮮組織(如皮膚、脂肪組織或骨髓)中，或者用現有技術所公知的任意的各種方法例如實施例1的那些方法在體外培養和/或富集。在血漿凝塊中培養的結果是(a)選擇性的生長出在UMC群中已經分化了的神經元并且具有與在血漿凝塊中培養之前的UMC相同的形態；或(b)UMC亞組在生長之后分化成神經元。本發明不被任何特定作用機制所限制。
UMC可以從任意的大范圍哺乳動物物種獲得，如人、非人類靈長目(如猴、黑猩猩和狒狒)、牛、綿羊、馬、山羊、豬、狗、貓、兔、豚鼠、倉鼠、沙鼠、大鼠或小鼠。
UMC能夠通過起始培養取自受試者(如人)的活檢物來體外收獲和富集。如這里所述，UMC可從例如皮膚活檢物或脂肪組織活檢物或骨髓活檢物中獲得。從真皮組織分離的UMC是特別有用的，因為它們很容易獲得和擴增。
要在體外產生適用于本發明的選定的UMC，培養物可以從例如受試者完整厚度(如1-5mm，或者大于5mm，如果能得到足夠組織)的齒齦、頭皮、耳廓后皮膚或者腭的真皮活檢標本起始。真皮位于表皮的下面，典型地具有0.5到3mm范圍的厚度。真皮標本可以用例如穿刺活檢程序來獲取。皮膚活檢物可以從位于例如耳朵后面的皮膚取得。在細胞培養起始之前，為了減少后續培養可能的污染，用抗生素和抗真菌劑反復清洗活檢物。合適的“清洗培養基”可以含有組織培養基，例如象Dulbecco′s改良的Eagle′s培養基(DMEM)、Iscove′s改良的Dulbecco′s培養基(IMDM)或者其它任何適合的培養基，并具有一些或全部以下的抗生素慶大霉素、兩性霉素B(FUNGIZONE)、支原體清除劑(MRA；Dianippon Pharmaceutical Company，Japan)、原生質素(plasmocin)以及泰樂菌素(tylosin)(可以由例如Serva，Heidelberg，Germany提供)。慶大霉素可以以10到100μg/ml(例如25到75μg/ml，或者大約50μg/ml)的濃度使用。兩性霉素B可以以0.5到12.5μg/ml(例如1.0到10.0μg/ml，或者大約2.5μg/ml)的濃度使用。MAR可以以0.1到1.5μg/ml(例如0.25到1.0μg/ml，或者大約0.5μg/ml)的濃度使用。原生質素可以以1到50μg/ml(例如10到40μg/ml，或者大約25μg/ml)的濃度使用。泰樂菌素可以以0.012到1.2mg/ml(例如0.06到0.6mg/ml，或者大約0.12mg/ml)的濃度使用。
如果需要，可以用無菌顯微解剖來將活檢物中的真皮組織與含有角化組織的表皮和含有脂肪細胞的皮下組織分開。然后用例如解剖刀或剪刀將組織精細切碎，這樣活檢標本就可以被分成小片。在一些實施例中，用蛋白酶(如膠原酶、胰蛋白酶、糜蛋白酶、木瓜蛋白酶或木瓜凝乳蛋白酶)將這些組織小片消化。用200-1000 U/ml的II型膠原酶消化10分鐘到24小時特別有用，盡管膠原酶的任何類型都可以使用(例如0.05％到0.1％的IV型膠原酶能夠對脂肪組織的消化特別有用)。如果使用酶促消化，細胞可通過離心收集并置于組織培養瓶中。
如果組織不進行酶促消化，組織碎片可以單個地置于組織培養瓶的干燥表面上，并允許附著大約2到10分鐘。可緩慢添加少量培養基，以免移動了附著的組織碎片。在被消化了的細胞的情況下，細胞可用培養基清洗以除去殘留的酶，懸浮在新鮮培養基中，置于一個或多個瓶子中。在孵育約48-72小時后，可向瓶子中加入額外的培養基。當用T-25瓶起始培養時，培養基最初的量典型地為大約1.5-2.0ml。由活檢標本建立細胞系需要約2到3周，在那個時候，細胞可以從起始培養器皿中移出以用于擴增。
在培養的早期，期望組織碎片仍然附著在培養器皿的底部。脫離的碎片可以重新植入新的器皿中。細胞可以根據標準技術通過對EDTA-胰蛋白酶的短暫暴露而刺激生長。這種對胰蛋白酶的暴露太短暫，不會將成纖維細胞從它們與培養器皿壁的附著釋放出來。在培養物已建立并接近匯合后，可立即加工細胞樣品來冷凍儲存在例如液態N2中(見下文關于細胞冷凍的額外信息)。這里所使用的“貼壁”細胞是那些貼附在標準組織培養器皿的材料(如塑料)上的細胞。“不貼壁”細胞包括那些不貼附在標準組織培養器皿的材料(如塑料)上的細胞，也包括那些當空間和營養有限時從組織培養器皿表面脫離的細胞。
一旦細胞達到匯合或幾乎匯合的情況時，可以看到活躍生長的UMC的不貼壁集落在上述培養基中漂浮。盡管本發明不受任何特殊作用機制限制時，由于空間和/或營養限制，起始的貼壁UMC脫離(即變成不貼壁的)是可能的。這些不貼壁UMC的集落可通過將培養基從細胞培養物中抽出并離心來收獲，可以使用(如生產神經元)、冷凍并儲存，也可以通過重新接種在新鮮組織培養基中擴展。當不貼壁細胞集落重新接種在新鮮組織培養器皿中時，細胞會再次貼壁到組織培養器皿的底面和/或壁上并獲得鵝卵石樣的形態。細胞生長過程、不貼壁細胞集落的收獲和重新接種都可按照期望多次重復。它可以實施如僅僅一次或兩次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次、12、15、17、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、500、1000次或者甚至更多次。
不貼壁UMC也可從脂肪組織(例如通過吸脂術或其它外科切除手術收獲的脂肪)培養物中分離到。可將組織切成小片，可去除膜狀物質，所得到的組織在能引起UMC從脂肪組織上活躍脫落的條件下置于培養物中。或者，在將膜從脂肪球上去除后，可用約0.1％到1％的膠原酶將脂肪組織分離。同樣地，UMC培養物可從骨髓活組織切片起始(參見例如Marko et al.(1995)Endocrinol.1364582-4588)。源自脂肪和骨髓的UMC的收獲和重新接種過程與上述源自皮膚的UMC一樣。事實上，本領域技術人員將意識到，可進行相似程序來從這里公開的任何UMC可能來源獲得UMC。
本發明包括了一種源自上述培養方法的分離的UMC神經元前體細胞和含有源自上述培養方法的包括神經元細胞前體細胞的細胞群的組合物。
任何適于UMC從活檢標本增殖的組織培養技術都可用來擴增細胞。適于擴增培養細胞的技術可以在例如R.I.Freshney，Ed.，AnimalCell CultureA Practical Approach，(IRL Press，Oxford，England，1986)和R.I.Freshney，Ed.，Culture of Animal CellsA Manual ofBasic Techniques，(Alan R.Liss & Co.，New York，1987)中找到。
細胞培養基可以是任何適于原代UMC培養物生長的培養基。培養基可以含有如上所述的抗生素、殺真菌劑和/或防止支原體生長的試劑。諸如酸性成纖維細胞生長因子(aFGF)在培養基中的存在可防止UMC分化為成纖維細胞。培養基可以是無血清的，或者可以補充人或非人血清[例如自體人血清、非自體人A/B型血血清、非自體人O型血血清、馬血清或者胎牛血清(FBS)]來促進細胞的生長。當培養基中包括血清時，血清典型地為約0.1％到約20％v/v的量(如大約0.5％到大約19％，大約1％到大約15％，大約5％到大約12％，或者大約10％)。特別有用的培養基包括補充了大約2 mM谷氨酰胺、大約10mg/L丙酮酸鈉、大約10％(v/v)FBS以及抗生素的葡萄糖DMEM(通常叫做“完全培養基”)，其中，葡萄糖的濃度范圍從大約1,000mg/L到大約4,500mg/L。UMC也能在無血清的培養基中擴增；用這種方式，UMC不會暴露于異種的或同種異體的血清蛋白質，當在含有非自體血清的培養基中擴增細胞時就不需要在無血清培養基中進行額外培養。
用于細胞培養的培養基可以補充抗生素，以防止由諸如細菌、真菌、酵母和支原體引起的細胞污染。在組織培養中，支原體污染是一個頻發的并特別傷腦筋的問題。為了防止支原體污染或讓其最小化，可以向培養基中加入諸如泰樂菌素這樣的試劑。培養基可以進一步補充一種或多種抗生素/抗真菌藥(例如慶大霉素、環丙沙星(ciprofloxacine)、丙氟沙星(alatrofloxacine)、阿齊霉素、MRA、原生質素和四環素)。泰樂菌素可以以0.006到0.6mg/ml(例如0.01到0.1mg/ml，或者大約0.06mg/ml)的濃度使用。慶大霉素可以以0.01到0.1mg/ml(例如0.03到0.08mg/ml，或者大約0.05mg/ml)的濃度使用。環丙沙星可以以0.002到0.05mg/ml(例如0.005到0.03mg/ml，或者大約0.01mg/ml)的濃度使用。丙氟沙星可以以0.2到5.0μg/ml(例如0.5到3.0μg/ml，或者大約1.0μg/ml)的濃度使用。阿齊霉素可以以0.002到0.05mg/ml(例如0.005到0.03mg/ml，或者大約0.01mg/ml)的濃度使用。MRA可以以0.1到1.5μg/ml(例如0.2到1.0μg/ml，或者大約0.75μg/ml)的濃度使用。原生質素可以以1到50μg/ml(例如10到40μg/ml，或者大約25μg/ml)的濃度使用。四環素可以以0.004到0.1mg/ml(例如0.008到0.05mg/ml，或者大約0.02mg/ml)的濃度使用。抗生素可以在培養的整個階段或部分培養階段存在。
支原體污染可通過用一種例如可以從bioMerieux(MarcyI′Etiole，France)獲得或可在室內制備的支原體瓊脂平板的系統通過瓊脂培養方法或者PCR來分析。美國典型培養物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)在市場上出售PCR“支原體檢測試劑盒”。含有泰樂菌素(0.06 mg/ml)、慶大霉素(0.1mg/ml)、環丙沙星(0.01mg/ml)、丙氟沙星(1.0μg/ml)、阿齊霉素(0.01mg/ml)和四環素(0.02mg/ml)的培養基對防止支原體污染特別有用。另一種對防止支原體污染有用的試劑是4-氧-喹啉-3-羧酸(OQCA)衍生物，它可以由例如ICNPharmaceuticals，Inc(Costa Mesa，CA)提供的“支原體清除藥劑”而從商業上獲得。這種試劑典型地以0.1到2.5mg/ml(例如0.2到2.0mg/ml，或0.5mg/ml)的濃度使用。在成纖維細胞培養起始后的前兩個星期可以存在抗生素混合物或其它試劑。在培養合適的時間(例如兩周)后，含有抗生素的培養基典型地被不含抗生素的培養基所替換。一旦培養物中存在足夠的細胞時，就能夠檢測它們的支原體、細菌和真菌污染。只有不含有可檢測到污染的細胞才能在本發明的方法中使用。
在血漿凝塊中培養UMC來產生神經元用于本發明的方法的血漿凝塊可以用現有技術中公知的任何方法來生產。血漿的制備可以通過，例如，向剛由合適的哺乳動物受試者取得的血液中加入檸檬酸鈉或肝素，然后將血液的血漿部分經離心從細胞成分中分離出來。血漿可以以液態或者比如凍干的形式獲得。如果血漿是以凍干的形式獲得的，那么在使用之前通過添加去離子水或者比如組織培養基來重配。血漿可以從被給予神經元的個體(受體)獲得，也就是說它可以是自體的。或者，血漿可以從與受體同樣的物種的一個或多個個體獲得，比如，它可以是從許多(如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90、100或者更多)的人志愿者制備的血漿樣品集合。另外，血漿可以從任何哺乳動物物種，例如人、非人靈長類動物、牛、綿羊、馬、山羊、豬、狗、貓、兔、豚鼠、倉鼠、沙鼠、大鼠或小鼠的一個或多個個體的成體、嬰兒的血液或者胎兒血液中分離出來。從這些物種獲得的血漿可與來自同樣物種或另一物種的UMC一起使用。
凝塊可通過在一個適當的器皿(如塑料組織培養皿)中將血漿和Ca2+離子源(如CaCl2)或凝血酶混合而形成。即使使用了除添加Ca2+離子外的其它誘導凝結的方法，由UMC生產神經元仍然需要在血漿凝塊中有相對高濃度的Ca2+離子。因此優選通過添加Ca2+離子來誘導凝結。如果要使用一些其它的方法，必須在細胞被添加到凝塊之前就通過將凝塊在含有Ca2+離子的溶液或培養基中孵育而將Ca2+離子引入到凝塊中。Ca2+離子在凝塊中的濃度可以是大約4mM到大約18mM，例如大約6mM到大約17mM；大約8mM到大約16mM；或大約8mM到大約15mM。
凝結可以在室溫下進行，或者在例如37℃下進行可以更快。在凝塊形成后，添加足夠的組織培養基到含有凝塊的器皿中，以防止凝塊變干。因此凝塊可以被培養基完全覆蓋或者培養基和凝塊的上表面水平線基本上一樣高。
組織培養基可以是任何適于神經元生長的培養基。一種這樣的培養基是“FGF-DMEM”，它含有補充了大約2mM谷氨酰胺、大約10mg/L丙酮酸鈉、大約2.5％(v/v)FBS(或者這里所公開的任何人血清)、酸性成纖維細胞生長因子(aFGF；大約5ng/ml)、肝素(大約5μg/ml)和抗生素的DMEM(通常叫做“完全培養基”)，葡萄糖的濃度范圍從大約1,000mg/L到大約4,500mg/L。另一種有用的培養基是“N培養基”，它含有補充了大約2mM谷氨酰胺、B27補充物(Gibco；以大約1∶50的比例添加到Neuralbasal培養基中)、表皮生長因子(EGF；終濃度大約20ng/ml)、R3長形胰島素樣生長因子(R3 IGF；終濃度大約25ng/ml)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF；終濃度大約10ng/ml)和白血病抑制因子(LIF；終濃度大約10ng/ml)的Neuralbasal培養基(Gibco，Carlsbad，CA)。如果期望，可利用N-2補充物(Gibco)來代替B27補充物。美國專利No.6,736,238(它的公開內容以整體的形式被引入這里做為參考)描述了各種適于神經元體外生長的培養基。
用于生長神經元的培養基可以補充一個或多個生長因子，例如酸性成纖維細胞生長因子(FGF；aFGF)、堿性FGF(bFGF)、胰島素樣生長因子1(IGF-1)、長形胰島素樣生長因子(R3 IGF)、表皮生長因子(EGF)、長形EGF、胰島素樣生長因子(IGF)、血小板來源的生長因子(PDGF)、神經生長因子(NGF)、轉化生長因子(TGF)家族成員(例如TGFβ)、骨形成蛋白(BMP)家族成員(例如BMP 2-8的任何一種)、FGF-7、FGF-9、睫狀神經營養因子(CNTF)、腦來源的神經營養因子(BDNF)、神經營養因子-3(NT-3)、神經營養因子-4(NT-4)、神經營養因子-5(NT-5)、神經膠質細胞系來源的神經營養因子(GDNF)或者LIF。可以理解的是，具有全長野生型生長因子活性至少50％的任何上述生長因子的片段或變體(例如具有缺失、添加或取代的那些)也可用于那些可使用全長野生型生長因子的本發明的任何目的。同樣有用的還有那些顯示出可增強生長因子的神經元生長促進活性的化合物；這樣的化合物在美國專利6,172,086中已被描述過，其公開內容在這里被整體引入當作參考。此外，神經元生長所需要的或可以增強神經元生長的氨基酸例如L-肉毒堿、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺和L-半胱氨酸可以添加到培養基中來生長神經元。其它添加劑包括甲狀腺激素、維生素E、乙醇胺、胰島素、轉鐵蛋白、超氧化物歧化酶、亞油酸、皮質酮、乙酸視黃酯、孕酮和腐胺。
將UMC、含有UMC的細胞群、或其碎片、或者含有UMC的被切碎的組織放到血漿凝塊的表面。細胞、被切碎的組織或組織碎片可被添加到血漿凝塊上面的培養基，并通過重力的作用使其沉降到血漿凝塊的表面上。或者，培養基的水平面可以調整到和血漿凝塊的上表面一致或者比血漿凝塊上表面稍低。然后可將UMC或組織碎片放到血漿凝塊表面并且孵育足夠長的時間(例如在37℃)以使細胞或組織碎片貼壁在凝塊表面。一旦發生貼壁，就可以加入額外的培養基使其完全覆蓋血漿凝塊。很重要的一點是不管什么時候在組織培養器皿中都要有足夠的培養基以防止血漿凝塊變干。可以理解的是，與其將細胞、被切碎的組織或組織碎片接觸血漿凝塊的表面，還不如將細胞、被切碎的組織或組織碎片包埋入血漿凝塊中。這樣它們就能在形成之后被插入，或者在凝塊形成之前將它們加入血漿中來制造凝塊。
在將細胞、被切碎的組織或組織碎片放到凝塊中后，培養器皿在標準組織培養條件下例如在大約37℃(如35℃、36℃、或37℃)、在含有大約5％到大約10％CO2(例如大約5％到大約6.5％CO2)的空氣中以及大約85％到大約98％濕度下進行孵育。細胞的生長和形態可以通過在其上方的顯微鏡來監控。神經元很容易被本領域技術人員辨認出來，其特征在于存在軸突和/或許多樹突。自然地，培養基改變和細胞傳代的頻率取決于處于培養中的細胞的分裂速度。這個因素會根據例如所使用的培養基、UMC的種類以及是否在培養中使用生長增強因子而改變。本領域技術人員將能夠為那些感興趣的培養物建立可使用的條件。
神經元可以通過將凝塊切成小碎片并將碎片包埋入新鮮血漿凝塊或放置在新鮮血漿凝塊的表面來傳代。神經元和UMC從凝塊碎片遷移到新的凝塊中進一步培養。神經元比UMC先被移入新凝塊，這個因素提供了一種在凝塊中富集神經元的方法。因此，例如在培養一種將含有神經元和UMC的凝塊碎片包埋入其中或貼壁到其表面的新凝塊后，可將凝塊碎片除去或者將新凝塊切成小碎片并又將其包埋入第三個新凝塊中，所述培養進行足夠長的時間以允許相對大數量的神經元遷移入新凝塊內部、但對于充足數量的UMC遷移入新凝塊內部來說時間還不夠長。這樣的程序可以按照期望的頻率進行重復，就是說直到獲得含有期望比例的神經元的細胞群為止。
或者，凝塊中的細胞可以通過溶解凝塊(見下文)并從被溶解的凝塊收集細胞來傳代。然后以與上述用于培養物起始的基本上同樣的方式來將這些細胞加入到新凝塊的表面。
細胞可以通過在培養物中添加諸如胰蛋白酶、鏈激酶或血纖維蛋白溶酶原的這些酶，并在室溫或37℃下孵育它們而從血漿凝塊中收獲到。
在從凝塊中收獲細胞后，將它們在無血清/血漿的培養基中進一步培養至少額外的4小時(例如過夜或大約18小時)。將細胞放在無血清的培養基中孵育可以將源自添加到培養基中的血清(如FBS)的蛋白質基本去除，如果這些蛋白質存在于注入患者的組合物中，可能引起不期望的免疫反應。無血清的培養基可以含有例如補充了約2mM谷氨酰胺、有或沒有約110mg/L的丙酮酸鈉的葡萄糖DMEM，其中葡萄糖的濃度范圍從大約1,000mg/L到大約4,500mg/L。葡萄糖濃度在大約4,500mg/L時特別有用。無血清培養基也可以含有一種或多種如上文所描述的那些抗生素。
任何細胞群(例如UMC、含有UMC的細胞、神經元或含有神經元的細胞)可被冷凍并儲存在任何適于冷凍這種細胞類型的培養基(例如任何通過商業手段可得到的冷凍培養基)中，儲存在例如大約-80℃的冷藏柜或液態N2中。不必在冷凍之前將細胞從血漿凝塊中收獲；含有這種細胞的凝塊可在冷凍培養基中冷凍。一種由大約70％(v/v)培養基、大約20％(v/v)FBS和大約10％(v/v)二甲亞砜(DMSO)組成的培養基特別適用于冷凍這里所公開的任何細胞類型。FBS可以被例如含有5％右旋糖的Krebs Ringer代替。DMSO也能被例如甘油代替。解凍的細胞可以用來起始用于制備額外的供以后用于同一個受試者的懸浮液的第二次培養，這樣可以避免要獲得第二個標本的不便。
神經元和含有神經元的組合物本發明也提供了一種用上述血漿凝塊方法由UMC產生的分離的神經元以及一種含有包括許多通過該方法由UMC產生的神經元的細胞群的組合物。在這些細胞群中，神經元優選細胞群的至少5％(例如至少5％；7％；9％；10％；12％；15％；18％；20％；25％；30％；35％；40％；45％；50％；55％；60％；65％；70％；75％；80％；85％；90％；95％；97％；98％；99％；99.5％；99.8％或100％)。這些細胞群中的其它細胞可以是但不限于以下細胞類型的一種或多種UMC、成纖維細胞、角化細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、黑素細胞、皮膚朗氏細胞或內皮細胞。在一個實施方案中，組合物基本上沒有成纖維細胞、角化細胞、脂肪細胞、前脂肪細胞、黑素細胞、皮膚朗氏細胞和內皮細胞；它們也可以基本上沒有UMC。
在一個實施方案中，神經元和組合物基本上沒有源自異種或同種異體培養基血清的蛋白質。這里所使用的“基本上沒有源自異種或同種異體培養基血清的蛋白質”的細胞是指那些細胞周圍的液體含有少于0.1％(例如少于0.05％、少于0.01％、少于0.005％或少于0.001％)包含在預先培養細胞的組織培養基中的異種或同種異體血清的細胞。類似地，一種“基本上沒有源自異種或同種異體培養基血清的蛋白質”的組合物是指那些組合物內的細胞周圍的液體含有少于0.1％(例如少于0.05％、少于0.01％、少于0.005％或少于0.001％)包含在預先培養細胞的組織培養基中的異種的或同種異體的血清。
要獲得基本上沒有源自同種異體或異種培養基血清的蛋白質的細胞，培養細胞可以在不含有同種異體或異種血清的培養基中擴增，即在不含有血清或含有自體血清的培養基中。或者，細胞可以首先在含有同種異體或異種血清(例如0.1％到20％血清)的培養基中培養，然后在不含血清的培養基中培養。這樣，源自可能的免疫原性血清的蛋白質在細胞懸浮液中的存在可通過這些方法避免。
藥學上可以接受的載體，例如生理鹽水、賦形劑或者穩定劑可以在細胞被給予患者之前加入到這些細胞中。短語“藥學上可接受的”是指分子實體和組合物，它們在所使用的濃度下不會對細胞有害，是生理相容的，當給予人體時典型地不會產生過敏或類似的不利反應，例如胃不適、頭暈等等。各種藥學上可接受的載體、賦形劑或者穩定劑在現有技術中是公知的[Remington′s Pharmaceutical Sciences，16thEdition，Osol，A.Ed.1980]。可接受的載體、賦形劑或者穩定劑包括 諸如磷酸、檸檬酸和其它無毒有機酸的緩沖液；諸如抗壞血酸的抗氧化劑；小分子量(少于10個殘基)多肽；諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白類的蛋白質；諸如聚乙烯吡咯烷酮的親水聚合物；諸如甘氨酸、 谷氨酰胺、 天冬酰胺、 精氨酸或賴氨酸的氨基酸；單糖、二糖和其它糖類，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；諸如EDTA的螯合劑；諸如甘露醇或山梨糖醇的糖醇；鹽形成平衡離子，如鈉離子；和/或諸如Tween、Pluronics或PEG的非離子型表面活性劑。
或者，如果細胞沒有被立即給藥，它們可以在收獲之后于4℃在冰上孵育達24-48小時。對于這樣的孵育來說，細胞可以懸浮在具有適當摩爾滲透壓濃度并檢測了熱原和內毒素水平的生理溶液中。這種溶液典型地不含有酚紅pH指示劑，并且任何優選的血清是患者的血清(即自體血清)而不是胎牛血清(FBS)或其它異種血清(例如馬血清和山羊血清)。細胞可以在例如含有5％右旋糖、不含酚紅的DMEM的Krebs-Ringer溶液或任何其它生理溶液中懸浮。可將細胞抽出并在孵育培養基中給予受試者。細胞所懸浮的鹽水或孵育培養基的體積典型地與諸如要被注入的細胞量和由于組織惡化或缺損引起的損害程度這些因素有關。
生物可降解的無細胞基質含有本發明的神經元的組合物也能夠包含生物可降解的無細胞基質成分。無細胞基質成分通常充當一個結構的角色。比如，可以被填入組織的缺損、孔、間隙或空腔中，并提供一種環境，在這種環境中被注入或被植入的細胞能夠粘附在基質或周圍組織上，生長并由于新組織的生長而產生結構因子或其它因子(例如趨化因子)。在許多情況下，基質的間隙填充作用是暫時的，并僅僅持續到被植入的細胞和/或宿主細胞遷移到這個區域并形成新組織。優選無細胞基質是生物可降解的。基質優選固態或半固態的物質，并在生理條件下是不溶的。這種組合物適于注入或植入受試者體內以修復已經退化了的組織。這里所使用的術語“生物可降解的”是指一種生物上沒有害處、并且能通過自然效應物(例如天氣、土壤細菌、植物或動物)被化學降解或分解的組合物。本發明可以使用的基質的例子包括但不限于含有自體和非自體蛋白質的無細胞基質和含有生物可降解的聚合物的無細胞基質。
許多含有非自體蛋白質的生物可降解的無細胞基質可以使用到這里所提供的組合物中。生物可降解的無細胞基質的例子包括含有任何類型膠原(例如牛、豬、人或生物工程膠原)、或者任何類型的與例如戊二醛交聯的帶有糖胺聚糖(GAG)的膠原的基質。基質包含的膠原包括但不限于可吸收的膠原海綿、膠原膜和骨松質。有用的膠原類型包括例如牛膠原(例如ZYDERM和ZYPLAST，可以從McGhan Medical Corporation，Santa Barbara，CA那里購買到)、豬膠原、人尸體膠原(例如FASCIANTM(Fascia Biosystems，LLC，BeverlyHills，CA)、CYMETRATM(LifeCell Corp.，Branchburg，NJ)、或DERMALOGENTM(以前由Collagenesis Corp.生產)、生物工程膠原(例如FORTAPERMTM，可以從Organogenesis，Inc.，Canton，MA那里獲得)和自體人膠原(AUTOLOGEN，見下文)。FASCIANTM可以特別有用。這種產物可以以5種不同顆粒大小的形式獲得，任何一種都可以使用到這里所描述的組合物和方法當中。尺寸為0.25mm的顆粒可以特別有用。另外一種適用于這種基質的生物聚合物是纖維蛋白。為本發明的目的感興趣的就是用來由UMC生產神經元的血漿凝塊類型(見上文)。事實上，在某些實施方案中，沒有必要將神經元從用來生產它們的血漿凝塊中提取出來。任選地可以被切成適當的大小和形狀的凝塊能被直接植入或直接移植到損傷的或缺損的神經組織中去。
可吸收的膠原海綿可以從例如Sulzer Calcitek，Inc.(Carlsbad，CA)購買到。這些以COLLATAPE、COLLACOTE和COLLAPLUG的名字銷售的膠原海綿填料由從牛深屈肌(Achilles)腱提取的交聯膠原和GAG制成。這些產物是柔軟的、易曲折的、不易碎的和無熱源的。大于90％的膠原海綿典型地由開孔組成。
生物可降解的無細胞基質可以含有形成例如薄膜的膠原(例如牛或豬I型膠原)。一種這樣的膜由Sulzer Calcitek生產，并作為BIOMENDTM銷售。另一種這樣的膜基質由Geistlich Sohne AG(Wolhusen，Switzerland)作為BIO-GIDE銷售，它由豬I型和III型膠原制成。BIO-GIDE有一個雙分子層結構，一個表面是多孔的并允許細胞向內生長，第二個表面是致密的，防止纖維組織向內生長。
其它含有膠原的合適基質包括由NeuCell，Inc.(Campbell，CA)生產的COLLAGRAFT，和由Wright Medical Technology(Arlington，TN)出售的OSTEOSET硫酸鈣α-半水化物小球。
生物可降解的無細胞基質也能用形成顆粒或塊的骨松質制成。這些材料由動物(例如人、非人靈長類動物、牛、綿羊、豬或者山羊)骨組成，其中基本所有的有機物質(例如蛋白質、脂、核酸、碳水化合物和如維生素和非蛋白質激素的小有機分子)都被去除。這種類型的基質在這里被稱為“無機基質”。一種作為BIO-OSS松質顆粒和BIO-OSS塊出售的這樣的基質由Geistlich Sohne AG生產。這個公司也生產一種塊型基質(BIO-OSS膠原)，其含有無機骨、另外大約含有10重量％的膠原纖維。
其它有用的生物可降解的無細胞基質可以含有明膠、羊腸線、脫礦質的骨、無機骨、珊瑚或羥磷灰石或這些物質的混合物。由脫礦質的人骨制成的基質例如形成小塊并由GenSci RegenerationLaboratories，Inc.(Toronto，Ontario，Canada)作為DYNAGRAFT出售，由Tutogen Medical，Inc.(Clifton，NJ)作為TUTOPLAST出售或者由Osteotech，Inc.(Eatontown，NJ)作為GRAFTON脫礦質的骨基質出售。脫礦質的骨可以和例如膠原組合生產出海綿狀、塊狀或膜狀的基質。生物可降解的基質可以含有諸如粘多糖或透明質酸的糖胺聚糖。
特別適用于本發明目的的是形成桿狀的生物聚合物(例如這里公開的各種類型的膠原或纖維蛋白)凝膠。在這些桿中的生物聚合物原纖維依靠磁場定向為縱向(軸向)。這種含有神經元并任選含有其它細胞(如施旺細胞)的桿可以用來橋接例如外周神經的切斷的末梢之間的間隙。桿內縱向排列的原纖維用來引導跨越切斷的神經末梢之間的間隙的神經生長，從而促進原有神經連接的再生。這些生物聚合物桿和制造它們的方法在美國專利No.6,057,137中更為詳細地記載，其公開內容整體引入這里作為參考。
此外，由一個或多個單體制成的合成聚合物可以用來制造在這里有用的生物可降解的無細胞基質。這種合成聚合物包括例如聚(羥基乙酸)、聚(乳酸)和聚(羥基乙酸)-聚(乳酸)。合成聚合物也能與上面所提到的任何物質組合形成基質。形成單一基質的不同聚合物可以在分開的隔室或層上。例如，W.L.Gore & Associates，Inc.(Flagstaff，AZ)生產一種多孔的生物可降解的無細胞基質(GORE RESOLUT XT再生材料)。這種基質由合成的生物可降解的乙交酯和碳酸亞丙酯共聚物纖維組成，細胞可以遷移入這種基質中，基質附著到封閉的由合成的生物可降解的乙交酯和丙交酯共聚物組成的組成的不允許細胞向外生長的膜上。其它適合的生物可降解的基質的例子可以在例如美國專利No.5,885,829中找到。
為本發明的目的而感興趣的是諸如聚吡咯、聚苯胺、聚噻吩和這些聚合物的衍生物的導電生物聚合物。這種衍生物的例子包括3-取代的聚苯胺、聚吡咯和聚噻吩，例如烷基取代的衍生物。基質可以由這些聚合物來構建或者這些聚合物能被包被到這里所公開的任何其它生物可降解的無細胞基質材料上。這種基質對本發明的有用性源自電荷增強神經突延伸和神經再生的發現。這些基質的神經生長增強性質可通過體內或體外應用得到進一步增強，其通過對在放置到受試者體內之前附著了神經元的基質施加電壓或電流。這些導電聚合物和它們的用途在美國專利No.6,095,148中被更為詳細的記載，其公開內容整體引入這里作為參考。
細胞附著到生物可降解的無細胞基質上的能力可通過用一個或多個本領域公知的附著分子包被基質來增強。這些分子包括天然分子(例如像昆布氨酸和纖連蛋白這樣的細胞外基質因子)和合成分子(例如含有纖連蛋白和/或昆布氨酸結合位點的肽)。有用試劑的例子是但不限于基膜成分、明膠、阿拉伯樹膠、I-XII型膠原、纖連蛋白、層粘連蛋白、血小板反應蛋白、巢蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖以及它們的混合物。其它合適的附著分子包括簡單的糖類、復雜的糖類、脫唾液酸糖蛋白、外源凝集素、生長因子、低密度脂蛋白、肝素、聚賴氨酸、聚鳥氨酸、凝血酶、玻連蛋白以及纖維蛋白原。合成分子包括利用傳統的方法摻入一個或多個諸如氨基酸序列RGD(SEQ ID NO1；來自纖連蛋白)、LIGRKKT(SEQ ID NO2；來自纖連蛋白)和YIGSR(SEQ ID NO3；來自層粘連蛋白)的結合位點制得的肽。附著分子的用途和將其連接到生物可降解的無細胞基質上的方法在美國專利No.6,095,148中記載。
在選擇了生物可降解的無細胞基質后，可將濃縮的細胞懸浮液(例如含有上述由UMC生產的神經元的懸浮液)均勻地分布到基質表面上。濃縮懸浮液典型地是為了避免超過基質吸收液態懸浮液的容量而使用的。例如，用于GORE RESOLUT XT基質的細胞懸浮液通常具有大約94μl到125μl的體積，每平方厘米的基質含有大約2.0×106到大約4.0×106個細胞。細胞可在未進一步添加培養基時附著到基質上。細胞可與基質在例如大約37℃下孵育大約1-2小時。在孵育后大約60分鐘，細胞典型地附著并均勻分布到整個基質材料上。此時，含有加載了細胞的基質的培養容器可以補充額外的培養基，細胞可在基質中培養大約3-4天。因為細胞是被高密度地添加到基質以充分填滿基質內部空間的，所以在這3-4天的培養期間很少或沒有增殖發生。事實上，明顯的細胞增殖在這個期間典型地是不期望的，因為分裂細胞可以分泌能降解或部分降解基質的酶(例如膠原酶)。
有細胞附著的基質典型地用例如鹽水或者沒有血清和酚紅的培養基清洗(比如最少清洗3次，每次10分鐘)以基本除去在給予患者時可能引起免疫反應的免疫原性蛋白質(例如如果在基質接種步驟使用了含有非自體血清的培養基的源自培養基血清的蛋白質)。每次清洗可以使用新鮮PBS。然后可將基質在使用之前在新鮮PBS或無血清培養基中孵育(例如2小時長的孵育)。在孵育之后，可將含有細胞的基質置于組織惡化或缺損的區域。
對于膠原海綿基質(例如COLLACOTE)，在大約1.5ml生長培養基中的大約1.5×106到2.0×106個細胞(或根據需要而更多)可以接種到2cm×4cm的薄(大約2.5到3.0mm的厚度)海綿上。然后可將海綿在未進一步添加額外培養基時在37℃下孵育大約1-2小時，使基本所有的細胞都充分貼壁到基質材料上。在細胞貼壁后，可將額外的培養基添加到基質和細胞組合物，然后可將它們在37℃下孵育3-4天，每天換培養基。如果含有非自體血清的培養基被用于細胞接種步驟，可將組合物從含有這種血清的培養基中移出，并用PBS反復清洗(例如3次或更多)。在每次添加PBS后，基質可以在棄去PBS之前孵育10-20分鐘。在最后一次清洗之后，組合物可以立即給予受試者，或者轉移到裝有生理溶液(例如Kreb′s Ringer溶液)的運輸小瓶中，并在大約4℃下孵育達大約24-48小時。
對于膜基質(例如BIOMENDTM)，在大約100μl培養基中的大約1.5×106到2×106個細胞(或者多于所需要的量)可以接種到15mm×20mm的薄(大約0.5到1.0mm的厚度)膜上。然后可將膜在未進一步添加額外培養基時在37℃下孵育大約30-60分鐘，使基本所有的細胞都充分貼壁到基質材料上。在細胞貼壁后，可將額外的培養基添加到基質和細胞組合物上，然后可將它們在37℃下孵育2-3天，每天換培養基。細胞典型地是以高密度(見上文)添加到基質，以使得它能充分填充細胞可達到的基質內的空間。清洗組合物象上文對海綿基質的記載一樣，可以立即使用或孵育。
在諸如上述無機基質(例如BIO-OSS塊)或者脫礦質的骨基質(例如DYNAGRAFTTM基質)的塊狀基質的情況下，在大約100到150μl生長培養基中的大約1.5×106到2.0×106個細胞(或者根據需要而更多)可以接種到1cm×1cm×2cm的基質材料立方塊中。細胞典型地被緩慢接種到塊狀基質的一個面上。一旦培養基和細胞都被吸收進塊內后，可以用同樣的方式在塊的另外一個面上接種。可以重復這個程序，直到這個塊的所有面都接種并且這個塊被培養基完全飽和。應該小心避免添加過量的培養基從而引起培養基和細胞從塊中滲漏。然后可將組合物在未進一步添加額外培養基時在37℃下孵育大約60-120分鐘，使基本所有細胞充分貼壁到基質材料上。在細胞貼壁后，可將額外的培養基添加到基質和細胞組合物，然后可將其在37℃下孵育2-3天，每天更換培養基。細胞典型地是以高密度(見上文)添加到基質，以使得它能充分填充細胞可達到的基質內的空間，并和上述結果一樣。清洗組合物象上文對海綿基質的記載一樣，可以立即使用或孵育。
含有本發明的神經元和小顆粒生物可降解的基質(例如FASCIANTM、CYMETRATM或DERMALOGENTM)的組合物可以通過在用金屬鎖連接的兩個注射器之間來回傳遞來混合成分而進行制備。例如FASCIANTM典型地可以以80mg/注射器提供在注射器(例如3cc注射器)中。FASCIANTM顆粒可以在使用之前直接在注射器中清洗，吸取少量(例如1.5ml)清洗緩沖液(例如等滲鹽水或含有右旋糖的Kreb′s Ringers溶液)放入注射器中，通過金屬鎖將第一個注射器和第二個注射器連接，在這兩個注射器之間來回傳遞顆粒和清洗溶液數次。要將顆粒從清洗液中分離，可將混合物轉移到一個無菌管中，并使FASCIANTM顆粒沉淀。可將溶液去除(例如輕輕倒出或吸出)，當期望時可反復進行清洗程序，其通過將顆粒吸取到一個新注射器中(例如通過18規格或20規格的針頭)。
當顆粒被適當清洗后，可以用與清洗相同的程序將其與細胞混合。細胞(例如1.5×106到2×106個細胞)可懸浮在溶液(例如1.5 ml含有5％右旋糖的 Kreb′s Ringers溶液)中，并吸收到注射器中。含有這些細胞的注射器可以通過金屬鎖與含有填充顆粒的注射器連接，這兩種成分可以通過在注射器之間來回傳遞進行混合。然后可將混合物轉移到一個T-25組織培養瓶或組織培養皿或管中，這樣細胞就能附著到填料顆粒上。或者當附著發生的時候，混合物仍然在注射器內，盡管這可能對細胞更有害。混合物可以孵育過夜，然后轉移到容器(例如小瓶或管)中交給醫師或者轉移到注射器給予患者。要交給醫師的容器在運輸過程中可以保持在冰上。當使用這種小顆粒的無細胞生物可降解基質時，含有細胞的顆粒懸浮液任選地進行注射而不是將其植入到組織退化或缺損的區域。
可以理解的是，本發明的組合物除含有細胞和藥學上可接受的載體和/或生物可降解的無細胞基質(見下文)、和/或生物可降解無細胞填料(見下文)外，還可含有任何一種或多種上文所列出的神經元生長因子。
本發明也提供了制造含有本發明神經元和基質成分的組合物的方法。這些方法典型地涉及提供包括大量神經元的細胞群，提供生物可降解的無細胞基質，將生物可降解的無細胞基質與細胞群一起孵育，這樣細胞就能整合到基質上或基質內，從而形成一種可用于修復損傷的或缺損的神經組織的組合物。
生物可降解的無細胞填料材料本發明組合物可含有本發明的神經元，同時含有一種或多種生物可降解的無細胞可注射填料材料(即填充劑)。組合物適于注射到受試者體內以修復退化的組織。填料材料通常充當結構功能。比如，它可以填充組織內的缺損、孔、間隙或空腔，并提供一個被注射的細胞可以貼壁到周圍組織上并且由于新組織的生長而生長并產生結構因子和其它因子(例如趨化因子)的環境。在許多情況下，填料的間隙填充功能只是暫時的，只持續到被植入的和/或宿主細胞遷移入這個區域并形成新組織為止。填料優選是生物可降解的。填料典型地是以粘性溶液或懸浮液的形式提供或使用。填料可以與包括本發明神經元的細胞群組合。
生物可降解的無細胞可注射填料的許多類型都可以用于本發明的組合物。填料可以由包括從受試者獲得的任何膠原類型的自體蛋白質組成。這種組合物的一個例子就是以前由Collagenesis Corp.(Beverly，MA)生產的Autologen。Autologen是來自受試者的自體真皮膠原纖維的分散體，所以在與諸如UMC和任選的成纖維細胞一起再次給予受試者時不會引起甚至最小限度的免疫反應。為了獲得Autologen，從受試者獲得組織(例如真皮、胎盤或者臍帶)樣品并交給Collagenesis Corp.，在那里樣品被加工成為富含膠原的分散體。大約1.5平方英寸的真皮組織可以生產1立方厘米(cc)的Autologen。Autologen的濃度可以根據受試者體內矯正缺損或增大組織的所需的量進行調節。在分散體中Autologen的濃度可以是例如至少大約25mg/L(例如至少大約30mg/L，至少大約40mg/L，至少大約50mg/L或至少大約100mg/L)。
無細胞可注射填料材料也可以含有非自體蛋白質，包括任何類型的膠原。許多膠原產品可以商業得到，用于本發明的組合物。人膠原產品也可以商業得到。商業可得到的膠原的例子包括但不限于牛膠原，例如諸如Zyderm和Zyplast的重構牛膠原產品，其含有與戊二醛交聯并懸浮在含有0.3％利多卡因的磷酸鹽緩沖生理鹽水中的重構牛膠原纖維。這些產品是由Santa Barbara，CA的McGhan MedicalCorporation生產的。豬膠原產品也可以商業得到。在本發明中有用的膠原可以從合適的物種的組織中分離，或者它們可以被制成重組蛋白質。重組蛋白質可以含有與天然存在蛋白質一樣的氨基酸序列，或者它們可以具有含有改善蛋白質功能的氨基酸替換、缺失或插入的氨基酸序列。
有用的填料材料的其它例子包括但不限于溶解的明膠、聚乙醇酸(例如溶解的聚乙醇酸或聚乙醇酸顆粒)或羊腸線縫合物。一種特定的明膠基質植入物是例如以Fibril的商標出售。該填料含有等量的(1)分散在0.9％(按體積計算)氯化鈉溶液中的豬明膠粉末和o-氨基己酸的混合物、和(2)來自患者的一份血漿。其它有用的作為填料的物質包括透明質、透明質酸、restalyn和parleane。
本發明也提供了制備含有本發明神經元和生物可降解的無細胞填料的組合物的方法。這些方法典型地涉及提供一種包括本發明的基本上沒有免疫原性蛋白質(例如源自培養基血清的蛋白質)的神經元的細胞群，提供一種或多種生物可降解的無細胞填料材料，并將填料和細胞群組合。
使用本發明的神經元的方法本發明的神經元和組合物可在體外和體內使用。神經元以及含有神經元的組合物的體外用途包括它們用作體外篩選或測試感興趣的用于例如神經元生長促進活性或神經毒性活性的化合物的靶的用途。它們也可用于體外和體內的基礎神經生物學研究。
神經元特別適用于治療任何種類的神經系統疾病(見上文)。神經元可經注射、植入或移植給藥。它們可在例如去除腫瘤切除部位的腫瘤手術期間植入。這樣，例如，在藥學可接受的載體和/或生物可降解的無細胞填料(見上文)中的含有本發明的神經元的組合物(見上文)可以被注入到感興趣的CNS區域(例如腦室或脊髓)。或者，附著到和/或摻入生物可降解的無細胞基質(見上文)中的神經元可以被植入或移植到損傷的或缺陷的CNS組織(腦或脊髓)或者外周神經。
給藥可以是單次或多次。因此，它們可以進行一、二、三、四、五、六、七、八、九、十、11、12、13、14、15、17、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、100、150、200、250、300、350、400、450、500、700、1000或者更多次。在進行多次給藥時，給藥可間隔任何適當的時間，例如30秒、一分鐘、兩分鐘、三分鐘、四分鐘、五分鐘、1 0分鐘、20分鐘、30分鐘、45分鐘、1小時、兩小時、三小時、四小時、五小時、八小時、12小時、1 8小時、24小時、兩天、三天、四天、一周、兩周、三周、一個月、兩個月、三個月、四個月、五個月、六個月、八個月、十個月、一年、18個月、兩年、三年、四年、五年、六年、八年、十年、12年、15年、18年、20年、25年、30年、40年、50年或者甚至更長的時間間隔。
一種或多種生長因子也可以給予本發明的神經元受體。這些因子包括上文列舉的任意因子。可以理解的是，相關生長因子可能直接作用來促進植入或移植的神經元的生長或者可能通過作用在其它細胞上來間接幫助組織修復，例如通過增強血管生成。生長因子可以跟含有神經元的組合物成分一樣給予受試者。或者，它們可以分開給藥并且或者同時或者在不同時間給藥。此外，它們可以在細胞組合物同一部位或者不同部位進行給藥。它們可以全身或局部給藥，例如口服、經皮、經直腸、經陰道、鼻內、胃內、氣管內或肺內或靜脈內皮下、肌內或者腹膜內注射給藥。給藥頻率與細胞組合物的一樣(見上文)。
生長因子可以生長因子本身的形式給藥。或者，它可以通過結合到或包裹入作為生長因子儲池或倉庫的固體基質上而被傳遞。固體基質可以是一個物體或者多個物體(成形為例如顆粒或線)。生長因子從固體基質逐漸釋放到其環境中。在固體基質是珠的形式時，珠通常是具有約0.005-2.0mm直徑的近似球形。在固體基質是線狀時，線通常具有0.01-1.0mm的直徑。這些線在形成凝膠前可被折疊成網狀或者切成小片(約5-10mm)。在含神經元的組合物還含有生物可降解的無細胞基質時，可以理解的是，如果需要，基質還可以作為固體基質起減緩生長因子釋放的作用。能夠制造成固體基質的物質包括膠原、明膠、乙烯-乙酸乙烯酯、聚交酯/羥基乙酸共聚物、纖維蛋白、八硫酸蔗糖、葡聚糖、聚乙二醇、藻酸鹽、聚丙烯酰胺、纖維素、膠乳、多羥基乙基甲基丙烯酸酯、尼龍、滌綸、聚四氟乙烯、聚乙醇酸、聚乳酸、聚苯乙烯、聚氯乙烯共聚物、羊腸線、棉花、亞麻、聚酯以及絲綢。
固體基質可以將肝素或硫酸乙酰肝素蛋白聚糖結合到它上面，作為促進肝素結合的生長因子(例如bFGF、VEGF或PDGF)結合到它上面的手段。這種固體基質的一個例子是主要由瓊脂糖與結合到其上的肝素組成的珠。固體基質可以是各種物理形狀，例如珠、不規則顆粒、片或者線。當生長因子包裹到固體基質中時，生長因子隨著時間而逐步釋放，例如由于作用在固體基質上的酶。
將一種或多種生長因子送遞給受試者的另一種手段是通過給予受試者用一種或多種含有編碼一種或多種生長因子的核酸序列的表達載體轉染或轉化的重組細胞。這些細胞可以是神經元本身或者其它細胞類型，例如成纖維細胞、UMC、角化細胞、內皮細胞或淋巴樣細胞。適用于神經元的組織相容性需求(見上文)同樣適用于用來送遞生長因子的重組細胞；這些細胞優選源自受體，即它們是自體的。
既然本發明的神經元是源自UMC的，那么可以理解的是，這里描述的所有UMC(例如由實施例1中所述方法生產的那些)都可用于治療同樣的列舉在這里作為用本發明神經元可治療的神經系統疾病。此外，UMC可以是這里所述的任何組合物的成分。
下面的實施例用來舉例說明但并不限制本發明。
實施例實施例1-自體UMC和成纖維細胞的分離按如下方法從得自正常健康人志愿者的皮膚活檢物起始培養來體外收獲和富集細胞以得到UMC。約10到200mm3的活檢物從耳廓后區域獲得，成纖維細胞組織培養如上所述使用含有4500mg/L D-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和10％FBS的DMEM進行起始。在貼壁成纖維細胞傳代兩次或三次達到完全匯合后，觀察到了不貼壁的活躍生長細胞的集落。這個過程能夠通過在較少血清中起始培養以及通過5ng/ml的aFGF的存在而縮短，或者通過在直接來自組織的血漿凝塊中生長細胞(見實施例2)，其中加入300mM的CaCl2達到15mM的終濃度。每個集落包括2到約80個的細胞，其具有鵝卵石樣形態并活躍分裂。通過吸出含有漂浮集落的培養基并離心該培養基來收集集落。將離心沉淀的細胞轉移到新的組織培養皿中，其通過直接接種在含有aFGF和肝素的新鮮培養基(含有4500mg/L D-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、2.5％熱滅活的FBS、5ng/mL的重組人aFGF和5pg/mL肝素的DMEM)中而實現。將細胞懸液加入到新鮮組織培養瓶中，在37℃孵育。每周給細胞加料兩次，并在達到匯合時(通常在一到兩周內)進行傳代或分化性胰蛋白酶消化。在起始培養約3-6周內觀察到了鵝卵石樣的細胞集落。分離集落并在新鮮組織培養器皿中培養使細胞變成了貼壁的。
不貼壁細胞集落也從人脂肪組織如下分離到了。將組織切成小片并去除所有可見的膜。將組織置于DMEM培養基中，其中含有4500mg/L D-葡萄糖、2mM L-谷氨酰胺、2.5％熱滅活的FBS、1到10ng/mL的重組人aFGF和5pg/mL肝素。在這些條件下，鵝卵石樣的細胞從脂肪組織活躍脫落，并繼續長期生長。將脂肪組織小片清洗并置于新鮮組織培養器皿中。在大約2周之內，將UMC經IV型膠原酶37℃處理大約5-15分鐘而從組織中分離。來自脂肪組織的新細胞在培養中保持活躍生長超過一年，直到培養終止。一旦培養物充分生長，就觀察到了不貼壁細胞的簇集。當這些細胞重新接種在新鮮組織培養瓶中時，觀察到了同樣類型的細胞活躍生長。
在存在aFGF時，來自皮膚和脂肪組織培養物的細胞在外觀上是形態相似的并具有鵝卵石樣形態。然而，當從培養基中去除aFGF時，大多數的細胞完全分化成了貼壁的成纖維細胞。鵝卵石樣的不貼壁細胞也在由骨髓起始的培養物中觀察到了，其利用由Marko等人描述的方法(見上文)。因此，看起來至少從由真皮建立的成纖維細胞培養物或者從脂肪組織或骨髓的培養物收獲的不貼壁上皮樣細胞確實是UMC。
實施例2-UMC分化為神經元在初步實驗中，發現由牛血漿制備的凝塊在支持細胞生長方面與由胎牛血漿制成的那些凝塊一樣有效。比培養基中通常存在的濃度(即約2mM)更高濃度的Ca2+的存在對于血漿凝塊UMC培養物中神經元的生長是必需的。血漿凝塊中神經元的分化、生長和遷移都被發現依賴于用于凝塊生產的Ca2+(以CaCl2的形式)的濃度。發現CaCl2的最優濃度是大約8mM到大約15mM。
以下是代表性實驗的說明。
凍干的牛血漿(Sigma Aldrich Co.，St.Louis，MO；Cat.No.P-4639)用適當體積的不含肝素的組織培養基例如DMEM或Neurobasal培養基(見上文)進行重構。將適當體積的CaCl2儲液(例如300mM)加入到一系列塑料組織培養皿(一組具有30mm的直徑，另一組具有60mm的直徑)中，以使加入血漿后的終濃度是15mM。將血漿加入到培養皿中(1ml到30mm培養皿，2ml到60mm培養皿)，將其渦旋以混合CaCl2和血漿。薄的凝塊(高度小于1mm)通過加入0.5到0.75ml血漿到30mm培養皿中以及1.0到大約1.25ml血漿到60mm培養皿中而制得；如上所述，將適當體積的CaCl2溶液加入到培養皿中達到終濃度為15mM。
然后將培養皿在室溫或37℃孵育直到血漿凝結。在37℃凝結需要大約2-3小時，這比在室溫快。將大約2ml組織培養基加入到30mm組織培養皿中，5ml加入到60mm組織培養皿中。組織培養基是“N培養基”(見上文)。然后將培養皿儲存在37℃、10％CO2空氣的組織培養箱中，直到準備使用。如實施例1所述制備的少量(每個凝塊大約5個細胞到大約105個細胞)真皮來源的UMC加入到每個培養皿中，允許細胞沉降在每個凝塊上。培養皿中的組織培養基每3-4天更換；去除用過的培養基后，加入1.5ml到30mm組織培養皿中，加入3ml到60mm組織培養皿中。凝塊中細胞的生長延續了大約一年，這是用顯微鏡觀察到的。
血漿凝塊中的UMC亞群在起始培養2-3天后觀察到了向神經元的分化。在大多數培養物中，具有唯一軸突的小細胞是首先出現神經元形態的細胞。在以后階段，具有樹突狀外觀的細胞在培養基中是可見的。大多數UMC來源的神經元在凝塊的上部生長，保持UMC形態的細胞靠近凝塊底部。
當凝塊中的細胞達到較高的密度時，將一片或多片血漿凝塊轉移到新鮮制備的血漿凝塊上。細胞在18-24小時中從被轉移的片移動到新凝塊中。神經元是遷移入新凝塊的第一種細胞。含有細胞的血漿凝塊用標準的含DMSO的冷凍培養基貯存在液態N2中(見上文)。
如果將薄的(垂直尺寸小于1mm)的血漿凝塊用于神經元的長出，細胞可以通過用標準技術進行的胰蛋白酶處理而從凝塊中收獲。1U/ml濃度的血纖維蛋白溶酶原(Sigma；Catalog No.P-9156)用于從較厚的血漿(垂直尺寸大約3mm到大約4mm)回收神經元。需要三次處理來從凝塊釋放神經元。由前兩次處理所釋放的細胞幾乎全部(如果不是全部)是UMC和其它污染細胞。看起來通過增加血纖維蛋白溶酶原的濃度，由一次或者可能兩次處理來釋放神經元是可能的。
通過在凝塊周圍的培養基中包括B27(或者N-2)培養補充物混合物(Gibco，Carlsbad，CA)來增加凝塊中神經元的產生。在培養基中使用aFGF作為唯一的生長因子也觀察到了人神經元的生長增強。然而，在用從大鼠皮膚制備的UMC進行的平行實驗中，需要生長因子的組合(bFGF、長形EGF、LIF和R3長形IGF)；除了aFGF之外的這些生長因子在人細胞培養基中的存在進一步增加了神經元的生長。
不用實施例1記載的方法生產的UMC，而是用皮膚和脂肪組織的小片(例如尺寸各自為大約0.5到大約5mm的近似立方體的碎片)在血漿凝塊中產生神經元也是可能的。這兩種組織在分開的實驗中測試。組織碎片直接置于凝塊表面上。培養皿中的培養基水平面要足夠高以防止變干，但也要足夠低以防止組織碎片漂浮并允許它們附著到血漿凝塊表面。在這些培養物中，通過使用帶有低血清濃度(即不高于2.5％)并包含人aFGF(5ng/ml)的培養基來防止成纖維細胞的過度生長。堿性FGF(bFGF)也可以加入到培養基中。起始這些培養5-7天期間，在組織碎片緊鄰的凝塊中觀察到了神經元的生長。組織(皮膚或脂肪)碎片可從原始血漿凝塊中移出并用于接種新的血漿凝塊。從脂肪組織回收的神經元在形態上不同于從皮膚回收的神經元。那些從皮膚產生的是小的樹突細胞，而那些從脂肪產生的是大的少突細胞。
在重新接種進血漿凝塊后，源自人和大鼠骨髓的UMC(以前也稱為前脂肪細胞)就在血漿凝塊中產生出神經元。這些UMC/前脂肪細胞記載于共同未決的美國專利申請Serial No.10/330,584中，其公開內容整體引入這里作為參考。考慮到從皮膚和脂肪碎片生長神經元的能力(見上文)，很可能從骨髓細胞或骨髓碎片生長它們同樣是可行的，象對皮膚和脂肪碎片所進行的一樣將骨髓細胞或骨髓碎片置于血漿凝塊表面。
一旦神經元由上述血漿凝塊方法產生，它們就可以從凝塊中分離并在標準液體培養條件下生長。
本發明的許多實施方式已經被記載。然而，能夠理解的是，可以進行不脫離本發明精神和范圍的各種修改。相應地，其它實施方式是在下面權利要求的范圍之內的。
權利要求
1.生產神經元的方法，該方法包括如下連續步驟(a)提供未分化的間充質細胞(UMC)來源；(b)提供含有約6mM到約18mM Ca2+的血漿凝塊；(c)將UMC從來源加入到血漿凝塊中；并且(d)孵育血漿凝塊，其中，在孵育期間，血漿凝塊中的UMC亞群分化為神經元，從而在血漿凝塊中產生了包括神經元的細胞群。
2.權利要求1的方法，其中UMC來源是哺乳動物皮膚碎片。
3.權利要求1的方法，其中UMC來源是哺乳動物脂肪組織碎片。
4.權利要求1的方法，其中UMC來源是含有UMC的不貼壁的衍生細胞群，不貼壁的衍生細胞通過如下過程生產，包括(a)提供含有未分化的間充質細胞(UMC)的組織的碎片以獲得起始細胞；(b)從所述碎片中分離起始細胞；(c)培養起始細胞；并且(d)從所述培養物中收獲不貼壁的衍生細胞群，其中所述的不貼壁的衍生細胞包括UMC。
5.權利要求4的方法，該過程進一步包括一輪或多輪衍生，包括利用從前一輪收獲的不貼壁的衍生細胞作為起始細胞重復步驟(c)和(d)。
6.權利要求5的方法，其中一輪或多輪額外的衍生包括一個到二十輪。
7.權利要求4的方法，其中所述的含有UMC的組織選自真皮組織、脂肪組織、結締組織、筋膜、固有層以及骨髓。
8.權利要求4的方法，進一步包括在酸性成纖維細胞生長因子存在下培養所述不貼壁的細胞。
9.權利要求1的方法，進一步包括從血漿凝塊中分離細胞群。
10.權利要求9的方法，進一步包括在無血清培養基中培養所分離的細胞群。
11.權利要求1的方法，其中UMC來源是從給予了該細胞群的個體中獲得的。
12.由權利要求1的方法生產的神經元。
13.含有包括了神經元的細胞群的組合物，其中細胞群是由權利要求1的方法生產的。
14.權利要求13的組合物，進一步包括藥學可接受的載體。
15.權利要求13的組合物，進一步包括無細胞的生物可降解基質，其中細胞群的細胞被整合到基質內或基質上。
16.權利要求13的組合物，進一步包括無細胞的生物可降解填料。
17.權利要求13的組合物，其中組合物基本上沒有來自培養基血清的蛋白質。
18.修復哺乳動物受試者中損傷的或缺損的神經組織的方法，該方法包括將權利要求13的組合物注射入、移植或者植入到神經組織中。
19.權利要求18的方法，其中神經組織是中樞神經系統(CNS)組織。
20.權利要求19的方法，其中CNS組織是脊髓組織。
21.權利要求21的方法，其中CNS組織是腦組織。
22.權利要求18的方法，其中神經組織是外周神經系統(PNS)組織。
23.權利要求18的方法，其中哺乳動物受試者是人患者。
24.權利要求18的方法，其中哺乳動物受試者具有脊髓損傷。
25.權利要求18的方法，其中哺乳動物受試者患有選自下組的疾病或缺損阿耳茨海默氏病、帕金森病、亨廷頓病、泰氏-薩氏病、肌萎縮性脊髓側索硬化、中風、面神經退化、手的外周損傷、神經纖維瘤病、纖維肌痛、脊髓空洞癥、神經系統的自身免疫疾病、以及神經組織腫瘤。
26.權利要求20的方法，其中組合物的細胞群是自體的。
全文摘要
本發明提供了一種由未分化的間充質細胞(UMC)生產神經元的方法。本發明也公開了由該方法生產的分離的神經元、含有這種神經元的組合物、以及使用這種組合物修復損傷的或缺損的神經組織的方法。
文檔編號A61L27/38GK1836034SQ200480023104
公開日2006年9月20日 申請日期2004年6月11日 優先權日2003年6月13日
發明者O·馬科 申請人:埃索拉根技術有限公司