抑制膜病毒復制的藥物,其生產方法,藥物組合物和抑制病毒感染的方法

專利名稱：抑制膜病毒復制的藥物,其生產方法,藥物組合物和抑制病毒感染的方法
技術領域：
本發明涉及制藥工業，更具體地，涉及提供一種用于抑制膜病毒復制的藥物。
本發明涉及抑制具有糖脂膜的病毒復制的化合物及其藥學上可接受的鹽，例如人免疫缺陷病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSV)、丙型肝炎病毒(HCV)。
現有技術當前的研究致力于開發治療病毒感染的療法和方法，特別是HSV、HCV和HIV/AIDS，以及AIDS相關復合物引起的感染。免疫系統被擾亂的AIDS患者罹患這種病原體引起的成為直接死因的許多機會性感染，例如卡氏肺囊蟲和白色念珠菌、HSV、巨細胞病毒(CMV)、HCV或來自一些腫瘤的類型(卡波西肉瘤)。治療AIDS的方法還未知，當前在大多數病例中使用療法的效力缺乏充足的證據并具有不良的副作用。
HIV的特征在于高度遺傳可變性，因此也具有抗原可變性。即使從同一患者中但在不同疾病階段獲得的HIV毒株在抗原特性和核苷酸序列上可不同。不同的氣候地理區域具有不同的毒株。這使得AIDS的化療、免疫治療和疫苗預防變得復雜化。
迄今使用的治療HSV感染的大多數抗病毒方法是擾亂病毒DNA合成的物質，包括碘羥基尿苷、胞嘧啶、阿拉伯糖、腺嘌呤、阿拉伯糖苷和三氟胸苷。這些物質也影響相似的宿主細胞功能，涉及細胞毒性問題，這些問題使得它們不能在人中系統使用。現在，治療HSV感染的主要藥物是具有強抗病毒活性和低毒性的無環鳥苷。然而，其微弱的溶解度和耐藥性病毒的出現限制了該藥物的應用。
迄今還未開發出抗丙型肝炎的疫苗，干擾素和結合病毒唑的干擾素是主要使用的合適藥物。使用這些制劑治療成本高且效力不足。已知僅有25-40％的HSV-感染個體對干擾素治療有反應。
現在，AIDS化療與逆轉錄酶抑制劑的開發和使用相結合，也和HIV蛋白酶抑制劑的開發和使用相結合，HIV逆轉錄酶抑制劑是核苷性質的齊多夫定(AZT，Retrovir)、埃皮維爾3TC(Lamivudine)、維戴克斯(ddl，Didianosine)、希維德(ddc，Zalcitabin)、澤瑞特(d4T，Stavudine)、阿巴卡韋(ABC，Ziagen)、科姆維爾(齊多夫定+埃皮維爾)、Trizivir(阿巴卡韋+埃皮維爾+Zxidovudine)或非核苷性質的地拉韋定(rescriptor)、奈韋拉平(Viramune)、依法韋侖(Sustiva)或核苷酸性質的替諾福韋、Viread。在俄羅斯注冊的俄羅斯產的制劑疊氮膦(Phosphazide)。因為這些制劑干擾了基因組結構，所以也對大生物體有毒性。逆轉錄酶在整個疾病期間合成病毒DNA，因此為了生存使用HIV逆轉錄酶抑制劑是必需的。
現在，有幾種制劑代表HIV蛋白酶抑制劑沙奎納維(Invvirase)、印地納維(Crixivan)、里托納維(Norvir)、萘菲納維(Viracept)、氨普奈韋(Agenerase)、Kaletra(Lopinavir+里托納維)，HIV蛋白酶負責病毒蛋白質的成熟(加工)。擾亂糖蛋白加工導致HIV病毒顆粒不能與CD4細胞相連。
現在，術語“第三線治療”用于描述治療HIV/AIDS患者的特征，已證實這些患者的病原體對各類制劑的至少一種藥物有抗性，或使用兩種不同治療方案被證實是無效的。這種高度活性的抗逆轉錄治療(HAART)也用術語“mega-HAART”或“giga-HAART”表示。第三線治療包括同時使用4種具有不同的HIV復制阻斷機制的抗逆轉錄制劑核苷和非核苷逆轉錄酶抑制劑和蛋白酶抑制劑。預測各種藥物可能的負相互作用就更復雜了，結果副反應和并發癥的可能性急劇增加。在這種情況中需要時常檢測血清中藥物濃度，該方法是昂貴的。由于使用的藥物會導致伴隨的感染，需要使用抑制藥物活性的制劑來完成治療過程，這樣該治療方法就更復雜了。
已知的醫學制劑使得能控制疾病的過程，但不能治愈AIDS患者。仍然需要繼續開發能治愈或至少提供更好的防止致命病毒的藥物，并且該開發過程結合了借助于已知機制尋找能抑制病毒復制的新化合物和開發解決問題的新方法。
擴展了治療HIV/AIDS患者的制劑的范圍。現在，以下制劑正處于臨床研究階段Emtricitabine、DAPD(核苷類似物)、Kapravirin、TMC-120(非核苷類似物)。一些新的蛋白酶抑制劑也吸引了人們的注意力如Atazanavir(Erivada)、替拉那維、Mozenavir。進行了開發全新類型的制劑的研究交互酶(interase)抑制劑(S-1360)、融合抑制劑(噴他夫西(T-20或Fuzeon))、T-1249、PRO-542和趨化因子受體抑制劑(SCH-C和PRO-140)。然而，測試的結果尚不明確。例如，SCH-C制劑在施用最大劑量的測試中導致健康個體的ECG中QT間隔增加，這是可能心臟并發癥的征兆。融合抑制劑是多肽T-20由36個天然氨基酸片段組成、T-1249由39個片段組成。這些制劑限于靜脈內施用；在一些形成皮下結節的患者中施用T-20，結果偶然出現了皮下感染和膿腫。
高度聚合的聚陰離子天然化合物也值得注意肽聚糖、葡聚糖、多糖等。這些化合物低毒且能吸收病毒顆粒并可用作HIV病毒顆粒的生物異源物質“陷阱”。這些物質表現出抑制合胞體形成，但這些藥物對于病毒感染的直接作用尚不清楚(歐洲申請04065512和0467185)。關于磺化聚脲，提示(RU 2160746)具有從2000到4000分子量的這些物質通過以下機理抑制HIV、HSV和HCV活性合成寡聚物的陰離子基團與病毒和/或細胞膜結合并藉此干擾病毒的復制能力。
大多數已知最危險的病毒是HIV、HSV、HCV、CMC，流感病毒是典型的膜病毒。膜病毒感染宿主細胞最初以宿主細胞表面的各種受體與病毒糖蛋白的相互作用為基礎。然后，病毒與細胞膜融合并且病毒顆粒內含物流入宿主細胞的細胞質。干擾該過程可能會阻止病毒與宿主細胞最初的相互作用及其后來的融合，并且也抑制了病毒顆粒形成。
在WO 95/199491995中，一種物質作用于兩個靶位第一次成為可能在蛋白酶和HIV逆轉錄酶上。在RU 2196602中，第一次提出了同時抑制HIV感染和CMV感染的方法。抑制作用通過阻斷蛋白酶和逆轉錄酶以及后期gBCMV人結構蛋白質分子的活性位點的機理進行。兩個專利中均使用了富勒烯(fullerene)衍生物。
近來，注意力集中在富勒烯的生物活性以及有關使用其抗病毒的可能性上。開發醫學制劑道路上的主要障礙是關于富勒烯在水中的不溶性，這阻礙了其直接施用進人機體。
已知通過與聚乙烯吡咯烷酮形成加合物來制備水溶性形式的富勒烯的方法，如Kiselev O.I.等(Mol.Material，1998，11卷，41頁)所述。其表現出抗A型和B型的流感病毒的效力。
制備富勒烯的方法也是已知的，包括將預溶解在有機溶劑中的富勒烯與氯仿配制的聚合物基質混合，減壓蒸發混合物直至完全除去溶劑，得到的復合物溶解于磷酸鹽緩沖液(pH7.4-7.6)，然后超聲處理產物(RU 2162819，2001)。膜腦磷脂用作水溶性基質。
通過這種修飾作用制備的產物是不穩定的化合物，其水性溶液是懸浮液，這限制了其應用和保存的可能性。
有希望的趨勢是通過化學合成提供水溶性富勒烯衍生物。與本發明最相關的現有技術是描述于專利WO 95/199949、RU 2196602、RU 2124022和US6613771中的化合物及其制備方法。
含有通式所示的水溶性富勒烯衍生物的化合物是本領域已知的(WO 95/19949，1995，US 6613771，2003)。取代基是任何具有1到20個碳原子的烷基或芳烷基取代基，特別是那些用氮或氧取代的。然而，該化合物在水中溶解度低(等于1mg/ml)，并且其制備方法復雜。
RU 2196602提出了在基于氨基酸和富勒烯二肽衍生物的化合物的幫助下抑制HIV復制和CMV感染的方法。富勒烯-一氨基-己酸和富勒烯-一氨基-丁酸的鈉鹽用作富勒烯氨基酸衍生物。
按照技術本質和技術結果最接近的化合物是N-(一氫)-富勒烯-氨基-己酸HC60NH(CH2)5COOH(RU 2124022)。
為制備該化合物，向富勒烯的鄰-二氯苯溶液中加入氨基己酸鉀鹽的水性溶液和18-冠-6。反應混合物于60℃攪拌6-8小時。然后蒸餾去除溶劑，殘留物用飽和的氯化鉀溶液處理，并用水洗滌殘留的富勒烯衍生物的殘留物。定量目標產物的產量。獲得的N-(一氫)-富勒烯-氨基-己酸可溶于二甲基亞砜、二甲基甲酰胺和吡啶。
該合成方法不利的是，富勒烯C60與氨基己酸鉀鹽在兩相系統中的反應條件增加了過程時間；另外，18-冠-6用作增溶劑是昂貴的。
目標產物的產量低且不超過用于合成的富勒烯重量的5％。
所有專利均描述了氨基酸和肽對富勒烯的一元加成物的早期產物。然而，富勒烯沿著雙鍵具有許多等價的反應中心，這提供了形成聚加成產物的機會。

發明內容
本發明的一個目的是提供用于在治療膜病毒導致的疾病中抑制這些病毒活性的基于富勒烯聚羧基陰離子的一種藥物。
為解決提出的問題，做出了由相同的發明概念統一起來的一組發明一種含有富勒烯聚羧基陰離子的化合物的藥物，其生產方法，含有所述藥物的藥物組合物，以及用于抑制膜病毒復制的方法。
本發明的實質在于解決所述的問題和一種用于抑制膜病毒復制的藥物，該藥物含有通式C60Hn[NH(CH2)mC(O)O]n所示富勒烯羧基陰離子的水溶性化合物，其中C60是富勒烯核心，NH(CH2)mC(O)O-是氨基羧基陰離子，m是整數，優選3和5，最優選5，n是2到12的整數，優選4到6，最優選6。
提出的問題也通過提供一種抑制膜病毒復制的藥物的制備方法來解決，其中向富勒烯的鄰-二氯苯溶液中加入鉀鹽或鈉鹽形式的氨基酸，然后加入選自聚環氧烷的增溶劑分子量為150到400或更高的聚亞烷基二醇，也可加入聚乙二醇的二甲醚或18-冠-6，其中氨基酸的量必須超過富勒烯多于50倍，并且合成在60-80℃進行。
為解決提出的問題，本發明也提出了一種以有效量和藥學上可接受的賦形劑配制的用于抑制膜病毒復制的藥物組合物，該組合物含有通式C60Hn[NH(CH2)mC(O)O-]n所示富勒烯聚羧基陰離子的水溶性化合物，
其中C60是富勒烯核心，NH(CH2)mC(O)O-是氨基羧基陰離子，m是整數，優選3和5，最優選5，n是2到12的整數，優選4到6，最優選6。
用于抑制膜病毒復制的藥物組合物是以片劑、膠囊、注射用溶液、栓劑的形式。
用于抑制膜病毒復制的方法由在治療HIV/AIDS、皰疹感染、丙型肝炎病毒導致的疾病中抑制病毒的上述特性的藥物組合物組成。
在聚環氧烷烴存在下，富勒烯與氨基酸鹽在有機溶劑介質中反應得到如通式(I)所示的水溶性富勒烯聚羧基陰離子C60Hn[NH(CH2)mC(O)O-]n， (I)其中C60是富勒烯核心，NH(CH2)mC(O)O-是氨基羧基陰離子，m是整數，優選5，n是2到12的整數，優選4到6。
例如C60H2[NH(CH2)3C(O)O-]2-富勒烯-二-氨基-丁酸陰離子C60H2[NH(CH2)5C(O)O-]2-富勒烯-二-氨基-己酸陰離子C60H4[NH(CH2)5C(O)O-]4-富勒烯-四-氨基-己酸陰離子C60H6[NH(CH2)5C(O)O-]6-富勒烯-六-氨基-丁酸陰離子C60H6[NH(CH2)7C(O)O-]6-富勒烯-六-8-氨基-辛酸陰離子分子量與所得化合物的n和m值相關n＝4且m＝5時，C60H4[NH(CH2)5C(O)O-]4(富勒烯-四-氨基-己酸陰離子)的分子量是1240g；n＝6且m＝5時，C60H6[NH(CH2)5C(O)O-]6(富勒烯-六-氨基-己酸陰離子)的分子量是1500g。
為制備該藥物，向富勒烯的鄰-二氯苯溶液(甲苯或任何其它可接受的有機溶劑)中加入其鹽(鉀鹽或鈉鹽)形式的氨基酸，然后加入增溶劑。氨基酸和增溶劑引入反應介質的次序不重要，它們可在預混合后以復合物的形式引入。增溶劑可由各種聚環氧烷烴制成分子量為150到400或高于400的聚乙二醇(例如，PEG-1500)，也可是具有取代的末端基團(例如，分子量為500的聚乙二醇二甲酯)或環狀結構(例如，18-冠-6的鉀鹽)的聚乙二醇。
按照本發明，富勒烯/氨基酸的比例大于50倍。當所述比例小于50倍時，得到的化合物具有較低的水溶性和高的毒性。
最優化的合成溫度是+(60-80)℃。
通過用合適的堿來處理酸可實現所需藥學上可接受的鹽的轉化，特別是鈉鹽或鉀鹽。具體地，水不溶性的富勒烯-聚羧酸轉化為更優選的藥學上可接受的、能溶于水的鹽，例如鈉鹽。
目標產物的產量不低于所用富勒烯的150％。本發明的目標產物的特征在于組成恒定，目標產物中主要物質的含量大于90％。
式(I)所示化合物是固體、棕黑色無味的晶體物質，其鹽形式可溶于水而酸形式不溶于水。所述化合物的鈉鹽溶于水時形成具有飽和的棕紅色的非透明溶液。式(I)所示化合物的鈉鹽溶于冰醋酸、不溶于96％乙醇、鄰-二氯苯、甲苯和丙酮。酸形式的所述化合物易溶于DMSO(實施例1)。
式(I)所示化合物于400℃或更高的溫度完全燒毀，這與富勒烯在420℃熔化截然不同。
式(I)所示化合物的真實性由399-4000cm-1區域中的IR光譜確認圖形和吸收區帶與富勒烯有大于90％的一致性；與氨基酸的一致性不低于80％；合成的重現性不低于80％。氨基酸基團不同的富勒烯衍生物沒有這種相似性(實施例2)。
所得化合物的結構的具體特性在于分子中存在幾個羧基基團，這些羧基取決于介質的pH而處于鹽式或酸式，從而表現出緩沖性能。所述化合物的轉化為溶解狀態的pH是5.6-6.0。
在Merck 60F254硅膠板上進行TLC。化合物分離的最佳結果得自以下展開劑系統乙酸乙酯-苯-水4∶1∶1.5。在該系統中，發現具有氨基己酸的富勒烯衍生物的Rf值為0.82、0.71和0.47的3個斑點，具有氨基辛酸的富勒烯衍生物的Rf值為0.82的1個斑點，具有氨基丁酸的富勒烯衍生物的Rf值為0.47的1個斑點。加入茚三酮的樣品顯示產物中沒有具有伯氨基團的化合物(實施例3)。
式(I)所示化合物用具有不同溶劑化能力的氘化溶劑配制的溶液的1H和13C-NMR譜于20℃記錄在工作頻率為1H是200.13MHz和13C是50.32MHz的WM-200儀器上。
13C-NMR(δ，D2O)25.2(CH2CH2C(O)O-)，25.4(CH2(CH2)2C(O)O-)，26.8(CH2C(O)O-)，69.5(CH2NH)，130-160(C60)，183.7(C(O)O-)。
1H-NMR(δ，CD3OD)1.16d(1H，J＝6.0Hz，-NH-)，1.26；1.45和1.65(分別是3m，1H，3H，-(CH2)3-)，2.18；2.23；(2s，0.2H，-NH...)，2.34t(2H，J＝7.2Hz，-CH2C(O)O-)，2.94brt(0.4H，J＝6.0Hz，J＝1.8Hz，-NCH2-)，3.6m(1H，J＝1.8Hz，J＝6.0Hz，C60H)。
1H-NMR(δ，DMSO-d6)1.02d(0.4H，J＝6.0Hz，-NH-)，1.22；1.32和1.52(3m，6H.，-(CH2)3-，0.90；2.08(2s，各自是0.3H，-NH...)，2.20t(2H，J＝7.2Hz，-CH2C(O)O-)，2.68q(2H，-NCH2-)，7.46m；8.17s(各自是0.5H，C60H)，12.08brs(1H，-C(O)OH)。
1H-NMR(δ，D2O)1.25m，1.49m(分別是2H，4H，J＝7.8Hz，J＝6.9Hz，-(CH2)3-)，1.88d，(0.1H，J＝1.6Hz，-NH...)，1.89d(0.1H，J＝5.5Hz，-NH...)，2.05d(0.1H，J＝1.6Hz，-NH...)，2.24t(2H，J＝7.3Hz，-CH2C(O)O-)，2.82br t(1.5H，J＝1.6Hz，J＝7.5Hz，-NCH2-)，3.9m；(1H，J＝5.5Hz，C60H)。
提出的化合物的以下特性以分子中的富勒烯核心的存在為條件，許多獨立的多重鍵使得富勒烯被視為聚烯烴系統。通過多重鍵進行的加成是富勒烯最典型的。容易加上親核試劑與游離基團，這使得這些物質有可能用作抗氧化劑。
本發明的技術結果提供了一類新穎的化合物將試劑與兩種或多種氨基酸經由幾根雙鍵親核加成到富勒烯中得到的通式(I)所示富勒烯-羧基陰離子。
不同于富勒烯，這些化合物具有新的特性，在水中比類似物的可溶性更好，藉此提供所述化合物對感染細胞作用的高效力和低毒性。
所述化合物的具體特性在于其對于人致病的各種病毒(包括HIV、HSV、HCV)具有廣范的抗病毒活性。
在式(I)所示化合物作用下，所有檢測感染細胞方法的實驗中均發生了對病毒誘導的細胞病變作用的抑制以及降低了培養液中病毒抗原的水平。所以，在以100 TCD50的劑量連續感染細胞培養物7-10天之后，濃度為1μg/ml的制劑(富勒烯-聚氨基-己酸的鈉鹽)為再接種的成淋巴細胞樣的人細胞MT-4提供了抗HIV-1的病毒細胞病變作用(VCA)的全面保護。制劑濃度為10μg/ml時，培養基中未檢測到病毒。在這些濃度或更高的濃度(至100μg/ml)，制劑未表現出對細胞的細胞毒性作用。在96小時期間通過蛋白質和核酸在硝酸銀染色的12.5％PAAG中電泳，判斷蛋白質和核酸分布沒有變化，所述化合物在1、10和100μg/ml的研究濃度對于淋巴細胞培養的生物合成過程顯示無作用。人免疫缺陷病毒感染的細胞在培養24-48小時后，分布比正常細胞培養物和有制劑的情況弱。同時，在有研究濃度(1和10μg/ml)的所述化合物的條件下，病毒誘導的細胞在帶強度和圖譜中的分布對應于對照培養。其它具有氨基丁酸和8-氨基辛酸的富勒烯衍生物表現出低于具有氨基己酸的有關HIV-1的抗病毒活性(實施例4)。
所述化合物在細胞培養物感染48小時之后，以100 TCD50的劑量給藥，濃度為10μg/ml的富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽為非洲綠猴腎細胞(VERO)和人胚胎成纖維細胞(M-21)的再接種培養物提供抗單純皰疹病毒(HSV-1)的細胞破壞作用的全面保護。在同樣的時間期間，在未接受所述化合物作用的對照感染細胞培養物中，細胞100％死亡。式(I)所示化合物-具有各種氨基酸的富勒烯衍生物-表現出有關HSV-1的抗病毒活性。(實施例5)式(I)所示化合物的抗病毒活性在豬胚胎腎(SPEV)的再接種細胞培養物的HSV-誘導感染的實驗模型中進行評價。在我們的工作中使用了屬于基因型1b、劑量為TCD50的丙型肝炎病毒的致細胞病變毒株。所以，濃度為100μg/ml的富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽使得在感染后第7天的HCV感染的細胞100％存活。得到的結果表明，濃度達100μg/ml的制劑對SPEV細胞培養物沒有細胞毒性特性。同時，感染了30-40％單層細胞的HCV感染細胞培養物已經在第4天和第7天發生了致細胞病變現象，結果所有的HCV感染細胞死亡。HCV感染的細胞在感染24小時后用該制劑處理的情況中，該制劑也表現出相似的活性。然而，當同時與病毒施用時，該制劑表現出最大的抗病毒活性當制劑濃度是100μg/ml時，SPEV細胞的培養物中病毒滴度降低了7.41g，當制劑濃度為50μg/ml時病毒的滴度降低了3.01g(實施例6)。
確定了所述化合物抑制人上皮癌Hep2的再接種細胞的增殖效力的作用。所以，濃度為10、50和100μg/ml(最明確的是100μg/ml)富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽抑制Hep2癌癥細胞的單層形成，這可能反映了所述化合物對有絲分裂活性的影響。單層形成速率的降低、在含有制劑的樣品中蛋白質含量較少以及其中的核酸含量減少均支持了增殖的抑制。獲得了可證實在該制劑影響下不存在細胞凋亡誘導的數據未記錄到DNA斷裂、沒有形成可溶性和膜mRNA的重分配，而這是檢測到Fas-依賴性凋亡可能性的征兆。(實施例7)式(I)所示化合物的制劑的藥學即用形式可制備成用于口服或胃腸外施用的劑型來治療或預防病毒感染和表明要使用抗氧化劑和解毒劑的疾病。
該化合物與常規的藥物載體混合并以片劑、膠囊、栓劑、軟膏劑或注射用溶液等形式使用。含有式(I)所示化合物的組合物含有約0.1-90重量％，優選0.5-10重量％的活性化合物。本發明的化合物可口服、胃腸外或直腸施用，可含有常規的無毒藥學上可接受的載體、興奮劑和輔助劑。這種藥物組合物可生產為用于口服的膠囊或片劑的形式，作為注射的無菌制劑或栓劑。就作為膠囊和片劑的口服使用而言，組合物可按照制備藥物制劑領域廣為知曉的方法制備，這些組合物可含有該領域已知的微晶纖維素、淀粉來提供主體，還可含有硬脂酸鎂與乳糖和/或其它賦型劑，粘合劑、膨脹劑、崩解劑、稀釋劑和潤滑劑。用于注射的溶液可按照已知的方法使用無毒、胃腸道外可應用的稀釋劑或溶劑來制備，例如甘露醇、1，3-丁二醇、水、Ringer溶液、氯化鈉的等滲溶液。在直腸施用的栓劑中，這種組合物可通過將藥物與等量的非刺激性賦型劑混合來制備，例如可可脂、合成甘油酯或聚乙二醇，這些賦型劑在常溫下是固體，但在直腸腔中融化和/或溶解同時釋放藥物(實施例8)。
提出的化合物可用于治療HIVE、HSV、HCV導致的疾病。通過使用藥學上可接受劑量的式(I)所示化合物來治療感染性疾病同時影響幾種病毒并涉及各種病毒復制階段。已表明治療伴隨著施用制劑的應激效應的降低，增強生物體抗感染的抗氧化保護的作用。生物體中毒是一些病毒感染過程的特征并導致疾病的危險性。計算的數據表明0.1-250或2500mg/天可用于治療或預防以上癥狀，口服劑量可高2-5倍。具體每位患者的具體劑量水平和藥物施用頻率可以變化并取決于許多因素，包括所選擇化合物的活性、其代謝穩定性和作用的時間、患者的年齡、體重、一般身體狀況、性別、施用的類型和時間、消除率、藥物組合(實施例9)。
式(I)所示化合物可與其它抗病毒藥物、免疫調節劑、抗感染藥物或疫苗和任何用于治療的藥物制劑的各種組合一起使用。
附圖簡述

圖1.顯示了在NICOLET EZ OMNIC軟件(美國)的NICOLET“AVATAR320-FT.IR”紅外光譜儀(美國)上記錄的富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽的圖譜；圖2.1在NICOLET EZ OMNIC軟件(美國)的幫助下通過紅外光譜技術證實了富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽的真實性(富勒烯核心的存在)；圖2.2在NICOLET EZ OMNIC軟件(美國)的幫助下通過紅外光譜技術證實了富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽的真實性(氨基己酸)；圖3顯示了使用NICOLET EZ OMNIC軟件(美國)的NICOLET“AVATAR320-FT.IR”紅外光譜儀上記錄的富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽樣品紅外光譜和吸收帶；圖4.顯示了NICOLET EZ OMNIC軟件(美國)的NICOLET“AVATAR320-FT.IR”紅外光譜儀(美國)上記錄的富勒烯-聚氨基-己酸和富勒烯-聚氨基-丁酸鈉鹽樣品紅外光譜和吸收帶；圖5.顯示了式(I)所示化合物的TLC結果。富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽樣品(ACA-15、ACA-21、ACA-22-顯示了合成的數目)有Rf＝0.82、0.71、0.47的3個斑點，富勒烯-聚氨基-丁酸(ABA)鈉鹽-Rf＝0.47，富勒烯-聚氨基-辛酸(AOA)鈉鹽-Rf＝0.82，富勒烯維持在起點。
圖6顯示了在96小時期間，式(I)所示化合物在用HIV1感染的成淋巴細胞樣人細胞培養物中對生物合成過程的影響。圖中顯示了蛋白質的電泳圖a)非感染培養物的；b)HIV-1感染培養物的；c)在具有濃度為1μg/ml的制劑(富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽)的情況下非感染細胞的；d)具有濃度為1μg/ml的制劑的HIV-1感染細胞的；e)具有濃度為10μg/ml的制劑的非感染細胞的；f)具有濃度為10μg/ml的制劑的HIV-1感染細胞的；圖7說明了式(I)所示化合物(富勒烯)與無環鳥苷的比較作用保護VERO細胞(A)和M21細胞(B)免遭1型皰疹病毒的細胞病變作用。使用濃度為10、50、100μg/ml的富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽得到的結果。
圖8顯示了用濃度為10、50、100μg/ml的富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽作用于人上皮癌細胞Hep2的再接種培養物Fas-抗原的膜形式(a)和可溶性形式(b)。
實踐本發明的最佳實施例實施例1.合成.一些式(I)所示化合物的特性.
2.5g一批的富勒烯溶解于鄰-二氯苯(o-DCB)中，加入摩爾比為1∶1一半體積的PEG-500和氨基己酸鉀鹽。反應混合物維持于70℃攪拌至少4小時。除去溶劑，干燥沉淀物直至無o-DCB的氣味。通過加入約120ml 8％鹽酸，pH5.0制備酸式化合物，通過將酸式化合物溶解于0.1N氫氧化鈉得到pH7.0的鹽式。產物的產量為5.6g，是所使用的富勒烯的224％。
360mg一批的富勒烯溶解于甲苯。將16g氨基丁酸鉀鹽和50g PEG-500引入溶液。然后的過程如上所述。產量為540g，是所使用富勒烯的150％。
富勒烯及其衍生物的溶解性列于表1。
實施例2.酸式或其鈉鹽的式(I)所示化合物在具有KBr的圓盤中進行其在IR光譜區域的光譜檢測。為此，1mg初步干燥的制劑在研缽中與150mg光譜純的溴化鉀混合并將混合物于7.5-10cm-1的壓力下壓縮2-5分鐘。
所得樣品的光譜記錄于使用NICOLET EZ OMNIC軟件(美國)的NICOLET“AVATAR 320-FT.IR”IR光譜儀(美國)。光譜參數分辨率，4cm-1；格式-光密度；范圍，399-4000cm-1；取樣頻率，1.929cm-1。通過校正H2O/CO2線來處理光譜(圖1)。同時在相同條件下記錄用于合成的富勒烯和氨基酸的IR吸收光譜。
為確認所述化合物中存在氨基酸和富勒烯，使用減色光譜的方法，接著在NICOLET EZ OMNIC軟件(美國)的幫助下處理結果(圖2.1，2.2)。不同合成方式得到的富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽樣品的IR光譜圖形和吸收帶的一致性超過80％。(合成的數目示于圖3.)。富勒烯-聚氨基-丁酸和富勒烯-聚氨基-己酸的圖形的一致性基本上低一些(圖4.)。
實施例3.TLC.通過TLC技術分離式(I)所示的化合物制備式(I)所示化合物的溶液用水配制濃度為1μg/ml的富勒烯-聚氨基-己酸、富勒烯-聚氨基-丁酸和富勒烯-聚氨基-辛酸的鈉鹽溶液。富勒烯溶解于甲苯。
10μl(10μg)測試溶液點樣于Silufol層析板(10×15cm，0.1mm厚層)的起始線上。
板在空氣中干燥10分鐘，然后置于具有混合溶劑(苯醇∶96％乙醇∶水＝1∶4∶1.5)的展缸中并進行上行層析。當溶劑前端展開至離起始線約10cm處時，取出板并于空氣中干燥20分鐘。
在層析板上發現了Rf＝0.82、0.71、0.47的3個斑點富勒烯-聚氨基-己酸為0.47，富勒烯-聚氨基-丁酸為0.47，富勒烯-聚氨基-辛酸為0.82；富勒烯留在起點(圖5)。
TLC.估計制劑中游離氨基酸的含量。
用水配制濃度為1μg/ml的富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽的測試溶液。
參考溶液是濃度為0.05μg/ml(5％)和0.01μg/ml(1％)的氨基己酸(ACA)的水溶液。
10μl(10μg)測試溶液和10μl的每種參考溶液點樣于Silufol層析板(10×15cm，0.1mm厚層)的起始線上。
板在空氣中干燥10分鐘，然后置于具有混合溶劑(正丁醇∶96％乙醇∶水＝2∶2∶1)的展缸中并進行上行層析。當溶劑前端展開至離起始線約10cm處時，取出板并于空氣中干燥20分鐘。然后置于95-100℃的干燥箱10分鐘。冷卻后的板噴上用丙酮配制的25％茚三酮溶液，在空氣中干燥5分鐘，然后置于95到100℃的干燥箱內5分鐘。
在測試溶液的層析板上，除了主要的斑點之外，還允許存在粉紅色斑點，該斑點的大小和顏色強度不超過參考溶液在層析板上的斑點(分別是不超過5％或1％)。
配制0.25％茚三酮溶液。0.25g茚三酮置于100ml容量瓶中，溶解于20ml丙酮中，體積定容至標記并攪拌。該溶液應在使用時新鮮配制。
實施例4.在人成淋巴細胞樣細胞模型上評價式(I)所示化合物有關HIV-1的抗病毒活性。
細胞.使用再接種的人成淋巴細胞樣的細胞MT-4。細胞以3.0-5.0×105個細胞/ml培養在具有10％胚胎血清、10μg/ml慶大霉素的RPMI 1640培養基中。細胞的存活率用0.4％的臺盼藍溶液染色來確定。
病毒.來自俄羅斯醫學科學院，Ivanovskii病毒學研究所收集的的人免疫缺陷病毒的HIV-1899A病毒株用作病毒源。
Glaxo Wellcome(英國)生產的雷特羅維(疊氮胸苷)用作陽性對照。
確定抗病毒活性.在塑料24孔板上用成淋巴細胞樣細胞模型檢測制劑的抗病毒活性。病毒劑量是100 TCD50(50％組織細胞致病變劑量)。培養物于37℃在具有5％CO2、98％濕度的環境中培養5-7天直至計算結果之時。通過免疫酶分析細胞培養物中病毒誘導的細胞病變作用(CPA)的抑制和病毒抗原水平來確定該制劑的活性。
在制劑(富勒烯-聚氨基-丙酸鈉鹽)劑量為1μg/ml時，檢測到了對細胞避免病毒CPA的全面保護(表2)。在這些濃度未檢測到制劑對細胞的細胞毒性作用。測定了培養基中的病毒消失時制劑的濃度(表5)。研究了施用制劑的不同方案(表7.1和7.2)。氨基己酸或PEG均未表現出抑制HIV的作用(表8)。
通過蛋白質和核酸在用硝酸銀染色的12.5％PAAG中電泳來研究式(I)所示化合物對HIV-1感染的淋巴細胞的生物合成途徑的影響。培養后，通過離心使細胞沉淀，并置于含有Tris、pH8.0，EDTA，Triton X305和PMSF的溶液中。通過在96小時期間，初始培養物中、病毒感染的培養物中、濃度為1、10和100μg/ml的制劑作用于未感染細胞的培養物中和1、10μg/ml制劑作用于HIV感染細胞的培養物中蛋白質-核酸分布的變化來評價結果(圖6)。
其它富勒烯衍生物與富勒烯-聚氨基-己酸相比，富勒烯-聚氨基-丁酸和富勒烯-聚氨基-辛酸鈉鹽表現出相對較低的有關HIV-1的抗病毒活性(表8和9)。
實施例5.在非洲綠猴腎細胞(VERO)和人胚胎成纖維細胞(M-21)的再接種培養物模型上評價式(I)所示化合物有關HSV-1的抗病毒活性。
細胞.來自俄羅斯醫學科學院，Ivanovskii病毒學研究所的非洲綠猴腎細胞(VERO)和人胚胎成纖維細胞(M-21)的再接種培養物用于檢測。
病毒.在VERO細胞中復制的1型單純皰疹病毒的毒株L2用于檢測。
AZT無環鳥苷用作陽性對照。
檢測細胞毒性作用。在單層形成階段將濃度為500和1000μg/ml的制劑(富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽)引入非感染細胞培養基中。3天跟蹤檢測的培養物中未表現出所檢物質的細胞破壞作用。
在用100 TCD50病毒感染劑量感染培養物30和60分鐘后，基于制劑引入來研究濃度為1.0、10和50μg/ml的富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽的保護作用。得到的結果表明，細胞培養物感染48小時后制劑提供完全保護VERO和M-21免受HSV-1的細胞破壞作用。在對照組的跟蹤期間，檢測未經過化合物作用的感染細胞，觀察到100％的細胞死亡。在濃度為10-4到10-2M的PEG和氨基己酸的存在下未觀察到保護細胞免收HSV。
式(I)所示化合物有關HSV-1的不同抗病毒活性取決于氨基酸基團(表10)。
實施例6.在細胞培養物中HSV誘導感染的實驗模型上評價式(I)所示化合物的抗病毒活性。
在我們的工作中使用了屬于基因型1b的丙型肝炎病毒的致細胞病變毒株。毒株分離自患慢性丙型肝炎的女性患者血清，該毒株鑒定為丙型肝炎病毒。用于檢測的HSV感染劑量等于50/20μl的10TCD。
檢測在Ivanovskii病毒學研究所(俄羅斯醫學科學院)的實驗室中進行。
使用得自“Narva”公司(俄羅斯)的對HSV致病作用高度敏感的豬胚胎腎細胞(SPEV)再接種細胞培養物。這些培養物以生長在24-孔塑料板上的1天單層細胞的形式使用。SPEV細胞培養物生長在具有10％胎牛血清并添加了谷氨酰胺和抗生素(100U/ml)的培養基199中。
使用相同系的豬胚胎腎細胞(SPEV)來滴定殘留的病毒感染。
實驗中使用培養基199中100μg/ml和低一些的不同稀釋度的制劑-富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽。為研究制劑的抗病毒活性，在用丙型肝炎病毒感染時和感染24小時后將各種濃度的制劑引入24-孔塑料培養板上的SPEV細胞培養物中。
在感染后的第7天研究HSV感染和未感染的SPEV細胞培養物的存活率。
為確定殘留的HSV感染活性，用制劑處理感染的細胞后從板上的細胞中提取培養液樣品并在SPEV細胞培養物中滴定。應用計算丙型肝炎病毒滴度的Rid和Mench公式，從感染后第6-7天(產生病毒的最大細胞病變作用時)的滴度結果計算HSV的感染活性。
得到的結果表明，濃度達100μg/ml劑量的制劑無SPEV細胞培養物的細胞毒性性質(表11)。
濃度為100μg/ml的制劑在感染后第7天提供了HSV感染細胞的100％存活率(表12)。在相同條件下，Reaferonum也誘導了細胞的100％存活。
同時，在用10 TCD50/細胞劑量的HSV感染的細胞培養物中，早在第4天和第7天就產生了影響30-40％的單層細胞的細胞病變現象，通常所有的HSV-感染細胞死亡。
當在感染24小時后用制劑處理HSV感染細胞時，該制劑表現出類似活性。然而，該制劑在同時施用病毒時表現出最大的抗病毒活性制劑濃度為100μg/ml時，SPEV細胞培養物中的病毒滴度降低了7.41g，而制劑濃度為50μg/ml時，降低了3.01g(表13)。
實施例7.式(I)所示化合物對人上皮癌Hep2的再接種細胞增殖的影響。
我們在實驗中使用1天培養的傳代14 Hep2細胞-人上皮癌的再接種細胞。
含有DMEM+谷氨酰胺+抗生素+5％FBS(胎牛血清)的生長培養基。支持培養基是DMEM/用兩套(kit)氨基酸和維生素+谷氨酰胺+抗生素+10％牛血清加強效果。
研究制劑對富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽的實施例中細胞培養物的生物合成過程的影響表明濃度為10、50和100μg/ml的制劑明顯抑制Hep2細胞的增殖。這種影響作用在第7天使用濃度為100μg/ml的制劑時最明顯在單層中出現了不連續性并且培養基中有許多細胞團聚體。
從玻璃板上取出500μl培養基中的單層細胞。從200μl中沉淀細胞，重懸于裂解緩沖液中；在用Kumashi染色的12.5％PAAG中進行蛋白質電泳。
與對照相比，研究的制劑濃度在第2天觀察到蛋白質分布強度的降低并且在第7天降低最劇烈。這表明，由于制劑的存在抑制了細胞有絲分裂的活性，細胞數量降低了。與對照相比，在第7天觀察到制劑的作用造成的DNA數量降低。未檢測到DNA斷裂，即未檢測到細胞凋亡現象。
為確定制劑對胞內生物合成過程的影響，我們分析了Hep2細胞中Fas-抗原mRNA的合成與成熟。Fas-抗原是細胞程序性死亡(細胞凋亡)信號的受體蛋白，并且它可存在兩種形式膜形式和可溶形式。在有制劑的情況中，發生了Fas-抗原mRNA的交替形式的重分配，這說明制劑對Hep2細胞中轉錄水平的生物合成過程有影響；然而，重分配說明Fas-依賴性細胞凋亡的可行性不存在(圖8.)。
實施例8.以下提供的制劑是作為本發明劑型的例子直腸栓劑，該制劑含有0.1到200mg，通常是5-20mg式(I)所示化合物，達10％丙二醇以及達2g的親脂性堿。
膠囊含有0.1到1000mg式(I)所示化合物(通常為50到200mg)，填充膠囊所需量的淀粉或其替代物。
注射用溶液含有0.1到1.0體積％的式(I)所示化合物(通常為0.5％)；850mg氯化鈉；30mg氯化鉀。注射用水配成100ml。
實施例9出生于1981年的男性患者A原來未接受過抗病毒制劑。自從2003年8月以來確定為疾病的3A期。診斷為巨細胞病毒(CMV)感染、潛伏期、口咽和尿道念珠菌病、單純皰疹、復發期。伴發病慢性腎盂腎炎、細菌性復發(relapsing bacterial)、具有低復制的慢性丙型肝炎。初期實驗室分析數據血漿中RNA的數量是120000拷貝/ml，淋巴細胞中的病毒滴度等于1∶8，T4淋巴細胞的數量是59mm3，存在對HIV-1的抗體。患者志愿接受本發明制劑的治療。按照以下時間表進行治療第一個月-以20mg直腸栓劑的形式施用制劑(富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽)，在3個月期間每天一枚栓劑。
出生于1980年的男性患者V。自從2003年8月以來確定為HIV感染的3A期。擴散性皰疹感染并有生殖器、腹股溝和臀區域損傷。口咽和尿道念珠菌。巨細胞病毒(CMV)感染潛伏期。伴發病綜合形式的慢性乙型肝炎。初期實驗室數據血漿中RNA的數量是140000拷貝/ml，淋巴細胞中的病毒滴度等于1∶4，T4淋巴細胞的數量是163mm3，T-指數等于0.6，淋巴細胞總量是0.53×10-6/ml，存在對HIV-1的抗體，這使我們能對疾病做出結論。患者志愿接受本發明制劑的治療。按照以下時間表進行治療每3天施用20mg直腸栓劑，在3個月期間每天一枚栓劑。患者的臨床分析數據見表14。
使用本發明的制劑表現出改善了患者的情況。
表1富勒烯及其衍生物的溶解度

表2在成淋巴細胞樣細胞(第5天)的模型上檢測富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽對于人免疫缺陷病毒(HIV-1)的抗病毒活性

附注*是對照的非感染細胞**是對照病毒-100TCA50
表3在人成淋巴細胞樣細胞模型上檢測富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽細胞毒性

附注*是對照的非感染細胞表4在細胞培養物模型上檢測參考制劑“雷特羅維”(0.3μg/ml)對于人免疫缺陷病毒的活性

附注*是對照的非感染細胞**是對照病毒-100TCA50表5在細胞培養物模型上通過免疫酶分析檢測制劑對于人免疫缺陷病毒的活性(第6天)

附注值＞0.086為HIV陽性表6在細胞培養物模型上檢測PEG對于人免疫缺陷病毒的活性(第6天)

表7.1在人成淋巴細胞樣細胞模型上檢測取決于制劑的引入方案的富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽對于HIV-1的抗病毒活性

表7.2在人成淋巴細胞樣細胞模型上取決于制劑的各種引入方案的富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽對于HIV-1的抗病毒活性


表8在人成淋巴細胞樣細胞模型上檢測富勒烯衍生物對于HIV-1的抗病毒活性

表9在人成淋巴細胞樣細胞模型上的富勒烯衍生物對于HIV-1的抗病毒活性

AOA-富勒烯-聚氨基-辛酸鈉鹽ABA-富勒烯-聚氨基-丁酸鈉鹽表10在非洲綠猴腎細胞(VERO)培養物模型上檢測富勒烯衍生物的抗-皰疹活性

病毒HSV-1，10TCD50/ml
*物質與細胞的接觸時間A-24小時，B-48小時表11富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽對再接種的豬胚胎腎細胞(SPEV)培養物的細胞毒性性能

表12有富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽的情況中感染后第7天HSV感染的SPEV細胞培養物的生存率

表13在HSV感染的SPEV細胞培養物模型上研究富勒烯-聚氨基-己酸鈉鹽的抗病毒活性

表14檢測用制劑治療的HIV-1感染患者的血液樣品

附注*在細胞培養物中得到50％CPE(或合胞體)的樣品稀釋度的倒數值
權利要求
1.一種抑制膜病毒復制的藥物，其特征在于，所述藥物含有通式C60Hn[NH(CH2)mC(O)O]n所示富勒烯聚羧基陰離子的水溶性化合物，其中C60是富勒烯核心，NH(CH2)mC(O)O-是氨基羧基陰離子，m是整數，優選3和5，最優選5，n是2到12的整數，優選4到6，最優選6。
2.一種抑制膜病毒復制的藥物的生產方法，其特征在于，向富勒烯的鄰-二氯苯溶液中引入鉀鹽或鈉鹽形式的氨基酸，然后加入選自聚環氧乙烷的增溶劑分子量為150到400或更高的聚乙二醇，以及聚乙二醇的二甲醚或18-冠-6，其中氨基酸的量應大于富勒烯的量50倍，并且合成在60-80℃進行。
3.一種用于抑制膜病毒復制的藥物組合物，其特征在于，所述組合物含有有效量的如權利要求1所述的藥物和藥學上可接受的填充劑。
4.一種如權利要求3所述的用于抑制膜病毒復制的藥物組合物，其特征在于，所述組合物以片劑、膠囊、注射用溶液、栓劑的形式制備。
5.一種用于抑制膜病毒復制的方法，其特征在于，當治療HIV、皰疹病毒、丙型肝炎病毒導致的疾病時，用權利要求3和4所述的藥物組合物抑制病毒。
全文摘要
本發明涉及制藥工業，更具體地，涉及提供一種用于抑制膜病毒復制的藥物。本發明的目的在于提供一種在治療膜病毒導致的疾病中用于抑制這些病毒活性的基于富勒烯羧基陰離子的藥物。為實現所述目的，提出了由相同的發明概念聯合的一組發明所述一組發明包括一種制備化合物的方法，研究了作用機制，提供藥物組合物，并開發了使用組合物進行治療的方法。所述目的通過選擇保證聚加成產物制備的成分的定量比例和反應條件來實現。在合成中，氨基酸的量已確定必須超過富勒烯的量大于50倍。通過提出的方法制備的產物具有不受限的水溶性、所需的生物利用度、對感染細胞的高效作用和低毒性。目標產物中主要物質的含量至少有90％。該方法適合于流水線生產并可用于制藥工業。本發明開發了用于治療人免疫缺陷病毒(HIV)、單純皰疹病毒(HSC)和丙型肝炎病毒(HCV)導致的感染性疾病的藥物組合物和方法。
文檔編號A61K31/185GK1819834SQ200480017167
公開日2006年8月16日 申請日期2004年5月31日 優先權日2003年6月23日
發明者列弗·達維多維奇·拉斯那特叟夫, I·Y·斯瓦茨曼, I·K·萊爾納, B·E·拉斯特索瓦 申請人:列弗·達維多維奇·拉斯那特叟夫