新的聚(乙二醇)修飾的化合物及其用途的制作方法

專利名稱：新的聚(乙二醇)修飾的化合物及其用途的制作方法
1.相關申請的交叉參考本申請根據35U.S.C§119(e)要求2003年5月12日提交的共同待決的美國臨時專利申請序號60/470,246的優先權。將該優先權申請的內容完整并入本公開作為參考。
1.發明領域本發明涉及用聚(乙二醇)或者“PEG”修飾基于肽的化合物。具體地，本發明涉及用PEG，優選20到60K道爾頓的線性PEG部分修飾的肽單體、二聚體和寡聚體。此外，本發明涉及使用此類PEG修飾的化合物的新的治療方法。
2.發明背景近年來，隨著蛋白質研究的發展，已經發現了具有多種作用的許多肽。隨著基因重組技術和肽的有機合成方法的發展，已經可能大量得到這些生理學活性肽和它們的結構上類似的化合物。許多具有特定活性的這些肽非常適宜用作藥物。
這些肽的實例包括結合紅細胞生成素(EPO)受體(EPO-R)的肽。EPO是具有165個氨基酸的糖蛋白激素，在24、38、83和126位氨基酸上具有糖基化位點，其分子量為約34,000。EPO刺激有絲分裂和紅細胞前體細胞的分化，從而確保產生紅細胞。EPO在血紅細胞形成過程中是關鍵的，該激素潛在可用于診斷和治療特征是低或者缺陷紅細胞產生的血液疾病。已經發現了與EPO-R相互作用的許多肽(見，例如，Wrighton等人的美國專利號5,773,569；和Wrighton等人的美國專利號5,830,851；Smith-Swintosky等人的WO01/91780)。
然而，肽的清除通常非常快，當施用于循環系統時尤其如此。因此，希望提高這些肽的耐久性。此外，當肽從動物的不同物種得到，通過肽蛋白質工程化設計，和/或具有與宿主的肽不同的結構時，由于抗體的產生，存在導致嚴重癥狀的危險。因此，希望還提高此類肽的抗原性。為了使用這些肽作為藥物，必須提高抗原性和耐久性。
用諸如聚(乙二醇)的大分子化合物對肽化學修飾已經表明可有效提高多種肽的抗原性和耐久性。從而，聚(乙二醇)和聚(乙二醇)衍生物已經廣泛用作肽修飾的大分子試劑。
聚(乙二醇)的最常見的形式具有下面的結構HO-(CH2CH2O)nCH2CH2-OH上面的聚合物α-、ω-二羥基聚(乙二醇)可以以簡單形式表示為HO-PEG-OH，其中可以理解-PEG-符號代表下面的結構單位-CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-不被任何具體理論或者作用機理所限制，認為長的鏈樣PEG分子或者部分當在水性介質中時被高度水合并且處于快速運動中。認為該快速運動導致PEG占據(sweep out)大體積并且防止其他分子的接近和干擾。結果，當連接到另一化學實體(如肽)時，PEG聚合物鏈可以保護此類化學實體免于免疫應答和其他清除機制。結果，PEG化通過優化藥物動力學、增加生物利用率，和減小免疫原性和給藥頻率提高了藥物功效和安全性。
例如，PEG的一些活性衍生物已經連接到蛋白質和酶，得到了有益結果。PEG在有機溶劑中是可溶的。連接到酶的PEG可以導致PEG-酶綴合物，其在有機溶劑中是可溶和有活性的。PEG連接到蛋白質與未經修飾的蛋白質相比可以減小PEG-蛋白質綴合物的免疫原性和腎臟清除速率，這導致綴合物的血液循環壽命顯著增加。
例如，已經報導PEG共價連接到治療性蛋白質延長了它們的體內半壽期，和/或減小了它們的免疫原性和抗原性，所述治療性蛋白質為例如白介素(Knauf，M.J.等人，J.Biol.Chem.1988，263，15，064；Tsutsumi，Y.等人，J.Controlled Release 1995，33，447)、干擾素(Kita，Y.等人，Drug Des.Delivery 1990，6，157)、過氧化氫酶(Abuchowski，A.等人，J.Biol.Chem.1977，252，3，582)、超氧化物歧化酶(Beauchamp，C.O.等人，Anal.Biochem.1983，131，25)，和腺苷脫氨酶(Chen，R.等人，Biochim.Biophy.Acta1981，660，293)。
此外，連接到表面的PEG可以減小蛋白質和細胞對表面的吸附并改變表面的電性質。類似地，連接到脂質體的PEG可以導致這些顆粒的血液循環壽命的極大增加，從而可能增加它們用于藥物遞送的實用性(J.M。Harris，編者，″Biomedical and Biotechnical Applications of PolyethyleneGlycol Chemistry，″Plenum，New York，1992)。
Johnson等人的美國專利5,767,078公開了可以結合EPO-R的肽單體的二聚化。二聚化是基于單體的共價連接。PEG是形成二聚體的優選連接體。特別用于此文的PEG具有僅3400或5000的分子量。
Smith-Swintosky等人的WO01/91780公開了肽的二聚體和多聚體，它們顯示出對生長因子型受體的結合和信號起始。所公開的連接體是聚乙二醇。然而，該參考文獻沒有提供選擇適宜大小或者類別(例如，線性)PEG的指導。
Wei等人的美國專利6,077,939公開了基本上由多肽和通過腙或者還原的腙鍵，或者肟或者還原肟鍵共價結合所述多肽的N-末端α-碳原子的水溶性聚合物組成的組合物。所述水溶性聚合物的分子量范圍為200到200K道爾頓。公開PEG作為水溶性聚合物的實例。PEG的分子量為僅700到20K道爾頓，并且據說優選僅5K道爾頓的PEG部分。
Balu等人的WO 01/38342公開了通過C1-12連接部分連接兩個肽鏈形成的二聚體。該文獻指出二聚體的N-末端可以PEG化。然而，該出版物沒有指出所用PEG的分子量或者指出PEG是線性還是分枝的。
Saifer等人(Adv.Exp.Med.Biol.(1994)，366377-87)描述了牛和重組人Cu，Zn超氧化物歧化酶(SOD)的PEG化加合物，其中1-9條鏈的高分子量(35K-120K道爾頓)PEG偶聯到SOD。Somack等人(Free Rad.Res.Comms.(1991)，12-13553-562)描述了含有1到4條鏈的高分子量(41K-72K道爾頓)PEG的SOD加合物。這兩篇參考文獻都沒有教導用PEG修飾肽。而且，認為用于這些化合物中的PEG部分是分枝的，與線性PEG相反。
盡管在PEG修飾的基于肽的化合物領域中取得了進步，但是仍然需要具有提高的抗原性和耐久性的新的PEG修飾的化合物。
本章節和整個說明書中的引用和/或對參考文獻的討論不應該被認為是承認這些參考文獻是本發明的現有技術。
發明概述本發明涉及基于肽的化合物，其包含肽部分和聚(乙二醇)部分，其中聚(乙二醇)部分是線性的并且具有20K道爾頓以上的分子量。
優選地，聚(乙二醇)部分具有約20到60K道爾頓的分子量。更優選地，聚(乙二醇)部分具有約20到40K道爾頓的分子量。最優選地，PEG具有約20K道爾頓的分子量。
優選地，聚(乙二醇)部分具有小于1.20，更優選小于1.1，最優選小于1.05的多分散值(Mw/Mn)。
優選地，肽部分是二聚體的并且包含通過連接體部分連接的兩個單體肽。此外，此類二聚體和其他多聚體可以是異二聚體或異多聚體。
在一個實施方案中，肽部分選自結合紅細胞生成素的肽。此類EPO-R結合肽的非限制性實例包括在公開的國際申請PCT/US00/32224(公開號WO01/38342A2)，PCT/US96/09810(公開號WO96/40749)和PCT/US01/16654(公開號WO01/91780Al)；和美國專利5,767,078、5,773,569、5,830,851、5,986,047中的那些。可以用作本發明肽部分的其他代表性EPO-R結合肽在2003年5月12日提交的美國臨時申請序號60/479,245中描述。可以用作本發明肽部分的其他代表性EPO-R結合肽在2003年5月12日提交的美國臨時申請序號60/469,993中描述。可以用作本發明肽部分的其他代表性EPO-R結合肽在2003年5月12日提交的美國臨時申請序號60/470,244中描述。
在另一實施方案中，肽部分選自結合血小板生成素受體(“TPO-R”)的肽。此類TPO-R結合肽的非限制性實例包括公開于美國專利6,552,008、6,506,362、6,498,155、6,465,430、6,333,031、6,251,864、6,121,238、6,083,913、5,932,546、5,869,451、5,683,983、5,677,280、5,668,110，和5,654,276和公開的美國專利申請2003/0083361、2003/0009018、2002/0177166和2002/0160013中公開的那些。
優選地，此類基于肽的化合物還包含肽部分和聚(乙二醇)部分之間的間隔臂部分。更優選地，間隔臂部分具有結構-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-其中α、β、γ、δ和ε每個都是整數，它們的值獨立地選擇。這種間隔臂部分在2003年5月12日申請的標題為“Novel Spacer Moiety For Poly(ethylene Glycol)Modified Peptide-base Compounds”的美國臨時專利申請序號60/469,996中詳細描述。
在優選實施方案中，α為整數，1≤α≤6；β為整數，1≤β≤6；ε為整數，1≤ε≤6；δ為0或1；γ為整數，0≤γ≤10；Y為NH或CO。
在某些優選實施方案中，當γ＞1時β＝2。
在一個尤其優選的實施方案中，α＝β＝ε＝2；γ＝δ＝1；Y為NH。
在其他實施方案中，γ＝δ＝0；
2≤α+ε≤5；Y為CO。
在某些其他實施方案中，γ＝δ＝0；α+ε＝5；Y為CO。
本發明還涉及包含一種或多種上述基于肽的化合物的藥物組合物。
發明詳述定義肽中氨基酸殘基如下簡寫苯丙氨酸為Phe或F；亮氨酸為Leu或L；異亮氨酸為Ile或I；甲硫氨酸為Met或M；纈氨酸為Val或V；絲氨酸為Ser或S；脯氨酸為Pro或P；蘇氨酸為Thr或T；丙氨酸為Ala或A；酪氨酸為Tyr或Y；組氨酸為His或H；谷氨酰胺為Gln或Q；天冬酰胺為Asn或N；賴氨酸為Lys或K；天冬氨酸為Asp或D；谷氨酸為Glu或E；半胱氨酸為Cys或C；色氨酸為Trp或W；精氨酸為Arg或R；甘氨酸為Gly或G。肽中非常規氨基酸縮寫如下1-萘基丙氨酸為1-nal或者Np；2-萘基丙氨酸為2-nal；N-甲基甘氨酸(也稱作肌氨酸)為MeG或Sc；乙酰化甘氨酸(N-乙酰基甘氨酸)為AcG，高絲氨酸甲酯為Hsm。
“肽”或者“多肽”指通過酰胺鍵連接在一起的α氨基酸的氨基酸單體的聚合物。肽長為兩個或通常更多個氨基酸單體。通常，當用于本領域和本發明的上下文中時，術語“肽”指長僅為幾個氨基酸殘基的多肽。具體地，本發明的肽優選長度不超過約50個氨基酸殘基，更優選長度為約5到40個氨基酸殘基，甚至更優選長度為約17到40個氨基酸殘基。相比，多肽可以包含任意數目的氨基酸殘基。所以，多肽包括肽以及更長的氨基酸序列，如蛋白質，其可以長數百個氨基酸殘基。
用于本發明的肽可以是更長多肽序列的部分或者“衍生自”更長多肽序列，如蛋白質的序列。
如文中所用的短語“藥學上可接受的”指“通常認為安全”，即當施用于人時為生理上可耐受的并且通常不產生過敏或者類似的不良反應，如胃不適、眩暈等等的分子實體和組合物。優選地，如本文所用的術語“藥學上可接受的”指得到聯邦或者州政府管理機構的批準或者美國藥典或者其他公知的藥典中所列用于動物，更尤其用于人。術語“載體”指與化合物一起施用的稀釋劑、佐劑、賦形劑或者運載體。此類藥物載體可以是無菌液體，如水和油，包括石油、動物、植物或者合成來源的油，如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油等等。水或者水性溶液鹽水溶液和水性右旋糖和甘油溶液優選用作載體，尤其用于可注射溶液。適宜的藥物載體在E.W.Martin的“Remington′s Pharmaceutical Sciences”中描述。
如本文所用的術語“激動劑”指生物活性配體，其結合其互補生物活性受體并活化該受體而導致該受體中生物應答或者增強所述受體的現有生物活性。
PEG部分用于本發明的PEG部分是線性的并且具有20K道爾頓或更大的分子量。優選地，PEG具有約20到60K道爾頓的分子量。更優選地，PEG具有約20到40K道爾頓的分子量。最優選地，PEG具有20K道爾頓的分子量。
PEG部分通過直接連接到肽部分、連接到連接體部分或者間隔臂部分而連接到本發明的化合物。在一個實施方案中，PEG部分連接到肽單體或者二聚體的至少一個末端(N-末端或者C-末端)例如，肽二聚體的每個N末端可以具有一個連接的PEG部分(共兩個PEG部分)。在一個實施方案中，PEG可以作為連接體，其二聚化兩個肽單體例如，一個PEG部分可以同時連接到肽二聚體的兩個N末端。在另一實施方案中，PEG連接到肽單體或者二聚體的間隔臂部分。在優選實施方案中，PEG連接到肽二聚體的連接體部分。在非常優選的實施方案中，PEG連接到間隔臂部分，其中所述間隔臂部分連接到肽二聚體的連接體LK部分。最優選地，PEG連接到間隔臂部分，其中所述間隔臂部分通過賴氨酸連接體的羰基碳或者賴氨酸酰胺連接體的酰胺氮連接到肽二聚體。
本發明的基于肽的化合物可以包含多個PEG部分(例如，2、3、4或更多)。在某些實施方案中，PEG部分包含兩條線性單體PEG鏈。優選地，兩條線性PEG鏈通過賴氨酸殘基或者賴氨酸酰胺(賴氨酸殘基，其中羧基已經被轉化成酰胺部分-CONH2)連接在一起。更優選地，兩條PEG鏈連接到賴氨酸的α和ε氫基，而羧基活化為羥基琥珀酰亞胺酯用于結合到間隔臂部分。例如，當賴氨酸酰胺連接兩條單體PEG鏈時，二聚體可以在結構上如式I闡明，并且如式II所概述式I 式II 在式I中，N2代表賴氨酸的ε氨基的氮原子，N1代表賴氨酸的α氨基的氮原子。在優選實施方案中，兩個肽單體的C-末端賴氨酸為L-賴氨酸。在備選實施方案中，一個或多個賴氨酸殘基可以是D-賴氨酸。
當化合物包含一個以上PEG部分時，多個PEG部分可以是相同或不同的化學部分(例如，不同分子量的PEG)。在一些情況中，PEG化的程度(連接到肽的PEG部分數和/或PEG所連接的肽的總數)可以受到PEG化反應中PEG分子與肽分子比例的影響，以及總濃度的影響(如果反應混合物中存在PEG分子和肽分子)。通常，最佳PEG對肽的比例(按照不提供過量未反應的肽和/或PEG的反應效率)將由如下因素決定，這些因素為諸如PEG化的所希望的程度(例如，單、二-、三-等等)、所選聚合物的分子量、聚合物是分枝的還是未分枝的，和具體連接方法的反應條件。
本領域技術人員可以利用多種PEG連接方法[見，例如，Goodson，等人(1990)Bio/Technology 8343(PEGylation of interleukin-2 at itsglycosylation site after site-directed mutagenesis)；EP 0 401 384(couplingPEG to G-CSF)；Malik，等人，1992)Exp.Hematol.201028-1035(PEGylation of GM-CSF using tresyl chloride)；PCT公開號WO90/12874(PEGylation of erythropoietin containing a recombinantly introducedcysteine residue using a cysteine-specific mPEG derivative)；美國專利號5,757,078(PEGylation of EPO peptides)；美國專利號5,612,460(ActiveCarbonates of Polyalkylene Oxides for Modification of Polypeptides)；美國專利號5,672,662(Poly(ethylene glycol)and related polymersmonosubstituted with propionic or butanoic acids and functionalderivatives thereof for biotechnical applications)；美國專利號6,077,939(PEGylation of an N-terminal α-carbon of a peptide)；Veronese等人，1985)Appl.Biochem.Bioechnol 11141-142(PEGylation of anN-terminalα-carbon of a peptide with PEG-nitrophenylcarbonate(″PEG-NPC″)or EG-trichlorophenylcarbonate)；和Veronese(2001)Biomaterials 22405-417(Review article on peptide and proteinPEGylation)(關于肽和蛋白質PEG化的綜述文章)]。
例如，PEG可以通過反應基共價結合氨基酸殘基。反應基為活化的PEG分子可以結合的基團(例如，游離氨基或羧基)。例如，N-末端氨基酸殘基和賴氨酸(K)殘基具有游離氨基；C-末端氨基酸具有游離羧基。巰基(例如，半胱氨酸殘基中存在的)也可以用作連接PEG的反應基。此外，已經描述了用于特別在多肽的C-末端特異引入活化基團(例如，酰肼、醛和芳香族氨基)的酶輔助方法[Schwarz，等人(1990)Methods Enzymol.184160；Rose，等人(1991)Bioconjugate Chem.2154；Gaertner，等人(1994)J.Biol.Chem.2697224]。
例如，使用具有不同反應部分的甲氧基化PEG(“mPEG”)可以將PEG分子連接到氨基。此類反應部分的非限制性實例包括琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(SS)、琥珀酰亞胺基碳酸酯(SC)、mPEG-亞胺酯、琥珀酰亞胺基丙酸酯(SPA)和氰尿酰氯。具有反應部分的此類mPEGs的非限制性實例包括mPEG-琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(mPEG-SS)、mPEG2-琥珀酰亞胺基琥珀酸酯(mPEG2-SS)、mPEG-琥珀酰亞胺基碳酸酯(mPEG-SC)、mPEG-亞胺酯、mPEG-對-硝基苯基碳酸酯(mPEG-NPC)、mPEG-琥珀酰亞胺基丙酸酯(mPEG-SPA)、和mPEG-氰尿酰氯。
當PEG的連接不是特異的并且希望包含特異PEG連接的肽時，可以從PEG化化合物的混合物純化所希望的PEG化化合物。例如，如果希望N-末端PEG化的肽，那么可以從隨機PEG化肽群體純化N-末端PEG化形式(即，從其他單PEG化部分分離該部分)。
在優選實施方案中，PEG位點特異地連接到肽。通過固相合成已經進行了在生長激素釋放因子的有效類似物的N-末端、側鏈和C-末端的位點特異PEG化[Felix，等人(1995)Int.J.Peptide Protein Res.46253]。另一種位點特異方法包括通過N-末端蘇氨酸的高碘酸鈉氧化產生的N-末端的反應性醛基以位點特異的方式將肽連接到脂質體表面嫁接的PEG鏈的末端[Zalipsky，等人(1995)Bioconj.Chem.6705]。然而，該方法局限于具有N-末端絲氨酸或蘇氨酸殘基的多肽。
在一個方法中，通過還原性烷基化可以實現選擇性N-末端PEG化，還原性烷基化利用特定蛋白質中可用于衍生的伯氨基(賴氨酸對N-末端)的不同類型的差別反應性。在適宜的反應條件下，包含羰基的PEG選擇性連接到肽的N-末端。例如，通過在一定pH下進行反應可以選擇性N-末端PEG化蛋白質，所述反應利用賴氨酸殘基的ε-氨基和肽的N-末端殘基的α-氨基之間的pKa不同。通過這種選擇性連接，主要在蛋白質的N-末端發生PEG化，而不明顯修飾其他反應基(例如，賴氨酸側鏈氨基)。使用還原性烷基化，PEG應該具有用于偶聯蛋白質的一種反應性醛(例如，可以使用PEG丙醛)。
位點特異誘變是可以用于制備用于位點特異聚合物連接的肽的另一種方法。通過該方法，肽的氨基酸序列設計成在肽內的希望的位置上摻入適宜的反應基。例如，WO 90/12874描述了通過插入半胱氨酸殘基或者用半胱氨酸殘基替換其他殘基修飾的蛋白質的位點定向PEG化。該公開還描述通過將半胱氨酸特異的mPEG衍生物與EPO上重組導入的半胱氨酸殘基反應制備mPEG-紅細胞生成素(“mPEG-EPO”)。
當PEG部分連接到間隔臂部分或者連接體部分時，可以使用類似的連接方法。在該情況中，間隔臂或者連接體含有反應基并且含有適宜的補充反應基的活化的PEG分子用于實現共價連接。在優選實施方案中，連接體或者間隔臂反應基是末端反應基(即，位于連接體或者間隔臂的末端)。
使用將水溶性聚合物連接到分子的受體結合部分(例如，肽+間隔臂)的多種化學方法的任意一種可以將本發明的肽、肽二聚體和其他基于肽的分子連接到水溶性聚合物(例如，PEG)。通常的實施方案利用一個連接接頭將水溶性聚合物共價連接到受體結合部分，然而，在備選實施方案中，可以使用多種連接接頭，包括進一步變化，其中不同種類的水溶性聚合物連接到不同連接接頭處的受體結合部分，所述接頭可以包括間隔臂和/或一個或多個肽鏈的共價連接接頭。在一些實施方案中，二聚體或者更高級多聚體將包含不同種類的肽鏈(即，異二聚體或者其他異多聚體)。作為實例并且不限制，二聚體可以包含具有PEG連接接頭的第一條肽鏈和缺少PEG連接接頭或者利用不同于第一條肽鏈的連接化學的第二條肽鏈，在一些變通方案中，間隔臂可以含有或者缺乏PEG連接接頭和所述間隔臂，如果被PEG化，可以利用不同于第一和/或第二條肽鏈的連接化學。備選實施方案利用連接到受體結合部分的間隔臂部分的PEG和綴合到所述分子的肽部分的氨基酸之一的側鏈的不同水溶性聚合物(例如，糖)。
多種聚乙二醇(PEG)種類可以用于PEG化受體結合部分(肽+間隔臂)。基本上可以使用任意適宜的反應性PEG試劑。在優選實施方案中，反應性PEG試劑將導致綴合到受體結合部分時形成氨基甲酸酯或者酰胺鍵。適宜的反應性PEG種類包括，但不限于，可以在NOF Corporation(Yebisu Garden Place Tower，20-3 Ebisu 4-chome，Shibuya-ku，Tokyo150-6019)的Drug Delivery Systems目錄(2003)和Nektar Therapeutics(490Discovery Drive，Huntsville，Alabama 35806)的Molecular Engineering目錄(2003)中出售的那些種類。例如并且不限于下面的PEG試劑通常是多種實施方案中優選的mPEG2-NHS、mPEG2-ALD、multi-ArmPEG、mPEG(MAL)2、mPEG2(MAL)、mPEG-NH2、mPEG-SPA、mPEG-SBA、mPEG-硫酯、mPEG-DoubleEsters、mPEG-BTC、mPEG-ButyrALD、mPEG-ACET、雜官能PEGs(NH2-PEG-COOH、Boc-PEG-NHS、Fmoc-PEG-NHS、NHS-PEG-VS、NHS-PEG-MAL)、PEG丙烯酸酯(ACRL-PEG-NHS)、PEG-磷脂(例如，mPEG-DSPE)、SUNBRITE系列的多臂PEGs，包括本領域技術人員所選化學活化的基于甘油的PEGs的GL序列，任意一種SUNBRITE活化的PEGs(包括但不限于羧基-PEGs、p-NP-PEGs、Tresyl-PEGs、醛PEGs、縮醛-PEGs、氨基-PEGs、硫醇-PEGs、馬來酰亞胺-PEGs、羥基-PEG-胺、氨基-PEG-COOH、羥基-PEG-醛、羧酸酐型-PEG、官能化PEG-磷脂，和本領域技術人員選擇用于他們的特定應用和習慣的其他類似和/或適宜的反應性PEGs。
肽部分來源于多種動物(包括人、微生物或植物)和通過遺傳工程和合成產生的任意肽可用作肽部分。實例包括結合EPO-R的肽和結合TPO-R的肽。
優選地，肽部分包含一種或多種肽，每種肽的長度小于50個氨基酸，更優選約10到25個氨基酸，最優選約12-18個氨基酸。
在一個優選實施方案中，肽部分選自結合EPO-R的肽，如在Wrighton等人的美國專利號5,773,569；5,830,851；和5,986,047；Wrighton等人的PCT公開號WO96/40749；Johnson和Zivin的美國專利號5,767,078和PCT公開號96/40772；Balu的PCT公開號WO01/38342和Smith-Swintosky，等人的WO01/91780；2003年5月12日提交的美國臨時申請序號60/479,245；2003年5月12日提交的美國臨時申請序號60/469,993；2003年5月12日提交的美國臨時申請序號60/470,244中公開的那些肽。
在另一優選實施方案中，肽部分選自結合血小板生成素-受體(“TPO-R”)的肽。此類TPO-R結合肽的非限制性實例包括在美國專利6,552,008、6,506,362、6,498,155、6,465,430、6,333,031、6,251,864、6,121,238、6,083,913、5,932,546、5,869,451、5,683,983、5,677,280、5,668,110和5,654,276和公開的美國專利申請2003/0083361、2003/0009018、2002/0177166和2002/0160013中描述的那些TPO-R結合肽。
在一個實施方案中，肽部分是長為10到40或更多氨基酸殘基并且具有序列X3X4X5GPX6TWX7X8的單體肽，其中每個氨基酸由標準的單字母簡寫表示；X3為C；X4為R、H、L或W；X5為M、F或I；X6獨立地選自20種遺傳編碼的L-氨基酸的任一種；X7為D、E、I、L或V；X8為C，所述肽結合并活化紅細胞生成素受體(EPO-R)或者作為EPO激動劑。
在另一實施方案中，肽部分是長為17到約40個氨基酸的單體肽，其包含核心氨基酸序列LYACHMGPITX1VCQPLR，其中每個氨基酸由標準的單字母簡寫表示；X1為色氨酸(W)、1-萘基丙氨酸(1-nal)或者2-萘基丙氨酸(2-nal)。
在再一個實施方案中，肽部分包含一個或多個TPO-R結合肽，其具有諸如Ac-Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Nal(1)-Leu-Ala-Ala-Arg-Sar或Ac-Ile-Glu-Gly-Pro-Thr-Leu-Arg-Gln-Trp-Leu-Ala-Ala-Arg-Sar的序列。
根據本發明的一些實施方案，獨立地選自20種遺傳編碼的L-氨基酸或者立體異構的D-氨基酸的2個或多個，優選2到6個氨基酸殘基將偶聯到上述核心序列的一端或兩端。例如，序列GG將通常連接到核心序列的一端或兩端以便容易合成肽。本發明還提供了這些肽和所述肽的衍生物和肽模擬物的綴合物，它們保留了EPO-R結合性質。
20種常規氨基酸的異構體(例如，D-氨基酸)、非天然氨基酸，如a，a-二取代的氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸和其他非常規氨基酸也可以是本發明化合物的適宜成分。非常規氨基酸的實例包括，但不限于β-丙氨酸、3-吡啶基丙氨酸、4-羥基脯氨酸、O-磷酸絲氨酸、N-甲基甘氨酸、N-乙酰基絲氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基組氨酸、5-羥基賴氨酸、正亮氨酸和其他相似氨基酸和亞氨基酸。
在優選實施方案中，本發明的肽部分在核心序列的兩個半胱氨酸殘基之間含有分子內二硫鍵。例如 或 二聚和寡聚肽在優選實施方案中，本發明的單體肽部分經二聚或者寡聚化以形成二聚體或者寡聚體。
在一個實施方案中，使用生物素/鏈霉抗生物素蛋白蛋白系統可以寡聚化本發明的肽單體。通過標準技術可以合成肽單體的生物素化類似物。例如，肽單體可以C-末端生物素化。這些生物素化單體然后通過與鏈霉抗生物素蛋白孵育[例如，在室溫下以4∶1摩爾比在磷酸緩沖鹽水(PBS)或者HEPES緩沖的RPMI培養基(Invitrogen)中孵育1小時]寡聚化。在該實施方案的變通方案中，生物素化肽單體可以通過與多種通過商業途徑可得到的抗-生物素抗體的任意一種[例如，山羊抗-生物素IgG，來自Kirkegaard& Perry Laboratories，Inc.(Washington，DC)]孵育而寡聚化。
連接體在優選實施方案中，本發明的肽單體通過共價連接到至少一個連接體部分二聚化。連接體(LK)部分是優選的，但是不是必需的，C1-12連接部分任選以一個或兩個NH-鍵結束并且任選在一個或多個可利用的碳原子上用低級烷基取代基取代。優選地，連接體LK包含-NH-R-NH-，其中R是低級(C1-6)線性烴，其經諸如羧基或氨基的官能團取代從而能夠結合另一分子部分(例如，可以存在于固態支持體的表面上)。最優選地，連接體是賴氨酸殘基或者賴氨酸酰胺(賴氨酸殘基，其中羧基已經被轉化成酰胺部分-CONH2)。在優選實施方案中，連接體通過同時連接到兩個肽單體的每一個的C-末端氨基酸橋接兩個肽單體的C-末端。
例如，當C-末端連接體LK是賴氨酸酰胺時，二聚體可以在結構上如式1所示并且如式II概述式I 式II
在式I中，N2代表賴氨酸的ε-氨基的氮原子，N1代表賴氨酸的α-氨基的氮原子。該二聚結構可以寫作[肽]2Lys-酰胺以表示肽結合賴氨酸的α和ε氨基，或者寫作[Ac-肽]2Lys-酰胺以表示N-末端乙酰化肽結合賴氨酸的α和ε氨基，或者寫作[Ac-肽，二硫鍵]2Lys-酰胺以表示N-末端乙酰化肽結合到賴氨酸的α和ε氨基，每個肽含有分子內二硫鍵環，或者寫作[Ac-肽，二硫鍵]2Lys-間隔臂-PEG以表示N-末端乙酰化肽結合賴氨酸的α和ε氨基，每個肽含有分子內二硫鍵環，并且間隔臂分子在賴氨酸的C末端和PEG部分之間形成共價鍵。
通常，盡管不是必須，通過不同于分子間二硫鍵形成的技術二聚化肽二聚體將還含有肽單體的半胱氨酸殘基之間的一個或多個二硫鍵。例如，兩個單體可以通過一個和多個分子間二硫鍵交聯。優選地，兩個單體含有至少一個分子內二硫鍵。最優選地，肽二聚體的兩個單體含有分子內二硫鍵，從而每個單體含有環狀基團。
肽修飾還可以修飾本發明肽化合物的氨基和/或羧基末端以產生本發明的其他化合物。氨基末端修飾包括甲基化(即，-NHCH3或者-N(CH3)2)、乙酰化(例如，用乙酸或者其鹵化衍生物，如α-氯乙酸、α-溴乙酸、α-碘乙酸)、加入芐氧基羰基(Cbz)，或者用保護基團保護氨基末端，所述保護基團含有RCOO-定義的羧化物官能度或者R-SO2-定義的磺酰官能度，其中R選自烷基、芳基、雜芳基、烷基芳基等等，和類似基團。還可以在N-末端摻入脫氨基酸(從而沒有N-末端氨基)以減小對蛋白酶的敏感性或者限制肽化合物的構象。在優選實施方案中，N-末端被乙酰化。在最優選的實施方案中，乙酰化N-末端甘氨酸以產生N-乙酰甘氨酸(AcG)。
羧基末端修飾包括用氨甲酰基取代游離酸或者在羧基末端形成環狀內酰胺以導入結構限制。還可以環化本發明的肽，或者在肽的末端摻入脫氨基或者脫羧基殘基，從而沒有末端氨基或者羧基，從而減小對蛋白酶的敏感性或者限制肽的構象。本發明化合物的C-末端官能團包括酰胺、酰胺低級烷基、酰胺二(低級烷基)、低級烷氧基、羥基，和羧基，和它們的低級酯衍生物，和其藥學上可接受的鹽。
可以將20種遺傳編碼的氨基酸(或者立體異構的D型氨基酸)的天然發生的側鏈用其他側鏈取代，所述其他側鏈為例如，烷基、低級烷基、4-、5-、6-到7-元環狀烷基、酰胺、酰胺低級烷基、酰胺二(低級烷基)、低級烷氧基、羥基，和羧基，和它們的低級酯衍生物，和4-、5-、6-到7-元雜環。具體地，可以使用脯氨酸類似物，其中脯氨酸殘基的環大小從5元改變到4、6或7元。環狀基團可以是飽和的或不飽和的，如果飽和，可以是芳族或者非芳族的。雜環基團優選含有一個或多個氮、氧和/或硫雜原子。此類基團的實例包括呋咱基、呋喃基、咪唑烷基、咪唑基、咪唑啉基、異噻唑基、異噁唑基、嗎啉基(例如，嗎啉代)、噁唑基、哌嗪基(例如，1-哌嗪基)、哌啶基(例如，1-哌啶基、哌啶子基)、吡喃基、吡嗪基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡唑基、噠嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基(例如，1-吡咯烷基)、吡咯啉基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、硫代嗎啉基(例如，硫代嗎啉代)，和三唑基。這些雜環基團可以是取代或未取代的。當基團被取代時，取代基可以是烷基、烷氧基、鹵素、氧，或者取代或未取代的苯基。
可以通過磷酸化和其他方法(例如，如Hruby，等人(1990)BiochemJ.268249-262中描述]修飾肽部分。
本發明的肽部分還可以作為具有相似生物活性的非肽化合物的結構模型。本領域技術人員認識到可以用多種技術構建具有與前導肽化合物相同或相似的所希望的生物活性的化合物，但是它們在溶解性、穩定性和對水解和蛋白水解方面比前導肽化合物具有更有利的活性[見，Morgan和Gainor(1989)Ann.Rep.Med.Chem.24243-252]。這些技術包括用由膦酸酯、酰胺化物、氨基甲酸酯、磺酰胺、仲胺和N-甲基氨基酸組成的主鏈替換肽主鏈。
單體、二聚體、或者寡聚體肽部分可以直接連接到PEG部分或者其可以通過一個或多個間隔臂部分連接。
間隔臂部分在其中單體、二聚體、或寡聚體肽部分通過間隔臂部分連接到PEG部分的實施方案中，間隔臂部分可以是任選以-NH-鍵或者-(CO)O-基團結束的部分。例如，間隔臂可以是低級(C1-12)線性烴，其任選以諸如羧基或氨基的官能團取代從而能夠結合另一分子部分，或者一個或多個甘氨酸(G)殘基，或者氨基己酸(Ahx)如6-氨基己酸；或者賴氨酸(K)殘基或者賴氨酸酰胺(K-NH2，其中羧基已經轉化為酰胺部分-CONH2的賴氨酸殘基)。
在優選實施方案中，間隔臂部分具有下面的結構-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-其中α、β、γ、δ和ε每個都是整數，它們的值獨立地選擇。
在優選實施方案中，α為整數，1≤α≤6；β為整數，1≤β≤6；ε為整數，1≤ε≤6；δ為0或1；γ為整數，0≤γ≤10；Y為NH或CO。
在某些優選實施方案中，當γ＞1時β＝2。
在一個尤其優選的實施方案中，α＝β＝ε＝2；γ＝δ＝1；Y為NH。
在其他實施方案中，γ＝δ＝0；2≤α+ε≤5；
Y為CO。
在一個實施方案中，γ＝δ＝0；α+ε＝5；Y為CO。
根據本發明，水溶性部分(優選PEG)連接到間隔臂的NH末端。水溶性部分可以直接連接到間隔臂或者間接地，例如，通過酰胺或者氨基甲酸酯鍵連接。肽部分連接到間隔臂的Y末端。間隔臂可以連接到肽的C-末端或N-末端。所以，在其中間隔臂連接到肽的C-末端的實施方案中，Y是NH。在其中間隔臂連接到肽的N-末端的實施方案中，Y是CO。在優選實施方案中，本發明的間隔臂通過下述賴氨酸連接體連接到肽二聚體。在該實施方案中，連接體優選連接到連接體部分的C-末端，并且Y是NH。在另一優選實施方案中，本發明的間隔臂作為三功能連接體(也在下文描述)的部分連接到肽。在該實施方案中，Y是CO并且Y與三功能連接體的N原子形成酰胺鍵。
肽合成期間間隔臂部分可以摻入肽。例如，當間隔臂含有游離氨基和能夠結合另一分子部分的第二種官能團(例如，羧基或氨基)時，間隔臂可以綴合到固相支持體。之后，可以通過標準固相技術將肽直接合成在間隔臂的游離氨基上。
在優選實施方案中，含有兩個官能團的間隔臂首先通過第一個官能團偶聯到固相支持體。當將合成二聚肽時，任選地具有能夠作為肽合成的起始位點的兩個或多個官能團和能夠結合另一分子部分的額外官能團(例如羧基或氨基)的連接體LK部分通過間隔臂的第二個官能團和連接體的第三個官能團綴合到間隔臂。之后，可以以固相合成技術的變通方案將兩個肽單體直接合成到連接體LK部分的兩個活性氮基團。例如，固相偶聯的具有游離胺基的間隔臂可以通過連接體的游離羧基與賴氨酸連接體反應。
在備選實施方案中，當肽部分連接到間隔臂部分時，所述間隔臂可以在肽合成后綴合到肽。此類綴合可以通過本領域公知的方法實現。在一個實施方案中，連接體含有適于連接合成肽的靶標官能團的至少一個官能團。例如，具有游離胺基的間隔臂可以與肽的C末端羧基反應。在另一個實施方案中，具有游離羧基的間隔臂可以與肽的N-末端或者賴氨酸殘基的游離胺基反應。在再一個實施方案中，含有游離巰基的間隔臂可以通過氧化形成二硫鍵綴合到肽的半胱氨酸殘基。
藥物組合物在本發明的另一方面，提供了基于上面的PEG修飾的肽的化合物的藥物組合物。通過施用此類組合物減輕或者調節的疾病包括上文指出的那些疾病。此類藥物組合物可以通過經口、腸胃外(肌內、腹膜內、靜脈內(IV)或者皮下注射)、透皮(被動地或者使用離子電滲療法或者電穿孔)、透粘膜(鼻、陰道、直腸或者舌下)施用途徑或者使用生物可侵蝕的插入物施用，并且可以配制成適宜每種施用途徑的劑型。通常，本發明包括包含有效量治療肽(例如，結合EPO-R的肽)與藥學上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體的藥物組合物。此類組合物包括多種緩沖成分(例如，Tris-HCl、乙酸鹽、磷酸鹽)、pH和離子強度的稀釋劑；添加劑，如去污劑和增溶劑(例如，Tween 80，聚山梨酯80)、抗氧化劑(例如，抗壞血酸、偏亞硫酸氫鈉)、防腐劑(例如，Thimersol、苯甲醇)和膨脹性物質(例如，乳糖、甘露醇)；將所述物質摻入到聚合物化合物如聚乳酸、聚乙醇酸等等的顆粒制劑，或者摻入到脂質體中。還可以使用透明質酸。此類組合物可以影響本發明蛋白質和衍生物的物理狀態、穩定性、體內釋放速率，和體內清除速率。見，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版(1990，Mack Publishing Co.，Easton，PA18042)1435-1712頁，將其并入本文作為參考。可以以液體形式，或者可以以干燥粉劑(例如，凍干)形式制備組合物。
經口遞送預計用于本文的是經口固體劑型，其在Remington′s PharmaceuticalSciences，第18版1990(Mack Publishing Co.Easton PA18042)第89章中一般性描述，將其并入本文作為參考。固體劑型包括片劑、膠囊劑、丸劑、藥片或者錠劑、扁囊劑、微型藥片、粉劑或者粒劑。而且，脂質體或者類蛋白質膠囊化也可以用于配制本發明組合物(例如，在美國專利號4,925,673中報導的類蛋白質微球體)。可以使用脂質體膠囊化并且可以用多種聚合物衍生脂質體(例如，美國專利號5,013,556)。用于治療劑的可能的固體劑型的描述由Marshall，K.在G.S.Banker和C.T.Rhodes編輯的Modern Pharmaceutics(1979年)的第10章中給出，將其并入本文作為參考。通常，該制劑將包括EPO-R激動劑肽(或者其化學修飾的形式)和插入物成分，其允許保護免于胃環境的破壞，并在腸中釋放生物活性物質。
還預計用于本文的是經口施用的液體劑型，包括藥學上可接受的乳劑、溶液劑、混懸劑和糖漿劑，它們可以含有其他組分，包括惰性稀釋劑；和佐劑，如濕潤劑、乳化劑和混懸劑；和甜味劑、矯味劑和芳香劑。
肽可以經化學修飾從而衍生物的經口遞送是有效的。通常，預計化學修飾將至少一個部分連接到組成分子自身，其中所述部分允許(a)抑制蛋白水解；和(b)從胃或腸吸收到血流中。還希望一種或幾種組分的總體穩定性的增加和增加在體內的循環時間。如上文討論，PEG化是藥物使用的優選的化學修飾。可以使用的其他部分包括丙二醇、乙二醇和丙二醇的共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚脯氨酸、聚-1，3-二氧戊環和聚-1，3，6-tioxocane[見，例如，Abuchowski和Davis(1981)″Soluble Polymer-Enzyme Adducts，″in Enzymes as Drugs.Hocenberg和Roberts，編著(Wiley-InterscienceNew York，NY)367-383頁；和Newmark，等人(1982)J.Appl.Biochem.4185-189]。
對于經口制劑，釋放部位可以是胃、小腸(十二指腸、空腸或回腸)，或者大腸。本領域技術人員可以利用這樣的制劑，其將不在胃中釋放，而是將在十二指腸或者腸的別處釋放。優選地，該釋放將避免胃環境的有害影響，可以通過保護肽(或者衍生物)或者通過遠離胃環境，如在腸中釋放肽(或衍生物)避免胃環境的有害影響。
為了確保完全的胃抗性，對至少pH5.0不可滲透的包衣是必需的。用作腸包衣的更常見的惰性成分的實例是乙酸-1，2，4-苯三酸纖維素(CAT)、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯(HPMCP)、HPMCP 50、HPMCP 55、聚醋酸乙烯鄰苯二甲酸酯(PVAP)、丙烯酸樹脂L30D、Aquateric、醋酞纖維素(CAP)、丙烯酸樹脂L、丙烯酸樹脂S和Shellac。這些包衣可以用作混合膜。
包衣或者包衣混合物也可以用在片劑上，這些包衣或者包衣混合物不意在保護免于胃的影響。所述包衣或者包衣混合物可以包括糖包衣，或者使得片劑更易吞咽的包衣。膠囊劑可以由用于遞送干燥治療劑(即，粉劑)的硬殼(如明膠)組成，對于液體形式，可以使用軟明膠殼。扁囊劑的殼材料可以是厚淀粉或者其他可食用的紙。對于丸劑、錠劑、模制片或者片劑研制劑，可以使用濕法塊化(moist massing)技術。
肽(或者衍生物)可以包括在制劑中作為顆粒大小為約1mm的粒劑或者微型藥片形式的多微粒(multiparticulate)。用于膠囊施用的材料的制劑也可以是粉劑、略微壓制的塊，或者甚至片劑。這些治療劑可以通過壓縮制備。。
還可以包括著色劑和/或矯味劑。例如，可以(如通過脂質體或者微球體膠囊化)制備肽(或衍生物)，然后將其包含在可食用產品，如含有著色劑和矯味劑的冷藏飲料中。
可以用惰性物質稀釋或者增加肽(或衍生物)的體積。這些稀釋劑可以包括糖，尤其甘露醇、α-乳糖、無水乳糖、纖維素、蔗糖、改良葡聚糖和淀粉。某些無機鹽也可以用作填充劑，它們包括三磷酸鈣、碳酸鎂和氯化鈉。一些通過商業途徑可獲得的稀釋劑是Fast-Flo、Emdex、STA-Rx 1500、Emcompress和Avicell。
固體劑型的治療劑制劑中可以包含崩解劑。用作崩解劑的物質包括但不限于淀粉，包括基于淀粉的商用崩解劑Explotab。淀粉羥乙酸鈉、Amberlite、羧甲基纖維素鈉、ultramylopectin、藻酸鈉、明膠、橙皮、酸性羧甲基纖維素、天然海綿和膨潤土都可以使用。崩解劑還可以是不溶性陽離子交換樹脂。粉狀樹膠也可以用作崩解劑和粘合劑并且可以包括諸如瓊脂、Karaya或黃蓍膠的粉狀樹膠。海藻酸和其鈉鹽也可以用作崩解劑。
粘合劑可以用于將肽(或衍生物)活性劑保持在一起以形成硬片劑并且包括來自天然產物的材料，如阿拉伯樹膠、黃蓍膠、淀粉和明膠。其他包括甲基纖維素(MC)、乙基纖維素(EC)和羧甲基纖維素(CMC)。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥丙基甲基纖維素(HPMC)都可以用于醇溶液以粒化肽(或衍生物)。
肽(或衍生物)的制劑中可以包括抗摩擦劑以防止配制過程期間粘著。潤滑劑可以用作肽(或衍生物)和模壁中間層，這些潤滑劑包括但不限于硬脂酸，包括其鎂和鈣鹽；聚四氟乙烯(PTFE)、液體石蠟、植物油和蠟。也可以使用可溶性潤滑劑，如十二烷基硫酸鈉、十二烷基硫酸鎂、多種分子量的聚乙二醇、碳蠟4000和6000。
可以加入助流劑，其改善配制期間藥物的流動性質并且幫助壓制期間的重排。助流劑可以包括淀粉、滑石粉、致熱性硅石和水合硅鋁酸鹽。
為了幫助肽(或衍生物)溶于水性環境，可以加入表面活性劑作為濕潤劑。表面活性劑可以包括陰離子去污劑，如十二烷基硫酸鈉、磺基琥珀酸二辛酯鈉和磺酸二辛酯鈉。可以使用陽離子去污劑并且其可以包括苯扎氯銨或芐索氯銨。可以包括在本發明制劑中作為表面活性劑的可能的非離子去污劑的名單為聚桂醇400、聚氧乙烯(40)硬脂酸酯、聚氧乙烯氫化蓖麻油10、50和60、甘油單硬脂酸酯、聚山梨酯40、60、65和80、蔗糖脂肪酸酯、甲基纖維素和羧甲基纖維素。這些表面活性劑可以單獨或者以不同比例的混合物存在于所述蛋白質或者衍生物的制劑中。
可以增強肽(或衍生物)吸收的添加劑為例如脂肪酸油酸、亞油酸和亞麻酸。
控釋經口制劑也是希望的。肽(或衍生物)可以摻入到允許通過擴散或者浸取機制釋放的惰性基質，如樹膠中。緩慢變性基質也可以摻入到制劑中。某些腸包衣也具有緩釋效果。控釋的另一種形式是通過基于Oros治療系統(Alza Corp.)的方法，即藥物封裝在半透性膜中，該膜允許水進入并且由于滲透作用將藥物擠過一個小的開口。
其他包衣可以用于制劑。這些包衣包括可以在包衣鍋中應用的多種糖。肽(或衍生物)還可以以膜包衣的片劑提供并且用于該情況的材料分成兩組。第一組是非腸物質并且包括甲基纖維素、乙基纖維素、羥乙基纖維素、甲基羥基-乙基纖維素、羥丙基纖維素、羥丙基-甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉、聚維酮和聚乙二醇。第二組由通常為苯二甲酸酯的腸材料組成。
材料混合物可以用于提供最佳膜包衣。可以在鍋涂布器或者在流化床或者通過壓縮包衣進行膜包衣。
腸胃外遞送用于腸胃外施用的根據本發明的制劑包括無菌水性或非水性溶液劑、混懸劑或乳劑。非水性溶劑或者賦形劑的實例為丙二醇、聚乙二醇、植物油，如橄欖油和玉米油、明膠和可注射的有機酯，如油酸乙酯。此類劑型還可以含有佐劑，如防腐劑、濕潤劑、乳化劑和分散劑。它們可以通過例如，通過保留細菌的濾器過濾、向組合物摻入消毒劑、通過放射處理組合物或者通過熱處理組合物進行消毒。它們還可以在使用即刻前用無菌水或者某種其他無菌可注射介質產生。
直腸或陰道遞送用于直腸或陰道施用的組合物優選為栓劑，其除了活性物質還含有賦形劑，如可可脂或者栓劑蠟。用于經鼻或舌下施用的組合物也可以用本領域熟知的標準賦形劑制備。
經肺遞送本文還設想經肺遞送EPO-R激動劑肽(或者其衍生物)。肽(或衍生物)被吸入時遞送到哺乳動物的肺中并穿過肺上皮層進入血流[見，例如，Adjei，等人(1990)Pharmaceutical Research 7565-569；Adjei等人(1990)Int.J.Pharmaceutics 63135-144(醋酸亮丙瑞林)；Braquet，等人(1989)J.Cardiovascular Pharmacology 13(sup5)143-146(內皮素-1)；Hubbard，等人(1989)Annals of Internal Medicine，卷III，206-212頁(α1-抗胰蛋白酶)；Smith，等人(1989)J.Clin.Invest.841145-1146(α-1-蛋白酶)；Oswein，等人(1990)″Aerosolization of Proteins″，Proceedings of Symposium onRespiratory Drug Delivery II Keystone，Colorado(重組人生長激素)；Debs，等人(1988)J.Immunol.1403482-3488(γ干擾素和腫瘤壞死因子α)；和Platz等人的美國專利號5,284,656(粒細胞集落刺激因子)]。在Wong等人的美國專利號5,451,569中描述了經肺遞送藥物實現全身性效果的方法和組合物。
預計用于本發明實踐中的是設計用于經肺遞送治療產品的多種機械裝置，其包括但不限于噴霧器、定量吸入器和粉末吸入器，它們都是本領域技術人員熟悉的。適于本發明實踐的通過商業途徑可獲得的裝置的一些特例為Ultravent噴霧器(Mallinckrodt Inc.，St.Louis，MO)；Acorn II噴霧器(Marquest Medical Products，Englewood，CO)；Ventolin定量吸入器(GlaxoInc.，Research Triangle Park，NC)；和Spinhaler粉末吸入器(FisonsCorp.，Bedford，MA)。
所有此類裝置需要使用適于肽(或衍生物)的調劑的制劑。通常，每種制劑對于所有裝置的類型是特異的并且可以包括除了用于治療的常規稀釋劑、佐劑和/或載體之外還使用適宜的推進推進劑物質。而且，預計使用脂質體、微囊劑或者微球體，包括復合物，或者其他類型載體。根據所用的化學修飾類型或者裝置類型，在不同制劑中還可以使用化學修飾的肽。
適于用射流或超聲噴霧器使用的制劑將通常包含溶于水中的肽(或衍生物)，其濃度為每毫升溶液約0-1到25mg生物活性蛋白質。該制劑還可以包括緩沖劑和簡單糖(例如，用于蛋白質穩定和滲透壓的調節)。噴霧器制劑還可以包含表面活性劑，其減小或者防止形成氣溶膠中溶液的霧化導致的肽(或衍生物)的聚集。
定量吸入器裝置使用的制劑將通常包含細分的粉末，其含有通過表面活性劑懸浮在推進劑中的肽(或衍生物)。推進劑可以是用以該目的的任意常規物質，如含氯氟烴、氫氯氟烴、氫氟烴或者烴，包括三氟甲烷、二氯二氟甲烷、二氯四氟乙醇，和1，1，1，2-四氟乙烷或者它們的組合。適宜的表面活性劑包括三油酸山梨坦和大豆卵磷脂。油酸也可以用作表面活性劑。
用于從粉末吸入器裝置調劑的制劑將包含細分的干燥粉劑，其含有肽(或衍生物)并且還可以包括膨脹劑，如乳糖、山梨醇、蔗糖或者甘露醇，它們的量將促進粉劑從裝置的分散，例如，按重量計為制劑的50-90％。肽(或衍生物)應該最有利地以顆粒形式制備，其平均顆粒大小小于10mm(或者微米)，最優選0.5到5mm，以最有效地遞送到遠端肺。
鼻遞送還預計EPO-R激動劑肽(或衍生物)的鼻遞送。鼻遞送允許向鼻子使用治療產品后，肽直接進入血流，而不必使產物沉積在肺中。用于經鼻遞送的制劑包括使用葡聚糖或者環葡聚糖的那些制劑。
劑量對于所有肽化合物，隨著進一步研究的進行，將出現關于治療多種患者中多種疾病的適宜的劑量水平的信息，普通技術人員考慮接受者的治療背景、年齡和一般健康，將能夠確定適宜給藥。所選劑量取決于所希望的治療效果、施用途徑和所希望的治療持續時間。通常，每天將0.001到10mg/kg體重的劑量水平施用于哺乳動物。通常，對于靜脈內注射或者灌注，劑量可以較低。給藥方案可以取決于循環半壽期和所用制劑而變。
本發明的肽(或者它們的衍生物)可以與一種或多種額外的活性成分或者藥物組合物結合施用。
實施例下面的實施例闡明本發明，但是不作為限制。
實施例1H-HAP-Boc分子的合成步驟ACbz-TAP的合成 (TAP) (Cbz-TAP)將TAP(10g，67.47mmol，從Aldrich Chemical Co.購買)在無水二氯甲烷(DCM)(100ml)中的溶液冷卻到0℃。將氯甲酸苯甲酯(Cbz-Cl，Cbz＝羧基芐氧基)(4.82ml，33.7mmol)在無水DCM(50ml)中的溶液通過滴液漏斗在6-7小時內緩慢加入TAP溶液，而整個過程中反應混合物的溫度保持在0℃。然后使所得混合物升溫到室溫(～25℃)。再過16小時后，真空下除去DCM并且殘渣在3N HCl和乙醚之間分配。收集水性層并用50％NaOH水溶液中和到pH 8-9并用乙酸乙酯萃取。用無水Na2SO4干燥乙酸乙酯層，然后真空濃縮以提供粗品單-Cbz-TAP(5g，約50％產率)。該化合物不經進一步純化直接用于步驟B的反應。
步驟BCbz-TAP-Boc的合成 (Cbz-TAP) (Cbz-TAP-Boc)將Boc2O(3.86g，17.7mmol，Boc＝叔丁氧基羰基)加入Cbz-TAP(5g，17.7mmol)在己烷(25ml)的劇烈攪拌的懸浮液中。在室溫繼續攪拌過夜。將反應混合物用DCM(25ml)稀釋并用10％檸檬酸溶液(2X)、水(2X)和鹽水洗滌。用無水Na2SO4干燥有機層并真空濃縮。粗產物(產率5g)直接用于步驟C的反應中。
步驟CBoc-TAP的合成 (Cbz-TAP-Boc)(H-TAP-Boc)將來自步驟B的粗品Cbz-TAP-Boc溶于甲醇(25ml)中并在5％披鈀碳(5％w/w)存在下在氣球壓(balloon pressure)氫化16小時。過濾混合物，用甲醇洗滌并在真空下濃縮濾液得到粗品H-TAP-Boc產物(產率3.7g)。
步驟A-C后總產率約44％(基于所用Cbz-Cl的量計算)。
實施例2將間隔臂連接具有C-末端的肽下面的反應圖解闡明怎樣將間隔臂連接具有C-末端的肽。
具有游離C-末端的肽
根據實施例1制備H-TAP-Boc。DCC為N，N’-二環己基碳二亞胺。
實施例3將間隔臂連接到具有游離側鏈酸的肽下面的反應圖解闡明怎樣將間隔臂連接到具有游離側鏈酸的肽。
具有游離側鏈酸的肽 TFA是三氟乙酸。
實施例4用mPEG-NPC PEG化肽在C-末端具有TAP的肽 其中mPEG-NPC具有下面的結構 mPEG-NPC實施例5用mPEG-SPA PEG化肽在C-末端具有TAP的肽
其中mPEG-SPA具有下面的結構 mPEG-SPA實施例6連接間隔臂和合成肽下面的反應圖解闡明怎樣將間隔臂連接到固相支持體和在該固相支持體上合成肽。
實施例7合成連接到樹脂的具有間隔臂的肽二聚體步驟ATentaGel-連接體的合成 (TentaGel溴化物) (TentaGel-連接體)將TentaGel溴化物(2.5g，0.48mmol/g，從德國Rapp Polymere得到)、苯酚連接體(5當量)和K2CO3(5當量)在20ml N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中加入到70℃并保持14小時。冷卻到室溫后，洗滌樹脂(0.1N HCl，水，乙腈(ACN)，DMF，MeOH)并干燥得到琥珀色樹脂。
步驟BTentaGel-連接體-TAP(Boc)的合成 將來自上面步驟的樹脂2.5g和H-TAP-Boc(1.5gms，5當量)和冰醋酸(34μl，5當量)用1∶1 MeOH/四氫呋喃(THF)的混合物吸收并過夜搖動。向混合物加入氰基硼氫化鈉(5當量)溶于THF的1M溶液并再搖動7小時。樹脂過濾洗滌(DMF，THF，0.1N HCl，水，MeOH)并干燥。將少量樹脂用芐基氯和二異丙基乙基胺(DIEA)在DCM的溶液苯甲酰化并用70％三氟乙酸(TFA)-DCM切割并用LCMS和HPLC檢查。
步驟CTentaGel-連接體-TAP-Lys的合成 (TentaGel-連接體-TAP(Bec)) (TentaGel-連接體-TAP-Lys)來自上面步驟B的樹脂用的Fmoc-Lys(Fmoc)-OH的活化溶液(Fmoc＝9-芴基甲氧基羰基，從5當量氨基酸和5當量HATU(N，N，N’，N’-四甲基-O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)六氟磷酸脲鎓制備)溶于0.5M DMF的溶液然后加入10當量DIEA制備)處理并輕微搖動14小時。然后將樹脂洗滌(DMF，THF，DCM，MeOH)并干燥得到受保護的樹脂。樹脂用10％乙酸酐、20％吡啶在DCM中的溶液處理20分鐘，然后如上洗滌來帽化殘留胺基團。將樹脂在30％哌啶在DMF的溶液輕微搖動20分鐘除去Fmoc基團，然后洗滌(DMF，THF，DCM，MeOH)并干燥。
步驟DTentaGel-連接體-TAP-Lys(肽)2的合成
(TentaGel-連接體-TAP-Lys) (TentaGel-連接體·TAP-Lys(肽)2)來自上面步驟C的樹脂進行用HBTU/HOBt活化偶聯Fmoc-氨基酸和同時用哌啶除去Fmoc以構造兩條肽鏈的重復循環。這在可以從AppliedBiosystems，Inc得到的ABI 433自動肽合成儀上方便地進行。最初的Fmoc去除后，將末端胺基用乙酸酐(10當量)和DIEA(20當量)在DMF中的溶液酰化20分鐘，然后如上洗滌。
步驟E從樹脂切割 (TentaGel-連接體-TAP-Lys(肽)2) (具有間隔臂的肽)將來自上面步驟D的樹脂室溫下懸浮在TFA(82.5％)、苯酚(5％)、乙二硫醇(2.5％)、水(5％)和苯硫基甲烷(5％)的溶液中3小時。也可以使用備選切割混合物，如TFA(95％)、水(2.5％)和三異丙基硅烷(2.5％)。TFA溶液冷卻到5℃并倒入Et2O中以沉淀肽。過濾并減壓干燥得到具有間隔臂的所希望的肽二聚體。通過制備HPLC以C18柱純化得到具有間隔臂的純的肽二聚體。
步驟F氧化氧化具有還原半胱氨酸殘基的二聚肽(連接到間隔臂)得到具有二硫鍵的二聚肽。
含有還原的半胱氨酸 含有氧化的二硫鍵的殘基的二聚肽(XYZ) 二聚肽(XYZ)二聚肽溶于20％DMSO/水(1mg干重肽/mL)并允許在室溫靜置36小時。通過將反應混合物加到C18HPLC柱(Waters Delta-Pak C18，15微米顆粒大小，300埃孔徑，40mm×200mm長度)，然后使用40分鐘內從5到95％ACN的線性ACN/水/0.01％TFA梯度進行純化。含有所希望肽的級分經凍干得到松軟的白色固態產物。
實施例8用mPEG-NPC PEG化具有間隔臂的肽二聚體 例如， 連接到間隔臂的二聚肽與等量(基于摩爾)活化的PEG種類(mPEG-NPC，日本的NOF Corp.生產，可以通過美國NektarTherapeutics(以前“Shearwater Corp.”)得到)在無水DMF中的溶液混合得到澄清溶液。5分鐘后，向上述溶液加入4當量DIEA。在室溫下攪拌混合物14小時，然后用C18反相HPLC純化。通過基質輔助激光解吸離子化(MALDI)質譜法證實PEG化肽的結構。mPEG-NPC具有下面的結構 mPEG-NPC實施例9用mPEG-SPA PEG化具有間隔臂的肽二聚體 還可以用mPEG-SPA實施具有間隔臂的肽二聚體的PEG化。mPEG-SPA具有下面的結構。
mPEG-SPA實施例10離子交換純化實施例8中所得 樣品用于鑒定適于純化肽-間隔臂-PEG綴合物的離子交換支持體。
一般步驟如下將離子交換樹脂(2-3g)裝入1cm柱，然后轉化成鈉形式(將0.2N NaOH裝入1cm柱，直到洗脫液為pH14)，然后轉化成氫形式(用0.1N HCl或者0.1M HOAc洗脫直到洗脫液匹配上樣pH)，然后用25％ACN/水洗滌直到pH6。綴合前的肽或者肽-PEG綴合物溶于25％ACN/水(10mg/mL)并用TFA調節pH至低于3，然后在單獨的實驗中裝入柱子上。用2-3體積25％ACN/水洗滌并收集5mL級分后，通過用25％ACN/水中的0.1MNH4OAc洗脫從柱子釋放肽，再次收集5mL級分。HPLC分析揭示哪些級分含有目的肽。用蒸發光散射檢測器(Evaporative Light-ScatteringDetector(ESLD))分析表明當肽滯留在柱上并用NH4OAc溶液洗脫時(通常級分4和10之間)，沒有觀察到作為污染物的非-綴合的PEG。當以最初洗滌緩沖液洗脫肽時(通常前2個級分)，沒有觀察到所希望的PEG-綴合物和過量PEG的分離。
基于離子交換支持體分離肽-PEG綴合物與未反應的(或水解的)PEG的能力以及它們滯留起始二聚肽的能力選擇這些離子交換支持體。Mono SHR5/5強陽離子交換預裝柱(Amersham Biosciences)、SE53 Cellulose微粒狀強離子交換支持體(Whatman)、和SP Sepharose Fast Flow強陽離子交換支持體(Amersham Biosciences)被鑒定為適宜的離子交換支持體。
實施例11基于α-氨基酸合成三功能分子合成具有下面結構的分枝三功能分子 m＝1-5，n＝1-14，m和n為整數其中X＝OH， 或 所述合成是根據下面的方案 m＝1-5，n＝1-14，m和n為整數這些三功能分子可以同時作為連接體和間隔臂。
實施例12基于叔酰胺合成三功能分子合成具有下面結構的分枝三功能分子 m＝1-5，n＝1-14，m和n為整數其中X＝OH, 或 所述合成是根據下面的方案 m＝1-5，n＝1-14，m和n為整數這些三功能分子可以同時作為連接體和間隔臂。
實施例13合成同三功能(homotrifunctional)分子合成具有下面結構的分枝三功能分子 m＝1-2，n＝1-6，m和n為整數其中
X＝OH, 或 所述合成是根據下面的反應方案 m＝1-2，n＝1-6，m和n為整數這些三功能分子可以同時作為連接體和間隔臂。
實施例14用三功能分子進行C-末端二聚化和PEG化根據實施例12產生具有如下結構的三功能分子 該三功能分子用于根據下面的反應圖解的C-末端二聚化和PEG化
實施例15用三功能分子進行N-末端二聚化和PEG化根據下面的制備三功能分子 5分鐘內向Boc-βAla-OH(10.0g，52.8mmol)(Boc＝叔丁氧基羰基)和亞氨基二乙酸二乙酯(10.0g，52.8mmol)在200mL DCM中的0℃溶液加入DCC(10.5g，50.9mmol)。在2分鐘內形成白色沉淀。讓反應混合物升溫到室溫并攪拌24小時。用燒結濾器(介質多孔性)濾除尿素并減壓除去溶劑。將殘渣用500mL EtOAc(EtOAc＝乙酸乙酯)吸收，如上過濾，并轉移到分液漏斗。有機相經洗滌(飽和NaHCO3、鹽水、1N HCl、鹽水)、干燥(MgSO4)、過濾、和干燥得到無色油。油在10分鐘內固化得到白色晶體狀固體。
將粗品二酯用75mL THF(THF＝四氫呋喃)和75mL MeOH(MeOH＝甲醇)吸收并加入50mL水。向該溶液加入25mL水中的KOH(KOH＝氫氧化鉀)(8.6g，153mmol)溶液。反應混合物顏色變成淡黃色。攪拌12小時(pH仍然～12)后，在旋轉蒸發器上除去有機溶劑，所得淤漿在Et2O(Et2O＝二乙酯)和飽和NaHCO3之間分配。合并的水相酸化到pH1，用NaCl飽和，并用EtOAc萃取。將EtOAc相洗滌(鹽水)、干燥(MgSO4)，并濃縮得到13.97g產物，其為白色固體(2步90.2％產率)。
注釋當在ACN中進行DCC反應時產率下降到73％。當使用DIC時，不用層析不能從目的產物除去尿素副產物；不用層析可以定量除去DCC尿素。用水溶性碳二亞胺也能很好地進行反應。
5分鐘內向50mL ACN中二酸(1.00g，3.29mmol)和羥基琥珀酰亞胺(0.945g，8.21mmol)的溶液加入DCC(1.36g，6.59mmol)。立即形成白色沉淀。攪拌反應混合物22小時并過濾除去DCC尿素。減壓除去溶劑并用EtOAc(250mL)吸收溶劑，并轉移到分液漏斗。有機相經洗滌(飽和NaHCO3、鹽水、1N HCl、鹽水)、干燥(MgSO4)、并濃縮得到白色固體。將固體以75mL ACN吸收，濃縮得到1.28g產物，其為白色固體(78.2％產率)。
注釋產率在THF中下降到31％，在DMF(用DIC代替DCC)中下降到68％，在DCM/DMF中下降到57％。起始二酸在ACN中是可溶的，因此如果在DCC加入前存在沒有溶解的物質，可以將其濾除并丟棄。
該三功能分子用于根據下面的反應圖解進行N-末端二聚化和PEG化 實施例16合成mPEG2-賴氨醇(lysinol)-NPC將通過商業途徑可獲得的賴氨醇用過量mPEG2處理，導致形成mPEG2-賴氨醇。之后，用過量NPC處理mPEG2-賴氨醇，形成mPEG2-賴氨醇-NPC。
實施例17用三功能分子PEG化(PEG部分包含兩個線性PEG鏈)根據實施例15制備具有下面結構的三功能分子
步驟1-三功能連接體偶聯到肽單體為了偶聯連接體，將2當量肽與無水DMF中的1當量三功能連接體混合得到澄清溶液，2分鐘后加入5當量DIEA。室溫下攪拌混合物14小時。減壓除去溶劑并將粗產物溶于DCM中的80％TFA中30分鐘以除去Boc基團，然后通過C18反相HPLC純化。通過電噴射質譜法證實二聚體的結構。該偶聯反應將連接體連接到每個單體的賴氨酸殘基的ε氨基的氮原子。
步驟4-肽二聚體的PEG化通過氨基甲酸酯鍵PEG化將肽二聚體和PEG種類(mPEG2-賴氨醇-NPC)以1∶2摩爾比在無水DMF中混合得到澄清溶液。5分鐘后，向上面的溶液加入4當量DIEA。室溫攪拌混合物14小時，然后用C18反相HPLC純化。通過MALDI質譜證實PEG化肽的結構。還將純化的肽通過如下概述的陽離子交換層析進行純化。
通過酰胺鍵PEG化將肽二聚體和PEG種類(mPEG2-Lys-NHS)以1∶2摩爾比在無水DMF中混合得到澄清溶液。可以從例如，Nektar Therapeutics(490 DiscoveryDrive，Huntsville，Alabama 35806)的Molecular Engineering目錄(2003)的條目號2Z3X0T01得到mPEG2-Lys-NHS。5分鐘后，向上面的溶液加入10當量DIEA。室溫攪拌混合物2小時，然后用C18反相HPLC純化。通過MALDI質譜證實PEG化肽的結構。還將純化的肽通過如下概述的陽離子交換層析進行純化。
本發明不限于本文描述的具體實施方案的范圍。實際上，根據前面的描述和附圖
，除了本文描述的之外對本發明的多種修飾對于本領域技術人員是顯而易見的。這些修飾意在所附權利要求書的范圍內。
本發明的說明書中引用和討論了多種參考文獻，包括專利、專利申請、方案和多種出版物。提供這些參考文獻的引用和/或討論僅僅是用于闡明本發明的描述并且不是承認此類參考文獻是本文描述的發明的“現有技術”。該說明書中引用和討論的所有參考文獻在此完整并入本文作為參考，就像每個參考文獻單獨并入作為參考一樣。
權利要求
1.包含肽部分和聚(乙二醇)部分的基于肽的化合物，其中聚(乙二醇)部分是線性的并且具有20K道爾頓以上的分子量。
2.權利要求1的化合物，其中聚(乙二醇)部分具有20到40K道爾頓的分子量。
3.權利要求2的化合物，其中聚(乙二醇)部分具有小于1.20的多分散值(Mw/Mn)。
4.權利要求1的化合物，其中肽部分是包含一個肽的肽單體。
5.權利要求1的化合物，其中肽部分是包含通過連接體部分連接的兩個肽的肽二聚體。
6.權利要求4或5的化合物，其中每個肽包含不超過50個氨基酸單體。
7.權利要求6的化合物，其中每個肽包含約10到25個氨基酸單體。
8.權利要求7的化合物，其中每個肽包含約12到18個氨基酸單體。
9.權利要求1的化合物，其中肽部分包含結合紅細胞生成素受體的肽。
10.權利要求1的化合物，其中肽部分包含結合血小板生成素受體的肽。
11.權利要求1的化合物，其還包含肽部分和聚(乙二醇)部分之間的間隔臂部分。
12.權利要求1的化合物，其中間隔臂部分具有結構-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-其中α、β、γ、δ和ε每個都是整數，它們的值獨立地選擇。
13.權利要求12的化合物，其中α為整數，1≤α≤6；β為整數，1≤β≤6；ε為整數，1≤ε≤6；δ為0或1；γ為整數，0≤γ≤10；Y為NH或CO。
14.權利要求13的化合物，其中γ＞1并且β＝2。
15.藥物組合物，其包含(a)基于肽的化合物，所述基于肽的化合物包含肽部分和聚(乙二醇)部分，其中聚(乙二醇)部分是線性的并且具有20K道爾頓以上的分子量；和(b)一種或多種藥學上可接受的稀釋劑、防腐劑、增溶劑、乳化劑、佐劑和/或載體。
16.權利要求15的組合物，其中聚(乙二醇)部分具有20到40K道爾頓的分子量。
17.權利要求15的組合物，其中聚(乙二醇)部分具有小于1.20的多分散值(Mw/Mn)。
18.權利要求15的組合物，其中肽部分是包含一個肽的肽單體。
19.權利要求15的組合物，其中肽部分是包含通過連接體部分連接的兩個肽的肽二聚體。
20.權利要求18或19的組合物，其中每個肽包含不超過50個氨基酸單體。
21.權利要求20的組合物，其中每個肽包含約10到25個氨基酸單體。
22.權利要求21的組合物，其中每個肽包含約12到18個氨基酸單體。
23.權利要求15的組合物，其中肽部分包含結合紅細胞生成素受體的肽。
24.權利要求15的組合物，其中肽部分包含結合血小板生成素受體的肽。
25.權利要求15的組合物，其還包含肽部分和聚(乙二醇)部分之間的間隔臂部分。
26.權利要求15的組合物，其中間隔臂部分具有結構-NH-(CH2)α-[O-(CH2)β]γ-Oδ-(CH2)ε-Y-其中α、β、γ、δ和ε每個都是整數，它們的值獨立地選擇。
27.權利要求26的組合物，其中α為整數，1≤α≤6；β為整數，1≤β≤6；ε為整數，1≤ε≤6；δ為0或1；γ為整數，0≤γ≤10；Y為NH或CO。
28.權利要求27的組合物，其中γ＞1并且β＝2。
29.權利要求1的化合物，其中聚(乙二醇)部分具有20到60K道爾頓的分子量。
30.權利要求1的化合物，其中聚(乙二醇)部分具有20K道爾頓的分子量。
31.權利要求1的化合物，其中聚(乙二醇)部分包含至少一條線性聚(乙二醇)鏈。
全文摘要
本發明涉及含有肽部分和聚(乙二醇)部分的基于肽的化合物，其中聚(乙二醇)部分(優選線性的)具有20K道爾頓(優選20到60K道爾頓)的分子量。肽部分可以是單體的、二聚體的或者寡聚體的。此類基于肽的化合物可以任選包括連接體部分和/或間隔臂部分。
文檔編號A61K47/48GK1820024SQ200480018757
公開日2006年8月16日 申請日期2004年5月12日 優先權日2003年5月12日
發明者C·P·霍姆斯, D·圖梅爾提, 殷群 申請人:阿費麥克斯公司