增加的神經胚素分泌的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：1092330閱讀：549來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：增加的神經胚素分泌的制作方法
            
技術領域：
            本發明涉及用于制備神經胚素肽以及例如通過基因治療將神經胚素局部遞送至神經系統特定區域的方法和組合物，所述神經系統包括中樞神經系統和眼。本發明包括自被包封入半透大膠囊(macrocapsule)的經轉導或轉染的細胞遞送神經胚素。本發明進一步還涉及可制備增加量的神經胚素的哺乳動物細胞。
            
背景技術：
            細胞具有多種方式將從頭合成的蛋白質導向至所述細胞的各個區室及細胞外間隙。將信號肽引入染色體DNA編碼部分并通過核醣體作為蛋白質的一部分合成。信號肽構成了N-末端，可以將新合成的多肽導入粗面內質網。在這里，所述信號肽被從多肽切除，成熟蛋白質分泌入周圍環境。因此，所述信號肽仍然留在了細胞內。
            
蛋白質的原(pro)-部分被從蛋白質的成熟部分切割出來終止于細胞外。對于一些神經營養因子例如NGF而言，所述的蛋白質原-部分作為神經肽具有生物活性。
            
在插入的基因編碼分泌型蛋白質的基因治療中，需要將信號序列置于成熟蛋白質之前以確保其通過粗面內質網和高爾基氏體的正確加工。幾乎恒定不變的首選是所述蛋白質的天然信號肽，因為通常期望的是所述蛋白質以與天然細胞分泌和加工的相同方式分泌和/或加工。對于一些應用情況，還期望蛋白質的表達量與天然細胞中的相等。另外，本領域技術人員不能排除切割出的信號序列在細胞新陳代謝中發揮作用的可能性。最終，本領域技術人員可以選用蛋白前-原-部分確保成熟蛋白的正確加工和折疊。
            
多數情況下，預期分泌治療因子的經體內轉導及轉染的細胞不能分泌治療足夠量的治療因子并且不能分泌足夠的時間。當細胞在體外被轉染或轉導并在基因修飾后插入患者的情況下，這在離體基因治療中同樣也是一個問題。
            
現有技術沒有提供關于在哺乳動物中將信號肽與異源蛋白偶聯的很多信息。對于在真菌或酵母中異源表達哺乳動物蛋白質而言，通常的做法是用在生產者物種中功能性的信號肽取代哺乳動物信號肽。
            
發明概述本發明涉及一種用于制備生物學活性神經胚素多肽的方法，該方法包括培養其中含有表達載體的細胞，該表達載體中包含可操作地連接于編碼信號肽和神經胚素多肽的核苷酸序列的啟動子序列，其中所述的核苷酸序列不編碼神經胚素原-區。
            
所述天然的人前原神經胚素多肽長220個氨基酸(
            

            
圖17A)(SEQ IDNO10)。所述神經胚素信號肽由39個氨基酸組成，起始于第一位甲硫氨酸，終止于第39位丙氨酸(圖17B)。神經胚素的最長的全長前-結構域由69個氨基酸組成，起始于第40位絲氨酸，終止于第107位精氨酸(圖17C)。一種成熟的神經胚素多肽由C末端113個氨基酸組成，起始于第108位的丙氨酸，終止于第220位的甘氨酸。前-原-神經胚素含有幾個可能的前-肽切割位點，原-前-神經胚素在哺乳動物細胞中表達可以引起多種成熟肽的分泌，所述成熟肽可能為由C末端的140，113，107，和104個氨基酸組成的形式。對于所有這些成熟形式中的每一種來說，存在一個相應的原-結構域，其由從成熟肽的第40位到首位殘基前一位的氨基酸組成。
            
本發明為在用病毒載體在體內及體外轉導哺乳動物細胞時常出現的下述問題提供了解決方案幾乎根本沒有神經營養性因子包括神經胚素的分泌。這種現象還出現于基于質粒的表達載體中。由于某些未知的原因，哺乳動物細胞經常被阻遏而無法分泌出所述載體編碼的神經營養性因子。一種可能的解釋是分泌型蛋白質的正確加工是細胞特異性的。這是病毒載體基因治療應用中的重要問題。目前，病毒載體基因治療是體內或離體基因治療的最優選(如果不是唯一相關的話)的方法，這是由于病毒載體能確保穩定地整合入被轉導細胞的基因組內。
            
本發明提供了成熟人神經胚素或成熟人神經胚素生物活性截短形式即分泌的神經胚素多肽作為前-蛋白而非前-原蛋白有效表達。本發明所述神經胚素前蛋白通常包括兩組分分泌的神經胚素多肽(如上所述)，和異源的信號序列。
            
另外，本發明人發現用來自其他蛋白質諸如來自免疫球蛋白重鏈可變區的另一種信號肽替換取代神經胚素的天然信號肽，可以更進一步提高神經胚素的分泌，尤其是自經轉導的細胞的分泌。
            
另外，本發明人還發現通過去除編碼信號肽及神經胚素多肽的核苷酸序列中的編碼原-區的核苷酸序列，能夠表達并且獲得比包括原區在內時更多量的分泌型神經胚素。
            
現已發現盡管原-區是許多蛋白質正確折疊所必需的，但是確實可以制備出無原-區的生物活性神經胚素多肽。
            
另一方面本發明涉及編碼所述信號肽和所述神經胚素多肽的核苷酸序列，含該核苷酸序列的表達載體，包含本發明所述載體以及一種或多種藥物學可接受的佐劑、賦形劑、載體和/或稀釋劑的藥物組合物。所述藥物組合物可以用于體內和離體的基因治療。
            
另一方面，本發明涉及經本發明所述載體轉導或轉染的分離的宿主細胞。
            
與經編碼帶有其天然信號肽的神經胚素的載體轉導或轉染的細胞相比，這類經過基因修飾的宿主細胞能夠產出出人意料的大量神經胚素。因此，這些經過轉導或轉染的宿主細胞可以作為工業化大規模制備神經胚素的生產細胞的有希望的來源。所述神經胚素-分泌細胞還可以移植入哺乳動物受試者充當神經胚素的來源。一種具體的應用為離體基因治療。
            
另一方面本發明涉及一種能夠產生感染性載體粒子的包裝細胞系，該載體顆粒含有源自反轉錄病毒的基因組，該基因組包含5’反轉錄病毒LTR、tRNA結合位點、包裝信號、可操作地連接于編碼融合蛋白的多核苷酸序列、第二鏈DNA合成起點以及3’反轉錄病毒LTR，所述融合蛋白包括神經胚素和免疫球蛋白信號肽。
            
這些包裝細胞系還可以用于制備本發明所述病毒載體。當包封并移植至CNS時候，它們還可以用于體內基因治療。
            
另一方面，本發明涉及轉基因非人哺乳動物，其中含有至少一種在被本發明所述載體轉導或轉染的細胞。所述過表達神經胚素的動物可用于基因繪圖以及篩選和開發藥物。
            
優選地，所述經轉導或轉染的細胞具有個體動物的基因型，即，并非是同種異體的(allogenic)或異種的(xenogenic)移植體。
            
另一方面，本發明涉及可植入細胞培養裝置，所述裝置其中含有允許神經營養性因子擴散通過的半透薄膜；和至少一種本發明所述的分離的宿主細胞。
            
這些膠囊可用于神經胚素移植入中樞神經系統時的局部遞送。生長因子局部及延長的遞送是治療多種CNS疾病的優選施用方法，包括但不限于帕金森氏疾病，阿耳茨海默病(Alzheimer’s disease)，亨延頓舞蹈病(Huntington′s disease)，中風(stroke)，和肌萎縮性側索硬化(ALS)。同樣，所述膠囊可用于為了外周疾病包括但不限于神經病和神經病性疼痛的神經胚素的局部及延長的遞送。其他的適應癥還包括眼部疾病。
            
本發明所述的膠囊劑提供了使用膠囊方式將病毒顆粒遞送至患者所需部位的方法。與單次輸注相反，載體-制備型細胞系的膠囊化能夠使得將病毒顆粒持續地遞送至目標部位。此外，還可以重復治療，減小免疫攻擊的可能性。所述膠囊具有足夠大的孔，允許釋放自包裝細胞的病毒顆粒通過，但阻止宿主細胞進入膠囊。
            
這種膠囊方式提高了所述治療的安全性和可控性，因為該裝置能很容易地被撤除(終止轉導治療)或外植(explanted)及再植入(reimplanted)(修飾治療)。另外，由于膠囊裝置為非開放性的或者非外部化的(externalised)，所以減少了感染的幾率。
            
最后，由于膠囊化作用能夠阻止包裝細胞在患者體內的遷移，從而延長了植入的包裝細胞的存活能力，所以這種治療方法需要的細胞很少。這有助于進一步降低所述患者體內的免疫反應。
            
另一方面本發明涉及本發明所述載體作為藥物的用途。
            
另一方面，本發明涉及本發明所述載體用于制備在治療神經系統疾病的藥物的用途。
            
另一方面，本發明涉及本發明所述載體在制備用于治療CNS疾病的藥物的用途。
            
另外，本發明涉及一種治療神經系統疾病的方法，該方法包括向需要的個體施用治療有效量的本發明所述載體；或者其中治療有效量的藥物組合物，其含有所述載體。
            
依據本發明的這個方面提供了改進后的基因治療方法，用于治療神經系統疾病。正如所附實施例證明的那樣，用本發明所述病毒載體轉導導致所編碼神經胚素的前所未有的分泌水平，以及由此而帶來的增強的治療效果。
            
另一方面本發明涉及一種治療神經系統疾病的方法，該方法包括向需要的個體移植-治療有效量的本發明所述的轉導細胞；或者-本發明所述的可植入裝置或者這個方面提供了另一種治療神經系統疾病的方法，該方法基于離體基因治療和能分泌增量神經胚素的治療用細胞的植入。
            
大規模生產神經胚素目前優選的方法為在大腸桿菌中異源表達，然后是蛋白質的溶解、提取、純化、重折疊以及任選的切割。用于制備研究規模量的另一種方法包括培養哺乳動物生產者細胞例如CHO細胞，該細胞可將經正確加工及折疊的神經胚素分泌入培養基，因而能夠相對容易地從培養基分離出所述神經胚素。本發明所述的哺乳動物細胞能夠制備得到比此前的哺乳動物細胞更多的神經胚素，因而是用于制備生物活性神經胚素的改進的細胞來源，該神經胚素是經過正確加工及折疊的神經胚素。
            
附圖簡述圖1各種哺乳動物的IgSP序列的比對結果。
            
圖2實施例2的轉導試驗中使用的慢病毒載體構建體pHsC.IgSP.hNBN.W的載體圖譜。
            
圖3pNSln.IgSP.hNBN的載體圖譜。與實施例1使用的位于BamHI和XhoI限制酶切位點之間的pHsC.IgSP.hNBN.W相同的IgSP-NBN序列。
            
圖4RetL3ELISA測定的NBN活性(雙份樣品)。(a)使用大腸桿菌中制備的重組小鼠Artemin(mART)作為標準測定的細胞上清中的NBN活性，(b)經轉染的細胞的上清的分析結果，(c)經轉導的細胞的上清的分析。
            
圖5用抗-NBN抗體#_378進行Western印跡分析。(a)來自CHO-NBN16細胞的GFR[alpha]3親和純化的NBN(CHO-NBN)和20ng大鼠重組NBN(rNBN)的分析結果(b)經IgSP-NBN表達構建體轉染或轉導的ARPE-19以及穩定過表達來自野生型構建體的NBN的兩種CHO細胞克隆(CHO-NBN25c和CHO-NBN16)的上清的分析。箭頭標示的是經抗體#_378還原后神經胚素的糖基化及非-糖基化單體的位置。
            
圖6預測利用SignalP對信號肽的切割。解釋參見實施例4。
            
圖7圖7A圖示的是質粒pHs C.hNBN.W，圖7B圖示的是質粒pHsCXW。解釋參見實施例6。
            
圖8圖8A圖示的是條件培養基中的相對NBN釋放，圖8B和8C圖示的是不同細胞系中的NBN，還參見實施例7。
            
圖9圖示的是天然人神經胚素多肽的104個羧基(C)末端氨基酸序列(SEQ ID NO19)，以及編碼所述天然人神經胚素104個C末端氨基酸的相應DNA序列(SEQ ID NO58)與為CHO細胞表達而優化的編碼天然人神經胚素104個C末端氨基酸的合成基因(SEQ ID NO59)之間的比對。(*)標示的是合成基因中相對于天然序列發生了改變的核苷酸。
            
圖10圖示的是質粒pNBN026-35內的神經胚素序列(SEQ ID NO60)。該序列的上游緊鄰“CT”二聯核苷酸，其參與構成XhoI限制酶切位點。下游緊鄰BamHI限制酶切位點。
            
圖11圖示的是融合于合成信號序列的神經胚素C末端104氨基酸的DNA(SEQ ID NO61)和氨基酸(SEQ ID NO62)序列。下劃線標出的為信號序列。
            
圖12圖示的是融合于神經胚素信號序列的神經胚素C末端104氨基酸的DNA(SEQ ID NO63)和氨基酸(SEQ ID NO64)序列。下劃線標出的為信號序列。
            
圖13A圖示的是融合于白蛋白信號序列的神經胚素C末端104氨基酸的DNA(SEQ ID NO65)和氨基酸(SEQ ID NO66)序列。下劃線標出的為信號序列。
            
圖13B圖示的是融合于經修飾白蛋白信號序列的神經胚素C末端104氨基酸的DNA(SEQ ID NO69)和氨基酸(SEQ ID NO70)序列。下劃線標出的為信號序列。
            
圖14圖示的是融合于人生長激素信號序列的神經胚素C末端104氨基酸的DNA序列(SEQ ID NO67)和氨基酸(SEQ ID NO68)序列。下劃線標出的為信號序列，其含有內含子。
            
圖15圖示的是使用白蛋白信號肽序列(15A)或人生長激素信號肽序列(15B)(15C)時，自CHO細胞分泌的神經胚素的質譜分析結果。11,156和11,157道爾頓處的峰對應于104個氨基酸的神經胚素C末端片段。11,084和11,085道爾頓處的峰對應于103個氨基酸的神經胚素C末端片段。圖15A圖示的是白蛋白-指導分泌的去糖基化神經胚素。圖15B圖示的是人生長激素-指導分泌的去糖基化神經胚素。圖15C圖示的是人生長激素-指導分泌的神經胚素。具有較大質量(mass)的峰對應的是各種糖基化存在形式。
            
圖16圖示的是KIRA測定結果，顯示了CHO細胞中產生重組制備的神經胚素的活性。
            
圖17A圖示的是包括成熟蛋白質、原-結構域和信號肽的全長神經胚素的氨基酸序列(SEQ ID NO10)。圖17B圖示的是全長天然神經胚素信號肽的氨基酸序列。圖17C圖示的是全長神經胚素原-結構域的氨基酸序列。
            
定義“C末端氨基酸”在本申請中是指多肽鏈中位于多肽鏈氨基(N)末端最遠端的一連串連續的氨基酸。
            
“神經胚素原-區”是指這樣的區域，其中含有至少對應于SEQ IDNO10，11，12中第41至-11位氨基酸的氨基酸。
            
“前原神經胚素多肽”(SEQ ID NO10)在本申請中是指由下列序列組成的多肽成熟的人神經胚素，即，神經胚素C末端的113個氨基酸(SEQID NO10的第108-220位a.a.)，全長人神經胚素原-結構域，即，成熟神經胚素N末端近端的68個氨基酸(SEQ ID NO10的第40-107位a.a.)，以及人神經胚素信號肽，即，神經胚素原-結構域N末端近端的39個氨基酸(SEQ ID NO10的第1-39位a.a.)，信號肽-真核生物信號肽。真核生物的信號肽是存在于待分泌或將成為膜成分的蛋白質上的肽。通常位于蛋白質的N-末端。本申請中，SignalP(版本2.0或者優選版本3.0)中鑒定的所有信號肽都被認為是信號肽。
            
“功能性神經胚素信號肽”在本申請中是指SEQ ID NO10的前39個氨基酸或者或者其中任一能實現成熟神經胚素從細胞分泌的部分。
            
“功能性神經胚素信號序列”是指編碼功能性的神經胚素信號肽的核酸序列。
            
哺乳動物信號肽是指源自分泌自ER的哺乳動物蛋白質的信號肽。
            
成熟的人神經胚素多肽在本申請中是指天然人神經胚素C-末端的113個氨基酸，即SEQ ID NO.10中的第108-220位氨基酸。
            
成熟的小鼠神經胚素多肽在本申請中是指天然小鼠神經胚素C-末端的113個氨基酸，即SEQ ID NO.11中的第112-224位氨基酸。
            
成熟的大鼠神經胚素多肽在本申請中是指天然大鼠神經胚素C-末端的113個氨基酸，即SEQ ID NO.12中的第112-224位氨基酸。
            
神經胚素多肽在本申請中是指一種多肽，其中含有天然人神經胚素C-末端第99-140位氨基酸，大鼠或小鼠神經胚素C-末端第99-144位氨基酸。更優選地，神經胚素多肽含有天然人神經胚素C-末端的99-113位氨基酸，天然大鼠神經胚素C-末端99-113位氨基酸，或者小鼠神經胚素C-末端的99-113位氨基酸，其中的每一種都具有天然序列中的達15個氨基酸的取代。一些情況下，應理解“分泌的神經胚素多肽”是指待分泌的多肽而不是已分泌的多肽。所述分泌的神經胚素多肽不含神經胚素原-區。
            
功能性的神經胚素原結構域是位于信號肽和成熟肽之間的肽，所述原肽可在切割信號肽后用弗林蛋白酶從成熟肽切割。
            
生物活性二聚化時與GFRα3一起結合RET并誘導RET二聚化及自身磷酸化的能力。用Kira Elisa或RET L3 Elisa試驗測量。
            
“異源的”當用于核酸序列或氨基酸序列時，是指來源于與特定宿主細胞不同來源的序列，或者，如果來自同樣的宿主細胞，則是對其原始形式修飾得到的。
            
異源的信號肽  非天然地可操作地連接于神經胚素多肽的信號肽。
            
發明詳述本發明涉及一種用于制備神經胚素多肽的方法，其中編碼神經胚素多肽的核苷酸序列不編碼原-區。本申請中原-區至少包括SEQ ID NO.10，11或12中的第-41至-11位氨基酸。更優選地，所述原-區包括至少SEQ IDNO.10，11或12中任一序列中的第-41至-1位氨基酸。更優選地，所述原-區包括至少SEQ ID NO.10，11或12中任一序列中的第-41至10位氨基酸。最優選地，其含有所述序列的原-結構域，相當于SEQ ID NO10中的-41至27位氨基酸，或者SEQ ID NO11或SEQ ID NO12中的-41至31位氨基酸。
            
信號肽本發明所述的表達載體包含含有啟動子序列的核酸，該啟動子序列能夠指導編碼可操作地連接有信號肽的神經胚素多肽的的核苷酸序列的表達，其中所述的核苷酸序列不編碼神經胚素多肽的原-區。
            
在分泌過程中，所述神經胚素前-蛋白的信號肽被產生神經胚素多肽的宿主細胞所切割。盡管所述切割位點通常是確定的，但是本領域技術人員應該知道信號肽切割位點是可以變動的。因此，有關確切切割位點不確定的實施方案也在本發明的范圍之內。
            
所述信號肽可以是任一功能性的信號肽，例如異源的信號肽，例如哺乳動物信號肽。所述信號肽可以來自任一合適物種的，例如人，小鼠，大鼠，猴子，豬，狗，貓，牛或馬。
            
所述信號肽連接于神經胚素多肽，并且優選直接地融合于所述神經胚素多肽，例如所述信號肽的C-末端與神經胚素多肽的N-末端融合。
            
正如所附實施例證實的那樣，該信號肽的使用通常可使體外和體內神經胚素的分泌增加。該結果利用慢病毒-轉導的細胞(體內和體外)和質粒轉染的細胞(體外)都能再現。當所述信號肽基因被直接融合于成熟蛋白質的編碼基因時，所述細胞能夠制備出具有生物學活性的成熟蛋白質(即，不含有原-區部分)。
            
本發明人發現不僅天然的神經胚素信號肽可用作信號肽，而且異源的信號肽也可以使用，并且往往提供比天然信號肽更高的產量。所述異源的信號肽可以選自生長因子信號肽、激素信號肽、細胞因子信號肽和免疫球蛋白信號肽組成的組。
            
因此，信號肽的實例是選自以下信號肽組成的組的信號肽TGFβ信號肽、GDF信號肽、IGF信號肽、BMP信號肽、神經營養因子信號肽、PDGF信號肽和EGF信號肽的信號肽，選自激素信號肽的信號肽，所述激素選自生長激素、胰島素、ADH、LH、FSH、ACTH、MSH、TSH、T3、T4、和DHEA組成的組，或者白細胞介素信號肽。
            
一個實施方案中，所述信號肽選自neurturin信號肽、GDNF信號肽、persephin信號肽和NGF信號肽組成的組。
            
另一個實施方案中，所述信號肽選自白蛋白信號肽、經修飾的白蛋白信號肽和生長激素信號肽組成的組，諸如選自大鼠白蛋白信號肽、經修飾的大鼠白蛋白信號肽和人生長激素信號肽的信號肽組成的組，例如大鼠白蛋白信號肽和人生長激素信號肽。
            
因此，一些實施方案中，所述分泌的神經胚素多肽融合于天然的大鼠白蛋白信號肽。這種融合蛋白的實例為SEQ ID NO66。其他實施方案中，所述分泌的神經胚素多肽連接于經修飾的大鼠白蛋白信號序列。這種融合蛋白的實例為SEQ ID NO70。其他實施方案中，所述分泌的神經胚素多肽融合于人生長激素的信號序列。這種融合蛋白的實例為SEQ IDNO68。
            
還有另一個實施方案中，所述信號肽是免疫球蛋白信號肽，諸如免疫球蛋白重鏈信號肽。具體而言，免疫球蛋白信號肽可以是選自小鼠IgSP(SEQ ID NO 4)、大鼠IgSP(SEQ ID NO 6)、豬IgSP(SEQ ID NO 5)、猿IgSP(SEQ ID NO 2 or 3)、人IgSP(SEQ ID NO 1)組成的組的信號肽，諸如小鼠IgSP(SEQ ID NO 4)或人IgSP(SEQ ID NO 1)。
            
免疫球蛋白信號肽(IgSP)是已知見于許多哺乳動物的19個氨基酸的小肽。源自人、獼猴、狨(marmoset)、大鼠、小鼠和豬的該序列的比對結果圖示于圖1。與人IgSP相比的序列同一性百分比差別很大，從21％(豬)-68％(狨)。這種相當大的差別表明該特異性序列可以在很大程度上變動而基本上并不改變所述信號肽的生物學功能。另外還發現了種間存在的交叉反應性，如所附實施例所證實的那樣。用在大鼠(體內試驗)和人細胞(ARPE-19細胞)中具有功能的小鼠IgSP進行了這些試驗。
            
優選地，所述IgSP是小鼠或人來源的，因為已知小鼠IgSP能夠在小鼠、大鼠和人體內發揮作用。就應用于人類而言，所述IgSP優選來源于人類，這是為了減少任何種間交叉副作用的風險。
            
另一個實施方案中，所述信號肽是天然的神經胚素信號肽，例如天然的人神經胚素信號肽。在本申請中，將天然神經胚素信號肽和神經胚素多肽的后一種構建體稱為delta-原(pro)神經胚素。
            
還有另一個實施方案中，所述信號肽是一種合成的信號肽，例如所述信號肽具有SEQ ID NO 62的氨基酸序列AA1-AA38位。(MetSerTrpAlaTrpAlaAlaCysProProCysProThrAlaLeuGlyLeuGlyGlySerAlaLeuTrpProThr-LeuAlaAlaLeuAlaLeuLeuSerSerValAlaGluAla)
            
神經胚素神經胚素多肽是具有下列功效的蛋白質促進神經元細胞及組織的存活，維持神經元細胞及組織的表型分化，阻止神經元細胞及組織的變性，促進神經元細胞及組織的再生，以及恢復神經元細胞及組織的活性。神經胚素(最早的描述，例如，見WO00/01815)另外還被稱為″artemin″(參見，例如，WO00/18799)和″enovin″(參見，例如，WO00/04050)。
            
神經胚素已經分類為TGF-β超家族的關系膠原的成員(Massague，et al，.1994，Trends in Cell Biology，4172-178)，是膠質細胞系-來源的神經營養性因子配體家族(“GDNF”；WO93/06116)的成員，在該家族中包括GDNF、persephin(“PSP”；Milbrandt et al.，1998，Neuron 20245253)和neurturin(″NTN″；WO 97/08196)。GDNF亞家族的配體都能通過RET受體酪氨酸激酶誘導信號傳導。GDNF亞家族的這3種配體與神經營養性受體-GFR[α]受體家族的相對親和力不同。優選地，神經胚素通過GFR[α]3-RET復合體發揮作用。Baudet et al.，Development，127，pp.4335-44(2000)；Baloh et al.，Neuron，21，pp.1291-1302(1998)；Airaksinen et al.，Mol.Cell.Neuroscience，13，pp.313-325(1999)。
            
神經胚素(SEQ ID NO10)與GDNF亞家族成員Neurturin、Persephin和GDNF之間氨基酸序列比較結果顯示于表1。可用于本發明的神經胚素多肽優選具有GDNF亞家族指紋(fingerprint)，即表1中下劃線部分的氨基酸殘基。
            
表1神經胚素與Persephin、Neurturin和GDNF之間的氨基酸序列比較————————————Neurturin-全長   --------------------MQRWKAAALASVLCSSVLSIWMCREGLLLSHRLGPA神經胚素MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEASLGSAPRSPAPREGPPPPersephin-全長---------------------------GDNF_人-全長-----MKLWDVVAVCLVLLHTASAFPLPAGKRPPEAPAEDRSLGRRRAPFALSSDSNeurturin-全長LVPLHRLPRTLDARIARLAQYRALLQGAPDAMELRELTPWAGRPPGPRRRAGPRRR神經胚素VLASPAGHLPGGRTARWCSGRARRPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGPersephin-全長-MAVGKFLLGSLLLLSLQLGQGWGPDARGVPVADGEFSSEQVAKAGGTWLGTHRPLGDNF_人-全長NMPEDYPDQFDDVMDFIQATIKRLKRSPDKQMAVLPRRERNRQAAAANPENSRGKGNeurturin-全長RARARLGARPCGLRELEVRVSELGLGYASDETVLFRYCAGACEA-AARVYDLGLRR神經胚素SRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRR-ARSPHDLSLASPersephin-全長ARLRRALSGPCQLWSLTLSVAELGLGYASEEKVIFRYCAGSCPRGARTQHGLALARGDNF_人-全長RRGQRGKNRGCVLTAIHLNVTDLGLGYETKEELIFRYCSGSCDA-AETTYDKILKN**   :*  ****::.*:**:*:*:* *  ::*Neurturin-全長LRQRRRLRRE---RVRAQPCCRPTAYEDE+VSFLDAHSRYHTVHELSARECACV-
            
神經胚素LLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYE-AVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGPersephin-全長LQGQGRAHGG--------PCCRPTRYT-DVAFLDDRHRWQRLPQLSAAACGCGGGDNF_人-全長LSRNRRLVSD----KVGQACCRPIAFDDDLSFLDDNLVYHILRKHSAKRCGCI-* .****:  ::*:*.:::.** *.*——————————*代表具有單個完全保守的殘基的位置。表示下列“強的”基團之一是完全保守的-STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY，FYW.
            
.表示下列“較弱的”基團之一是完全保守的-CSA，ATV，SAG，STNK，STPA，SGND，SNDEQK，NDEQHK，NEQHRK，VLIM，HFY.
            
從表1顯示的氨基酸序列比對方式可以看出，神經胚素具有7個在TGF-[β]超家族中保守的半胱氨酸殘基。基于該序列的比對，神經胚素被證明是神經營養性因子的GDNF亞家族的成員(LGLG-FR(Y/F)CSGSC-QxCCRP-SAxxCGC，GDNF亞家族指紋，表1中的下劃線部分)。
            
本申請中使用的神經胚素多肽可以任一生物活性形式提供，包括前-蛋白形式、成熟的蛋白質、糖基化的蛋白質、磷酸化蛋白質、截短的形式或者任一其他翻譯修飾的蛋白質。已知對于每一NBN變體而言生物活性的神經胚素都是二聚形式的，這是因為二聚體的形成是活性需要的。單體NBN多肽幾乎甚至根本沒有活性。生物活性的神經胚素多肽包括二聚多肽，該多肽在輔助因子(例如GFR[α]3或RET)存在情況下能夠與GFR[α]3或者與GFR[α]3和RET的復合體結合，誘導RET二聚化及RET的自身磷酸化。因此，在本申請中，“神經胚素多肽”是一種具有神經營養活性的多肽(例如，描述見WO 00/01815)。
            
用本發明所述方法制備的神經胚素多肽具有天然神經胚素的至少一種生物活性。為本發明目的的生物活性可以用任一合適的方法測定。生物學活性的神經胚素多肽是具有下述特征的多肽其二聚化時，能夠與GFRα3一起結合至RET并誘導RET二聚化及自身磷酸化。(參見，例如，Sanicola et al.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，946238)。測定受體結合及受體自身磷酸化的任一方法都可用于測評用本發明所述方法制備的神經胚素多肽的生物活性。例如，實施例17中描述的KIRA測定(ELISA)可用于測評神經胚素的生物活性。(還參見，Sadick et al.，1996，Anal.Biochem.，235(2)207)。
            
神經胚素的生物活性形式還可以使用實施例1描述的RetL3 ELISA試驗進行檢測。無生物學功能的神經胚素不能用RetL3 ELISA試驗檢測。
            
下列全長的序列表示帶有野生型信號肽的野生型前-原-神經胚素。當在哺乳動物細胞內進行轉導或轉染時，得到的成熟神經胚素只有極少量是分泌型的。人、小鼠和大鼠神經胚素的天然信號肽由開頭的39個氨基酸表示。
            
SEQ ID NO10中的--AA-80-AA140(″野生型″人前原形式)，SEQ ID NO11中的--AA-80-AA144(小鼠前原形式)，SEQ ID NO12中的--AA-80-AA144(大鼠前原形式)，本發明所述的分泌的神經胚素多肽可以長度各不相同。盡管成熟的人神經胚素多肽通常由前原神經胚素的C末端113個氨基酸組成，但是這113個氨基酸并非都是獲得有用的神經胚素生物活性所必需的。氨基末端的截短是可允許的。因此，所述分泌的神經胚素多肽對應于天然人神經胚素C末端的99-113個氨基酸，即，它的長度可以是99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112或113個氨基酸。分泌的神經胚素多肽的確切長度的選定是一種設計選擇，這是本領域技術人員能夠操作的。分泌的人神經胚素多肽由人神經胚素C末端104個氨基酸組成，舉例說明于下文提供的工作(working)實施例中。除了長度的變化之外，所述分泌的人神經胚素多肽還可以在序列上有所不同。
            
下列″野生型″神經胚素氨基酸(″aa″或″AA″)序列是那些可用于本發明所述方法和組合物序列的范例--SEQ ID NO10中的AA1-AA140(成熟的140AA；下文稱為″140NBN″)，--SEQ ID NO10中的AA25-AA140(成熟的116AA；下文稱為″116NBN″)，--SEQ ID NO10中的AA28-AA140of SEQ ID NO10(成熟的113AA(SEQ ID No.14)；下文稱為″113NBN″)，--SEQ ID NO11中的AA1-AA144(小鼠成熟144AA)，--SEQ ID NO12中的AA1-AA144of SEQ ID NO12(大鼠成熟--144AA)，--肽，其具有SEQ ID No.10中AA107-AA140所示C-末端序列，更優選具有SEQ ID No.10中AA76-AA140所示序列的肽，并保留了GDNF家族和TGF-β超家族的7個特征性Cys殘基。
            
一個實施方案中，優選的神經胚素多肽含有(7個)保守的半胱氨酸，如SEQ ID NO.10中第43，70，74，107，108，136和138位所示。已知TGF-超家族中的這7個保守半胱氨酸殘基形成了3個單體內二硫鍵(例如，SEQID NO.10中43-108，70-136和74-138位半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵)和1個單體間二硫鍵(例如，SEQ ID NO.10中107-107位半胱氨酸殘基之間形成的二硫鍵)，它們與延伸的β鏈區域一起形成了TGF-[β]超家族的保守結構基序。參見，例如，Daopin et al.，Proteins 1993，17176-192。
            
優選地，所述神經胚素多肽是野生型蛋白質的一種成熟形式。目前認為對于經基因修飾的哺乳動物細胞中的高水平分泌來說，原-區的缺失是很重要的。
            
可用于本發明的神經胚素多肽還包括全長神經胚素分子的截短形式。在所述截短的分子中，從N-末端或C-末端優選從N-末端缺失一個或多個氨基酸。所述截短的神經胚素多肽可以通過下述方式獲得提供成熟的神經胚素多肽，在足以能制備截短型神經胚素多肽的條件下讓該成熟神經胚素多肽與至少一種蛋白酶接觸。優選地，至少一種蛋白酶是外切蛋白酶(exoprotease)，接觸成熟神經胚素多肽能形成外切肽酶(exopeptidase)神經胚素多肽消化產物，該產物可以被二肽基肽酶(dipeptidyl peptidase)進一步消化。更優選地，根據本發明，表達載體編碼的蛋白質是截短的形式，無需再進一步加工。
            
本申請所述的截短的神經胚素多肽包括包含在成熟神經胚素序列中保守的7個半胱氨酸殘基的多肽序列。一些優選的實施方案中，所述截短的神經胚素多肽包括成熟113NBN神經胚素多肽中的至少85個羧基末端氨基酸。更優選的實施方案中，所述截短的神經胚素多肽包括成熟人113NBN中的至少98個羧基末端氨基酸。
            
一種截短的形式包括成熟神經胚素的7個半胱氨酸殘基中從第一個到最后一個的97個氨基酸。其對應于SEQ ID No 20的氨基酸2-97。
            
神經胚素的其他變體包括截短的NBN形式。這些截短形式的實例包括(i)本申請中命名為NBN 112的112AA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的112個氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的29-140位氨基酸。
            
(ii)本申請中命名為NBN111的111AA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的111個氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的30-140位氨基酸。
            
(iii)本申請中命名為NBN110的110AA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的110個氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的31-140位氨基酸。
            
(iv)本申請中命名為NBN109的109AA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的109個氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的32-140位氨基酸。
            
(v)本申請中命名為NBN108的108AA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的108個氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的33-140位氨基酸。
            
(vi)本申請中命名為NBN107AA的107AAAA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的107個氨基酸，例如SEQ ID NO.10中的34-140位氨基酸。
            
(vi)本申請中命名為NBN106的106AA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的106個氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的35-140位氨基酸。
            
(viii)本申請中命名為NBN105的105AA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的105個氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的36-140位氨基酸。
            
(ix)本申請中命名為NBN104的104AA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的104個氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的37-140位氨基酸。(也如SEQ ID No.19所示)。
            
(x)本申請中命名為NBN103的103AA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的103個氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的38-140位氨基酸。
            
(xi)本申請中命名為NBN 102的102AA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的102個氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的39-140位氨基酸。
            
(xii)本申請中命名為NBN101的101AA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的101個氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的40-140位氨基酸。
            
(xiii)本申請中命名為NBN100的100AA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的100個氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的41-140位氨基酸。
            
(xiv)本申請中命名為NBN99的99AA多肽序列，其具有成熟神經胚素多肽羧基末端的99個氨基酸，例如，SEQ ID NO.10中的42-140位氨基酸(也如SEQ ID No.20所示)。
            
很顯然本申請中公開的神經胚素截短形式(例如，從99AA到112AA的形式)具有神經營養活性。
            
在最優選的實施方案中，所述截短的神經胚素多肽是成熟113AA神經胚素多肽的99aa，100aa，101aa，102aa，103aa，104aa，105aa，106aa，107aa，108aa，109aa，110aa，111aa或112aa羧基末端氨基酸(即，分別相應命名為NBN99，NBN100，NBN101，NBN102，NBN103，NBN104，NBN105，NBN106，NBN107，NBN108，NBN109，NBN110，NBN111或NBN112)。所述序列還可以發現于小鼠和大鼠神經胚素多肽中，分別為SEQ ID No.11和12中羧基末端的99aa，100aa，101aa，102aa，103aa，104aa，105aa，106aa，107aa，108aa，109aa，110aa，111aa or 112aa。這些截短的NBN形式的最優選實例具有生物活性(稱為″生物活性的截短神經胚素多肽″)，因為已經證實其具有神經營養活性。如上所述，NBN二聚化是生物活性所必需的，這是因為對于NBN單體多肽，幾乎甚至根本沒有觀察到活性。
            
小鼠和大鼠神經胚素的截短形式也在本發明范圍之內。這些截短形式可以由SEQ ID No 16(小鼠)C-末端的99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，或116個氨基酸組成，或者它們可以由SEQ ID No 18(大鼠)C-末端的99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111或112個氨基酸組成。
            
因此，本發明包括選自成熟的NBN、N-末端截短的NBN、突變的NBN或者突變且N-截短的NBN的神經胚素多肽，所述成熟NBN選自具有SEQID No 10的1-140位氨基酸或SEQ ID No 11或12的1-144位氨基酸，SEQID NO 13、14、15、16、17或18所示序列的神經胚素組成的組，例如，選自具有SEQ ID NO 13、14、15、16、17或18所示序列的神經胚素的成熟NBN，更具體而言為選自具有SEQ ID NO 10的106、104，102或99個C-末端氨基酸的N-末端截短神經胚素的神經胚素多肽或者選自人神經胚素的116個C-末端氨基酸、人神經胚素的113個C-末端氨基酸、人神經胚素的104個C-末端氨基酸和人神經胚素的116個C-末端氨基酸組成的組的神經胚素多肽，具有SEQ ID NO 19所示氨基酸序列的神經胚素多肽，或者含有SEQ ID NO 20所示99個氨基酸的神經胚素多肽。
            
可用于本發明的NBN還包括那些具有與上述各種前原-、前-、成熟的和截短的″神經胚素″多肽基本上類似或相同的氨基酸序列的NBN多肽。優選地，使用的神經胚素多肽與SEQ ID NO.10-23所示神經胚素多肽的成熟肽具有至少70％，更優選85％，甚至更優選90％，或者甚至進一步優選95％的同一性或相似性。最優選，使用的神經胚素多肽與SEQ ID NO.10-23所示神經胚素多肽的成熟肽之間具有至少99％相似性或同一性。
            
候選多肽與本發明神經胚素多肽之間的同源性程度可以確定為這兩氨基酸序列之間的相似性或同一性程度。
            
高水平的序列同一性表明第一序列可能源自于第二序列。氨基酸序列同一要求兩個被比對的序列之間具有相同的氨基酸序列。因此，與參考序列之間具有70％氨基酸同一性的候選序列要求，在比對后該候選序列中70％的氨基酸等同于該參考序列中的相應氨基酸。同一性可以用電腦分析測定，例如，但不限于，ClustalX電腦比對程序(Thompson JD，Gibson TJ，Plewniak F，Jeanmougin F，& Higgins DG″The ClustalX windows interfaceflexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysistools″；Nucleic Acids Res.1997，25(24)4876-82)，和本申請中推薦的缺省參數(default parameters)。使用該程序，本發明的類似DNA序列編碼的多肽的成熟部分顯示與本申請中SEQ ID NO10(人NBN)、SEQ ID NOS11和12(嚙齒動物NBN)所示氨基酸序列之間具有至少70％，更優選85％，更優選90％，或者更優選95％，最優選至少99％的同一性程度。
            
其他的比對工具也已知，例如Needleman et al.，J.Mol.Biol.48443(1970)中描述的動態編程算法(dynamic programming algorithm)，和DNAstar，Inc.制作的商品化的軟件包Align Program，其中的教導在本申請中引入作為參考。候選序列和參考序列之間的比對一旦進行并改進，就可以計算出同源性百分比的得分。每一序列的各個氨基酸根據它們彼此間的相似性依次進行比較。
            
相似性因子包括相似的大小、形狀及電荷。一種特別優選的測定氨基酸相似性的方法是PAM250矩陣法，描述見Dayhoff et al.，Atlas of proteinsequence and structure 345-352(1978 &上述)，在此引入作為參考。首先，計算相似性得分，其為比對的成對氨基酸相似性得分的和。為了同源性和同一性百分比的目的，可以把插入及缺失忽略不計。因此，缺口罰分(gap penalties)不能用于這種計算。
            
然后，用原始得分除以候選化合物和神經胚素多肽的7個半胱氨酸骨架的得分的幾何平均數，使原始得分標準化。該幾何平均數是這些得分的乘積的平方根。標準化的原始得分即為同源性百分比。
            
如上所述，本發明所述神經胚素多肽包括變體多肽。在本申請中，術語″變體多肽″包括具有下述氨基酸序列的多肽(或者蛋白質)其在一個或多個氨基酸位置上不同于部分SEQ ID NO.10，13，14，19，20，21，22或23(人NBN)，或者SEQ ID No.11，12，15-18(嚙齒類NBN)中所示的成熟肽。所述變體多肽包括上述的經修飾的多肽，以及保守取代、拼接變體、同種型、來自其他物種的同系物，和多態性。
            
如本申請中定義的那樣，術語″保守取代″表示一個氨基酸殘基被另一個生物學上類似的殘基所取代。通常，生物學相似性，如上所述，反映了具有保守氨基酸的野生型序列上的取代。
            
對神經胚素多肽序列中的氨基酸的取代可以選自該氨基酸所屬類別的其他成員(參見表1)。另外，各種氨基酸通常可以被中性氨基酸取代，所述中性氨基酸例如，丙氨酸，亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，和甲硫氨酸。(參見，例如，MacLennan et al.，1998，ActaPhysiol.Scand.Suppl.，64355-67；Sasaki et al.，1998，Adv.Biophys.，351-24)。多重取代也在本發明的范圍之內；但是，本發明的神經胚素多肽都必須具有如下文C部分所述的天然神經胚素的至少一種活性，參見下表 
            
例如，本領域技術人員期望保守的氨基酸取代對生物活性幾乎或根本沒有任何影響，特別是當保守性取代少于多肽或蛋白質殘基總數的10％時。優選地，保守的氨基酸取代是少于多肽或蛋白質5％，最優選少于多肽或蛋白質的2％中發生變化。
            
一個實施方案中，所述神經胚素多肽含有至多15個氨基酸的取代，例如至多12個氨基酸的取代，例如至多10個氨基酸的取代，例如至多8個氨基酸的取代，例如至多5個氨基酸的取代。例如當用例如人113NBN計算時，最優選的保守取代表示在野生型成熟氨基酸序列中少于3個氨基酸的取代。一個特別優選的實施方案中，成熟序列中只有單個氨基酸取代，其中被取代的和取代氨基酸都是非-環狀的。具體而言，保守取代的其他實例包括一個疏水殘基對另一個疏水殘基的取代，例如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸，或者一個極性殘基對另一個極性殘基的取代，例如精氨酸取代賴氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸，或者谷氨酰胺取代天冬酰胺，等。
            
術語保守取代還包括用取代的氨基酸殘基代替未-取代的親代氨基酸殘基，只要用取代的多肽激發的抗體與未-取代的多肽之間也發生免疫反應即可。
            
對該初始氨基酸序列的修飾可得到這樣的蛋白質，其具有與未經修飾的相多肽基本等同的活性，因而可以認為其為親代蛋白質的功能性類似物。所述修飾可以是有意實現的，例如，通過定點誘變，或者它們可以是天然生成的，包括拼接變體、同種型、其他物種的同系物，和多態性。所述功能性類似物也在本發明范圍之內。
            
來自人、小鼠和大鼠的99個C-末端氨基酸的比對顯示如下
            
CLUSTAL W(1.82)多序列比對％ ％小鼠GCRLRSQLVPVSALGLGHSSDELIRFRFCSGSCRRARSQHDLSLASLLGAGALRSPPGSR大鼠GCRLRSQLVPVSALGLGHSSDELIRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLDAGALRSPPGSR人GCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSR*********************:************************.*****.*****％小鼠PISQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDHLSATACGCLG大鼠 PISQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDHLSATACGCLG人  PVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG*:**************************:**********取代優選在標記為“無星號”、“.”或者“”的非-保守位置進行。
            
其他優選的取代位置用“％”標示。
            
此外，初始氨基酸序列的修飾還可得到這樣的蛋白質，其不再保留親代蛋白質的生物活性，包括占主導地位的陰性形式等。占主導地位的陰性蛋白質可以通過下述方式干擾野生型蛋白質結合或者鰲合通常與該多肽在功能上相互作用的調節劑，諸如上游或下游組分。這類占主導地位的陰性形式也在本發明的范圍之內。
            
截短的神經胚素的生物學活性形式公開于WO02/072826(NsGene和Biogen)。截短的及突變的神經胚素分子還可見于WO02/060929(Biogen)，特別是其中含有源自SEQ ID No14中8-113位氨基酸的氨基酸序列的突變的神經胚素，其中所述的變體神經胚素多肽包含一個或多個選自下組的氨基酸取代位于該變體多肽氨基酸序列中第14位的除精氨酸以外的氨基酸，位于該變體多肽氨基酸序列中第39位的除精氨酸以外的氨基酸，位于該變體多肽氨基酸序列中第68位的除精氨酸以外的氨基酸，和位于該變體多肽氨基酸序列中第95位的除天冬酰胺以外的氨基酸，例如為賴氨酸殘基，其中所述的氨基酸位置根據SEQ ID NO10多肽序列進行編號。所述突變形式可以是如上所述的截短的形式，或者包含全長的成熟蛋白質(SEQID NO 14中1-113位氨基酸)。優選地，第14、39或68位的氨基酸為賴氨酸。
            
信號肽的切割在確定將被摻入表達構建體的特定神經胚素形式之前，可以使用現有技術中的預測工具驗證切割信號肽諸如Igsp的可能性。一種優選的這類預測工具是SignalP軟件，該軟件可獲自SignalP WWW服務站點(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/)，或者優選從相同服務站點獲得的新的3.0版本(http//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/).
            
SignalP WWW server為你的序列的每一個位置反饋3個得分C-得分(未加工的切割位點得分)受訓以識別切割位點相對于其他序列位置網絡(networks trained)的輸出得分。其經訓練為
            
高  在+1位(即緊接于切割位點之后)低  在所有其他位置。
            
S-得分(信號肽得分)受訓以識別切割位點相對于其他序列位置網絡(networks trained)的輸出得分。其經訓練為高  切割位點之前的所有位置在切割位點后第30位和非-分泌的低蛋白質的N-末端中。
            
Y-得分(聯合的切割位點得分)切割位點定位的預測可以通過下述方式進行優化觀察在何處C-得分高且S-得分從高到低值變化。通過將C-得分與S-得分的斜率合并，用Y-得分將其格式化。
            
具體而言，Y-得分是C-得分和S-得分的平穩導數(smoothed derivative)的幾何平均數(即，當前位置之前的d位和之后的d位上的S-得分平均值之間的差，其中d隨所選擇網絡整體不同而不同)。
            
所有這3個得分都是用不同部分數據訓練的5個網絡的平均值。
            
對每一序列而言，SignalP報告最大的C-得分、S-得分和Y-得分，以及N-末端與預定切割位點的平均S-得分。這些數值可用于區分信號肽和非-信號肽。如果你的序列預先確定具有信號肽，那么所述切割位點可以推測為最大Y-得分位置的前一位。
            
對于常見的信號肽而言，所述C-和Y-得分在+1位最高，盡管S-得分在切割位點之前較高而在切割位點之后較低。
            
為了進行比較，可以將推測結果與野生型神經胚素信號肽預定切割位置(在前-原-NBN的39位和40位氨基酸之間切割)進行比較。
            
優選地，在SignalP-NN或SignalP-HMM程序中，所述神經胚素在信號肽和神經胚素之間都具有預定切割位點。這樣的神經胚素包括但不限于NBN113，NBN106，NBN104，NBN102和NBN99。特別優選這樣的神經胚素，其在SignalP-NN和SignalP-HMM在這兩個程序中，該位置上都有推定的信號肽。這樣的神經胚素包括NBN113和NBN99。
            
新的版本(3.0)還包含新的用于描述“signal peptidedness”的得分D或Dmax(區別得分(signal peptidedness))，″signal peptidedness″與使用所述信號肽時所查詢蛋白質的分泌水平相關。
            
利用所選神經胚素多肽，本發明使用的信號肽優選顯示至少0.5的Dmax值，例如至少0.6，例如至少0.7，例如至少0.8。
            
參考文獻Henrik Nielsen，Jacob Engelbrecht，Sren Brunak and Gunnarvon HeijneIdentification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides andprediction of their cleavage sites.Protein Engineering，10，1-6(1997)。關于SignalP-HMM輸出模型Henrik Nielsen and Anders KroghPrediction ofsignal peptides and signal anchors by a hidden Markov model.In Proceedings ofthe Sixth International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology(ISMB 6)，AAAI Press，Menlo Park，California，pp.122-130(1998)。改進的信號肽預測-SignalP 3.0.Jannick Dyrlv Bendtsen，Henrik Nielsen，Gunnar vonHeijne and Sren Brunak.JMB(2004)。Prediction of signal peptides and signalanchors by a hidden Markov model.Henrik Nielsen and Anders Krogh.Proceedings of the Sixth International Conference on Intelligent Systems forMolecular Biology(ISMB 6)，AAAI Press，Menlo Park，California，pp.122-130，1998.
            
醫學用途和治療方法在一個方面，本發明涉及本發明所述載體用于制備用于治療神經系統疾病的藥物的用途。所述神經系統疾病可以是一種周圍神經系或中樞神經系統的疾病。
            
神經胚素可用于治療神經元缺陷，包括但不限于病變神經元和受損傷的神經元。受到創傷的外周神經包括，但不限于，延髓(medulla)或脊髓(spinal cord)的神經。神經胚素可用于治療CNS疾病，例如神經變性疾病，例如，大腦缺血性神經損傷(cerebral ischaemic neuronal damage)；神經病，例如周圍神經病變，阿耳茨海默病，亨延頓舞蹈病，肌萎縮性側索硬化癥(ALS)。神經胚素進一步還可用于治療記憶減弱，例如與癡呆有關的記憶減弱。
            
神經胚素還可作為治療外周神經疾病的治療候選物，例如哺乳動物的神經病性疼痛(神經病性疼痛)。所述神經病性疼痛可能與下列狀況相關毒素-誘導的神經損傷，病原體-誘導的神經損傷，創傷-誘導的神經損傷，藥物-誘導的神經損傷，特發神經病，糖尿病性神經病，炎癥-誘導的神經損傷，或神經變性(neurodegeneration)。神經胚素還可以用于治療哺乳動物中的外周神經病。所述外周神經病包括創傷-誘導的神經損傷，病毒-誘導的神經損傷，化療-誘導的神經損傷，毒素-誘導的神經損傷藥物-誘導的神經損傷，維生素缺乏-誘導的神經損傷；特發神經病；和糖尿病性神經病。使用神經胚素治療神經病性疼痛的方法和組合物公開于WO 02/078730(Biogen)。
            
優選地，神經胚素用于治療選自下組的疾病外周神經病包括神經病性疼痛，脊髓損傷，脊神經根性撕脫傷(spinal root avulsion)，三叉神經痛(ticdoloreaux)，灼痛(causalgia)，角膜損傷和視網膜病變。
            
根據本發明的一個優選實施方案，所治療的神經變性疾病是帕金森氏病。現已知神經胚素可提高多巴胺能神經元的存活(WO 00/01815 NsGene；Baloh et al 1998 Neuron 211291-1302).
            
本發明所述的載體、膠囊和組合物還可以用于治療眼部疾病，例如色素性視網膜炎、黃斑病變，青光眼，和糖尿病性視網膜病變。神經胚素還可用于治療角膜創口和潰瘍(EP 1223 966 Biopharm).
            
可以通過下述方式治療神經系統疾病向需要其的個體施用治療有效量的本發明所述載體或者治療有效量的本發明所述藥物組合物。
            
另外，本發明還為將要裸露或包封的移植細胞轉導至或移植入其中的腦部分提供了立體定位坐標(表II)
            
表II 
            
在上表中所述中央-外側維數相對于腦的中線；前-后維數相對于前連合和后連合之間的中點，負數代表向后方向；背-腹維數相對于前聯合與后聯合中點之間的連線，負數為這條連線的腹側；所有尺寸都以厘米表示；Gpe是指蒼白球的外節段；Gpi代表蒼白球的內節段；Snr代表黑質網狀部；STN代表底丘腦核；NBM代表邁耐特(meynert)基底核；以及尾代表尾狀核。
            
神經系統疾病可以通過將以下物質移植到需要的個體而不是體內轉導來治療i.治療有效量的本發明所述經轉導或轉染的細胞；或ii.其中含有經轉導或轉染的細胞的可植入裝置。
            
優選地所述移植包括細胞或可植入裝置。
            
所述移植可以包括自體移植、同種異體移植或異種移植。
            
治療中樞神經系統中神經變性疾病的靶組織重要的參數是選擇合適的靶組織。根據其對神經營養性因子的反應來選擇腦部區域。可以通過遞送單位劑量的本申請所述基因治療載體或者通過植入本發明所述的裸露或包封的細胞，實現區域的靶向。
            
在人類當中，能夠保持對神經營養性因子的應答性直到成年的CNS神經元包括膽堿能基底前腦神經元，內嗅皮質神經元(the entorhinal corticalneurons)，丘腦神經，藍斑核神經元，脊髓感覺神經元和脊髓運動神經元。
            
可以對患者進行初步初始掃描，例如MRI掃描，測定治療位點的準確位置。例如，在帕金森氏病治療中，基底神經節，包括黑質，是治療位點。腦部受影響區的大小使得選擇5個或更少的遞送位點就足以恢復臨床上顯著數目的多巴胺能神經元。相同數目的遞送位點可用于腦外部。
            
對于體內基因治療而言，遞送可以是全身的或局部的。對于全身遞送，通過肌內、皮下或腹腔內施用基因治療載體，從而使得神經胚素能夠連續釋放至循環系統。
            
對于體內基因治療而言，特異性的體內基因遞送位點被選擇為適當能夠在神經元或終端損失區域聚集。這類區域可以使用大量臨床巳知技術確定，包括磁共振成象(MRI)和活組織檢查。對于人而言，優選非侵入性的體內成象方法，例如MRI。一旦確定神經元終端損失的區域，選擇立體分布的遞送位點，使得每一單位劑量的神經胚素都被遞送入腦或脊髓中的其靶細胞處或距靶細胞500μm或500μm以內，且與另一遞送位點的距離不超過10mm。對于腦內，基因治療載體可以施用至腦實質和腦室。
            
在眼內，基因治療載體可以施用至玻璃體，視網膜下隙和支持包囊(sub-tenar capsule)。
            
對于周圍神經病包括神經病性疼痛的治療而言，所述基因治療載體可以施用至參與痛覺傳輸的身體區域。該區域可以包括脊髓和經鞘內施用。
            
一個實施方案中，所述載體通過肌內、皮下、或腹腔內注射施用。另一個實施方案中，將所述載體或組合物施用至參與痛覺傳輸的身體區域。第三個實施方案中，將所述載體或組合物鞘內施用或者施用至脊髓。第四種實施方案，所述載體施用至腦，包括實質和腦室。第五種實施方案，所述載體施用入眼，包括玻璃體，視網膜下隙，和支持包囊。
            
體內基因治療用的劑量要求和遞送方式另外一個重要的參數是被遞送入靶組織的神經胚素的劑量。在這點上，″單位劑量″通常是指每毫升神經胚素組合物中的神經胚素濃度。對于病毒載體而言，神經胚素濃度定義為每毫升神經營養組合物中的病毒顆粒數目。最佳地，對于使用病毒表達載體遞送神經胚素而言，每單位劑量的神經胚素包含2.5-25μl的神經胚素組合物，其中所述的組合物含有置于藥物學可接受液體中的病毒表達載體，每毫升神經胚素組合物可提供1010-1015個含神經胚素的病毒顆粒。這樣高的滴度尤其可使用腺伴隨病毒。對慢病毒而言，所述滴度通常較低，例如108-1010轉導單位每毫升(TU/ml)，見實施例2所述測定。
            
所述神經胚素組合物通過下列方式遞送至靶組織中每一遞送細胞位點微注射、輸注、劃痕加載(scrape loading)、電穿孔或適合通過外科切口將所述組合物直接遞送入遞送位點組織的其他方式。所述遞送要慢慢地完成，例如在約5-10分鐘的時段內(取決于被遞送神經胚素組合物的總體積)。
            
本領域技術人員應該清楚本發明使用的直接遞送方法消除了與體內基因治療有關的限制性危險因素；即，攜帶編碼神經胚素的轉基因的載體轉導非-靶細胞的可能性。本發明中，遞送是直接進行的，遞送位點是經過選擇的，使得分泌的神經胚素的擴散只發生于對照的和預定的腦部區域以使得與靶神經元的接觸最優化，同時最小化與非-靶細胞的接觸。
            
基因治療載體廣義地說，基因治療就是設法將新的遺傳物質傳遞至患者的細胞從而獲得對該患者有益的治療效果。這種有益效果包括治療或預防多種疾病、疾病及其他狀況。
            
體外基因療法包括對分離的細胞進行修飾，然后將其注入、嫁接(graft)或移植入患者體內。參見，例如，美國專利Nos.4,868,116，5,399,346和5,460,959。體內基因療法意圖在體內直接靶向宿主患者的靶組織。
            
可用作基因轉移載體的病毒包括乳多空病毒(papovavirus)、腺病毒、痘苗病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒和反轉錄病毒。合適的反轉錄病毒包括HIV、SIV、FIV、EIAV、MoMLV組成的組。
            
用于治療神經系統疾病的病毒優選為慢病毒和腺伴隨病毒。這兩種類型的病毒都能整合入基因組而無細胞分裂的，而且在臨床前動物試驗中已經檢測了這兩種類型病毒引起的神經系統癥狀，特別是中樞神經系統癥狀。
            
現有技術中已經公開了制備AAV的方法，例如，US 5,677,158.US6,309,634和US 6,683,058公開了將AAV遞送至中樞神經系統的實例。
            
特定及優選的反轉錄病毒類型包括能夠轉導細胞并且在不導致細胞分裂情況下整合入其基因組的慢病毒。因此，優選地所述載體是復制-缺陷慢病毒顆粒。所述慢病毒顆粒可以由含下列元件的慢病毒載體制備5’慢病毒LTR、tRNA結合位點、包裝信號、可操作地連接于編碼融合蛋白多核苷酸信號的啟動子、第二鏈DNA合成起點和3’慢病毒LTR。在體內制備慢病毒及施用至神經細胞的方法公開于US20020037281(使用慢病毒載體轉導神經細胞的方法)。
            
反轉錄病毒載體是人臨床試驗最常用的載體，因為它們可攜帶7-8kb，大于許多其他病毒載體，而且因為它們能夠侵染細胞，并能將其遺傳物質高效穩定地整合入宿主細胞。參見，例如，，WO 95/30761；WO 95/24929。致腫瘤病毒亞科病毒(oncovirinae)需要至少一個靶細胞增殖循環，才能將外源核酸序列傳遞并整合入患者。反轉錄病毒載體隨機整合入患者基因組。
            
現已經公開了兩種類型的反轉錄病毒顆粒能有效侵染小鼠細胞的親嗜性(ecotropic)反轉錄病毒和能有效侵染多種細胞的兼嗜性(amphotrophic)反轉錄病毒。第三類包括能侵染除產生該病毒的物種之外的另一物種的異嗜性反轉錄病毒。它們只能整合入正在分裂細胞的基因組，它們的這種能力使得反轉錄病毒對于標記發育試驗用的標記細胞系以及遞送治療或自殺基因至癌或腫瘤而言很有吸引力。這些載體特別適合用于中樞神經系統，因為成年患者的中樞神經系統相對缺少細胞分裂。
            
對于人類患者中的應用而言，所述反轉錄病毒載體必須是復制缺陷性的。這就阻止了侵染性反轉錄病毒顆粒在靶組織中的繼續生成，相反所述復制缺陷性載體成為可穩定地摻入靶細胞基因組的“俘獲”轉基因。通常，在復制缺陷性載體中，gag、env和pol基因已經被缺失(隨病毒基因組其余的大部分一起)。異源DNA插入取代缺失病毒基因。可以將所述異源基因置于內源的異源啟動子(另一種異源啟動子在靶細胞中有活性)調控之下，或者反轉錄病毒5′LTR(所述病毒LTR在各種組織中都是有活性的)的控制下。通常，反轉錄病毒載體的轉基因容量約7-8kb。
            
復制缺陷型反轉錄病毒載體需要提供從例如改造的包裝細胞系反式復制及組裝所需的病毒蛋白質。重要的是所述包裝細胞不釋放有復制能力的病毒和/或輔助病毒。這一點通過下述操作已經實現由缺乏ψ信號的RNAs表達病毒蛋白，并且從單獨的轉錄單元表達gag/pol基因和env基因。此外，在一些包裝細胞系中，5’LTR已經被調控這些基因表達的非-病毒啟動子所取代并且添加了聚腺苷酸化信號。這些設計將最小化可復制型載體或輔助病毒產生的重組的可能性。參見，例如，美國專利No.4,861,719在此引入作為參考。
            
另外，本發明還涉及一種核酸構建體，其中含有編碼神經胚素多肽的核酸序列和信號序列。所述信號肽和神經胚素多肽如上所述。因此，一些實施方案中，所述核酸構建體編碼由前-原-神經胚素多肽C末端113個密碼子組成的序列。一些實施方案中，所述核酸編碼由前-原-神經胚素多肽C末端104個密碼子組成的序列。
            
所述核酸序列可以包含異源的信號肽，例如白蛋白信號序列，例如，大鼠白蛋白信號序列，并且含有SEQ ID NO65所示核酸序列。一些實施方案中，所述核酸構建體編碼經修飾的白蛋白信號序列，例如，大鼠白蛋白信號序列。一個示范性的實施方案是其中含有SEQ ID NO69的核酸構建體。其他實施方案中，所述核酸構建體編碼人生長激素信號序列。一個示范性的實施方案是其中含有SEQ ID NO67的核酸構建體。所述人生長激素信號序列可以包含內含子。
            
在本發明的一個具體的實施方案中，所述核酸構建體含有為了在轉染的宿主細胞中表達而經過優化的核酸序列。通過提供增加的多肽產量或提高的轉錄或轉染效率，密碼子使用的優化可為有益的。本發明經優化核酸構建體的示范性的實施方案如SEQ ID NO59所示。
            
由于巳知的遺傳密碼子簡并性，編碼同一種氨基酸的密碼子不止一種，因此DNA序列可以不同于SEQ ID NOS65、67或69所示序列，且分別仍編碼SEQ ID NOS66、68或70所示的相應氨基酸序列。這類DNA序列變體可以源自沉默突變(例如發生于PCR擴增過程中)，或者可以是天然序列故意誘變(deliberate mutagenesis)例如密碼子優化的產物。
            
所述核酸構建體可以是載體。合適的質粒載體的實例包括但不限于pFRT/lac Zeo，pFRT/dhfr-1，(Invitrogen，Carlsbad，CA)pUC，pGEM和pGEX(Pharmacia，Peapack，NJ)。其他合適的載體包括發揮同樣功能的病毒載體(例如復制缺陷型反轉錄病毒、腺病毒以及腺伴隨病毒)。
            
表達載體表達載體可以包括可操作地連接于要表達的核酸序列的一個或多個調控序列。調控序列的實例包括啟動子、增強子和聚腺苷酸化信號。所述調控序列的描述見，例如，Goeddel，1990 Methods Enzymol.，1853。調控序列包括在多種類型宿主細胞中指導核苷酸序列組成型表達的序列，以及僅在特定宿主細胞中指導核苷酸序列表達的序列(例如，組織-特異性調控序列)。本領域技術人員應該理解的是表達載體的設計取決于所轉化宿主細胞的選擇，目的蛋白表達水平等因素。可以將本發明所述表達載體導入宿主細胞從而制備蛋白質或肽。
            
用于重組表達本發明所用的神經胚素的載體的構建可以使用對于本領域普通技術人員來說無需詳細說明的常規技術完成。但是，如需查看綜述，本領域普通技術人員可以參閱Maniatis et al.，in Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory(NY 1982)。
            
簡而言之，重組表達載體的構建使用常規的連接技術。為了測試驗證構建載體中的序列正確，可以使用連接混合物來轉染/轉導宿主細胞，然后通過合適的抗生素抗性篩選出成功地經基因改變的細胞。
            
從轉染/轉導后的細胞制備載體，通過限制性酶切分析，和/或通過例如，Messing，et al.(Nucleic Acids Res.，9309-，1981)中描述的方法，Maxam，et al.(Methods in Enzymology，65499，1980)中描述的方法，Sanger雙脫氧法，或者本領域技術人員已知的其他合適方法進行測序。
            
使用常規的凝膠電泳方法實現切割片段的大小分離的描述參見，例如，Maniatis，et al.(Molecular Cloning，pp.133-134，1982).
            
本發明使用的表達元件在強度和特異性上各不相同。可以根據使用的宿主/載體系統，將任何多種合適的轉錄及翻譯元件，包括組成型和可誘導型啟動子，用于表達載體。當在哺乳動物細胞系統中克隆時，可以使用源自哺乳動物細胞基因組(例如金屬硫蛋白啟動子)或者哺乳動物病毒(例如CMV啟動子、腺病毒晚期啟動子、痘苗病毒7.5K啟動子)的啟動子；當制備含多拷貝表達產物的細胞系時，可以使用帶有合適可篩選標記物的基于SV40-、BPV-及EBV-的載體。
            
在轉錄、翻譯或者翻譯后水平上控制基因的表達。轉錄啟動是基因表達的早期且關鍵的事件。這取決于啟動子及增強子序列，并受與這些序列相互作用的特異性細胞因子的影響。許多原核基因的轉錄單元由啟動子以及在一些情況下還有增強子或調控元件組成(Banerji et al.，Cell 27299(1981)；Corden et al.，Science 2091406(1980)；and Breathnach and Chambon，Ann.Rev.Biochem.50349(1981))。對于反轉錄病毒而言，參與反轉錄病毒基因組復制的調控元件位于長末端重復序列(LTR)中(Weiss et al.，eds.，The molecular biology of tumor virusesRNA tumor viruses，Cold SpringHarbor Laboratory，(NY 1982))。莫洛尼(Moloney)鼠白血病毒(MLV)及Rous肉瘤病毒(RSV)LTRs包含啟動子及增強子序列(Jolly et al.，NucleicAcids Res.111855(1983)；Capecchi et al.，InEnhancer and eukaryotic geneexpression，Gulzman and Shenk，eds.，pp.101-102，Cold Spring HarborLaboratories(NY 1991)。其他的強效啟動子包括源自巨細胞病毒(CMV)及其他野生型病毒啟動子的啟動子。
            
另外現在還已公開了許多非-病毒啟動子的啟動子及增強子區域(Schmidt et al.，Nature 314285(1985)；Rossi and deCrombrugghe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 845590-5594(1987)).維持并提高休眠細胞(quiescent cells)中轉基因表達的方法包括使用啟動子，包括I型膠原蛋白(1和2)(Prockopand Kivirikko，N.Eng.J.Med.311376(1984)；Smith and Niles，Biochem.191820(1980)；de Wet et al.，J.Biol.Chem.，25814385(1983))、SV40和LTR啟動子。
            
哺乳動物宿主細胞中，可以使用基于多種病毒的表達系統。當使用腺病毒作為表達載體時，可以將編碼序列連接至腺病毒轉錄/翻譯調控復合體，例如，晚期啟動子和三分(tripartite)前導序列。然后，通過體外或體內重組將該嵌合基因插入腺病毒基因組。插入病毒基因組非必需區(例如E1或E3區)可以得到可存活的并能在感染的宿主中表達肽的重組病毒(參見，例如，Logan & Shenk，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，813655)。可替代地，可以使用痘苗病毒7.5K啟動子(參見，例如，Mackett et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，797415；Mackett et al.，1984，J.Virol.，49857；Panicali et al.，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，794927)。
            
根據本發明的一個實施方案，所述啟動子是選自下組的組成型啟動子泛醌(ubiquitin)啟動子，CMV啟動子，JeT啟動子，SV40啟動子，以及延伸因子1α啟動子(EF1-α)。
            
可誘導/可抑制型啟動子的實例包括Tet-On、Tet-Off、雷帕霉素-可誘導的啟動子、Mx1。
            
除使用病毒和非-病毒啟動子驅動轉基因表達之外，還可以使用增強子序列提高轉基因表達水平。增強子不僅能提高其天然基因的轉錄活性而且還能提高一些外源基因的轉錄活性(Armelor，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 702702(1973))。例如，本發明中使用帶有膠原蛋白啟動子2(I)的膠原蛋白增強子序列提高轉基因的表達。此外，還可以使用SV40病毒中的增強子元件來提高轉基因表達。這種增強子序列由72個堿基對的重復序列組成，描述見Gruss et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78943(1981)；Benoist andChambon，Nature 290304(1981)，and Fromm and Berg，J.Mol.Appl.Genetics，1457(1982)，所有這些文獻在此引入作為參考。當其存在于帶有不同啟動子的種系中時，該重復序列能提高許多不同的病毒基因和細胞基因的轉錄(Moreau et al.，Nucleic Acids Res.96047(1981)。
            
為了增加轉基因表達使其長期穩定表達，還可以使用調控啟動子活性的細胞因子。已經報道了幾種細胞因子，其可調節膠原蛋白2(I)和LTR啟動子的轉基因的表達(Chua et al.，connective Tissue Res.，25161-170(1990)；Elias et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.，580233-244(1990))；Seliger et al.，J.Immunol.1412138-2144(1988)and Seliger et al.，J.Virology 62619-621(1988))。例如轉化生長因子(TOF)，白細胞介素(IL)-1，和干擾素(INF)下調由各種啟動子例如LTR驅動的轉基因的表達。腫瘤壞死因子(TNF)和TGF1上調，可用于調控由啟動子驅動的轉基因表達。證明有用的其他細胞因子包括堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和表皮生長因子(EGF)。
            
帶有膠原蛋白增強子序列(Coll(E))的膠原蛋白啟動子還可用于提高轉基因表達，其通過抑制對載體的進一步的任何免疫應答，其中所述載體可在經處理的腦中產生，而無論其免疫保護的狀態。此外，還可以在遞送載體組合物后立即向經處理的宿主施用抗炎藥，包括類固醇，例如地塞米松，優選直至任一細胞因子-介導的炎性反應都平息。另外還可以施用免疫抑制藥劑如環孢菌素來減少干擾素的產量，這可以下調LTR啟動子和Coll(E)啟動子-增強子并減少轉基因表達。
            
所述載體可以包含其他序列例如編碼Cre-重組酶蛋白質的序列和LoxP序列。確保神經胚素暫時表達的另一種方式是使用Cre-LoxP系統，當施用Cre重組酶至細胞時(Daewoong et al，Nature Biotechnology 19929-933)或者通過將編碼重組酶的基因摻入病毒構建體時(Plück，Int J Exp Path，77269-278)，該系統將插入的DNA序列中的一部分切除。將重組酶的基因與LoxP位點和結構基因(本發明中為神經胚素)一起摻入病毒構建體常常使得結構基因的表達持續大約5天的時間。
            
本發明的方法中使用的載體還可以包括編碼可用于鑒定成功轉化的宿主細胞的可篩選標記物的核酸序列。哺乳動物細胞培養中使用的適宜可篩選標記物包括能賦予藥物抗性的基因，所述藥物例如新霉素，潮霉素和氨甲蝶呤。所述可篩選標記物可以是可擴增的可篩選標記物。一種可擴增的可篩選標記物是DHFR基因。另一合適的可擴增標記物是DHFRr cDNA(Simonsen and Levinson，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)802495)。其他可篩選標記物已由Thilly作了綜述(Mammalian Cell Technology，ButterworthPublishers，Stoneham，MA)。任一本領域技術人員都能選擇出合適的可篩選標記物。可以將可篩選標記物在同一載體中作為神經胚素前序列或者作為單獨載體的一部分導入宿主細胞。所述可篩選標記物和所述神經胚素序列可以置于不同的或者相同的啟動子的調控之下，后一種方式產生雙順反子(dicistronic)信息。這種構建體已為本領域所知(參見，例如 美國專利No.4,713,339)。
            
本發明的方法中使用的表達載體還可以編碼有助于重組制備神經胚素多肽純化的標簽。實例包括，但不限于，載體pUR278(Ruther et al.，1983，EMBO J.，21791)，其中可以將本申請所述的神經胚素多肽的編碼序列與lacz編碼區一起連接入載體框架從而制備得到雜合蛋白；此外還可使用pGEX載體表達帶有谷胱甘肽S-轉移酶(GST)標簽的神經胚素多肽。這些蛋白質通常是可溶性的，通過下述操作可以很容易地從細胞純化吸附到谷胱甘肽-瓊脂糖微珠然后在游離谷胱甘肽存在情況下洗脫。為了在純化后能很容易地去除標簽，所述載體包括切割位點(凝血酶或者Xa因子蛋白酶或者PreScission蛋白酶(Pharmacia，Peapack N.J.))。其他融合標簽已為本領域所知，例如，組氨酸標簽，麥芽糖結合蛋白標簽。
            
基因治療用的藥物制劑為了生成本發明使用的神經胚素組合物，可以將編碼神經胚素的表達病毒載體置于藥物學可接受的懸液、溶液或乳液中。合適的介質包括鹽水和脂質體制劑。
            
更具體地說，藥物學可接受的載體可以包括滅菌的含水或非水溶劑、懸浮劑和乳劑。非水溶劑的實例為丙二醇，聚乙二醇，植物油例如橄欖油，和可注射的有機酯例如油酸乙酯。含水載體包括水，醇/水溶液、乳液或懸浮劑，包括鹽水和緩沖介質。腸胃外用藥的載體包括氯化鈉溶液，Ringer′s葡萄糖，葡萄糖和氯化鈉，乳酸化的Ringer′s或固定的(fixed)油類。
            
靜脈內載體包括液體和營養補充物，電解液補充物(例如基于Ringer′s葡萄糖的)等。
            
防腐劑及其他添加物也可以存在，例如，抗微生物劑，抗氧化劑，螯合劑，和惰性氣體等。此外，神經胚素轉基因的組合物可以使用本領域熟知技術凍干，用于根據本發明所述進行隨后的重配和使用。
            
另外還可以使用膠體分散系統進行靶向的基因遞送。
            
膠態分散系統包括大分子復合體，納米微囊劑(nanocapsules)，微球體，珠子，以及基于脂類的系統，包括水包油乳化劑，微胞團(micelles)，混合微胞團，和脂質體。脂質體是用作體內和體外遞送工具的人工膜載體。現已證實直徑大小為0.2-4.0μm的大單層載體(LUV)能夠包封實質百分比(substantial percentage)的含大分子的含水緩沖液。RNA，DNA和完整病毒顆粒可以在含水內部包囊化，以生物學活性形式遞送至細胞(Fraley，et al.，Trends Biochem.Sci.，677，1981)。除哺乳動物細胞之外，脂質體可用于遞送植物、酵母和細菌細胞中的可操作編碼轉基因。為了使脂質體成為一種有效的基因轉移載體，應該具有下列特征(1)將編碼神經胚素的基因高效包封但不破壞其生物活性；(2)與無靶標細胞相比，優先且實質上都結合至靶細胞；(3)將載體的含水內容物高效遞送至靶細胞胞質；以及(4)精確且有效地表達遺傳信息(Mannino，et al.，Biotechniques，6682，1988)。
            
所述脂質體組合物通常是磷脂，特別是high-phase-transitiontemperature磷脂，通常與固醇類物質特別是膽固醇結合。其它磷脂或其他脂類也可使用。脂質體的物理特性取決于pH，離子強度，和二價陽離子的存在。
            
可用于脂質體制備的脂類的實例包括磷脂酰基化合物，例如磷脂酰甘油，磷脂酰膽堿，磷脂酰絲氨酸，磷酯酰乙醇胺，鞘脂類，腦苷脂類，和神經節苷脂。特別有用的為二酰基磷脂酰甘油，其中的脂質部分含有14-18個碳原子，優選為16-18個碳原子，并且是飽和的。舉例性的磷脂包括卵磷脂酰膽堿，二棕櫚酰磷脂酰膽堿以及二硬脂酰磷脂酰膽堿(distearoylphosphatidylcholine)。
            
脂質體的靶向可以根據構造上的和機理上的因素進行分類。構造上的分類以選擇性水平為基礎，例如器官特異性，細胞-特異性，和細胞器-特異性。機理學上的靶向可以根據其是被動的還是主動的進行劃分。被動靶向利用了脂質體向含竇狀毛細血管的器官中的內質網-內皮系統(RES)的細胞分布的自然趨勢。
            
另一方面，主動靶向涉及改變脂質體，其通過將脂質體偶聯至特異性配體例如單克隆抗體、糖、糖脂或蛋白質，或者通過改變脂質體的組成或大小，以實現對天然生成的定位位點之外的器官和細胞類型的靶向。
            
靶基因遞送系統的表面可以通過多種方式進行修飾。就脂質體靶向的遞送系統的情況而言，可以將脂類基團摻入脂質體的脂雙層，以保持靶向配體與脂質體雙層的穩定結合。可以使用各種連接基團將脂質鏈連接到靶向配體。
            
遞送系統的另一個實例包括移將能產生本發明所述載體顆粒的包裝細胞的組合物移植入治療區域。包封以及移植所述細胞的方法已為本領域所知，具體可得自WO 97/44065(細胞治療)。通過篩選能產生慢病毒顆粒的包裝細胞系，從而實現將未-分裂細胞在治療區域中的轉導。通過使用只轉導正在分裂細胞的反轉錄病毒顆粒，從而將轉導限制于在治療區域中從頭分化的細胞。
            
遞送基因治療載體組合物的方法在本發明定義方法之后，可以通過本領域技術人員熟知的方法實現神經胚素組合物的直接遞送，包括通過外科切割的顯微注射(參見，例如，Capecchi，Cell，22479-488(1980)}；電穿孔(參見，例如，Andreason andEvans，Biotechniques，6650-660(1988)}；輸注，與靶向型分子或共-沉淀劑(例如，脂質體，鈣)的化學復合，以及靶向組織的微粒轟擊(Tang，et al.，Nature，356152-154(1992))。
            
細胞的包封細胞包封療法建立在下述概念基礎之上在植入宿主之前用半透性的生物相容性物質包圍細胞，從而將細胞與受體宿主的免疫系統分離開來。本發明包括其中細胞被包封入免疫隔離的膠囊的裝置。″免疫隔離的膠囊″指的是這樣的膠囊，當其植入在受體宿主時，能將宿主免疫系統對所述裝置核心的細胞的有害影響最小化。通過將細胞封裝入由帶微孔薄膜形成的可植入聚合物膠囊實現細胞與宿主的免疫隔離。該方法能阻止宿主與植入組織之間的細胞-細胞接觸，消除直接提呈引起的抗原識別。另外，所述膜還適于根據其分子量控制分子例如抗體和補體的擴散(Lysaght et al.，56J.Cell Biochem.196(1996)，Colton，14 Trends Biotechnol.158(1996))。使用包封技術，可以將細胞移植入宿主而無免疫排斥，而無論是否使用免疫抑制藥物。有用的生物相容性聚合物膠囊通常包括內核和選擇性通透基質或膜形成的外周或周圍區域(″外殼″)，所述內核含有懸浮于液態介質或固定于固態基質中的細胞，所述外周或周圍區域不含有分離的細胞，是生物相容性的且足以保護核內細胞不受有害性的免疫攻擊。包封能阻止免疫系統的元件進入膠囊劑，從而保護包封細胞免受免疫破壞。膠囊膜的半透特性還可以允許目的生物活性分子很容易地從膠囊中擴散入周圍的宿主組織。
            
所述膠囊可以用生物相容性物質制成。″生物相容性物質″是指植入宿主后不會激發足以導致排斥所述膠囊劑或者例如由于降解而使其無法發揮作用的有害的宿主反應。所述生物相容物質相對于大分子諸如宿主免疫系統的組分而言是不透性的，但是相對于大分子諸如胰島素、生長因子和營養物而言是通透性的，同時允許新陳代謝的廢物能夠被除去。很多種生物相容的材料都適合于通過本發明的組合物遞送生長因子。許多生物相容性材料都是已知的，具有不同的外表面形態以及其他機械及結構特性。優選的膠囊劑類似于PCT國際專利申請WO 92/19195或WO 95/05452描述的膠囊劑，其在此引入作為參考；或美國專利Nos.5,639,275；5,653,975；4,892,538；5,156,844；5,283,187；或美國專利No.5,550,050，在此引入作為參考。所述膠囊劑允許代謝產物、營養物和治療物質通過，同時將對宿主免疫系統的不利影響最小化。生物相容性物質的組成包括圍繞周圍的半透膜和細胞內支持支架。優選地，將基因改變的細胞種植在被選擇透性膜包封的支架之上。纖維狀的細胞-支持用支架可以用選自下列的任一種生物相容性材料制成丙烯酸，聚酯，聚乙烯，聚丙烯，聚乙腈，聚乙烯teraphthalate，尼龍，聚酰胺，聚氨基甲酸酯，聚丁酯，絲，棉，幾丁質，碳，或生物相容的金屬。另外，鍵合的纖維結構也可用于細胞植入(美國專利No.5,512,600，在此引入作為參考}。生物可降解聚合物包括由聚(乳酸)PLA，聚(lactic-coglycolic acid)PLGA，和聚(羥基乙酸)PGA及其等效物組成的物質。現已用泡沫體支架提供用于粘附移植細胞的表面(PCT國際專利申請Ser.No.98/05304，在此引入作為參考}。織物網孔管用作血管移植物(PCT國際專利申請WO99/52573，在此引入作為參考)。另外，所述內核可以由水凝膠形成的固定基質組成，用來穩定細胞的位置。水凝膠是一種3維網狀交聯的親水聚合物，形式為基本由水組成的凝膠。
            
各種聚合物和聚合物混合物可用于制備圍繞外周的半透膜，包括聚丙烯酸酯(包括丙烯酸共聚物)，聚乙二烯，聚氯乙烯共聚物，聚氨基甲酸酯，聚苯乙烯，聚酰胺，醋酸纖維素，硝酸纖維素，聚砜(包括聚醚砜)，聚磷腈，聚丙烯腈，聚(丙烯腈/covinyl氯化物)，及其衍生物，共聚物和混合物。優選地，所述外周半透膜是一種生物相容的半透性的空心纖維膜。所述膜及其制備方法公開于美國專利Nos.5,284,761和5,158,881，在此引入作為參考。所述外周半透膜由一種聚醚砜空心纖維制成，例如美國專利No.4,976,859或美國專利No.4,968,733中描述的，在此引入作為參考。一種替代的外周半透膜材料是聚(丙烯腈/covinyl氯化物)。
            
所述膠囊可以是適于維持生物活性并提供遞送產物或功能途徑的任一結構，包括例如，柱狀的，矩形的，圓盤形的，補片-形狀的，卵形的，星形的，或者球狀的。另外，所述膠囊劑還可以盤繞或纏繞入網孔-樣或嵌套狀結構。如果所述膠囊劑在植入后還要回收，那么則不優選該傾向于使得膠囊從植入位點的結構，例如小到足以能在受體宿主血管中移動的球狀膠囊。某些形狀，例如矩形，補片，圓盤，柱體和平板狀片層，能提供更好的結構完整性，優選可以用于需要回收的情況。
            
當使用大膠囊(macrocapsules)時，優選每一粒中包封103-108個細胞，最優選優選105-107個細胞。可以通過植入較少或較多數量的膠囊來控制劑量，優選為每位患者1-10粒膠囊。
            
所述支架可以用細胞外基質(ECM)分子包被。合適的細胞外基質分子的實例包括，例如，膠原蛋白，層粘連蛋白，和粘連蛋白。還可以通過下述操作修飾支架表面用等離子體輻射處理賦予電荷以提高細胞附著力。
            
可以使用任一合適的方法密封膠囊，包括使用聚合物粘合劑或壓接、紐結(knotting)和熱封。此外，也可使用任一合適的″干燥″密封方法，描述參見，例如，美國專利No.5,653,687，在此引入作為參考。
            
所述包封的細胞裝置可以用本領域已知技術植入。許多植入位置都能使用本發明所述的裝置和方法。這些植入位置包括，但不限于，中樞神經系統，包括腦，脊髓(參見，美國專利Nos.5,106,627，5,156,844，和5,554,148，在此引入作為參考)，鞘內植入，以及眼睛的含水及玻璃液(參見，PCT國際專利申請WO97/34586，在此引入作為參考)，視網膜下隙，以及支持包囊。對于腦內而言，所述裝置可以植入實質和腦室。對于全身遞送而言，植入可以采用經肌肉內、皮下、或腹腔內的途徑。
            
ARPE-19細胞系是一種高級的平臺細胞系，可用于基于包封細胞的遞送技術，也可用于基于非包封細胞的遞送技術。所述ARPE-19細胞系是耐受的(hardy)(即，所述細胞系在嚴謹狀況下能夠存活，例如植入中樞神經系統或者眼內環境)。ARPE-19細胞可以進行基因修飾以分泌具有治療功效的物質。ARPE-19細胞具有相對長的壽命周期。ARPE-19細胞是人源性的。另外，包封的ARPE-19細胞在體內裝置中的存活性良好。ARPE-19細胞可以遞送有效量的生長因子。ARPE-19細胞激發的宿主免疫反應極為微弱可以忽略。而且，ARPE-19細胞是非-致瘤性的。
            
用于將膠囊植入CNS的方法和儀器的描述見US5,487,739。
            
在一個方面，本發明涉及一種生物相容的膠囊，其中含有包含著生存的包裝細胞的內核，該細胞能分泌能感染靶細胞的病毒載體，其中所述病毒載體是本發明所述的載體；和包裹在所述內核外周的外殼，所述的外殼包含通透性的生物相容性材料，所述材料為多孔性，選擇為允許100nm直徑的反轉錄病毒載體通過，允許所述病毒載體從膠囊釋放出去。
            
優選地，所述內核另外還含有基質，所述包裝細胞被所述基質固定。根據一個實施方案，所述外殼其中含有水凝膠或熱塑性材料。
            
適合于包裝細胞系的細胞的實例包括HEK293，NIH3T3，PG13，和ARPE-19細胞。優選地，所述細胞包括PG13和3T3細胞。
            
用于包封包裝細胞的方法和裝置公開于US6,027,721，在此引入作為參考。
            
宿主細胞本發明所述核酸構建體可用于制備神經胚素多肽。真核細胞可以用編碼可操作地連接于異源信號序列的重組神經胚素多肽的核酸構建體轉染。制備核酸構建體以及用構建體轉染細胞的方法已為本領域所知。(參見，例如，Ausubel et al.，eds.，1988，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates & Wiley-InterscienceNew York；Sambrook et al.1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，2 ed.，Cold Spring HarborLaboratory PressCold Spring Harbor，NY)。例如，細胞轉染可以使用電穿孔，磷酸鈣沉淀，或病毒載體感染。一些實施方案中，所述轉化宿主細胞是哺乳動物細胞，例如，CHO細胞，COS細胞，HeLa細胞，或NIH 3T3細胞。
            
在能使分泌型神經胚素多肽從所述細胞表達并分泌的表達條件下，將所述轉化宿主細胞培養于合適的生長培養基。一種合適生長培養基含有足以滿足細胞生長所需的營養物。細胞生長需要的營養物包括碳源、氮源、必需氨基酸、維生素、礦物質和生長因子。選擇性地，所述培養基可以含有牛血清或胎牛血清。所述生長培養基可以設計為能夠篩選含有核酸構建體的細胞。例如，這可以通過下述操作實現藥物篩選或者通過核酸構建體上的可篩選標記物或者用核酸構建體共-轉染補充的必需營養物的缺乏。培養的哺乳動物細胞有時培養在商品化的含血清或無血清培養基(例如MEM，DMEM}(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。為特定細胞系選擇適合的培養基要考慮的因素已為本領域所知。
            
因此，在一個方面，本發明涉及經本發明所述載體轉導或轉染的分離的宿主細胞。這些細胞優選是哺乳動物宿主細胞，因為這些細胞能分泌和正確加工所編碼的神經胚素。
            
優選的物種包括嚙齒類動物(小鼠，大鼠)，兔子，狗，貓，豬，猴子，人。
            
由本發明所述載體轉導的良好侯選原代培養物和細胞系的實例包括CHO，HEK293，COS，PC12，HiB5，RN33b，神經元細胞，胚胎細胞，RPE細胞系，ARPE-19，人類永生化的成纖維細胞，C2C12，HeLa，HepG2，紋狀體細胞，神經元，星形細胞，中間神經元。
            
對于包封和裸細胞治療，優選的細胞系類型是視網膜色素上皮細胞(RPE細胞)。RPE的來源是分離自哺乳動物視網膜的原代細胞。收獲RPE細胞的方法已有詳細描述(Li and Turner，1988，Exp.Eye Res.47911-917；Lopezet al.，1989，Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.30586-588)，其被認為是一種常規方法。在RPE細胞共移植的大部分公開報告中，細胞源自于大鼠(Li andTurner，1988；Lopez et al.，1989)。優選地，RPE細胞源自于人。除分離的原代細胞之外，培養的人類RPE細胞系可以用于實施本發明。
            
對于體內轉導而言，優選的宿主細胞包括紋狀體細胞，神經元，星形細胞和中間神經元。對于離體基因治療而言，優選的細胞包括神經元細胞，神經元前體細胞，神經元祖細胞，干細胞和胚胎細胞。干細胞和神經元前體細胞具有下列好處可以整合入所述組織并遷移。對于包封和對于裸細胞的植入而言，優選的細胞包括視網膜色素上皮細胞，包括ARPE-19細胞；人類永生化的成纖維細胞；和人類永生化的星形細胞。特別優選的是ARPE-19。
            
另一個實施方案中，所述治療細胞系選自人類成纖維細胞系，人類星形細胞細胞系，人類中腦細胞系，和人類內皮細胞系，優選用TERT、SV40T或vmyc永生化。
            
用于制備人類星形細胞系的方法此前已有描述(Price TN，Burke JF，Mayne LV.A novel human astrocyte cell line(A735)with astrocyte-specificneurotransmitter function.In Vitro Cell Dev Biol Anim.1999May；35(5)279-88.)。該方法也可用于制備星形細胞系。
            
為了制備其他的人類星形細胞系，優選下列3種該方法的改良方式。
            
可以使用取自5-12周齡胎兒的人類胎兒腦組織，而不是12-16周齡的組織。
            
可以永生化的基因v-myc，或TERT(端粒酶)，而不是SV40T抗原。
            
可以使用反轉錄病毒基因轉移代替用質粒轉染。
            
所述神經胚素多肽還可以表達于轉基因動物，例如嚙齒類動物，母牛，豬，綿羊或山羊中。轉基因動物是已將外源基因合并入其基因組從而使得該外源基因能夠從親代傳遞給后代的非人類動物。外源基因可以導入單細胞的胚胎(Brinster et al，.1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，824438)。制備轉基因動物的方法是本領域已知的(Wagner et al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 786376；McKnight et al.，1983，Cell 34335；Brinster et al.，1983，Nature 306332；Ritchie et al.，1984，Nature 312517；Baldassarre et al.，2003，Theriogenology 59831；Robl et al.，2003，Theriogenology 59107；Malassagneet al.，2003，Xenotransplantation 10(3)267)。
            
體外制備神經胚素一個單獨的方面本發明涉及哺乳動物細胞，例如上文定義的細胞，能夠分泌總量超過500ng/106個細胞/24小時的神經胚素多肽，更優選超過600ng/106個細胞/24小時，更優選超過700ng/106個細胞/24小時，更優選超過800ng/106個細胞/24小時，更優選超過900ng/106個細胞/24小時，例如超過1000ng/106個細胞/24小時。
            
優選地所述分泌的神經胚素是生物學活性的，正如實施例1描述的RetL3 ELISA試驗測定的那樣。這樣就省去了對糖基化，切割和再折疊的需要。
            
優選的宿主細胞選自CHO，HEK293 COS，PC12，HiB5，RN33b，C2C12，HeLa，HepG2，和ARPE-19細胞組成的組。更優選選自CHO，HEK293，COS，和ARPE-19組成的組。
            
通過下述操作能夠制備得到神經胚素或其功能等價物培養這些細胞，然后從所述培養基回收神經胚素，但不必對該蛋白質重折疊或糖基化。
            
此外通過加入增強子元件例如WPRE可以進一步提高表達(US6,136,597)。
            
產神經胚素細胞的支持基質本發明進一步還包括在植入哺乳動物神經系統之前，將產神經胚素細胞在體外培養于支持基質上。在植入之前將細胞預吸附至微載體，這樣的設計能夠提高移植細胞的長期存活能力，并提供長期功能性的效益。
            
為了提高所述移植的細胞，即移植的神經胚素分泌型細胞的長期存活能力，可以將在移植之前，在體外將待移植的細胞結合到支持基質。可以用于制備支持基質的物質包括符合下列要求的物質在體外保溫后細胞可吸附于其上，并能在其上生長，并且該材料能植入哺乳動物體內且不引發毒性反應或者破壞移植細胞或干擾其生物或治療活性的炎性反應。所述材料可以是合成的或天然的化學物質，或者具有生物學起源的物質。所述基質材料包括，但不限于，玻璃及其他氧化硅，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，聚偏二氟乙烯，聚氨基甲酸酯，聚藻酸鹽，聚砜，聚乙烯醇，丙烯腈聚合物，聚丙烯酰胺，聚碳酸酯，polypentent，尼龍，淀粉酶，天然的和經修飾的明膠以及天然的及經整理的(codified)膠原蛋白，天然的及經修飾的多糖，包括葡聚糖和纖維素(例如，硝化纖維}，瓊脂，和磁石(magnetite)。可吸收性或非-可吸收性材料都可以使用。另外還可使用本領域熟知的細胞外基質材料。細胞外基質材料可以商業途徑獲得或者通過下述方式制備得到培養分泌所述基質的細胞，回收分泌型細胞，然后使要移植的細胞與所述基質相互作用或者吸附于其上。用于培養被植入細胞的基質材料，或者與所述細胞混合的基質材料，可以是RPE細胞的內生產物。因此，例如，所述基質可以是待植入的RPE細胞產生和分泌的細胞外基質或基底膜物質。
            
為了提高細胞吸附、存活和功能，可以任選地用本領域已知的因子包被所述固體基質的外表面，以促進細胞吸附、生長或存活。所述因子包括細胞粘著分子，細胞外基質，例如，纖連蛋白，層粘連蛋白，膠原蛋白，彈性蛋白，氨基多糖(glycosaminoglycan)，或者蛋白多糖或生長因子。
            
可替代地，如果所述供植入細胞吸附的固體物質是由多孔材料構成的，可以向所述基質材料中摻入一種或多種促生長或促存活的因子，植入體內之后所述因子再從基質材料中慢慢地釋放出來。
            
當附著于本發明所述支持物時，所述用于移植的細胞通常位于該支持物的″外表面″上。所述支持物可以是固態的或多孔樣的。但是，即使是多孔載體，所述細胞也是與外周環境直接接觸的，并沒有膜或其他屏障的插入。因此，根據本發明，所述細胞被認為是位于所述支持物的″外表面″，即使細胞所粘附的表面是以多孔支持物載體的內部折疊面或盤旋面(convolutions)的形式存在而并不是所述顆粒或珠體本身的外部。
            
所述支持物的結構優選為球狀，例如珠粒，但是也可以是圓柱狀的，橢圓的，扁片或條形的，針狀或銷形(pin shape)等。支持基質的優選形式為玻璃纖維珠。另一種優選的珠粒為聚苯乙烯珠粒。
            
珠粒直徑大小為10μm-1mm，優選約90μm-約150μm。各種微載體珠粒的描述，參見，例如，isher Biotech Source 87-88，Fisher Scientific Co.，1987，pp.72-75；Sigma Cell Culture Catalog，Sigma Chemical Co.，St，Louis，1991，pp.162-163；Ventrex Product Catalog，Ventrex Laboratories，1989；這些參考文獻在此引入作為參考。所述珠粒大小的上限可以根據所述珠粒刺激宿主不良反應確定，所述宿主不良反應會妨礙移植的細胞的功能或者引起對外周組織的損害。所述珠粒大小的上限還由施用方法決定。所述的限度是本領域技術人員很容易測定的。
            
神經胚素多肽本發明進一步還涉及神經胚素多肽，其中含有信號肽和神經胚素多肽，其中所述多肽不含神經胚素原-區，例如融合于信號肽的神經胚素多肽。具體而言，所述信號肽的C-末端通過肽鍵與所述神經胚素多肽的N-末端連接。所述的信號肽和神經胚素多肽如上所述。
            
實施例實施例1用IgSP-NBN構建體體外轉染構建IgSP-NBN構建體IgSP.NBN通過重疊PCR制備。在第一擴增步驟中，通過PCR從pUbilz.NBN.BamHI載體擴增NBN的成熟片段，使用引物NBNs-IgSP.Flap(5’-GGTGAATTCGGCTGGGGGCCCGGGCAGCC-3’)和NBNas+XhoI(5’-TATACTCGAGCGAGCCCTCAGCCCAGGCA-3’)。在第二步PCR反應中，所述IgSP序列擴增自pNUT-IgSP-CNTF載體(參見US6,361,741)，使用引物IgSPKozakls+BamHI(5’-TATAGGATCCGCCACCATGAAATGCAGCTGGGTTATC-3’)和IgSPas-NBN.Flap(5’-GGCCCCCAGCCGAATTCACCCCTGTAGAAAG-3’)。在第三步中，將步驟1和2中的產物合并入最后的PCR反應制備IgSP-NBN，使用等量的這兩種產物作為模板并使用引物IgSPKozakls+BamHI和NBN-as+XhoI。
            
為了制備基于質粒的表達載體，將得到的片段克隆入用BamHI/XhoI消化后的pNSln中。在該載體中，所述IgSP-NBN序列置于CMV啟動子轉錄調控之下(參見圖3)。另外，當表達于哺乳動物細胞中時，所述載體含有能賦予G418抗性的Neo基因。
            
瞬時轉染試驗ARPE-19是一種人視網膜色素上皮細胞系(Dunn et al.1996)，37℃和5％CO2條件下生長于添加了10％胎牛血清(Sigma-Aldrich，Denmark)的含有Glutamax(Invitrogen，Denmark)的DMEM/Nutrient Mix F-12中。通過胰酶消化和再接種(1∶5分裂比)對細胞進行傳代，大約每周兩次。將細胞以105個細胞/孔的密度接種于6-孔平板(Corning Costar，Biotech Line，Denmark)用于轉染試驗。次日，按照廠商提供的說明書，使用Fugene6(Roche，Germany)用3μg質粒/孔轉染細胞，每孔均設一式兩份。轉染后3天收集細胞上清，用RetL3 ELISA測定其中的NBN活性。
            
RetL3 ELISA所述RetL3 ELISA檢測Ret-AP偶聯物與結合于NBN-特異性GFRα3受體的NBN的復合體之間的結合。該試驗只能檢測功能活性的NBN分子。簡而言之，96-孔平板(B & W Isoplate HB，Perkin Elmer，Denmark)用100μl以溶于50mM NaHCO3(pH＝9.6)的1μg/ml山羊抗人Fc(JacksonImmunoresearch Laboratories，TriChem，Denmark)在4℃包被16小時。用PBS/0.05％Tween20(PBST)洗滌后，將這些孔用含0.2％I-Block(Tropix，Applied Biosystems，Denmark)的PBST溶液在室溫封閉1小時，然后在PBST中作簡單洗滌。細胞上清或重組小鼠Artemin(R&D systems，UK)用DMEM/10％FCS稀釋，然后在孔內與以1μg/ml溶于RET-AP條件培養基(Biogen，USA)的GFRα3/Fc融合蛋白(R&D Systems，UK)在室溫保溫1.5小時。然后首先用PBST洗滌孔接著用AP-緩沖液(200mM Tris(pH＝9.8)，10mM MgCl2)洗滌，然后與以10％溶于AP-緩沖液的Sapphire Enhancer(Tropix，Applied Biosystems，Denmark)和以2％溶于AP-緩沖液的CSPD(Tropix，Applied Biosystems，Denmark)保溫30分鐘。通過使用MicrobetaTrilux Counter(Perkin Elmer，Denmark)測定發光情況。
            
結果(圖4(b))使用RetL3ELISA對從經pNSln-IgSP.NBN構建體瞬時轉染的ARPE-19細胞收集的上清進行檢測，其中的NBN活性為25.3-33.8ng/ml。相反，對于包括在同一試驗中的經野生型(前原)NBN表達構建體(pUbilz.hNBN)轉染的ARPE-19細胞，檢測到大約低5倍的NBN活性(4.4-6.4ng/ml)。經EGFP表達構建體(pNSlz-EGFP)瞬時轉染的ARPE-19的細胞上清中，則僅有極低或者甚至檢測不到NBN活性，證實了該測定法的特異性。
            
這些結果表明與使用野生型(前原)NBN構建體時的NBN釋放相比，嵌合的IgSP-NBN構建體能夠使得從哺乳動物細胞釋放的能結合并活化特異性NBN受體復合體的成熟NBN的量更高。
            
實施例2用IgSP-NBN構建體體外轉導制備慢病毒IgSP-NBN構建體和病毒原液為了制備慢病毒構建體，將pNSln-IgSP-NBN用BamHI-XhoI消化，將IgSP-hNBN PCR片段(如實施例1所述)連接入BamHI/XhoI-消化的pHsCXW得到pHsCXW.IgSP.NBNw(圖3)。pHsCXW是自身-滅活型慢病毒傳遞構建體pHR’-SIN-18的衍生物，其中包括通過用pUC19骨架取代該轉移構建體中較大的非病毒部分制備得到的WPRE元件(Dull et al.，J.Virol.，72(11)8463-71(1998)；Zufferey et al.，J.Virol.，72(12)9873-80(1998)Zuffereyet al.J.virol.，73(4)2886-92(1999))。pHsCXW的序列可以從GenGank IDAY468486獲取。
            
通過下述操作制備復制缺陷型LV-sC.IgSP.NBN.W病毒顆粒將pHsC.IgSP.NBN.W與pMD.G(VSV-G假分型載體(pseudo-typing vector))和pBR8.91(包裝載體)(Zufferey et al.，Nat.Biotech.，15871-75(1997))共轉染入293T細胞，反向提供所需的病毒蛋白。簡而言之，在轉染的前一天，將在含4.5g/l葡萄糖和glutamax(Life Technologies，32430-027)并補充10％FCS(Life Technologies，10099-141)的DMEM中培養的293T細胞接種于T75轉瓶(2×106個細胞/瓶)。對于每一個T75轉瓶而言，使用Lipofectamine，按照廠商提供的說明書，用5μg pMD.G，15μg pBR8.91和20μg轉移載體轉染細胞。轉染后2-3天收集含病毒的細胞上清，用0.45μm醋酸纖維素或polysulphonic濾膜過濾除菌，通過在4℃、50,000xg超離90分鐘濃縮。第二輪超速離心后，將濃縮后的病毒沉淀重懸于DMEM，分裝，然后保存于-80℃。為了測定病毒滴度，測定反轉錄酶(RT)活性(Cepko and Pear，Current Protocols in Molecular Biology，9.13.5-6，supplement 36)，然后使用轉導活性已知的EGFP慢病毒作為參照，從測得的RT活性中計算出轉導單位(TU)/ml。
            
轉導試驗用NBN表達載體轉導ARPE-19細胞。簡而言之，將細胞以105個細胞/孔的密度接種于6-孔平板(Corning Costar，Biotech Line，Denmark)。第二天，向每個孔(一式雙份)中加入2×105TU病毒和5μg/ml聚凝胺4小時。更換培養基，將培養物再保溫3天。然后，按照實施例2所述收集細胞上清用于RetL3 ELISA。
            
結果(圖4(c))使用RetL3 ELISA對從經LV-sC.IgSP.NBN.W病毒轉導的ARPE-19細胞收集的上清進行檢測，其中的NBN活性為39ng/ml。相反，經含野生型(前原)NBN cDNA的慢病毒(LV-sC-NBN.W)轉導或者用對照EGFP慢病毒(LV-sCEW)轉導的ARPE-19的細胞上清中，則僅檢測到極低的或者甚至檢測不到NBN活性。
            
這些結果表明，與使用含野生型(前原)NBN cDNA的病毒構建體相比，嵌合的IgSP-NBN構建體能夠允許更多的能結合并活化特異性NBN受體復合體的成熟NBN從哺乳動物細胞釋放。
            
實施例3自IgSP-NBN構建體表達的NBN蛋白質的分析細胞上清的Western印跡分析在Western印跡分析之前，來自轉染或轉導的細胞培養物細胞上清中的NBN通過與GFRa3-Ig的親合結合而得以濃縮。簡而言之，將NuncMaxiSorp平板的4個孔用300μl山羊抗人FNaHCO3(pH＝9.6)溶液在4℃包被16小時。所述孔用400μl含1％BSA的PBS溶液在室溫封閉1小時，然后用PBST洗滌三遍。然后添加300μl/孔GFRo3/Fc融合蛋白1μg/ml(R&D Systems，UK)，將平板在室溫保溫1小時以實現最大程度的結合。然后，將孔內倒空，再用PBST洗滌3次。然后向4孔中的每一孔添加收集自轉染或轉導的細胞培養物的上清300μl，在室溫保溫至少3小時并同時輕微振搖。然后用PBST洗滌所述孔兩次。然后向第一孔中添加20μl非還原性樣品緩沖液(2％SDS，0.4M Tris(ph＝8.0))，將所述平板快速振搖5分鐘洗脫出結合的蛋白。將這些內容物轉移到下一個孔內，重復該過程一洗脫出結合于其余孔的蛋白質。添加DTT至10mM后，將所述樣本在96℃加熱5分鐘，然后通過SDS PAGE在15％聚丙烯酰胺凝膠上用MultiPhor II系統遵照廠商的推薦(Amersham Pharmacia，Denmark)進行分析。將所述蛋白質轉印到PVDF膜上(BioRad，Denmark)，所述膜使用多克隆兔抗-NBN抗體(#378)作為檢測抗體進行免疫染色。使用ECL+系統(Amersham Pharmacia，Denmark)使膜顯色然后進行膠片曝光。
            
結果#_378是抗NBN-衍生肽的兔多克隆抗體(ALRPPPGSRPVSQPC)。如圖59(a)所示，單個分子量為7.2-18.5kDa的條帶在含下述NBN的還原(+DTT)樣本中識別出在大腸桿菌中產生的對應于單體非糖基化NBN113的純化的大鼠重組NBN。來自經野生型(前原)NBN轉染的穩定的CHO-NBN克隆的還原樣本中，除幾個其他條帶之外也識別到了相同分子量的條帶。此前的試驗中已經使用去糖基化和N-末端測序方法測定了許多這樣條帶的性質。分子量略低的條帶是成熟NBN的較小且非糖基化形式(NBN104)。此外，表觀MW約21kDa的非常寬的帶是NBN113和NBN104的糖基化形式。較大分子量的(糖基化的)條帶為偶見于GFRa3-親合純化樣本中的原-NBN。
            
如圖5b所示，在CHO-NBN細胞的兩個的穩定克隆中檢測到MW位于6.4-21.3kDa之間的、與非糖基化NBN113和NBN104對應的雙條帶。在用IgSP-NBN表達構建體轉導或轉染的ARPE-19中也檢測到了同樣的雙條帶。另外，與糖基化NBN113和NBN104對應的、MW接近于21kDa的雙條帶出現于所有檢測樣本中。這些結果表明用野生型(前原)NBN和IgSP-NBN構建體表達時，加工和翻譯后修飾是相似的。
            
實施例4嵌合IgSP-NBN病毒構建體的測序和信號肽的預測。
            
存在于構建體中的IgSP-NBN-核苷酸序列ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGTAAGGGGCTCCCAAGTCCCAAACTTGAGGGTCCATAAACTCTGTGACAGTGGCAATCACTTTGCCTTTCTTTCTACAGGGGTGAATTCGGCTGGGGGCCCGGGCAGCCGCGCTCGGGCAGCGGGGGCGCGGGGCTGCCGCCTGCGCTCGCAGCTGGTGCCGGTGCGCGCGCTCGGCCTGGGCCACCGCTCCGACGAGCTGGTGCGTTTCCGCTTCTGCAGCGGCTCCTGCCGCCGCGCGCGCTCTCCACACGACCTCAGCCTGGCCAGCCTACTGGGCGCCGGGGCCCTGCGACCGCCCCCGGGCTCCCGGCCCGTCAGCCAGCCCTGCTGCCGACCCACGCGCTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACGTCAACAGCACCTGGAGAACCGTGGACCGCCTCTCCGCCACCGCCTGCGGCTGCCTGGGCTGA(SEQID NO 7)
            
IgSP-NBN是融合構建體，帶有直接融合于成熟NBN(113)的、來自免疫球蛋白基因的信號肽。
            
所述IgSP-NBN含有內含子通過NetGene(CBS-DTU服務器)預測的內含子-外顯子長度478個核苷酸。
            
13.4％A，36.2％C，32.2％G，18.2％T，0.0％X，68.4％G+C供體拼接位點，指導鏈---------------------------------位置5′-＞3′  階段   鏈 可信度5′  外顯子內含子   3′47 2  +  0.00   GTGGTTACAG^GTAAGGGGCT2480  +  0.60   CGACGAGCTG^GTGCGTTTCC供體拼接位點，互補鏈-------------------------------------無供體位點預測超過閾值。
            
受體拼接位點，指導鏈------------------------------------pos 5′-＞3′  階段鏈可信度 5′內含子外顯子  3′1251   + 0.83   CTTTCTACAG^GGGTGAATTC1532   + 0.18   GCCCGGGCAG^CCGCGCTCGG1671   + 0.20   GCTCGGGCAG^CGGGGGCGCG1990   + 0.42   GCGCTCGCAG^CTGGTGCCGG
            
經拼接的轉錄本的核苷酸序列ATGAAATGCAGCTGGGTTATCTTCTTCCTGATGGCAGTGGTTACAGGGGTGAATTCGGCTGGGGGCCCGGGCAGCCGCGCTCGGGCAGCGGGGGCGCGGGGCTGCCGCCTGCGCTCGCAGCTGGTGCCGGTGCGCGCGCTCGGCCTGGGCCACCGCTCCGACGAGCTGGTGCGTTTCCGCTTCTGCAGCGGCTCCTGCCGCCGCGCGCGCTCTCCACACGACCTCAGCCTGGCCAGCCTACTGGGCGCCGGGGCCCTGCGACCGCCCCCGGGCTCCCGGCCCGTCAGCCAGCCCTGCTGCCGACCCACGCGCTACGAAGCGGTCTCCTTCATGGACGTCAACAGCACCTGGAGAACCGTGGACCGCCTCTCCGCCACCGCCTGCGGCTGCCTGGGCTGA(SEQ ID NO 8)經拼接的轉錄本的翻譯MKCSWVIFFLMAVVTGVNSAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG(SEQ ID NO 9)翻譯出的融合蛋白質經預測含有19個氨基酸的信號肽，該信號肽可以使用Signal P(可獲自www.cbs.dtu.dk的CBS DTU服務器)從成熟NBN(113)序列切割。(原核和真核生物肽的鑒定及其切割位點的預測。H.Nielsen，J.Engelbrecht，S.Brunak，G.Von Hejne，Protein Engineering 10，1-6，1997.)SignalP-NN結果(參見圖6a) 
            
#最可能的切割位點位于第19-20位之間VNS-AG
            
SignalP-HMM結果(參見圖6b)預測信號肽信號肽概率0.999信號錨定概率0.000最大切割位點概率0.660，位于第19-20位之間使用神經網絡(NN)和在真核細胞上受訓得到的隱藏(hidden)馬爾可夫模型(Markov models)(HMM)實施例5信號肽位置的預測。
            
Igsp融合于各種長度神經胚素多肽時，切割位點的預測使用上述鑒定的信號P程序2.0顯示如下。
            
切割位點  
            
IgSP(19)MKCSVVVIFFLMAVVTGVNS成熟形式的NBN(113)AGGPGSR(106)AR(104)AA(102)GAR(99)GCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTVVRTVDRLSATACGCLG實施例6將delta原-NBN克隆入pHsCXW通過重疊PCR三步擴增制備delta原-NBN(SEQ.ID.NO82)1)相對長度為117bp的前原NBN前導序列(即，39個氨基酸的信號肽)，5′端帶有BamHI/Kozak突出端，3′端帶有與成熟NBN(143bp)的10個重疊堿基；2)成熟NBN，5′端帶有與NBN前導序列重疊10個的堿基，3′端為XhoI(362bp)；3)將步驟1和2的產物合并入最后的PCR反應，制備delta原-NBN(492bp)。
            
第一步PCR反應(NBN前導)
            
所用引物BamHI+Kozak+hNBNsp，5’-TATAGGATCCGCCACCATGGAACTTG-GACTTGGAGG-3’hNBNsp3′-matNBN  FLAP   as，5’-GGCCCCCAGCGGCCTCTGCGACGCTGCTCA-3’使用質粒pHsC.hNBN.W(參看圖7a中的質粒圖譜)作為PCR反應的模板，所述反應使用Pfu-turbo聚合酶進行。
            
PCR反應條件94℃3min94℃30s55℃30s35個循環72℃1min72℃5min第二步PCR反應(成熟NBN)所用引物hNBNsp3′  FLAP-matNBN  s，5’-CGCAGAGGCCGCTGGGGGCCCGGGCAGC-3’NBNas+XhoI，5’-TATACTCGAGCGAGCCCTCAGCCCAGGCA-3’使用質粒pHsC.hNBN.W(參看圖7a中的質粒圖譜)作為PCR反應的模板，所述反應使用Pfu-turbo聚合酶進行。
            
PCR反應條件94℃3min94℃30s65℃30s35個循環72℃1min72℃5min
            
第三步PCR反應(delta原-NBN)所用引物BamHI+Kozak+hNBNsp，5’-TATAGGATCCGCCACCATGGAACTTGGACTTGGAGG-3’NBNas+XhoI，5’-TATACTCGAGCGAGCCCTCAGCCCAGGCA-3’將前兩步PCR反應的PCR片段(NBN前導序列和成熟NBN，二者都作1∶10稀釋)作為第三步PCR反應的模板，所述反應使用Pfu-turbo聚合酶進行，采用與第一步PCR相同的PCR方案。
            
將第三步PCR反應得到的PCR片段用BamHI和XhoI切割后克隆入pHsCXW中BamHI和XhoI位點之間(參見圖7b中的質粒圖譜)。
            
實施例7用IgSP-NBN構建體和delta原NBN構建體體外轉染不同的細胞系用不同的NBN構建體瞬時轉染后，對NBN(包括野生型前-原NBN，Δ-前NBN和IgSP-NBN)的分泌情況進行比較。瞬時轉染在ARPE-19，HEK293，CHO和HiB5細胞中進行。
            
細胞系按照實施例1的描述培養ARPE-19細胞。將HiB5(Renfranz et al.1991)，HEK293和CHO細胞培養于含10％胎牛血清(Invitrogen，Denmark)的DMEM(Invitrogen，Denmark)，然后另外向CHO用培養基中補充20mg/l L-脯氨酸。ARPE-19，HEK293和CHO細胞的培養條件為37℃和5％CO2，HiB5細胞的培養條件為33℃和5％CO2。通過胰蛋白酶消化和再接種(reseeding)(1∶5分裂比)的方法進行細胞傳代，約每周兩次。
            
瞬時轉染的NBN分泌將細胞以大約105個細胞/孔的密度接種于6-孔平板(Corning Costar，Biotech Line，Denmark)。第二天，分別用pHsC.hNBN.W，pHsC.IgSP.hNBN.W和pHsC.delta原-hNBN.W轉染細胞。ARPE-19細胞按實施例1的描述使用Fugene6轉染，設置一式三份的平行孔，而其余三種細胞系按照廠商提供的說明書使用Lipofectamine Plus(Invitrogen，Denmark)轉染，2μg質粒/孔，設置一式三份的平行孔。第二天，向孔中添加新鮮生長培養基，細胞繼續保溫24小時，然后收集調節的培養基(conditioned medium)。通過評估用pHsC.EGFP.W.平行轉染的孔中的EGFP表達水平保證足夠的轉染效率。使用RetL3 ELISA測定經調節的培養基中的NBN結合活性。RetL3 ELISA檢測Ret-AP偶聯物與NBN同NBN-特異性GFRα3受體的結合復合體之間的結合。數值計算為ng NBN/ml/24h和ng NBN/105個細胞/24h，然后以得自野生型NBN構建體轉染的細胞的值設定為1，將以上數值調整為相對NBN釋放。圖8中的數據代表這三種計算，表示為平均值±SEM(n＝3)。在圖8A中，*表示與用野生型NBN構建體轉染的細胞之間差異顯著(P＜0.05，單向ANOVA，Fisher LSD Method)結果如下表和圖8A所示，與使用野生型NBN構建體時相比，使用delta原-NBN構建體時所述這四種受試細胞系都表現出NBN釋放量的增加(NBN釋放量高出9-17倍，取決于具體的細胞系)。當用pHsC.IgSP，hNBN構建體轉染所述四種細胞系時，NBN的分泌量進一步升高(與野生型NBN相比，NBN釋放量高出29-91倍)。經EGFP表達構建體(pNSlz-EGFP)瞬時轉染過的ARPE-19的細胞上清中，則僅有極低或者甚至檢測不到NBN活性，證實了該測定的特異性。 
            
圖8B中圖示的是瞬時轉染的細胞系的條件培養基(24h)中的NBN濃度。來自經IgSP-NBN構建體轉染的HEK293細胞的條件培養基中，測得的濃度最高(1240±54ng NBN/ml)。圖8C中圖示的是NBN釋放/105個細胞/24小時。IgSP-NBN轉染的ARPE-19細胞表現出最大的NBN釋放量(133±35ng/105個細胞/24h)。
            
本發明的結果表明為了提高成熟NBN自哺乳動物細胞的分泌量，使用嵌合IgSP-NBN構建體和delta原NBN構建體適用于不同的細胞類型。
            
實施例8使用SignalP 3.0的預測使用版本3.0預測信號肽的位置。所述預測在具有下列序列的delta原NBN和IgSP-NBN上進行。
            
含NBN-SP的嵌合NBN分子(delta原NBNs)NBN-SP(SEQ ID NO24)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAdelta原NBN140(SEQ ID NO25)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGdelta原NBN113(SEQ ID NO26)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGdelta原NBN106(SEQ ID NO27)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGdelta原NBN104(SEQ ID NO28)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGdelta原NBN102(SEQ ID NO29)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGdelta原NBN99(SEQ ID NO30)MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEAGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG含IgSP的嵌合NBN分子(IgSP-NBNs)IgSP(SEQ ID NO4)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSIgSP-NBN140(SEQ ID NO31)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGIgSP-NBN113(SEQ ID NO32)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGIgSP-NBN106(SEQ ID NO33)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGIgSP-NBN 104(SEQ ID NO34)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGIgSP-NBN102(SEQ ID NO35)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGIgSP-NBN99(SEQ ID NO36)MKCSWVIFFLMAVVTGVNSGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG含大鼠白蛋白SP的嵌合NBN分子(AlbSP-NBNs)
            
AlbSP(SEQ ID NO37)MKWVTFLLLLFISGSAFSAlbSP-NBN140(SEQ ID NO38)MKWVTFLLLLFISGSAFSPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGAlbSP-NBN113(SEQ ID NO39)MKWVTFLLLLFISGSAFSAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGAlbSP-NBN106(SEQ ID NO40)MKWVTFLLLLFISGSAFSARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGAlbSP-NBN104(SEQ ID NO41)MKWVTFLLLLFISGSAFSAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGAlbSP-NBN102(SEQ ID NO42)MKWVTFLLLLFISGSAFSGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGAlbSP-NBN99(SEQ ID NO43)
            
MKWVTFLLLLFISGSAFSGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG含經修飾的大鼠白蛋白SP的嵌合NBN分子(ModAlbSP-NBNs)ModAlbSP(SEQ ID NO44)MKWVTFLLFLLFISGDAFAModAlbSP-NBN140(SEQ ID NO45)MKWVTFLLFLLFISGDAFAPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGModAlbSP-NBN113(SEQ ID NO46)MKWVTFLLFLLFISGDAFAAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGModAlbSP-NBN 106(SEQ ID NO47)MKWVTFLLFLLFISGDAFAARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGModAlbSP-NBN 104(SEQ ID NO48)MKWVTFLLFLLFISGDAFAAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG
            
ModAlbSP-NBN 102(SEQ ID NO49)MKWVTFLLFLLFISGDAFAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGModAlbSP-NBN99(SEQ ID NO50)MKWVTFLLFLLFISGDAFAGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG含人生長激素SP的嵌合NBN分子(GHSP-NBNs)GHSP(SEQ ID NO51)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAGHSP-NBN 140(SEQ ID NO52)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAPPPQPSRPAPPPPAPPSALPRGGRAARAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGGHSP-NBN113(SEQ ID NO53)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAAGGPGSRARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGGHSP-NBN 106(SEQ ID NO54)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAARAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG
            
GHSP-NBN104(SEQ ID NO55)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAAAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGGHSP-NBN102(SEQ ID NO56)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAGARGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLGGHSP-NBN99(SEQ ID NO57)MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSAGCRLRSQLVPVRALGLGHRSDELVRFRFCSGSCRRARSPHDLSLASLLGAGALRPPPGSRPVSQPCCRPTRYEAVSFMDVNSTWRTVDRLSATACGCLG信號肽的預測顯示于下表
            
含NBN信號肽1(delta原)蛋白質的信號肽預測 
            
1MELGLGGLSTLSHCPWPRRQPALWPTLAALALLSSVAEA-39個氨基酸*低于截止值含IgSP2的蛋白質的信號肽預測 
            
2MKCSWVIFFLMAVVTGVNS-19個氨基酸**低于截止值含ModAlbSP4的蛋白質的信號肽預測 
            
4MKWVTFLLFLLFISGDAFA-19個氨基酸*低于截止值含AlbSP3的蛋白質的信號肽預測  
            
3MKWVTFLLLLFISGSAFS-18個氨基酸-*低于截止值含GHSP5的蛋白質的信號肽預測 
            
5MATGSRTSLLLAFGLLCLSWLQEGSA-26個氨基酸*低于截止值實施例9神經胚素基因序列的優化根據目前至2002年間的數據，對CHO細胞中最常用的密碼子進行了分析，使用本領域巳知的方法(Nakamura et al.，1999，Nucleic Acids Res.，27(1)292)。中國倉鼠(Cricetulus griseus)依賴的密碼子使用列于下表。
            
表.倉鼠中對于每1,000個密碼子標準化的密碼子使用頻率。 
            
編碼C末端104個氨基酸片段的天然人核苷酸序列(Roseblad et al.，2000，Mol.Cell Neurosci.15(2)199；Baloh et al.，Neuron 211291)和合成基因的核苷酸序列的比對見圖9，對其中變化了核苷酸作了標示。這兩種序列具有83.33％的序列同一性。
            
實施例10神經胚素基因的克隆為了有助于連接至神經胚素5′端密碼子的各種信號肽序列的插入，合成100個密碼子(300個核苷酸)的神經胚素基因3′形式，并將其克隆入表達質粒。通過下述操作組配所述的100密碼子-形式的神經胚素基因將40pmol的寡核苷酸KD3-464至KD3-469(表2)合并入200μL含Deep Vent聚合酶(New England BioLabs，Beverly，MA)的緩沖液(10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，20mM Tris-Cl，2mM MgSO4，0.1％Triton X-100，pH 8.8)中。將內容物在95℃加熱4分鐘，然后進行20個下列循環95℃1分鐘，60℃30秒，以及72℃1分鐘，然后72℃延伸4分鐘。用SalI和NheI連續消化制備所述末端。包含位于神經胚素兩側30個堿基的非-編碼區的330個堿基片段通過凝膠純化，然后連接入經凝膠純化并經NheI和XhoI消化的質粒pFRT/dhfr-1(pcDNA/FRT的衍生物(Invitrogen，Carlsbad，CA)，其中的潮霉素基因被二氫葉酸還原酶基因所取代)。得到的質粒命名為pNBN026-35。pNBN026-35內的神經胚素序列顯示于圖10。
            
下表中給出了PCR中使用的寡核苷酸，以及為制備信號肽-神經胚素融合基因而進行組配的合成序列。所有序列都按照從5’至3’的方向。
            
表  
            
實施例11信號肽-神經胚素融合體的構建對四種不同信號肽的編碼序列進行了測試。這些序列中都包含來自神經胚素、大鼠白蛋白和人生長激素的信號序列。此外，合成信號序列得自在用于制備神經胚素信號肽的PCR擴增過程中的兩個移碼突變。使用寡核苷酸組配或者PCR方法合成所述融合體。將所述DNA片段連接入pNBN026。通過DNA序列分析，對所述四種分子中每一種的相關DNA序列進行驗證。
            
通過PCR擴增合成信號序列，使用寡核苷酸KD3-487，KD3-479，KD3-480，KD3-481，和KD3-482(表)以及puReTaq聚合酶(Pharmacia，Peapack，NJ，)。PCR反應條件包括將反應物95℃加熱4分鐘，然后進行20個下列循環95℃1分鐘，60℃30秒，72℃1分鐘，然后72℃延伸4分鐘。用PstI和XhoI消化制備末端。對所述330個堿基的片段進行凝膠純化，然后連接入也經過凝膠純化并用PstI-和XhoI消化的質粒pNBN026。得到的質粒命名為pNBN030。有兩個自發的移碼突變，它們未被預測到或者由互補且保持翻譯蛋白質讀框的寡核苷酸編碼。所述DNA和蛋白質序列如圖11所示。
            
通過PCR擴增合成神經胚素信號序列，使用寡核苷酸KD3-513和KD3-514(表)。使用的聚合酶為puReTaq(Pharmacia，Peapack，NJ，)。PCR反應條件包括95℃加熱4分鐘，然后進行3個下列循環95℃ 1分鐘，60℃30秒，72℃ 1分鐘，然后72℃延伸4分鐘。用NheI和XhoI消化制備末端。對所述330個堿基的片段進行凝膠純化，然后連接入也經過凝膠純化并用NheI和XhoI消化的質粒pNBN030。得到的質粒命名為pNBN038。所述DNA和蛋白質序列如圖12所示。
            
通過PCR擴增合成白蛋白信號序列，使用寡核苷酸KD3-487，KD3-471，和KD3-472(表)。使用的聚合酶為puReTaq(Pharmacia，Peapack，NJ)。PCR反應條件包括95℃加熱4分鐘，然后進行20個下列循環95℃1分鐘，60℃30秒，72℃1分鐘，然后72℃延伸4分鐘。用PstI和XhoI消化制備末端。將所述330個堿基的片段做凝膠純化，然后連接入也已經過凝膠純化并用PstI-和XhoI消化后的質粒pNBN026。得到的質粒命名為pNBN029。所述DNA和蛋白質序列如圖13所示。
            
通過PCR擴增從質粒pV30(基于pUC的質粒，其中含有人生長激素基因5’末端的基因組拷貝)合成人生長激素信號序列，使用寡核苷酸KD3-487，KD3-477和KD3-485(表2)。使用的聚合酶為puReTaq(Pharmacia，Peapack，NJ，)。PCR反應條件包括95℃加熱4分鐘，然后進行20個下列循環95℃1分鐘，60℃30秒，72℃1分鐘，然后72℃延伸4分鐘。用PstI和XhoI消化制備末端。對所述330個堿基的片段進行凝膠純化，然后連接入經過凝膠純化并用PstI-和XhoI消化后的質粒pNBN026。得到的質粒命名為pNBN031。所述DNA和蛋白質序列如圖14所示。
            
實施例12CHO細胞轉染提前用含Flp Recombination Target(frt)的DNA序列轉化CHO-DG44細胞(A1細胞)。這種A1宿主細胞系不含二氫葉酸還原酶基因(DHFR)，因此是DHFR-陰性的。上述的每一種質粒都能編碼DHFR基因，神經胚素融合基因，外加frt位點。質粒pOG44編碼所述Flp重組酶基因。用這些質粒共轉染A1細胞的結果是將單一拷貝的信號-肽-神經胚素融合基因和DHFR插入染色體。在與廠商描述一樣的條件下(即0.4毫米透明小容器，280伏特，950微法)(BioRad，Hercules，California)，用目的質粒外加質粒pOG44A1對細胞進行電穿孔。根據能在補充了10％透析過的胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的不含核苷的α-陰性培養基極限必需培養基Alpha(Minimal Essential Medium-Alpha)(Invitrogen，Carlsbad，CA)中生長的能力，篩選出表達DHFR的轉化細胞。大約兩周后，分離集落，轉移到盛裝有相同培養基的較大容器中擴大培養。將細胞培養物轉移到無血清培養基中進行分析。
            
實施例13轉染的細胞系的分析篩選出能夠表達神經胚素的侯選細胞系。為了從經調節的培養基分離細胞，對等份細胞培養物懸液離心。從細胞沉淀中取出經調節的培養基，然后將該培養基和該細胞沉淀進行處理，在16％聚丙烯酰胺凝膠上如通常所述那樣進行還原型變性電泳(Ausubel et al.同上)。電泳完成時，將所述蛋白質電印跡到PVDF膜上，用抗神經胚素的兔多克隆抗血清進行檢測。通過使用與辣根-過氧化物酶偶聯的山羊抗-兔多克隆抗血清(BioRad，Hercules，California)，對所述抗體-神經胚素復合體進行檢測蛋白質從編碼神經胚素的、合成的、白蛋白的和人生長激素的信號肽的質粒表達，每一種質粒都表達細胞沉淀級分中的免疫-反應性神經胚素。但是，只有白蛋白和人生長激素信號肽表達在經調節的培養基中的可檢測水平的神經胚素。所有表達的神經胚素多肽的電泳遷移率都與11kD，104-氨基酸形式的神經胚素一致。
            
實施例14CHO細胞中制備的神經胚素的序列使用免疫親和柱從經調節的培養基純化出神經胚素，如通常描述的那樣(Ausubel et al.，同上)。測定從細胞系純化的含白蛋白和生長激素信號肽的蛋白質的氨基-末端序列。將神經胚素加載到TFA微過濾物(AppliedBiosystems，Foster City，CA)上，進行自動的Edman化學降解。氨基末端測序在ABI Procise 494測序儀上完成。得到的PTH氨基酸使用裝有PTH C18反-相柱的ABI 140C Microgradient系統分離，使用ABI 7785A吸光度檢測器進行分析。對于這兩種構建體而言，原始蛋白質序列從全長神經胚素的104個C末端氨基酸片段的第一位殘基(即丙氨酸)開始。另外，利用生長激素信號肽表達的神經胚素制劑還包含不含氨基-末端丙氨酸殘基的103個氨基酸神經胚素C末端片段。所述103個氨基酸形式的神經胚素從丙氨酸開始。這兩種情況下，信號肽發揮預期作用，即神經胚素多肽從細胞中分泌，信號肽被該細胞切除。
            
實施例15重組神經胚素的質譜分析從含有編碼白蛋白和生長激素信號肽的構建體的細胞系的經調節的培養基純化的神經胚素，利用完整光譜學在ZMD質譜儀(Waters，Milford，MA)如生產商通常描述的那樣進行分析。對于兩種構建體，去糖基化樣本的第一個峰對應104個氨基酸的神經胚素多肽(圖15)。這兩種信號肽發揮預期作用，即神經胚素多肽從細胞中分泌，信號肽被該細胞切除。此外，從用編碼神經胚素和生長激素信號肽的構建體轉染的細胞分離的糖基化神經胚素包含各種的糖基化形式。
            
實施例16對來自用編碼神經胚素和異源信號序列的構建體轉染的CHO細胞的培養基中的神經胚素活性進行檢測生物活性使用激酶受體活化ELISA(KIRA)測定。該方法此前已有描述(Sadick et al.，1996，Anal.Biochem.，1996.235(2)207。簡而言之，NB41A3-mRL3細胞是表達Ret和GFRα3的附著性(adherent)鼠神經母細胞瘤細胞系，將該細胞以2×105個細胞/孔的密度接種于24-孔平板中補充了10％胎牛血清的Dulbecco′s改良eagle培養基(DMEM)內，然后在37℃和5％CO2條件下繼續培養18小時。
            
用PBS洗滌細胞，然后用0.25mL含連續稀釋的神經胚素的DMEM在37℃和5％CO2條件下處理10分鐘。每一樣本均以一式兩份的方式進行分析。細胞用1mL PBS洗滌，然后在4℃用0.30mL 10mM Tris HCl，pH 8.0，0.5％Nonidet P40，0.2％去氧膽酸鈉，50mM NaF，0.1mM Na3VO4，1mM苯甲磺酰氟裂解1小時，同時輕微振搖該平板。再通過反復吹打混勻裂解物，然后取0.25mL樣本轉移至96-孔ELISA板，該板已經用含5μg/mL抗-RetmAb(AA.GE7.3)(Upstate Biotechnology，Waltham，MA)的50mM碳酸鹽緩沖液，pH 9.6 4℃包被了18小時，然后室溫用封閉緩沖液(20mM Tris HClpH 7.5，150mM NaCl，0.1％Tween-20(TBST)，含1％普通小鼠血清和3％牛血清白蛋白)封閉1小時。
            
在室溫保溫2小時后，用TBST洗滌孔6次。再洗滌一次后向所述平板中加入3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺二鹽酸。顯色反應后，對僅用裂解物或裂解緩沖液處理過的孔讀取450nm處的吸光度數值，背景-矯正信號繪制為用于刺激的配體濃度的函數。
            
對連續稀釋的經調節的培養基進行測試，用與此前描述的一批從大腸桿菌表達、純化及再折疊的神經胚素類似的方式對功能性神經胚素進行檢測(圖16)。
            
實施例17用異源的信號肽表達成熟神經胚素合適的寡核苷酸可按照實施例9描述的方法制備，以克隆編碼成熟神經胚素的DNA序列(即，全長神經胚素的113C末端片段)。按照實施例10中的描述，可將編碼大鼠白蛋白或人生長激素信號肽的DNA序列融合于編碼成熟神經胚素多肽的DNA序列。可以將所述DNA序列轉染入真核細胞，例如CHO細胞，以制備分泌的成熟神經胚素。
            
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在本脫離本發明實質和范圍的前提下可以對本發明進行多種改進和變動，這一點對于本領域技術人員來說是顯而易見的。本申請描述的具體實施方案，提供的目的僅僅是為了舉例而決不應構成任何限制。說明書和實施例應當理解為只是舉例，本發明真正的范圍和實質由權利要求來限定。
            
序列SEQ ID NO類型  描述1 PIgSP人2 PIgSP猴3 PIgSP狨4 PIgSP小鼠5 PIgSP豬6 PIgSP大鼠7 N嵌合小鼠IgSP-人113NBN構建體的核苷酸序列8 NSEQ ID No 7的拼接轉錄本9 PSEQ ID NO 8和7編碼的嵌合蛋白質10P人前原神經胚素11P小鼠前原神經胚素12P大鼠前原神經胚素13P成熟的人116氨基酸(aa)神經胚素14P成熟的人113aa神經胚素15P成熟的小鼠119aa神經胚素16P成熟的小鼠116aa神經胚素17P成熟的大鼠116aa神經胚素18P成熟的大鼠113aa神經胚素19PN-末端截短的人104aa神經胚素20PN-末端截短的人99aa神經胚素21PN-末端截短的人140aa神經胚素22PN-末端截短的人106aa神經胚素23PN-末端截短的人102aa神經胚素24P人NBN-SP25Pdelta原NBN14026Pdelta原NBN113
            
27Pdelta原NBN10628Pdelta原NBN10429Pdelta原NBN10230Pdelta原NBN9931P小鼠IgSP-人140NBN嵌合蛋白32P小鼠IgSP-人113NBN嵌合蛋白33P小鼠IgSP-人106NBN嵌合蛋白34P小鼠IgSP-人104NBN嵌合蛋白35P小鼠IgSP-人102NBN嵌合蛋白36P小鼠IgSP-人99NBN嵌合蛋白37P大鼠白蛋白信號肽38P大鼠AlbSP-人140NBN嵌合蛋白39P大鼠AlbSP-人113NBN嵌合蛋白40P大鼠AlbSP-人106NBN嵌合蛋白41P大鼠AlbSP-人104NBN嵌合蛋白42P大鼠AlbSP-人102NBN嵌合蛋白43P大鼠AlbSP-人99NBN嵌合蛋白44P經修飾的大鼠白蛋白信號肽45PModAlbSP-人140NBN嵌合蛋白46PModAlbSP-人113NBN嵌合蛋白47PModAlbSP-人106NBN嵌合蛋白48PModAlbSP-人104NBN嵌合蛋白49PModAlbSP-人102NBN嵌合蛋白50PModAlbSP-人99NBN嵌合蛋白51P人生長激素信號肽52PGHSP-人140NBN嵌合蛋白53PGHSP-人113NBN嵌合蛋白54PGHSP-人106NBN嵌合蛋白55PGHSP-人104NBN嵌合蛋白56PGHSP-人102NBN嵌合蛋白57PGHSP-人99NBN嵌合蛋白
            
58N人104NBN核苷酸序列59N合成的104NBN的核苷酸序列60N質粒pNBN026-35中的神經胚素序列61N合成SP-合成104NBN的嵌合核苷酸序列62P合成SP-合成104NBN的嵌合蛋白63NNBNSP-合成104NBN的嵌合核苷酸序列64PNBNSP-合成104NBN的嵌合蛋白65NAlbSP-合成104NBN的嵌合核苷酸序列66PAlbSP-合成104NBN的嵌合蛋白67N含內含子GHSP-合成104NBN嵌合核苷酸序列68PGHSP-合成104NBN的嵌合蛋白69NModAlbSP-合成104NBN的嵌合核苷酸序列70PModAlbSP-合成104NBN的嵌合蛋白71N引物KD3-46472N引物KD3-46573N引物KD3-46674N引物KD3-46775N引物KD3-46876N引物KD3-46977N引物KD3-47178N引物KD3-47279N引物KD3-47780N引物KD3-47981N引物KD3-48082Ndelta原NBN113核苷酸序列序列表<110>NsGene公司(NsGene A/S)比奧根艾迪克MA公司(Biogen Idec MA Inc.)Groborg，MetteWahlberg，LarsTorno，JensKusk，PhilipPederson，Nels E.
            
Sisk，William P.
            
<120>增加的神經胚素分泌<130>P 951 PC00<160>82<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Met Asp Cys Thr Trp Arg Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Gly1   5   10  15Thr His Ala<210>2<211>19<212>PRT<213>獼猴(Macaca mulatta)<400>2Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp1   5   10  15Val Leu Ser<210>3<211>19<212>PRT<213>狨(Callithrix jacchus)<400>3Met Asp Trp Thr Trp Arg Ile Phe Leu Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly
            
1   5   10  15Ala His Ser<210>4<211>19<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>4Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly1   5   10  15Val Asn Ser<210>5<211>19<212>PRT<213>野豬(Sus scrofa)<400>5Met Glu Phe Arg Leu Asn Trp Val Val Leu Phe Ala Leu Leu Gln Gly1   5   10  15Val Gln Gly<210>6<211>19<212>PRT<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<400>6Met Lys Cys Ser Trp Ile Ile Leu Phe Leu Met Ala Leu Thr Thr Gly1   5   10  15Val Asn Ser<210>7<211>478<212>DNA<213>人工序列
            
<220>
            
<223>鼠IgSP-人NBN113<220>
            
<221>內含子<222>(47)..(125)<220>
            
<221>外顯子<222>(1)..(46)<220>
            
<221>外顯子<222>(126)..(478)<400>7atg aaa tgc agc tgg gtt atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca g 46Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr1   5   10  15gtaaggggct cccaagtccc aaacttgagg gtccataaac tctgtgacag tggcaatcac106tttgcctttc tttctacag gg  gtg aat tcg gct ggg ggc ccg ggc agc cgc 157Gly Val Asn Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg20  25gct cgg gca gcg ggg gcg cgg ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag ctg gtg  205Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val30  35  40ccg gtg cgc gcg ctc ggc ctg ggc cac cgc tcc gac gag ctg gtg cgt  253Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg45  50  55ttc cgc ttc tgc agc ggc tcc tgc cgc cgc gcg cgc tct cca cac gac  301Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp60  65  70ctc agc ctg gcc agc cta ctg ggc gcc ggg gcc ctg cga ccg ccc ccg  349Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro75  80  85  90ggc tcc cgg ccc gtc agc cag ccc tgc tgc cga ccc acg cgc tac gaa  397Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu95  100 105gcg gtc tcc ttc atg gac gtc aac agc acc tgg aga acc gtg gac cgc  445Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg110 115 120ctc tcc gcc acc gcc tgc ggc tgc ctg ggc tga  478Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly125 130<210>8<211>399
            
<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>鼠IgSP-人NBN113<220>
            
<221>CDS<222>(1)..(399)<220>
            
<221>sig_肽<222>(1)..(57)<223>鼠IgSP<220>
            
<221>misc_feature<222>(58)..(396)<223>人113神經胚素<400>8atg aaa tgc agc tgg gtt atc ttc ttc ctg atg gca gtg gtt aca ggg 48Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly1   5   10  15gtg aat tcg gct ggg ggc ccg ggc agc cgc gct cgg gca gcg ggg gcg 96Val Asn Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala20  25  30cgg ggc tgc cgc ctg cgc tcg cag ctg gtg ccg gtg cgc gcg ctc ggc144Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly35  40  45ctg ggc cac cgc tcc gac gag ctg gtg cgt ttc cgc ttc tgc agc ggc192Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly50  55  60tcc tgc cgc cgc gcg cgc tct cca cac gac ctc agc ctg gcc agc cta240Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu65  70  75  80ctg ggc gcc ggg gcc ctg cga ccg ccc ccg ggc tcc cgg ccc gtc agc288Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser85  90  95cag ccc tgc tgc cga ccc acg cgc tac gaa gcg gtc tcc ttc atg gac336Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp100 105 110gtc aac agc acc tgg aga acc gtg gac cgc ctc tcc gcc acc gcc tgc384Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys115 120 125ggc tgc ctg ggc tga399Gly Cys Leu Gly130
            
<220>
            
<223>鼠IgSP-人NBN113<220>
            
<221>misc_feature<222>(58)..(396)<223>人113神經胚素<400>9Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly1   5   10  15Val Asn Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala20  25  30Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly35  40  45Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly50  55  60Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu65  70  75  80Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser85  90  95Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp100 105 110Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys115 120 125Gly Cys Leu Gly130<210>10<211>220<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<220>
            
<221>misc_feature<223>全長人神經胚素<220>
            
<221>信號
            
<222>(1)..(39)<220>
            
<221>PROPEP<222>(40)..(80)<220>
            
<221>mat_肽<222>(81)..()<400>10Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp-80 -75 -70 -65Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu-60 -55 -50Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ser Leu Gly Ser Ala Pro Arg Ser Pro-45 -40 -35Ala Pro Arg Glu Gly Pro Pro Pro Val Leu Ala Ser Pro Ala Gly His-30 -25 -20Leu Pro Gly Gly Arg Thr Ala Arg Trp Cys Ser Gly Arg Ala Arg Arg-15 -10 -5  -1Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro1   5   10  15Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly20  25  30Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln35  40  45Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu50  55  60Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro65  70  75  80His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro85  90  95Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg100 105 110
            
Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val115 120 125Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>11<211>224<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<220>
            
<221>信號<222>(1)..(39)<220>
            
<221>PROPEP<222>(40)..(80)<220>
            
<221>mat_肽<222>(81)..()<400>11Met Glu Leu Gly Leu Ala Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg-80 -75 -70 -65Pro Arg Trp Gln Ser Ala Trp Trp Pro Thr Leu Ala Val Leu Ala Leu-60 -55 -50Leu Ser Cys Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro-45 -40 -35Ala Ala Arg Asp Gly Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp His-30 -25 -20Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Thr Leu Arg-15 -10 -5  -1Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala1   5   10  15Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala20  25  30
            
Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg35  40  45Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser50  55  60Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg65  70  75  80Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly85  90  95Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys100 105 110Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr115 120 125Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>12<211>224<212>PRT<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<220>
            
<221>信號<222>(1)..(39)<220>
            
<221>PROPEP<222>(40)..(80)<220>
            
<221>mat_肽<222>(81)..()<400>12Met Glu Leu Gly Leu Gly Glu Pro Thr Ala Leu Ser His Cys Leu Arg-80 -75 -70 -65Pro Arg Trp Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu-60 -55 -50Leu Ser Ser Val Thr Glu Ala Ser Leu Asp Pro Met Ser Arg Ser Pro
            
-45 -40 -35Ala Ser Arg Asp Val Pro Ser Pro Val Leu Ala Pro Pro Thr Asp Tyr-30 -25 -20Leu Pro Gly Gly His Thr Ala His Leu Cys Ser Glu Arg Ala Leu Arg-15 -10 -5  -1Pro Pro Pro Gln Ser Pro Gln Pro Ala Pro Pro Pro Pro Gly Pro Ala1   5   10  15Leu Gln Ser Pro Pro Ala Ala Leu Arg Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala20  25  30Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg35  40  45Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His Ser50  55  60Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg65  70  75  80Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Asp Ala Gly85  90  95Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys100 105 110Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr115 120 125Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>13<211>116<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>13Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala1   5   10  15
            
Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly20  25  30Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly35  40  45Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu50  55  60Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser65  70  75  80Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp85  90  95Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys100 105 110Gly Cys Leu Gly115<210>14<211>113<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>14Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys1   5   10  15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His20  25  30Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg35  40  45Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala50  55  60Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys65  70  75  80Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser85  90  95
            
Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leul00 105 110Gly<210>15<211>119<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>15Gly Ala Arg Ala Ala Arg Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr1   5   10  15Thr Asp Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser20  25  30Ala Leu Gly Leu Gly His Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe35  40  45Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu50  55  60Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg65  70  75  80Pro Ile Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser85  90  95Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala100 105 110Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly115<210>16<211>116<212>PRT<213>小家鼠(Mus musculus)<400>16Ala Ala Arg Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Thr Thr Asp Ala1   5   10  15
            
Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly20  25  30Leu Gly His Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly35  40  45Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Gln His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu50  55  60Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser65  70  75  80Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp85  90  95Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys100 105 110Gly Cys Leu Gly115<210>17<211>116<212>PRT<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<400>17Ala Ala Arg Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala1   5   10  15Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly20  25  30Leu Gly His Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly35  40  45Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu50  55  60Leu Asp Ala Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser65  70  75  80Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp
            
85  90  95Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys100 105 110Gly Cys Leu Gly115<210>18<211>113<212>PRT<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<400>18Ala Gly Thr Arg Ser Ser Arg Ala Arg Ala Thr Asp Ala Arg Gly Cys1   5   10  15Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Ser Ala Leu Gly Leu Gly His20  25  30Ser Ser Asp Glu Leu Ile Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg35  40  45Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Asp Ala50  55  60Gly Ala Leu Arg Ser Pro Pro Gly Ser Arg Pro Ile Ser Gln Pro Cys65  70  75  80Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser85  90  95Thr Trp Arg Thr Val Asp His Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu100 105 110Gly<210>19<211>104<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>19Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val
            
1   5   10  15Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg20  25  30Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser35  40  45Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser50  55  60Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val65  70  75  80Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser85  90  95Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100<210>20<211>99<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>20Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu1   5   10  15Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser20  25  30Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu35  40  45Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln50  55  60Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val65  70  75  80Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly85  90  95
            
Cys Leu Gly<210>21<211>140<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>21Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro1   5   10  15Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly20  25  30Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln35  40  45Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu50  55  60Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro65  70  75  80His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro85  90  95Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg100 105 110Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val115 120 125Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>22<211>106<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>22Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val1   5   10  15
            
Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg20  25  30Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp35  40  45Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro50  55  60Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu65  70  75  80Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg85  90  95Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly100 105<210>23<211>102<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>23Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala1   5   10  15Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys20  25  30Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala35  40  45Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro50  55  60Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe65  70  75  80Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr85  90  95Ala Cys Gly Cys Leu Gly100
            
<210>24<211>39<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>24Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp1   5   10  15Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu20  25  30Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala35<210>25<211>179<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>delta原人NBN140<220>
            
<221>信號<222>(1)..(39)<220>
            
<221>mat_肽<222>(40)..()<400>25Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp-35 -30 -25Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu-20 -15 -10Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala-5  -1  1   5Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala10  15  20  25Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg30  35  40
            
Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu45  50  55Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser60  65  70Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu75  80  85Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln90  95  100 105Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val110 115 120Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly125 130 135Cys Leu Gly140<210>26<211>152<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>delta原人NBN113<220>
            
<221>信號<222>(1)..(39)<220>
            
<221>mat_肽<222>(40)..()<400>26Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp-35 -30 -25Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu-20 -15 -10Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg
            
-5  -1  1   5Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val10  15  20  25Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg30  35  40Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser45  50  55Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser60  65  70Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val75  80  85Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser90  95  100 105Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly110<210>27<211>145<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>delta原人NBN106<220>
            
<221>信號<222>(1)..(39)<220>
            
<221>mat_肽<222>(40)..()<400>27Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp-35 -30 -25Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu-20 -15 -10
            
Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys-5  -1  1   5Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His10  15  20  25Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg30  35  40Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala45  50  55Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys60  65  70Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser75  80  85Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu90  95  100 105Gly<210>28<211>143<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>delta原人NBN104<400>28Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp1   5   10  15Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu20  25  30Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu35  40  45Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser50  55  60
            
Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala65  70  75  80Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala85  90  95Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg100 105 110Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp115 120 125Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>29<211>141<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>delta原人NBN102<220>
            
<221>信號<222>(1)..(39)<220>
            
<221>mat_肽<222>(40)..()<400>29Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp-35 -30 -25Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu-20 -15 -10Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser-5   -1  15Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu10  15  20  25Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser30  35  40
            
Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg45  50  55Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr60  65  70Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr75  80  85Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly90  95  100<210>30<211>138<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>delta原人NBN99<220>
            
<221>信號<222>(1)..(39)<220>
            
<221>mat_肽<222>(40)..()<400>30Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp-35 -30 -25Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu-20 -15 -10Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val-5  -1  1   5Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg10  15  20  25Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp30  35  40Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro
            
45  50  55Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu60  65  70Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg75  80  85Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly90  95<210>31<211>159<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>鼠IgSP-人NBN140<220>
            
<221>信號<222>(1)..(19)<220>
            
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>31Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5Val Asn Ser Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro-1  1   5   10Ala Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly15  20  25Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu30  35  40  45Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser50  55  60Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala65  70  75
            
Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala80  85  90Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg95  100 105Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp110 115 120 125Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>32<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>鼠IgSP-人NBN113<220>
            
<221>信號<222>(1)..(19)<220>
            
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>32Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5Val Asn Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala-1  1   5   10Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly15  20  25Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly30  35  40  45Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu50  55  60Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser65  70  75
            
Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp80  85  90Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys95  100 105Gly Cys Leu Gly110<210>33<211>125<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>鼠IgSP-人NBN106<220>
            
<221>信號<222>(1)..(19)<220>
            
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>33Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5Val Asn Ser Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser-1  1   5   10Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu15  20  25Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser30  35  40  45Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg50  55  60Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr65  70  75Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr80  85  90
            
Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly95  100 105<210>34<211>123<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>鼠IgSP-人NBN1104<220>
            
<221>信號<222>(1)..(19)<220>
            
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>34Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5Val Asn Ser Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu-1  1   5   10Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val15  20  25Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His30  35  40  45Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro50  55  60Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr65  70  75Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp80  85  90Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly95  100<210>35
            
<211>121<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>鼠IgSP-人NBN102<220>
            
<221>信號<222>(1)..(19)<220>
            
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>35Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5Val Asn Ser Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro-1  1   5   10Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe15  20  25Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu30  35  40  45Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly50  55  60Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala65  70  75Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu80  85  90Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly95  100<210>36<211>118<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>鼠IgSP-人NBN99
            
<220>
            
<221>信號<222>(1)..(19)<220>
            
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>36Met Lys Cys Ser Trp Val Ile Phe Phe Leu Met Ala Val Val Thr Gly-15 -10 -5Val Asn Ser Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala-1  1   5   10Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys15  20  25Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala30  35  40  45Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro50  55  60Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe65  70  75Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr80  85  90Ala Cys Gly Cys Leu Gly95<210>37<211>18<212>PRT<213>黑家鼠(Rattus rattus)<400>37Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala1   5   10  15Phe Ser
            
<210>38<211>158<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>大鼠白蛋白信號肽-NBN140<220>
            
<221>信號<222>(1)..(18)<220>
            
<221>mat_肽<222>(19)..()<400>38Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala-15 -10 -5Phe Ser Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala-1  1   5   10Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly15  20  25  30Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg35  40  45Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp50  55  60Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg65  70  75Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu80  85  90Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro95  100 105 110Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg115 120 125Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140
            
<210>39<211>131<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>大鼠白蛋白信號肽-NBN113<220>
            
<221>信號<222>(1)..(18)<220>
            
<221>mat_肽<222>(19)..()<400>39Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala-15 -10 -5Phe Ser Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg-1  1   5  10Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu15  20  25  30Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser35  40  45Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu50  55  60Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln65  70  75Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val80  85  90Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly95  100 105 110Cys Leu Gly<210>40
            
<211>124<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>大鼠白蛋白信號肽-NBN106<220>
            
<221>信號<222>(1)..(18)<220>
            
<221>mat_肽<222>(19)..()<400>40Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala-15 -10 -5Phe Ser Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln-1  1   5   10Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu15  20  25  30Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro35  40  45His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro50  55  60Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg65  70  75Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val80  85  90Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly95  100 105<210>41<211>122<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>大鼠白蛋白信號肽-NBN104
            
<220>
            
<221>信號<222>(1)..(18)<220>
            
<221>mat_肽<222>(19)..()<400>41Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala-15 -10 -5Phe Ser Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val-1  1   5   10Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg15  20  25  30Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp35  40  45Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro50  55  60Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu65  70  75Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg80  85  90Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly95  100<210>42<211>120<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>大鼠白蛋白信號肽-NBN102<220>
            
<221>信號<222>(1)..(18)<220>
            
<221>mat_肽
            
<222>(19)..()<400>42Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala-15 -10 -5Phe Ser Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val-1  1   5   10Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg15  20  25  30Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser35  40  45Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser50  55  60Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val65  70  75Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser80  85  90Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly95  100<210>43<211>117<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>大鼠白蛋白信號肽-NBN99<220>
            
<221>信號<222>(1)..(18)<220>
            
<221>mat_肽<222>(19)..()<400>43Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala-15 -10 -5
            
Phe Ser Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu-1  1   5   10Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser15  20  25  30Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser35  40  45Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val50  55  60Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met65  70  75Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala80  85  90Cys Gly Cys Leu Gly95<210>44<211>19<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>修飾的大鼠白蛋白信號肽<400>44Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp1   5   10  15Ala Phe Ala<210>45<211>159<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>修飾的大鼠白蛋白信號肽-NBN140<220>
            
<221>信號
            
<222>(1)..(19)<220>
            
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>45Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp-15 -10 -5Ala Phe Ala Pro Pro Pro Gln Pro Ser Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro-1  1   5   10Ala Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly15  20  25Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu30  35  40  45Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser50  55  60Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala65  70  75Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala80  85  90Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg95  100 105Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp110 115 120 125Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>46<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>修飾的大鼠白蛋白信號肽-NBN113<220>
            
<221>信號<222>(1)..(19)<220>
            
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>46Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp-15 -10 -5Ala Phe Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala-1  1   5   10Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly15  20  25Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly30  35  40  45Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu50  55  60Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser65  70  75Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp80  85  90Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys95  100 105Gly Cys Leu Gly110<210>47<211>125<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>修飾的大鼠白蛋白信號肽-NBN106<220>
            
<221>信號<222>(1)..(19)
            
<220>
            
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>47Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp-15 -10 -5Ala Phe Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser-1  1   5   10Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu15  20  25Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser30  35  40  45Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg50  55  60Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr65  70  75Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr80  85  90Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly95  100 105<210>48<211>123<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>修飾的大鼠白蛋白信號肽-NBN104<220>
            
<221>信號<222>(1)..(19)<220>
            
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>48Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp
            
-15 -10 -5Ala Phe Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu-1  1   5   10Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val15  20  25Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His30  35  40  45Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro50  55  60Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr65  70  75Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp80  85  90Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly95  100<210>49<211>121<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>修飾的大鼠白蛋白信號肽-NBN102<220>
            
<221>信號<222>(1)..(19)<220>
            
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>49Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp-15 -10 -5Ala Phe Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro-1  1   5   10
            
Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe15  20  25Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu30  35  40  45Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly50  55  60Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala65  70  75Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu80  85  90Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly95  100<210>50<211>118<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>修飾的大鼠白蛋白信號肽-NBN99<220>
            
<221>信號<222>(1)..(19)<220>
            
<221>mat_肽<222>(20)..()<400>50Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp-15 -10 -5Ala Phe Ala Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala-1  1   5   10Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys15  20  25Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala30  35  40  45
            
Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro50  55  60Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe65  70  75Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr80  85  90Ala Cys Gly Cys Leu Gly95<210>51<211>26<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>51Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu1   5   10  15Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala20  25<210>52<211>166<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>人生長激素SP-NBN140<220>
            
<221>信號<222>(1)..(26)<220>
            
<221>mat_肽<222>(27)..()<400>52Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu-25 -20 -15Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Pro Pro Pro Gln Pro Ser-10 -5  -1  1   5
            
Arg Pro Ala Pro Pro Pro Pro Ala Pro Pro Ser Ala Leu Pro Arg Gly10  15  20Gly Arg Ala Ala Arg Ala Gly Gly Pro Gly Ser Arg Ala Arg Ala Ala25  30  35Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala40  45  50Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys55  60  65  70Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala75  80  85Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro90  95  100Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe105 110 115Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr120 125 130Ala Cys Gly Cys Leu Gly135 140<210>53<211>139<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>人生長激素SP-NBN113<220>
            
<221>信號<222>(1)..(26)<220>
            
<221>mat_肽<222>(27)..()<400>53Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu-25 -20 -15
            
Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser-10 -5  -1  1   5Arg Ala Arg Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu10  15  20Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val25  30  35Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His40  45  50Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro55  60  65  70Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr75  80  85Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp90  95  100Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly105 110<210>54<211>132<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>人生長激素SP-NBN106<220>
            
<221>信號<222>(1)..(26)<220>
            
<221>mat_肽<222>(27)..()<400>54Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu-25 -20 -15Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ala Arg Ala Ala Gly Ala
            
-10 -5  -1  1   5Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly10  15  20Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly25  30  35Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu40  45  50Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser55  60  65  70Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp75  80  85Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys90  95  100Gly Cys Leu Gly105<210>55<211>130<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>人生長激素SP-NBN104<220>
            
<221>信號<222>(1)..(26)<220>
            
<221>mat_肽<222>(27)..()<400>55Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu-25 -20 -15Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly-10 -5  -1  1   5
            
Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly10  15  20His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys25  30  35Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly40  45  50Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro55  60  65  70Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn75  80  85Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys90  95  100Leu Gly<210>56<211>128<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>人生長激素SP-NBN102<220>
            
<221>信號<222>(1)..(26)<220>
            
<221>mat_肽<222>(27)..()<400>56Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu-25 -20 -15Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg-10 -5  -1  1   5Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg10  15  20
            
Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg25  30  35Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly40  45  50Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys55  60  65  70Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr75  80  85Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly90  95  100<210>57<211>125<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>人生長激素SP-NBN99<220>
            
<221>信號<222>(1)..(26)<220>
            
<221>mat_肽<222>(27)..()<400>57Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu-25 -20 -15Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Gly Cys Arg Leu Arg Ser-10 -5  -1  1   5Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu10  15  20Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser25  30  35Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg40  45  50
            
Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr55  60  65  70Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr75  80  85Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly90  95<210>58<211>312<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
            
<221>misc_feature<223>NBN104核苷酸序列<400>58gcagcggggg cgcggggctg ccgcctgcgc tcgcagctgg tgccggtgcg cgcgctcggc 60ctgggccacc gctccgacga gctggtgcgt ttccgcttct gcagcggctc ctgccgccgc120gcgcgctctc cacacgacct cagcctggcc agcctactgg gcgccggggc cctgcgaccg180cccccgggct cccggcccgt cagccagccc tgctgccgac ccacgcgcta cgaagcggtc240tccttcatgg acgtcaacag cacctggaga accgtggacc gcctctccgc caccgcctgc300ggctgcctgg gc312<210>59<211>312<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>合成NBN104核苷酸序列<400>59gccgccggcg ctcgaggctg ccggctgcgg tcccagctgg tgcctgtgcg ggccctgggc 60ctgggccacc ggtccgacga gctggtgcgg ttccggttct gctccggctc ctgccggcgg120gcccggtccc ctcacgacct gtccctggcc tccctgctgg gcgccggcgc cctgcggcct180cctcctggct cccggcctgt gtcccagcct tgctgccggc ctacccggta cgaggccgtg240tccttcatgg acgtgaactc cacctggegg accgtggacc ggctgtccgc caccgcctgc300ggctgcctgg gc312
            
<210>60<211>303<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>pNBN026-35中編碼NBN99的序列<400>60cgaggctgcc ggctgcggtc ccagctggtg cctgtgcggg ccctgggcct gggccaccgg 60tccgacgagc tggtgcggtt ccggttctgc tccggctcct gccggcgggc ccggtcccct120cacgacctgt ccctggcctc cctgctgggc gccggcgccc tgcggcctcc tcctggctcc180cggcctgtgt cccagccttg ctgccggcct acccggtacg aggccgtgtc cttcatggac240gtgaactcca cctggcggac cgtggaccgg ctgtccgcca ccgcctgcgg ctgcctgggc300tga  303<210>61<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>合成SP-NBN104合成<400>61atgagctggg cctgggcggc ctgtccaccc tgtcccactg cccttggcct cggcggcagt 60gccctgtggc ctaccctggc cgccctggcc ctgctgtcct ccgtggccga ggccgccgcc120ggcgctcgag gctgccggct gcggtcccag ctggtgcctg tgcgggccct gggcctgggc180caccggtccg acgagctggt gcggttccgg ttctgctccg gctcctgccg gcgggcccgg240tcccctcacg acctgtccct ggcctccctg ctgggcgccg gcgccctgcg gcctcctcct300ggctcccggc ctgtgtccca gccttgctgc cggcctaccc ggtacgaggc cgtgtccttc360atggacgtga actccacctg gcggaccgtg gaccggctgt ccgccaccgc ctgcggctgc420ctgggc   426<210>62<211>142<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>合成SP-NBN104合成氨基酸序列
            
<400>62Met Ser Trp Ala Trp Ala Ala Cys Pro Pro Cys Pro Thr Ala Leu Gly1   5   10  15Leu Gly Gly Ser Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu Leu20  25  30Ser Ser Val Ala Glu Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg35  40  45Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp50  55  60Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg65  70  75  80Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu85  90  95Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro100 105 110Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg115  120  125Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>63<211>432<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>NBN信號肽-合成NBN104<400>63atggagctgg gcctgggcgg cctgtccacc ctgtcccact gcccttggcc tcggcggcag 60cctgccctgt ggcctaccct ggccgccctg gccctgctgt cctccgtggc cgaggccgcc120gccggcgctc gaggctgccg gctgcggtcc cagctggtgc ctgtgcgggc cctgggcctg180ggccaccggt ccgacgagct ggtgcggttc cggttctgct ccggctcctg ccggcgggcc240cggtcccctc acgacctgtc cctggcctcc ctgctgggcg ccggcgccct gcggcctcct300
            
cctggctccc ggcctgtgtc ccagccttgc tgccggccta cccggtacga ggccgtgtcc360ttcatggacg tgaactccac ctggcggacc gtggaccggc tgtccgccac cgcctgcggc420tgcctgggct ga432<210>64<211>143<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>NBN信號肽-NBN104合成序列<400>64Met Glu Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ser Thr Leu Ser His Cys Pro Trp1   5   10  15Pro Arg Arg Gln Pro Ala Leu Trp Pro Thr Leu Ala Ala Leu Ala Leu20  25  30Leu Ser Ser Val Ala Glu Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu35  40  45Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser50  55  60Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala65  70  75  80Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala85  90  95Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg100 105 110Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp115 120 125Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly130 135 140<210>65<211>369<212>DNA<213>人工序列
            
<220>
            
<223>白蛋白信號肽-NBN104合成<400>65atgaagtggg tgaccttcct gctgctgctg ttcatctccg gctccgcctt ctccgccgcc 60ggcgctcgag gctgccggct gcggtcccag ctggtgcctg tgcgggccct gggcctgggc120caccggtccg acgagctggt gcggttccgg ttctgctccg gctcctgccg gcgggcccgg180tcccctcacg acctgtccct ggcctccctg ctgggcgccg gcgccctgcg gcctcctcct240ggctcccggc ctgtgtccca gccttgctgc cggcctaccc ggtacgaggc cgtgtccttc300atggacgtga actccacctg gcggaccgtg gaccggctgt ccgccaccgc ctgcggctgc360ctgggctga369<210>66<211>122<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>白蛋白信號肽-NBN104合成序列<400>66Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Leu Leu Phe Ile Ser Gly Ser Ala1   5   10  15Phe Ser Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val20  25  30Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg35  40  45Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp50  55  60Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro65  70  75  80Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu85  90  95Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg100 105 110Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly
            
115 120<210>67<211>662<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>具有內含子的GHSP-NBN104合成序列<400>67atggctacag taagcgcccc taaaatccct ttgggcacaa tgtgtcctga ggggagaggc 60ggcgtcctgt agatgggacg ggggcactaa ccctcaggtt tggggcttat gaatgttagt120atcgccatct aagcccagta tttggccaat ctccgaatgt tcctggtccc tggagggagg180cagagagaga gagaaaaaaa aaaacccagc tcctggaaca gggagagcgc tggcctcttg240ctctccagct ccctctgttg ccctccggtt tctccccagg ctcccggacg tccctgctcc300tggcttttgg cctgctctgc ctgtcctggc ttcaagaggg cagtgccgcc gccggcgctc360gaggctgccg gctgcggtcc cagctggtgc ctgtgcgggc cctgggcctg ggccaccggt420ccgacgagct ggtgcggttc cggttctgct ccggctcctg ccggcgggcc cggtcccctc480acgacctgtc cctggcctcc ctgctgggcg ccggcgccct gcggcctcct cctggctccc540ggcctgtgtc ccagccttgc tgccggccta cccggtacga ggccgtgtcc ttcatggacg600tgaactccac ctggcggacc gtggaccggc tgtccgccac cgcctgcggc tgcctgggct660ga   662<210>68<211>130<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>GHSP-NBN104合成序列<400>68Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu1   5   10  15Cys Leu Ser Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly20  25  30Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly35  40  45
            
His Arg Ser Asp Glu Leu Val Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys50  55  60Arg Arg Ala Arg Ser Pro His Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly65  70  75  80Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro85  90  95Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn100 105 110Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys115 120 125Leu Gly130<210>69<211>372<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>修飾的白蛋白信號肽序列-NBN104合成序列<400>69atgaagtggg tgaccttcct gctgttcctg ctgttcatct ccggcgatgc cttcgctgcc 60gccggcgctc gaggctgccg gctgcggtcc cagctggtgc ctgtgcgggc cctgggcctg120ggccaccggt ccgacgagct ggtgcggttc cggttctgct ccggctcctg ccggcgggcc180cggtcccctc acgacctgtc cctggcctcc ctgctgggcg ccggcgccct gcggcctcct240cctggctccc ggcctgtgtc ccagccttgc tgccggccta cccggtacga ggccgtgtcc300ttcatggacg tgaactccac ctggcggacc gtggaccggc tgtccgccac cgcctgcggc360tgcctgggct ga372<210>70<211>123<212>PRT<213>人工序列<220>
            
<223>修飾的大鼠白蛋白信號肽-NBN104合成序列
            
<400>70Met Lys Trp Val Thr Phe Leu Leu Phe Leu Leu Phe Ile Ser Gly Asp15  10  15Ala Phe Ala Ala Ala Gly Ala Arg Gly Cys Arg Leu Arg Ser Gln Leu20  25  30Val Pro Val Arg Ala Leu Gly Leu Gly His Arg Ser Asp Glu Leu Val35  40  45Arg Phe Arg Phe Cys Ser Gly Ser Cys Arg Arg Ala Arg Ser Pro His50  55  60Asp Leu Ser Leu Ala Ser Leu Leu Gly Ala Gly Ala Leu Arg Pro Pro65  70  75  80Pro Gly Ser Arg Pro Val Ser Gln Pro Cys Cys Arg Pro Thr Arg Tyr85  90  95Glu Ala Val Ser Phe Met Asp Val Asn Ser Thr Trp Arg Thr Val Asp100 105 110Arg Leu Ser Ala Thr Ala Cys Gly Cys Leu Gly115 120<210>71<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>合成寡核苷酸<400>71aagcttgcta gcatgaattc atctcgaggc tgccggctgc ggtcccagct ggtgcctgtg60cgggccctgg gcctgggcca c  81<210>72<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>合成寡核苷酸<400>72
            
ttctgctccg gctcctgccg gcgggcccgg tcccctcacg acctgtccct ggcctccctg60ctgggcgccg gcgccctgcg g  81<210>73<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>合成寡核苷酸<400>73cagccttgct gccggcctac ccggtacgag gccgtgtcct tcatggacgt gaactccacc60tggcggaccg tggaccggct g  81<210>74<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>合成寡核苷酸<400>74ggcccgccgg caggagccgg agcagaaccg gaaccgcacc agctcgtcgg accggtggcc60caggcccagg gcccgcacag g  81<210>75<211>81<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>合成寡核苷酸<400>75gtaccgggta ggccggcagc aaggctggga cacaggccgg gagccaggag gaggccgcag60ggcgccggcg cccagcaggg a  81<210>76<211>78<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>合成寡核苷酸<400>76cttggaattg tcgacggatc ctcagcccag gcagccgcag gcggtggcgg acagccggtc60
            
cacggtccgc caggtgga  78<210>77<211>55<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>合成寡核苷酸<400>77aagcttagct agcggatcca tgaagtgggt gaccttcctg ctgctgctgt tcatc 55<210>78<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>合成寡核苷酸<400>78ggcagcctcg agcgccggcg gcggagaagg cggagccgga gatgaacagc agcagcagga60a61<210>79<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>合成寡核苷酸<400>79aagcttagct agcggatcca tggctacagg taagc   35<210>80<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>合成寡核苷酸<400>80aagcttagct agcggatcca tggagctggg cctgggcggc ctgtccaccc tgtc  54<210>81<211>55<212>DNA<213>人工序列
            
<220>
            
<223>合成寡核苷酸<400>81ggcggcagcc tgccctgtgg cctaccctgg ccgccctggc cctgctgtcc tccgt  55<210>82<211>492<212>DNA<213>人工序列<220>
            
<223>delta原人113核酸序列<400>82tataggatcc gccaccatgg aacttggact tggaggcctc tccacgctgt cccactgccc 60ctggcctagg cggcagcctg ccctgtggcc caccctggcc gctctggctc tgctgagcag120cgtcgcagag gccgctgggg gcccgggcag ccgcgctcgg gcagcggggg cgcggggctg180ccgcctgcgc tcgcagctgg tgccggtgcg cgcgctcggc ctgggccacc gctccgacga240gctggtgcgt ttccgcttct gcagcggctc ctgccgccgc gcgcgctctc cacacgacct300cagcctggcc agcctactgg gcgccggggc cctgcgaccg cccccgggct cccggcccgt360cagccagccc tgctgccgac ccacgcgcta cgaagcggtc tccttcatgg acgtcaacag420cacctggaga accgtggacc gcctctccgc caccgcctgc ggctgcctgg gctgagggct480cgctcgagta ta49權利要求
            
1.用于制備生物學活性神經胚素多肽的方法，該方法包括培養含有表達載體的細胞，該表達載體包含啟動子序列，所述啟動子序列可操作地連接于編碼信號肽和神經胚素多肽的核苷酸序列，其中所述的核苷酸序列不編碼神經胚素原-區。
            
2.權利要求1所述的方法，其中所述的信號肽是異源的信號肽。
            
3.權利要求1所述的方法，其中所述的信號肽是哺乳動物信號肽。
            
4.權利要求3所述的方法，其中所述信號肽為人信號肽、大鼠信號肽、小鼠信號肽、豬信號肽、猿信號肽、犬信號肽、貓信號肽、牛信號肽或者馬信號肽。
            
5.上述權利要求中任一項所述的方法，其中所述信號肽選自生長因子信號肽、激素信號肽、細胞因子信號肽和免疫球蛋白信號肽組成的組。
            
6.權利要求5所述的方法，其中所述信號肽選自TGFβ信號肽、GDF信號肽、IGF信號肽、BMP信號肽、神經營養因子信號肽、PDGF信號肽和EGF信號肽組成的組。
            
7.權利要求5所述的方法，其中所述信號肽選自激素信號肽，所述激素選自生長激素、胰島素、ADH、LH、FSH、ACTH、MSH、TSH、T3、T4、和DHEA組成的組。
            
8.權利要求5所述的方法，其中所述信號肽為白細胞介素信號肽。
            
9.權利要求5所述的方法，其中所述信號肽選自neurturin信號肽、GDNF信號肽、persephin信號肽和NGF信號肽組成的組。
            
10.權利要求1所述的方法，其中所述信號肽選自白蛋白信號肽、經修飾的白蛋白信號肽和生長激素信號肽組成的組。
            
11.權利要求10所述的方法，其中所述信號肽選自大鼠白蛋白信號肽、經修飾的大鼠白蛋白信號肽和人生長激素信號肽組成的組，諸如大鼠白蛋白信號肽和人生長激素信號肽。
            
12.上述權利要求中任一項所述的方法，其中所述信號肽是合成的信號肽，諸如包含SEQ ID NO70的信號肽。
            
13.權利要求1所述的方法，其中所述信號肽為免疫球蛋白信號肽。
            
14.權利要求13所述的方法，其中所述的信號肽選自小鼠IgSP(SEQID NO 4)、大鼠IgSP(SEQ ID NO 6)、豬IgSP(SEQ ID NO 5)、猿IgSP(SEQ ID NO 2或3)、人IgSP(SEQ ID NO 1)組成的組。
            
15.權利要求13所述的方法，其中所述的IgSP是小鼠IgSP(SEQ IDNO 4)。
            
16.權利要求13所述的方法，其中所述的IgSP是人IgSP(SEQ ID NO1)。
            
17.權利要求1所述的方法，其中所述的信號肽是天然的神經胚素信號肽。
            
18.權利要求17所述的方法，其中所述的信號肽是天然的人神經胚素信號肽。
            
19.上述權利要求中任一項所述的方法，其中所述的神經胚素多肽選自成熟的NBN、N-末端截短的NBN、突變的NBN或者突變且N-截短的NBN，所述成熟NBN選自具有以下序列的神經胚素SEQ ID No 10的1-140位氨基酸，或SEQ ID No 11或12的1-144位氨基酸，SEQ ID NO 13、14、15、16、17或18所示序列。
            
20.權利要求19所述的方法，其中所述的神經胚素多肽為成熟的NBN，所述成熟NBN選自具有SEQ ID No 13，14，15，16，16，17或18所示序列的神經胚素組成的組。
            
21.權利要求20所述的方法，其中所述的神經胚素多肽為人成熟113NBN(SEQ ID No 14)。
            
22.上述權利要求1-19中任一項所述的方法，其中所述的神經胚素多肽選自以下序列組成的組人神經胚素的116個C-末端氨基酸、人神經胚素的115個C-末端氨基酸、人神經胚素的114個C-末端氨基酸、人神經胚素的113個C-末端氨基酸、人神經胚素的112個C-末端氨基酸、人神經胚素的111個C-末端氨基酸、人神經胚素的109個C-末端氨基酸、人神經胚素的108個C-末端氨基酸、人神經胚素的107個C-末端氨基酸、人神經胚素的106個C-末端氨基酸、人神經胚素的105個C-末端氨基酸、人神經胚素的104個C-末端氨基酸、人神經胚素的103個C-末端氨基酸、人神經胚素的102個C-末端氨基酸、人神經胚素的101個C-末端氨基酸、人神經胚素的100個C-末端氨基酸和人神經胚素的99個C-末端氨基酸。
            
23.權利要求1所述的方法，其中所述的神經胚素多肽選自含SEQ IDNO 10的106、104、102或99個C-末端氨基酸的N-末端截短的神經胚素組成的組。
            
24.權利要求1所述的方法，其中所述的神經胚素多肽選自人神經胚素的116個C-末端氨基酸、人神經胚素的113個C-末端氨基酸、人神經胚素的104個C-末端氨基酸、人神經胚素的116個C-末端氨基酸組成的組。
            
25.權利要求1所述的方法，其中所述N-末端截短的神經胚素具有SEQ ID No 19所示的氨基酸序列。
            
26.權利要求1所述的方法，其中所述N-末端截短的神經胚素包含SEQ ID NO 20所示的99個氨基酸。
            
27.權利要求1所述的方法，其中所述的神經胚素多肽包含源自SEQID No14的8-113位氨基酸的氨基酸序列，其中所述的變體神經胚素多肽包含一個或多個選自下組的氨基酸取代位于該變體多肽氨基酸序列中第14位的除精氨酸以外的氨基酸，位于該變體多肽氨基酸序列中第39位的除精氨酸以外的氨基酸，位于該變體多肽氨基酸序列中第68位的除精氨酸以外的氨基酸，和位于該變體多肽氨基酸序列中第95位的除天冬酰胺以外的氨基酸，其中所述的氨基酸位置根據多肽序列SEQ ID NO14進行編號。
            
28.權利要求27所述的方法，其中在第14、39或68位上的取代為賴氨酸。
            
29.上述權利要求中任一項所述的方法，其中所述載體是質粒。
            
30.上述權利要求1-28中任一項所述的方法，其中所述載體是病毒載體。
            
31.上述權利要求中任一項所述的方法，其中所述載體是哺乳動物表達載體。
            
32.權利要求30所述的方法，其中所述的載體是復制缺陷型慢病毒顆粒。
            
33.權利要求32所述的方法，其中所述載體顆粒由慢病毒載體產生，所述慢病毒載體含有5’慢病毒LTR、tRNA結合位點、包裝信號、可操作地連接于編碼所述信號肽和所述神經胚素肽的多核苷酸信號的啟動子、第二鏈DNA合成起點和3’慢病毒LTR。
            
34.權利要求30所述的方法，其中所述載體選自反轉錄病毒，諸如HIV，SIV，FIV，EIAV，AAV，腺病毒，皰疹病毒，和MoMLV組成的組。
            
35.上述權利要求中任一項所述的方法，其中所述的啟動子選自泛醌啟動子，CMV啟動子，JeT啟動子，SV40啟動子，和延伸因子1α啟動子(EF1-α)，小雞β-肌動蛋白，PGK，和MT-1組成的組。
            
36.權利要求34所述的方法，其中所述的啟動子為可誘導/可抑制型啟動子，諸如Tet-On、Tet-Off、雷帕霉素-可誘導型啟動子、Mx1和RU486。
            
37.上述權利要求中任一項所述的方法，其中所述細胞是哺乳動物宿主細胞。
            
38.權利要求37所述的方法，其中所述的哺乳動物選自嚙齒類動物、兔、犬、貓、豬、猴、人組成的組。
            
39.權利要求37所述的方法，其中所述的細胞選自CHO，HEK293，COS，PC12，HiB5，RN33b，神經元細胞，胚胎細胞，ARPE-19，永生化的成纖維細胞，C2C12，HeLa，HepG2，視網膜色素上皮細胞(RPE)細胞，紋狀體細胞，神經元，星形細胞，中間神經元組成的組。
            
40.權利要求39所述的方法，其中所述的細胞為CHO細胞。
            
41.包含編碼信號肽和神經胚素多肽的多核苷酸序列的核酸，其中所述的多核苷酸序列不編碼神經胚素原-區，其中所述信號肽和所述神經胚素肽如權利要求1-40中任一項所限定。
            
42.權利要求41所述的核酸，其中包含a)SEQ ID NO64，66，或68所示的核苷酸序列，或者b)編碼SEQ ID NO65，67，或69所示多肽的核苷酸序列。
            
43.權利要求41或42所述的核酸，其中所述的核苷酸序列已經被優化用以在哺乳動物中表達。
            
44.含有權利要求41-43中任一項所述核酸的表達載體。
            
45.藥物組合物，其中含有權利要求44所述載體以及一種或多種藥物學可接受的佐劑、賦形劑、載體和/或稀釋劑。
            
46.由權利要求44所述載體轉導或轉染的分離的宿主細胞。
            
47.權利要求46所述的細胞，其中所述的細胞是哺乳動物細胞。
            
48.權利要求47所述的哺乳動物細胞，其中所述細胞能夠分泌超過500ng/106個細胞/24小時的量的神經胚素或其功能對等物。
            
49.權利要求47所述的哺乳動物細胞，其選自CHO，HEK293，COS，PC12，HiB5，RN33b，永生化的成纖維細胞，C2C12，HeLa，HepG2，RPE細胞系，和ARPE-19細胞組成的組。
            
50.權利要求48所述的哺乳動物細胞，選自CHO，HEK293，COS，和ARPE-19組成的組。
            
51.權利要求47所述的哺乳動物細胞，選自RPE細胞，神經元細胞，神經元前體細胞，干細胞，和胚胎細胞組成的組。
            
52.權利要求47所述的細胞，其能結合于支持基質。
            
53.能夠產生感染性載體顆粒的包裝細胞系，其中所述的載體顆粒含有源自反轉錄病毒的基因組，該基因組包含5’反轉錄病毒LTR、tRNA結合位點、包裝信號、可操作地連接于編碼信號肽和神經胚素多肽的多核苷酸序列的啟動子、第二鏈DNA合成起點以及3’反轉錄病毒LTR，其中所述的核苷酸序列不編碼神經胚素原-區，且所述信號肽和神經胚素肽如權利要求1-40中任一項所限定。
            
54.權利要求53所述的包裝細胞系，其中所述的載體顆粒是復制缺陷型的。
            
55.權利要求53所述的包裝細胞系，其中所述的基因組是慢病毒來源的，所述的LTR是慢病毒LTR。
            
56.轉基因非人哺乳動物，其中含有至少一個由權利要求44所述載體轉導或轉染的細胞。
            
57.權利要求56所述的哺乳動物，其中所述的至少一個經轉導或者轉染的細胞含有所述哺乳動物的基因組。
            
58.可植入的細胞培養裝置，該裝置包括i.容許生長因子擴散通過的半透膜；和ii.至少一個權利要求46所述的分離的宿主細胞。
            
59.權利要求56所述的裝置，其中所述半透膜是免疫隔離的。
            
60.權利要求56所述的裝置，其中所述半透膜是多微孔的。
            
61.權利要求56所述的裝置，其中所述裝置進一步還包括置于所述半透膜內的基質。
            
62.權利要求56所述的裝置，其中所述裝置進一步還包括束縛性錨定物(tether anchor)。
            
63.權利要求44所述載體或權利要求56-60中任一項所述裝置作為藥物的用途。
            
64.權利要求44所述載體在制備用于治療神經系統疾病的藥物中的用途。
            
65.權利要求64所述的用途，其中所述神經系統疾病選自周圍神經病，包括神經病性疼痛，脊髓損傷，脊神經根性撕脫傷，三叉神經痛和灼痛組成的組。
            
66.權利要求63所述的用途，其中所述的藥物用于治療眼部疾病，所述眼部疾病，諸如角膜損傷和潰瘍，以及視網膜病變。
            
67.權利要求44所述載體在制備用于治療CNS疾病的藥物中的用途。
            
68.權利要求67所述的用途，其中所述的CNS疾病是神經變性疾病。
            
69.權利要求64所述的用途，其中所述神經變性疾病是外周神經病，包括神經病性疼痛。
            
70.一種治療神經系統疾病的方法，該方法包括向需要的個體施用i.治療有效量的權利要求44所述的載體；或者ii.治療有效量的權利要求45所述的藥物組合物。
            
71.權利要求70所述的方法，其中所述載體經肌內、皮下、或腹腔內施用。
            
72.權利要求70所述的方法，其中所述載體或組合物施用至參與痛覺傳輸的身體區域。
            
73.權利要求70所述的方法，其中所述載體或組合物經鞘內施用或者施用至脊髓。
            
74.權利要求70所述的方法，其中所述載體施用至腦，包括實質和腦室。
            
75.權利要求70所述的方法，其中所述載體施用入眼，包括玻璃體，視網膜下隙，和支持包囊(sub-tenar capsule)。
            
76.權利要求70所述的方法，其中所述神經系統疾病選自外周神經病，包括神經病性疼痛，脊髓損傷，脊神經根性撕脫傷，三叉神經痛，灼痛，角膜損傷，和視網膜病變組成的組。
            
77.治療神經系統疾病的方法，該方法包括向需要的個體移植治療有效量的權利要求46所述細胞。
            
78.權利要求77所述的方法，其中所述移植包括自體移植、同種異體移植或異種移植。
            
79.權利要求77所述的方法，其中所述細胞經鞘內施用或者施用至脊髓。
            
80.權利要求77所述的方法，其中所述細胞施用至腦，包括實質和腦室。
            
81.權利要求77所述的方法，其中將所述細胞施用至眼內，包括玻璃體，視網膜下隙，和支持包囊。
            
82.權利要求77所述的方法，其中所述神經系統疾病選自外周神經病，包括神經病性疼痛，脊髓損傷，脊神經根性撕脫傷，三叉神經痛，灼痛，角膜損傷，和視網膜病變組成的組。
            
83.一種治療神經系統疾病的方法，該方法包括向需要的個體移植權利要求56所述的可植入裝置。
            
84.權利要求77所述的方法，其中所述移植包括自體移植、同種異體移植或異種移植。
            
85.權利要求83所述的方法，其中所述裝置經鞘內植入或者植入至脊髓。
            
86.權利要求83所述的方法，其中所述裝置經植入施用于腦，包括實質和腦室。
            
87.權利要求83所述的方法，其中所述裝置經植入施用于眼，包括玻璃體，視網膜下隙，和支持包囊。
            
88.權利要求83所述的方法，其中所述神經系統疾病選自外周神經病，包括神經病性疼痛，脊髓損傷，脊神經根性撕脫傷，三叉神經痛，灼痛，角膜損傷，和視網膜病變組成的組。
            
89.上述權利要求72-80中任一項所述的方法，用于治療神經病性疼痛，該方法包括向需要的個體給予治療有效量的權利要求44所述的載體，或權利要求46-50中任一項所述的細胞的組合物，或權利要求56所述的細胞裝置。
            
90.神經胚素肽，包含信號肽和神經胚素肽，其中所述多肽缺乏神經胚素原-區。
            
91.權利要求90所述的多肽，其中所述神經胚素肽融合于所述信號肽。
            
92.權利要求91所述的多肽，所述信號肽的C-末端通過肽鍵與所述神經胚素肽的N-末端相連接。
            
93.上述權利要求90-92中任一項所述的多肽，其中所述的信號肽是異源信號肽。
            
94.上述權利要求90-93中任一項所述的多肽，其中所述的信號肽如權利要求1-40之一所定義。
            
95.權利要求94所述的多肽，其中所述信號肽選自以下信號肽組成的組天然大鼠白蛋白信號肽，經修飾的大鼠白蛋白信號肽，和人生長激素信號肽。
            
96.上述權利要求90-94中任一項所述的多肽，其中所述的信號肽是神經胚素信號肽。
            
97.上述權利要求90-94中任一項所述的多肽，其中所述的信號肽是IgSP。
            
全文摘要
            
本發明涉及用于制備神經胚素多肽以及通過基因治療將神經胚素局部遞送至神經系統特定區域的方法和組合物，所述神經系統包括例如中樞神經系統和眼。所述的生物活性神經胚素多肽是由不編碼天然神經胚素原－區的構建體制備的，所述構建體包含一種核酸，該核酸含有可操作連接于編碼信號肽和神經胚素多肽的核苷酸序列的啟動子，其中所述核苷酸序列不編碼神經胚素原－區。
            
文檔編號A61P25/28GK1835971SQ200480022946 
            
公開日2006年9月20日 申請日期2004年6月10日 優先權日2003年6月10日
            
發明者拉斯·U·沃爾伯格, 梅特·格朗伯格, 菲利普·庫斯克, 詹斯·托諾埃, 內爾斯·E·佩德森, 威廉·P·西斯克 申請人:Ns基因公司, 比奧根艾迪克Ma公司
            


                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
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