治療淀粉樣蛋白斑相關(guān)性病癥的nogo－受體拮抗劑的制作方法

專利名稱：治療淀粉樣蛋白斑相關(guān)性病癥的nogo－受體拮抗劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及神經(jīng)生物學(xué)、神經(jīng)病學(xué)以及藥物學(xué)。更具體地，其涉及通過(guò)給予Nogo受體拮抗劑來(lái)治療異常淀粉樣蛋白-β(amyloid-β)(Aβ)肽的產(chǎn)生及沉積的相關(guān)疾病的方法，所述疾病包括阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease)。
背景技術(shù)：
阿爾茨海默病(AD)是一種神經(jīng)變性紊亂，其導(dǎo)致記憶、認(rèn)知、推理、判斷以及情緒穩(wěn)定性的進(jìn)行性喪失，最終導(dǎo)致死亡。AD的病理學(xué)標(biāo)記是腦中淀粉樣蛋白斑(amyloid plaque)的存在。但是，淀粉樣蛋白斑及血管淀粉樣蛋白沉積物(淀粉樣血管病(amyloid angiopathy))也存在于其它病癥中，例如，在Trisomy 21(唐氏綜合征(Down’s Syndrome))、具有Dutch型淀粉樣變性的遺傳性腦出血(HCHWA-D)以及腦淀粉樣血管病(CAA)中。淀粉樣蛋白斑的主要成分是Aβ肽，其是通過(guò)β-分泌酶(βACE)及γ-分泌酶(早老素-1，2及相關(guān)蛋白)經(jīng)蛋白水解作用于淀粉樣(amyloid)前體蛋白(APP)而得到的。APP通過(guò)α-分泌酶及γ-分泌酶也轉(zhuǎn)變?yōu)闊o(wú)害的肽及蛋白片段。對(duì)人類家族性AD(FAD)的遺傳學(xué)研究已發(fā)現(xiàn)在APP和/或早老素中的突變改變了總Aβ肽的產(chǎn)生或原纖維生成性(fibrillogenic)Aβ42-3肽與其它APP裂解產(chǎn)物的比率。此外，表達(dá)突變的人FAD型APP的小鼠無(wú)論是否有早老素突變都具有淀粉樣蛋白斑沉積以及認(rèn)知損傷。
盡管AD涉及Aβ肽，仍不太確定何種形式的Aβ肽會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元官能障礙以及它們?nèi)绾纹鹱饔?。單體Aβ肽轉(zhuǎn)化為大的淀粉樣蛋白斑沉積物經(jīng)歷了幾個(gè)步驟，且中間體形式可能導(dǎo)致AD的神經(jīng)元官能障礙。因此，治療干預(yù)集中在降低Aβ肽水平及預(yù)防淀粉樣蛋白斑形成。這些方法已取得一些成功，其包括如用Aβ肽免疫及被動(dòng)給予抗Aβ肽抗體。參見(jiàn)，如，Bard等，NatureMed.6916-19(2000)；Holtzman等，Adv.Drug Delivery Rev.541603-13(2002)和國(guó)際專利申請(qǐng)WO 99/27944、WO 00/72876及WO 00/72880。但是，還是急需設(shè)計(jì)出更多的AD治療方法。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于如下發(fā)現(xiàn)用可溶性Nogo受體多肽治療降低Aβ肽水平，并且用Nogo受體拮抗劑(例如可溶性Nogo受體多肽)治療減少了Aβ肽和斑塊(plaque)沉積物的產(chǎn)生?；谶@些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的特征包括通過(guò)給予Nogo受體多肽可溶性片段及Nogo受體拮抗劑治療淀粉樣蛋白斑沉積相關(guān)性病癥的方法，所述病癥包括阿爾茨海默病。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于降低哺乳動(dòng)物中Aβ肽水平的方法，包含給予治療有效量的可溶性Nogo受體多肽。在某些實(shí)施方案中，與疾病、紊亂或病癥相關(guān)的Aβ肽水平升高了。在某些實(shí)施方案中，所述疾病、紊亂或病癥是阿爾茨海默病。
在某些實(shí)施方案中，通過(guò)大丸藥(bolus))注射或長(zhǎng)期輸注給予可溶性Nogo受體多肽。在某些實(shí)施方案中，經(jīng)靜脈內(nèi)給予可溶性Nogo受體多肽。在某些實(shí)施方案中，可溶性Nogo受體多肽被直接給予中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，可溶性Nogo受體多肽被直接給予側(cè)腦室(lateral ventricle)。
在某些實(shí)施方案中，可溶性Nogo受體多肽是哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-310(SEQ ID NO3)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-344(SEQ ID NO4)；和(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-310(SEQ ID NO5)；和(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-344(SEQ ID NO6)；和(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。
在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式進(jìn)一步包含融合部分。在某些實(shí)施方案中，所述融合部分是免疫球蛋白部分。在某些實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白部分是Fc部分。
在某些實(shí)施方案中，所述治療有效量為0.001mg/kg-10mg/kg。在某些實(shí)施方案中，所述治療有效量為0.01mg/kg-1.0mg/kg。在某些實(shí)施方案中，所述治療有效量為0.05mg/kg-0.5mg/kg。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中Aβ肽斑塊相關(guān)性疾病、紊亂或病癥的方法，包含給予治療有效量的NgR1拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，所述斑塊存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。在某些實(shí)施方案中，所述疾病、紊亂或病癥是阿爾茨海默病。
在某些實(shí)施方案中，NgR1拮抗劑被直接給予中樞神經(jīng)系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，NgR1拮抗劑被直接給予側(cè)腦室。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)大丸藥注射或長(zhǎng)期輸注給予NgR1拮抗劑。
在某些實(shí)施方案中，可溶性Nogo受體多肽是哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-310(SEQ ID NO3)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-344(SEQ ID NO4)；和(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-310(SEQ ID NO5)；和(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-344(SEQ ID NO6)；和(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。
在某些實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式進(jìn)一步包含融合部分。在某些實(shí)施方案中，所述融合部分是免疫球蛋白部分。在某些實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白部分是Fc部分。
在某些實(shí)施方案中，NgR1拮抗劑包含結(jié)合至哺乳動(dòng)物NgR1的抗體或其抗原結(jié)合片段。在某些實(shí)施方案中，所述抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、Fd片段、二價(jià)抗體(diabody)或單鏈抗體。在某些實(shí)施方案中，所述抗體或其抗原結(jié)合片段與產(chǎn)生自雜交瘤的單克隆抗體所結(jié)合的多肽結(jié)合，所述雜交瘤選自HB 7E11(ATCC保藏號(hào)PTA-4587)、HB 1H2(ATCC保藏號(hào)PTA-4584)、HB 3G5(ATCC保藏號(hào)PTA-4586)、HB 5B10(ATCC保藏號(hào)PTA-4588)或HB 2F7(ATCC保藏號(hào)PTA-4585)。在某些實(shí)施方案中，所述單克隆抗體產(chǎn)生自HB 7E11雜交瘤。在某些實(shí)施方案中，所述多肽包含選自AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO7)、LDLSDNAQLR(SEQ ID NO8)、LDLSDDAELR(SEQ IDNO9)、LDLASDNAQLR(SEQ ID NO10)、LDLASDDAELR(SEQ ID NO11)、LDALSDNAQLR(SEQ ID NO12)、LDALSDDAELR(SEQ ID NO13)、LDLSSDNAQLR(SEQ ID NO14)、LDLSSDEAELR(SEQ ID NO15)、DNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO16)、DNAQLR(SEQ ID NO17)、ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO18)、LALSDNAQLRVVDPTT(SEQID NO19)、LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ ID NO20)、LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQ ID NO21)或LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQID NO22)的氨基酸序列。
在某些實(shí)施方案中，所述治療有效量為0.001mg/kg-10mg/kg。在某些實(shí)施方案中，所述治療有效量為0.01mg/kg-1.0mg/kg。在某些實(shí)施方案中，所述治療有效量為0.05mg/kg-0.5mg/kg。
發(fā)明詳述除非另有指定，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有如本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的相同的含義。在沖突的情況下，以本申請(qǐng)及其所包括的定義為準(zhǔn)。除非上下文另有需要，單數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括復(fù)數(shù)以及復(fù)數(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)包括單數(shù)。本文中提及的所有出版物、專利和其它參考文獻(xiàn)全文在此并入作為參考，如同每一份單獨(dú)出版物或?qū)＠暾?qǐng)明確及單獨(dú)地被表明并入作為參考文獻(xiàn)一樣。
雖然類似或相當(dāng)于本文中所述的那些的方法和材料可在本發(fā)明實(shí)踐或測(cè)試中使用，但是合適的方法和材料描述如下。所述材料、方法和實(shí)例僅是例證性的而并不為了限制。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點(diǎn)在詳細(xì)的說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)中是顯而易見(jiàn)的。
在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)全文中，術(shù)語(yǔ)“包含”或諸如“含有”或“包括”的變體指包括所有列舉的完整事物或完整事物組，但不排除任何其它完整事物或完整事物組。
為了進(jìn)一步定義本發(fā)明，提供了如下術(shù)語(yǔ)和定義。
本文使用的“抗體”指完整的免疫球蛋白或其抗原結(jié)合片段。本發(fā)明抗體可以是任何同種型或類(如M、D、G、E和A)或任何亞類(如G1-4、A1-2)，且可具有kappa(κ)或lambda(λ)輕鏈。
本文使用的“人源化抗體”指其中至少一部分非人序列為人序列所取代的抗體。如何制備人源化抗體的實(shí)例見(jiàn)美國(guó)專利6,054,297、5,886,152和5,877,293。
本文使用的“治療有效量”指在劑量上及在必要的時(shí)間段內(nèi)達(dá)到所需治療效果的有效量。
本文使用的“預(yù)防有效量”指在劑量上及在必要的時(shí)間段內(nèi)達(dá)到所需預(yù)防效果的有效量。一般地，由于預(yù)防劑量用于受試者發(fā)病早期前或疾病早期，因此預(yù)防有效量應(yīng)小于治療有效量。
本文使用的“患者”指哺乳動(dòng)物，例如人。
本文使用的“融合蛋白”指包含與第二異源多肽融合的第一多肽的蛋白。
本文使用的“Nogo受體拮抗劑”指抑制Nogo受體-1與配體(如NogoA、NogoB、NogoC、MAG、OM-gp)結(jié)合的分子。
本文使用的“Nogo受體多肽”包括結(jié)合Aβ肽或拮抗Nogo受體功能的全長(zhǎng)Nogo受體-1蛋白及其片段。
本發(fā)明的第一方面是基于可溶性Nogo受體多肽直接結(jié)合Aβ肽的發(fā)現(xiàn)。因此，無(wú)意受理論所限，看來(lái)可溶性Nogo受體多肽在體內(nèi)可起Aβ肽濾過(guò)器(sink)的作用。可利用該機(jī)制以降低循環(huán)血、沉積位點(diǎn)或兩者中的Aβ肽水平，從而抑制了淀粉樣蛋白斑形成或縮小了現(xiàn)存的斑塊的尺寸。因?yàn)橐粋€(gè)作用位點(diǎn)是在血流中，本發(fā)明有利避免了將可溶性Nogo受體多肽給予中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的需要。然而，應(yīng)當(dāng)意識(shí)到可溶性Nogo受體多肽可不與全身給藥一起、或除全身給藥之外被直接給予CNS。
本發(fā)明的第二方面是基于可溶性Nogo受體多肽或其它Nogo受體拮抗劑如抗Nogo受體抗體在CNS中干擾Nogo受體功能的發(fā)現(xiàn)。該結(jié)果既降低了Aβ肽水平又減少了斑塊沉淀。在該機(jī)制中，可溶性Nogo受體多肽或其它Nogo受體拮抗劑的作用位點(diǎn)是在CNS中。不受理論所限，看來(lái)抑制NgR功能的至少一個(gè)效果是減少了生成Aβ肽的APP的加工。
Nogo受體拮抗劑任何一種Nogo受體拮抗劑都可用于本發(fā)明方法中。例如，可用于本發(fā)明方法的Nogo受體拮抗劑包括，但不限于可溶性Nogo受體-1多肽、結(jié)合至Nogo受體蛋白的抗體及該抗體的抗原結(jié)合片段、以及小分子拮抗劑。
可溶性Nogo受體-1多肽本發(fā)明的某些實(shí)施方案使用了可溶性Nogo受體-1多肽(Nogo受體-1也有多種名稱，如“Nogo受體”、“NogoR”、“NogoR-1”、“NgR”及“NgR-1”)。全長(zhǎng)Nogo受體-1由信號(hào)序列、N-末端區(qū)(NT)、8個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat，LRR)、LRRCT區(qū)(在8個(gè)富含亮氨酸重復(fù)序列C-末端的富含亮氨酸重復(fù)序列區(qū))、C-末端區(qū)(CT)及GPI錨組成。人及大鼠的Nogo受體多肽序列示于表1中。
表1.人和大鼠的Nogo受體-1多肽序列
本發(fā)明方法中所使用的可溶性Nogo受體多肽包含NT區(qū)、8個(gè)LRR及LRRCT區(qū)，缺少信號(hào)序列和功能性GPI錨(即，無(wú)GPI錨，或具有GPI錨但其無(wú)法有效地結(jié)合至細(xì)胞膜)。合適的多肽包括，例如，人Nogo受體的氨基酸26-310(SEQ ID NO3)和26-344(SEQ ID NO4)，及大鼠Nogo受體的氨基酸27-310(SEQ ID NO5)和27-344(SEQ ID NO6)(表2)。其它可用于本發(fā)明方法的多肽描述于，例如，國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US02/32007和PCT/US03/25004中。
表2.來(lái)自人和大鼠的可溶性Nogo受體多肽
包含可溶性Nogo受體多肽的融合蛋白可用于本發(fā)明的方法。在某些實(shí)施方案中，所述融合蛋白的異源部分是免疫球蛋白恒定區(qū)。在某些實(shí)施方案中，所述免疫球蛋白恒定區(qū)是重鏈恒定區(qū)。在某些實(shí)施方案中，所述異源多肽是Fc片段。在某些實(shí)施方案中，所述Fc連接至可溶性Nogo受體多肽的C-末端。在某些實(shí)施方案中，所述融合Nogo受體蛋白是二聚體，如Fc融合二聚體。
抗體本發(fā)明某些方法使用了Nogo受體拮抗劑，其為特異性結(jié)合免疫原性Nogo受體-1多肽并抑制Nogo受體-1與配體(如NogoA、NogoB、NogoC、MAG、OM-gp)結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。用于本發(fā)明這些方法中的抗體或抗原結(jié)合片段可以在體內(nèi)或體外制備。在某些實(shí)施方案中，所述抗Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段是鼠或人的。在某些實(shí)施方案中，所述抗Nogo受體-1抗體或其抗原結(jié)合片段是重組的、改造的、人源化的和/或嵌合的。在某些實(shí)施方案中，所述抗體選自描述于國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US03/25004中的抗體。用于本發(fā)明的抗體可被修飾或不被修飾而加以使用。
可用于本發(fā)明方法的抗體的舉例的抗原結(jié)合片段是Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、Fd、dAb以及包含互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)片段的片段、單鏈抗體(scFv)、嵌合抗體、二價(jià)抗體及多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結(jié)合的免疫球蛋白(如免疫粘附素)的至少一部分。
本文使用的Fd指由VH和CH1區(qū)組成的片段，F(xiàn)v指由抗體單臂的VL和VH區(qū)組成的片段，以及dAb指由VH區(qū)組成的片段(Ward等，Nature341544-46(1989))。本文使用的單鏈抗體(scFv)指其中VL區(qū)和VH區(qū)通過(guò)合成接頭以配對(duì)形成單價(jià)分子的抗體，所述接頭可使它們作為單條蛋白鏈來(lái)制備(Bird等，Science242423-26(1988)和Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-83(1988))。本文使用的二價(jià)抗體指雙特異性抗體，其中VH和VL區(qū)表達(dá)在單條多肽鏈上，但使用的接頭太短以致這兩個(gè)區(qū)在同一條鏈上無(wú)法配對(duì)，因此迫使所述區(qū)與另一條鏈的互補(bǔ)區(qū)配對(duì)，形成了兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)(參見(jiàn)，例如Holliger等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA906444-48(1993)和Poljak等，Structure21121-23(1994))。
免疫接種本發(fā)明方法所使用的抗體可通過(guò)免疫接種合適的宿主(如，脊椎動(dòng)物，包括人、小鼠、大鼠、綿羊、山羊、豬、牛、馬，爬行類、魚(yú)類、兩棲類，以及在烏類、爬行類和魚(yú)類卵中)來(lái)制備。上述抗體可以是多克隆或單克隆的。制備抗體的綜述參見(jiàn)，如Harlow和Lane(1988)，Antibodies，A LaboratoryManual；Yelton等，Ann.Rev.of Biochem.，50657-80(1981)；和Ausubel等，(1989)，Current Protocols in Molecular Biology(New YorkJohn Wiley &Sons)。抗體與免疫原性Nogo受體多肽的免疫反應(yīng)性可通過(guò)任何合適的方法(包括例如，免疫印跡測(cè)定法和ELISA)進(jìn)行測(cè)定。用于本發(fā)明方法的單克隆抗體可通過(guò)如上述Harlow和Lane(1988)所述的常規(guī)方法來(lái)制備。
可使用佐劑或不用佐劑，用免疫原性Nogo受體-1多肽來(lái)免疫宿主。合適的多肽描述于，例如，國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US01/31488，PCT/US02/32007和PCT/US03/25004中。也可用與完整或破裂細(xì)胞的細(xì)胞膜相連的Nogo受體-1免疫所述宿主，并通過(guò)與Nogo受體-1多肽結(jié)合來(lái)鑒定抗體。其它制備抗體的合適技術(shù)包括在體外將淋巴細(xì)胞暴露于Nogo受體-1或本發(fā)明的免疫原性多肽，或者在噬菌體或類似載體中來(lái)選擇抗體文庫(kù)。參見(jiàn)Huse等，Science2461275-81(1989)。
用于本發(fā)明方法的抗Nogo受體-1抗體也可通過(guò)篩選重組組合抗體文庫(kù)來(lái)分離。用于制備及篩選上述文庫(kù)的方法為本領(lǐng)域所公知。存在用于制備噬菌體展示文庫(kù)的商業(yè)渠道可獲得的方法及材料(如，Pharmacia的重組噬菌體抗體系統(tǒng)，產(chǎn)品目錄號(hào)27-9400-01；Stratagene的SurfZAPTM噬菌體展示試劑盒，產(chǎn)品目錄號(hào)240612以及來(lái)自MorphoSys的其它產(chǎn)品)。在從重組免疫球蛋白展示文庫(kù)中篩選并分離抗Nogo受體-1抗體后，可從展示包裝(displaypackage)(如，從噬菌體基因組)中回收編碼所選擇抗體的核酸，并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)重組DNA技術(shù)將其亞克隆至其它表達(dá)載體中。為表達(dá)通過(guò)篩選組合文庫(kù)所分離的抗體，將編碼抗體重鏈和輕鏈或其可變區(qū)的DNA克隆入重組表達(dá)載體中并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中。
Nogo受體拮抗劑的應(yīng)用本發(fā)明涉及通過(guò)給予Nogo受體拮抗劑用于治療異常Aβ肽沉積相關(guān)性疾病的方法。用于本發(fā)明方法的Nogo受體拮抗劑包括但不限于，可溶性Nogo受體多肽、抗Nogo受體蛋白的抗體及其抗原結(jié)合片段，以及小分子拮抗劑。在某些實(shí)施方案中，所述異常Aβ肽沉積與疾病、紊亂或病癥(如阿爾茨海默病)相關(guān)。
可溶性Nogo受體多肽的應(yīng)用本發(fā)明也涉及通過(guò)給予可溶性Nogo受體多肽用于降低Aβ肽水平的方法。在某些實(shí)施方案中，Aβ肽水平的升高與疾病、紊亂或病癥(如阿爾茨海默病)相關(guān)。
藥物組合物可將用于本發(fā)明方法的可溶性Nogo受體多肽及Nogo受體拮抗劑配制為藥物組合物來(lái)給予包括人類的哺乳動(dòng)物。用于本發(fā)明方法中的所述藥物組合物包含藥學(xué)上可接受的載體。
在這些藥物組合物中有用的藥學(xué)上可接受的載體包括，如離子交換劑、礬土、硬脂酸鋁、卵磷脂、諸如人血清白蛋白的血清蛋白、諸如磷酸鹽的緩沖物質(zhì)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、鹽或電解質(zhì)類、例如硫酸魚(yú)精蛋白、磷酸氫二鈉、磷酸氫二鉀、氯化鈉、鋅鹽、膠態(tài)硅石(colloidal silica)、三硅酸鎂、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素基物質(zhì)、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
所述用于本發(fā)明方法的組合物可通過(guò)任何合適的方法給予，如腸胃外、心室內(nèi)、經(jīng)口、通過(guò)吸入噴霧、局部、直腸、鼻、含服(buccal)、陰道或通過(guò)植入型藥盒(reservoir)給予。本文使用的術(shù)語(yǔ)“腸胃外”包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、滑膜內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)、損傷內(nèi)及顱內(nèi)注射或輸注技術(shù)。如前所述，用于本發(fā)明方法的Nogo受體拮抗劑在CNS中起作用，其既導(dǎo)致Aβ肽水平的下降，也導(dǎo)致斑塊沉積的減少。因此，在使用了Nogo受體拮抗劑的本發(fā)明方法中，Nogo受體拮抗劑必須穿過(guò)血腦屏障。穿過(guò)血腦屏障是Nogo受體拮抗劑分子自身所固有的物化特性的結(jié)果，或是藥物配方中其它成分的結(jié)果，或是使用諸如針頭、插管或手術(shù)器械的機(jī)械裝置以破壞血腦屏障的結(jié)果。當(dāng)Nogo受體拮抗劑不是天生能夠穿過(guò)血腦屏障的分子時(shí)，合適的給藥途徑為，例如胸骨內(nèi)或顱內(nèi)，例如直接地，將其給予側(cè)腦室。當(dāng)Nogo受體拮抗劑是天生能夠穿過(guò)血腦屏障的分子時(shí)，或當(dāng)可溶性Nogo受體多肽用于本發(fā)明方法，在所述方法中與Aβ肽的直接結(jié)合導(dǎo)致Aβ肽水平降低時(shí)，給藥途徑可以是如下所述的各種途徑中的一種或多種。
用于本發(fā)明方法的組合物的無(wú)菌可注射形式可以是水性或油脂性混懸劑(suspension)。這些混懸劑可根據(jù)本領(lǐng)域公知技術(shù)，用合適的分散劑或潤(rùn)濕劑及助懸劑(suspending agent)來(lái)配制。所述無(wú)菌可注射制劑也可是存在于無(wú)毒腸胃道外可接受稀釋劑或溶劑中的無(wú)菌可注射溶液或混懸劑，例如是溶于1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的載體和溶劑中可使用的有水、林格(Ringer′s)溶液及等滲氯化鈉溶液。此外，無(wú)菌不揮發(fā)性油類通常也作為溶劑或助懸介質(zhì)(suspending medium)。為達(dá)到該目的，可使用包括合成的單-甘油酯或二-甘油酯的任何一種刺激性小的不揮發(fā)性油類。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，如同天然的藥學(xué)上可接受的油類，例如橄欖油或蓖麻油，特別是它們的聚氧乙烯型(version)，可用于可注射制劑的制備。這些油類溶液或混懸劑也可包含長(zhǎng)鏈醇類稀釋劑或分散劑，例如經(jīng)常用于配制包括乳劑和混懸劑的藥學(xué)上可接受劑型的羧甲基纖維素或類似的分散劑。為了配制目的，也使用其它常用的表面活性劑，例如Tweens、Spans以及其它常用于制備藥學(xué)上可接受固體、液體或其它劑型的乳化劑或生物利用度增強(qiáng)劑。
腸道外劑型可以是單一大丸劑劑量、輸注或加樣(loading)大丸劑劑量，隨后為維持劑量。這些組合物可一天一次給予或“按需”給予。
某些用于本發(fā)明方法的藥物組合物可以任何經(jīng)口可接受的劑型經(jīng)口給予，所述劑型包括，如膠囊劑、片劑、水性混懸劑或溶液。某些藥物組合物也可通過(guò)鼻噴霧或吸入給予?？捎帽郊状蓟蚱渌线m的防腐劑、增強(qiáng)生物利用度的吸收促進(jìn)劑、碳氟化合物和/或其它常用的增溶劑或分散劑將上述組合物制備為鹽水溶液。
與載體材料一起制備單劑型的可溶性Nogo受體多肽或Nogo受體拮抗劑的量會(huì)根據(jù)所治療的宿主及給藥的具體方式而改變。所述組合物可以單劑量、多劑量或在確定的時(shí)間段內(nèi)在輸注劑(infusion)中給予。給藥方案也可調(diào)節(jié)以提供最佳期望響應(yīng)(如，治療或預(yù)防響應(yīng))。
本發(fā)明方法使用了可溶性Nogo受體多肽或Nogo受體拮抗劑的“治療有效量”或“預(yù)防有效量”。上述治療或預(yù)防有效量可根據(jù)諸如個(gè)體病狀、年齡、性別和體重的因素而改變。治療或預(yù)防有效量也是治療有益效果勝過(guò)任何有毒或有害效果的量。
對(duì)于任何特定患者而言，具體劑量和治療方案取決于多種因素，包括所使用的具體Nogo受體多肽或Nogo受體拮抗劑，患者年齡、體重、全身健康、性別及飲食，以及給藥時(shí)間、排泄率、聯(lián)合用藥和所要治療的具體疾病的嚴(yán)重程度。醫(yī)學(xué)護(hù)理工作者對(duì)上述因素的判斷是本領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)。所述劑量也取決于所要治療的患者個(gè)體、給藥途徑、配制劑的類型、所使用的化合物的特性、疾病的嚴(yán)重程度以及所期望的效果。所用劑量可通過(guò)本領(lǐng)域眾所周知的藥理學(xué)和藥物代謝動(dòng)力學(xué)原理來(lái)確定。
在本發(fā)明方法中，Nogo受體拮抗劑通常以腦室內(nèi)或鞘內(nèi)方式被直接給予到CNS，如給予到側(cè)腦室。在本發(fā)明方法中，當(dāng)可溶性Nogo受體多肽用于降低Aβ肽水平，所述可溶性Nogo受體多肽通常經(jīng)靜脈內(nèi)給予?？膳渲聘鶕?jù)本發(fā)明方法給藥的組合物，以便給予劑量為每天0.001-10mg/kg體重的Nogo受體拮抗劑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，所述劑量是每天0.01-1.0mg/kg體重。在某些實(shí)施方案中，所述劑量是每天0.05-0.5mg/kg體重。
補(bǔ)充的活性化合物也可摻入本發(fā)明方法所使用的組合物中。例如，Nogo受體抗體或其抗原結(jié)合片段，或可溶性Nogo受體多肽或融合蛋白可與一種或多種附加治療劑共同配制和/或共同給予。
本發(fā)明包含任何適于將可溶性Nogo受體多肽或Nogo受體拮抗劑遞送至所選擇靶組織的方法，包括水溶液的大丸藥注射(bolus injection of anaqueous solution)或可控制釋放系統(tǒng)的植入。使用可控制釋放的植入物減少了對(duì)重復(fù)注射的需求。
本發(fā)明方法所使用的可溶性Nogo受體多肽或Nogo受體拮抗劑可被直接輸注入腦內(nèi)。用于化合物的直接腦輸注的各種植入物是公知的，且它們?cè)谙蚧忌窠?jīng)系統(tǒng)紊亂的人類患者遞送治療化合物中是有效的。這些包括使用泵向腦進(jìn)行長(zhǎng)期輸注、腦功能區(qū)定位植入(stereotactically implanted)、臨時(shí)性間質(zhì)導(dǎo)管(interstitial catheter)、永久性顱內(nèi)導(dǎo)管植入物以及通過(guò)外科手術(shù)植入的生物可降解植入物。參見(jiàn)，例如，Gill等，同上；Scharfen等，“High ActivityIodine-125 Interstitial Implant For Gliomas，”Int.J.Radiation Oncology Biol.Phys.24(4)583-91(1992)；Gaspar等，“Permanent125I Implants for RecurrentMalignant Gliomas，”Int.J.Radiation Oncologv Biol.Phys.43(5)977-82(1999)；Gildenberg等，Textbook of Stereotactic and Functional Neurosurgery，McGraw-Hill (1998)中的第66章，577-580頁(yè)，Bellezza等，“StereotacticInterstitial Brachytherapy，”和Brem等，“The Safety of InterstitialChemotherapy with BCNU-Loaded Polymer Followed by Radiation Therapy inthe Treatment of Newly Diagnosed Malignant GliomasPhase I Trial，”J.Neuro-Oncolog26111-23(1995)。
所述組合物也可包含分散在生物相容的載體材料中的可溶性Nogo受體多肽或Nogo受體拮抗劑，對(duì)于所述化合物而言，載體起合適的遞送或支持系統(tǒng)的作用。持續(xù)釋放載體的合適的例子包括以具有一定形狀的制品形式(如栓劑或膠囊劑)存在的半透性聚合物基質(zhì)?？芍踩氲幕蛭⒛z囊持續(xù)釋放基質(zhì)包括聚交酯(美國(guó)專利3,773,319；EP 58,481)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(Sidman等，Biopolymers22547-56(1985))、聚(2-羥乙基-異丁烯酸酯)、乙烯基乙酸乙烯酯(ethylene vinyl acetate)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.1298-105(1982))或聚-D-(-)-3羥基丁酸(EP 133,988)。
在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可溶性Nogo受體多肽或Nogo受體拮抗劑通過(guò)直接輸注入腦的適當(dāng)區(qū)域以給予患者。參見(jiàn)，例如Gill等，“Direct braininfusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinsondisease，”Nature Med.9589-95(2003)。存在備選的技術(shù)并可用它們來(lái)給予本發(fā)明的可溶性Nogo受體多肽或Nogo受體拮抗劑。例如，可使用Riechert-Mundinger單元和ZD(Zamorano-Dujovny)多用途定位裝置進(jìn)行導(dǎo)管或植入物的腦功能區(qū)定位(stereotactic)放置。通過(guò)注射120ml碘海醇(omnipaque)和350mg碘/ml，用增強(qiáng)對(duì)比度的計(jì)算機(jī)體層攝影術(shù)(CT)以2mm切片厚度掃描可進(jìn)行三維多層(multiplanar)治療計(jì)劃(STP，F(xiàn)ischer，F(xiàn)reiburg，Germany)。該裝置容許在磁共振成像研究基礎(chǔ)上制定治療計(jì)劃，結(jié)合CT和MRI的靶信息可用于清楚的靶確認(rèn)。
經(jīng)改良與GE CT掃描儀(General Electric Company，Milwaukee，WI)一起使用(modified for use with)的Leksell腦功能區(qū)定位系統(tǒng)(Downs Surgical，Inc.，Decatur，GA)以及Brown-Roberts-Wells(BRW)腦功能區(qū)定位系統(tǒng)(Radionics，Burlington，MA)可用于該目的。因此，在植入當(dāng)天早晨，BRW腦功能區(qū)定位器框架的環(huán)狀底座圈可連接到患者的顱骨。使用夾在基底板上的石墨棒定位器框架可獲得以3mm間隔穿過(guò)(though)(靶組織)區(qū)域的連續(xù)CT切片?？稍赩AX 11/780計(jì)算機(jī)(Digital Equipment Corporation，Maynard，Mass.)上通過(guò)用石墨棒圖像的CT坐標(biāo)以在CT空間和BRW空間之間進(jìn)行繪圖，從而運(yùn)行計(jì)算機(jī)化治療計(jì)劃方案。
實(shí)施例實(shí)施例1在阿爾茨海默病中NgR和Nogo的亞細(xì)胞定位發(fā)生改變我們從NIH資助的哈佛腦組織資源中心(Harvard Brain Tissue ResourceCenter)獲得了患阿爾茨海默病(AD)的匿名人類患者和對(duì)照的腦組織樣品，并使用抗NogoA和抗NgR抗體用組織學(xué)方法研究了所述樣本中NogoA和NgR的定位(參見(jiàn)Wang等，J.Neurosci.225505-15(2002))。檢查了6個(gè)對(duì)照和6個(gè)AD病例中來(lái)自海馬和Broadman氏44區(qū)的組織。通過(guò)抗原封閉和免疫印跡中單一免疫反應(yīng)條帶的存在證實(shí)了染色的特異性。
在對(duì)照的成人腦中，在細(xì)胞染色很少的這些腦區(qū)的神經(jīng)氈中可以彌散性顆粒狀圖像檢測(cè)到NogoA的免疫反應(yīng)性。相比之下，在所有的AD病例中，NogoA明顯移動(dòng)到神經(jīng)元細(xì)胞體(cell body)。NgR定位以相反方式發(fā)生移動(dòng)。對(duì)照病例中NgR蛋白的最高濃度發(fā)現(xiàn)于細(xì)胞體(cell soma)中，而在AD病例中，腦顯示出彌散性神經(jīng)氈免疫反應(yīng)性及很少的細(xì)胞染色。使用抗NgR抗體的免疫印跡分析證實(shí)了這不是由于NgR水平的改變，并且接著用抗NogoA抗體進(jìn)行染色清楚地指出這也不是由于神經(jīng)元的缺失。除了NgR向細(xì)胞體之外的移動(dòng)，我們還觀察到NgR在淀粉樣蛋白斑中集中，并且對(duì)Aβ和NgR的雙重免疫組化證實(shí)了這兩種蛋白共同定位于這些沉積物中。這些發(fā)現(xiàn)提示NogoA/NgR途徑在AD病理學(xué)中起作用。
實(shí)施例2APP和多種形式的Aβ肽與NgR的相互作用基于這些觀察結(jié)果，我們測(cè)試了NogoA或NgR是否與APP直接相互作用。在COS-7細(xì)胞中表達(dá)NgR的表位標(biāo)記的構(gòu)建體(如Liu等，Science2971190-93(2002)描述來(lái)構(gòu)建的NgR-myc)和APP(APP-V5；I.M.A.G.E.克隆#5259793被亞克隆入pcDNA3.1-V5His形成與APP-695的C-末端融合物)，并用抗-V5和抗-myc抗體進(jìn)行免疫沉淀反應(yīng)。接著用抗-V5、抗-myc和抗-NgR抗體來(lái)檢測(cè)所述免疫沉淀材料的免疫印跡。免疫沉淀反應(yīng)研究表明APP與NgR是特異性相連的。使用抗-NogoA在免疫沉淀物中并沒(méi)有檢測(cè)到NogoA。我們也監(jiān)測(cè)了表位標(biāo)記的APP在經(jīng)轉(zhuǎn)染的COS-7細(xì)胞中的定位，并發(fā)現(xiàn)對(duì)照中大多數(shù)蛋白的胞內(nèi)定位在核周區(qū)，但NgR與APP的共表達(dá)使大多數(shù)APP的定位轉(zhuǎn)移到細(xì)胞表面。此外，在經(jīng)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的雙標(biāo)記試驗(yàn)中APP和NgR定位是相同的。細(xì)胞APP表達(dá)的總水平并不為NgR共表達(dá)所改變。而且，天然APP和NgR蛋白也共同定位在初級(jí)神經(jīng)元中，這可通過(guò)用抗-APP(Santa Cruz Biotechnology)和抗-NgR抗體檢測(cè)來(lái)確定。這些結(jié)果證實(shí)了NgR與APP物理相連。
我們接著研究了APP的Aβ區(qū)是否與它和NgR的相互作用相關(guān)—包括原纖維生成性Aβ42-3肽是否與NgR結(jié)合。我們通過(guò)將編碼序列與載體pAP-6(Nakamura等，Neuron21093-1100，1988)的信號(hào)序列-6xHis-胎盤堿性磷酸酶(AP)序列在框內(nèi)融合，制備了兩種包含堿性磷酸酶(AP)和Aβ的親水區(qū)(氨基酸1-28)的融合蛋白構(gòu)建體。AP-Aβ和Aβ-AP蛋白都與表達(dá)NgR的COS細(xì)胞結(jié)合，但不與載體-轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞結(jié)合。該結(jié)合是可飽和的，表觀Kd為60nM。也可使用純化的生物素-Aβ(1-40)在ELISA類測(cè)定法中用固定的NgR檢測(cè)相互作用。與之相反，在任一這些試驗(yàn)中，相反(reverse)的40-1肽無(wú)法與固定的NgR相互作用。我們?cè)?℃用表達(dá)人NgR-1的人SKNMC細(xì)胞與Fluo-Aβ42溫育2小時(shí)，發(fā)現(xiàn)原纖維生成性Aβ42肽與這些細(xì)胞結(jié)合。
如下所述，我們也測(cè)試了Aβ肽與可溶性NgR多肽，sNgR310(參見(jiàn)，例如PCT/US03/25004)的結(jié)合。將sNgR310固定在微量滴定板上并在4℃加入生物素-Aβ1-40或生物素-Aβ40-1達(dá)16個(gè)小時(shí)。在除去未結(jié)合的肽后，使用抗生物素蛋白鏈菌素偶聯(lián)的HRP來(lái)檢測(cè)已結(jié)合的生物素-Aβ。如同全長(zhǎng)NgR的情況一樣，我們觀察到生物素-Aβ1-40，而不是生物素-Aβ40-1與sNgR310結(jié)合。在存在抗-NgR抗體，諸如單克隆抗體HB 7E11(描述于PCT/US03/25004)的條件下，我們也進(jìn)行了這些試驗(yàn)，并發(fā)現(xiàn)生物素-Aβ1-40的結(jié)合可被抗-NgR抗體抑制。在獨(dú)立試驗(yàn)中，我們證實(shí)了抗-NgR抗體也抑制生物素Aβ1-40與表達(dá)大鼠NgR1的COS7細(xì)胞或表達(dá)人NgR1的SKNMC細(xì)胞的結(jié)合?？傊@些數(shù)據(jù)證實(shí)了APP及Aβ肽的天然存在形式與NgR直接發(fā)生相互作用。
Aβ(1-28)與NgR相互作用的特異性和選擇性可以幾種方式進(jìn)行探查。所述相互作用對(duì)于NgR1是特異的，因?yàn)镹gR2或NgR3-兩者與NgR都具有序列相似性—都不結(jié)合Aβ-AP。此外，我們觀察到物種特異性人NgR與人Aβ的結(jié)合超過(guò)小鼠NgR與人Aβ的結(jié)合，或人NgR與小鼠Aβ的結(jié)合，或小鼠NgR與小鼠Aβ的結(jié)合。最后，我們研究了從產(chǎn)生自我們實(shí)驗(yàn)室的ngr-/-小鼠(這些小鼠缺失了NgR的外顯子II且不產(chǎn)生NgR蛋白)培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞(neuron)，發(fā)現(xiàn)它們與NogoA的Nogo-66片段(參見(jiàn)，例如國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US01/0104和PCT/US02/32007)或Aβ肽都不結(jié)合。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了NgR是針對(duì)Aβ(1-28)的初級(jí)神經(jīng)元細(xì)胞表面結(jié)合位點(diǎn)。
為了進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明哪個(gè)殘基是NgR相互作用所必需的，我們制備了Aβ(1-28)肽中有若干缺失的AP融合蛋白，并通過(guò)測(cè)定AP活性來(lái)監(jiān)測(cè)與COS-7細(xì)胞表達(dá)的NgR的結(jié)合。氨基末端7個(gè)殘基的缺失并不改變與NgR的結(jié)合，但氨基末端14個(gè)殘基的缺失適度地降低了與NgR的結(jié)合。然而，氨基酸1-16的缺失卻使其不與NgR結(jié)合。在Aβ(1-28)的羧基末端截短了7個(gè)氨基酸的突變體與NgR無(wú)親和力。因此，氨基酸7-28與對(duì)NgR的親和力相關(guān)，且氨基酸15-28是特別重要的。與這些觀察結(jié)果一致，我們發(fā)現(xiàn)了天然β-分泌酶肽產(chǎn)物(包含氨基酸8-21)而非α-分泌酶剪接產(chǎn)物(在氨基酸17處被蛋白水解)與NgR結(jié)合。
實(shí)施例3NgR上Aβ結(jié)合的位點(diǎn)不同于被髓磷脂配體結(jié)合的位點(diǎn)通過(guò)在存在不同濃度的競(jìng)爭(zhēng)性游離Aβ的條件下，讓250nm可溶性AP-Aβ(1-28)或AP-Nogo(1-33)結(jié)合到包被了純化的sNgR310-Fc的孔，我們分析了Aβ(1-28)是否與其它已知的NgR的配體來(lái)競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合NgR。在類似的試驗(yàn)中，我們也測(cè)試了生物素-Aβ(1-40)是否與大鼠sNgR344-Fc結(jié)合。我們觀察到Aβ肽與sNgR310-Fc及sNgR344-Fc都結(jié)合。因此，Aβ肽—類似于NgR的其它配體—需要NgR蛋白完整的LRR區(qū)用于結(jié)合，但不需要?dú)埢?10-450的羧基尾部。但是，在競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)中，Aβ(1-28)取代了Aβ-AP的結(jié)合，但不取代AP-Nogo-66(1-33)或AP-OMgp的結(jié)合。在我們的試驗(yàn)中Aβ肽在高濃度才稍微開(kāi)始取代AP-MAG。因此，NgR上的Aβ結(jié)合位點(diǎn)看來(lái)明顯不同于對(duì)髓磷脂配體NogoA、OMgp和MAG的結(jié)合位點(diǎn)。與之相一致的是，Aβ的存在對(duì)髓磷脂或Nogo-66抑制軸突突起(outgrowth)幾乎沒(méi)有影響。
實(shí)施例4NgR加強(qiáng)Aβ的產(chǎn)生因?yàn)锳D發(fā)病的關(guān)鍵步驟之一是從APP蛋白水解產(chǎn)生Aβ，我們?cè)u(píng)估了NgR對(duì)該過(guò)程的影響。我們用NgR轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞并觀察到來(lái)自于這些細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中含有水平低但為可檢測(cè)的Aβ，與在表達(dá)FAD突變體APPsw的細(xì)胞中所觀察的情況具有可比性，表明了β-分泌酶加工增加。存在NgR也使α-分泌酶加工增加，這一點(diǎn)在NgR表達(dá)也使sAPPα水平上升的事實(shí)中得到證明。
為了調(diào)查在體內(nèi)NgR/Aβ相互作用對(duì)APP加工的意義，將來(lái)自于APPsw/PSEN-1(DeltaE9)小鼠的APPsw轉(zhuǎn)基因(APPsw transgene)繁殖入無(wú)NgR背景。如下所述檢測(cè)3月齡小鼠的腦抽提物中的Aβ和sAPPα水平。用0.1M甲酸抽提前腦，用Tris中和并在10,000×g離心澄清。通過(guò)使用免疫沉淀反應(yīng)及免疫印跡測(cè)定腦抽提物中的sAPPα水平，所述免疫沉淀反應(yīng)使用了抗氨基末端-APP 22C11抗體(Chemicon)，所述免疫印跡使用了抗-Aβ(1-17)6E10抗體(Chemicon)。與同窩出生的配對(duì)的對(duì)照小鼠相比，在生理?xiàng)l件下缺少NgR明顯地減少了Aβ和sAPPα的產(chǎn)生。這些結(jié)果證實(shí)了NgR在體內(nèi)上升的Aβ形成中起作用。
實(shí)施例5原纖維生成性Aβ42肽促進(jìn)Aβ肽與NgR的結(jié)合我們研究了NgR和Aβ肽之間的相互作用在聚集體形成中是否起作用。將sNgR310固定在微量滴定板上，并加入生物素-Aβ40和Aβ42肽。我們使用抗生物素蛋白鏈菌素HRP定量已結(jié)合的生物素-Aβ40肽，并發(fā)現(xiàn)增加Aβ42肽的濃度能以劑量依賴性方式增強(qiáng)生物素-Aβ40肽的結(jié)合。我們使用表達(dá)人NgR1的SKNMC細(xì)胞證實(shí)了這些數(shù)據(jù)，并發(fā)現(xiàn)Aβ42肽再次以劑量依賴性方式增強(qiáng)了生物素-Aβ40肽與細(xì)胞的結(jié)合。我們也發(fā)現(xiàn)抗-NgR抗體抑制了由Aβ42-肽-介導(dǎo)的、使生物素-Aβ40與表達(dá)人NgR1的SKNMC細(xì)胞結(jié)合增強(qiáng)的作用。這些結(jié)果表明干擾NgR/Aβ的相互作用抑制了Aβ肽聚集體的形成。
實(shí)施例6使用NgR拮抗劑治療減少了Aβ斑塊沉積為調(diào)查NgR/APP/Aβ相互作用在體內(nèi)所起的作用，將sNgR310-Fc(一種NgR拮抗劑；參見(jiàn)國(guó)際專利申請(qǐng)PCT/US03/25004)輸注入APPsw/PSEN-1(DeltaE9)雙轉(zhuǎn)基因小鼠中(來(lái)自于Jackson實(shí)驗(yàn)室)。該sNgR310-Fc蛋白包含與IgG的Fc部分融合的NgR的完整LRR配體結(jié)合(the entire LRRligand-binding of the NgR)。為給予sNgR310-Fc蛋白，用異氟烷/氧氣麻醉5月齡小鼠并在顱骨上用鉆錐鉆孔(burr hole)。在前囟點(diǎn)立體定位坐標(biāo)后(posterior)0.6mm和橫向(lateral)1.2mm處，將插管(ALZET腦輸注試劑盒II，Alza Scientific Products，Palo Alto，CA)插入右側(cè)腦室中，距軟膜表面4.0mm深。用氰基丙烯酸酯使插管支撐在適當(dāng)?shù)奈恢?held in place)并將導(dǎo)管與皮下滲透微型泵(Alzet 2ML4)連接。該泵以2.5μl/hr輸送1.2mg/mlsNgR310-Fc溶液或大鼠IgG PBS溶液28天(對(duì)照小鼠接受了大鼠IgG，因?yàn)镹gR和Fc部分皆為大鼠來(lái)源的)。28天后換泵并連接到相同的插管上。在56天中，輸注的蛋白總劑量為每只小鼠2.5mg。在此階段末期，將小鼠處死并使用來(lái)自于Biosource International的ELISA試劑盒，根據(jù)廠商的說(shuō)明書(shū)測(cè)定腦Aβ水平。如下用抗-Aβ免疫組化反應(yīng)來(lái)評(píng)估淀粉樣蛋白斑中的Aβ沉積。在用0.1M甲酸處理用于抗原回收后，使用抗-Aβ(1-17)6E10抗體對(duì)4％低聚甲醛固定的腦的矢狀切面中的Aβ斑塊進(jìn)行免疫組織學(xué)檢測(cè)。對(duì)來(lái)自每只動(dòng)物的3張切片用NIH圖像來(lái)定量斑塊區(qū)域占腦皮質(zhì)區(qū)的百分比。
在sNgR310-Fc處理的小鼠中，免疫反應(yīng)性Aβ在斑塊中的沉積明顯減少。此外，在這些小鼠的腦中Aβ(1-40)和Aβ(1-42)的總水平降低了50％。在這些小鼠中Aβ水平和淀粉樣蛋白斑沉積密切相關(guān)，提示sNgR310-Fc改變APP/Aβ代謝的程度超過(guò)改變Aβ聚集的程度。然而，我們的數(shù)據(jù)表明sNgR310-Fc的存在減少了Aβ的產(chǎn)生及其在斑塊中的沉積。也通過(guò)免疫沉淀反應(yīng)和免疫印跡分析測(cè)定了α-分泌酶產(chǎn)物sAPPα。在sNgR310-Fc處理的動(dòng)物腦中sAPPα水平下降的程度與Aβ水平下降的程度類似，這表明sNgR310-Fc在體內(nèi)抑制了α-分泌酶和β-分泌酶的加工。
雖然為了清楚理解本發(fā)明的目的，已經(jīng)通過(guò)例證以及實(shí)施例對(duì)上述發(fā)明進(jìn)行了具體描述，但是根據(jù)本發(fā)明的教導(dǎo)，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行某些改變和修飾但不違背所附的權(quán)利要求的精神或保護(hù)范圍對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。
申請(qǐng)人STRITTMATTER，Stephen，M.等申請(qǐng)?zhí)朠CT/US04/011728申請(qǐng)日2004年4月16日標(biāo)題治療淀粉樣蛋白斑相關(guān)性病癥的NOGO-受體拮抗劑代理人號(hào)A229 PCT針對(duì)說(shuō)明書(shū)所指的被保藏生物材料的專業(yè)技術(shù)人員獲得方案(expert solution)的相關(guān)說(shuō)明對(duì)于被保藏生物材料的說(shuō)明已經(jīng)全部包括在說(shuō)明書(shū)中。如下附加說(shuō)明不要求作為說(shuō)明書(shū)的一部分，而應(yīng)被視為“單獨(dú)的說(shuō)明”。它們僅涉及專業(yè)技術(shù)人員獲得方案。
如下附加說(shuō)明涉及在說(shuō)明書(shū)中被稱為“HB 1H2”的被保藏生物材料；出現(xiàn)在說(shuō)明書(shū)第3頁(yè)31行；以及權(quán)利要求書(shū)第3頁(yè)35項(xiàng)。
它在2002年8月9日以保藏號(hào)PTA-4584保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)10801 University BoulevardManassas，Virginia 20110-2209美國(guó)該附加說(shuō)明是針對(duì)1)對(duì)CA(加拿大)的指定對(duì)于對(duì)加拿大的指定，根據(jù)加拿大專利法的專利細(xì)則(Patent Rule)107和108條，從該申請(qǐng)被授予加拿大專利起，或從該申請(qǐng)被駁回、放棄并不再恢復(fù)、或撤回之日起，才可以將所述被保藏生物材料的樣本僅僅以發(fā)放樣本的方式(by the issue of a sample)來(lái)提供給由委托人(commissioner)提名的獨(dú)立專業(yè)技術(shù)人員(細(xì)則104(4))。
2)對(duì)EP(歐洲專利)的指定對(duì)于對(duì)歐洲專利組織(EPO)的指定，根據(jù)EPC實(shí)施細(xì)則條款(Rule)28(3)，從授予該申請(qǐng)歐洲專利的公告(mention)被公開(kāi)起，或者如果該申請(qǐng)被駁回或撤回或視撤，則自其申請(qǐng)日起計(jì)算20年起，才可以將所述被保藏生物材料的樣本僅僅以發(fā)放樣本的方式來(lái)提供給由請(qǐng)求者(requester)提名的專業(yè)技術(shù)人員(Rule 28(4)EPC)。
3)對(duì)FI(芬蘭)的指定對(duì)于對(duì)芬蘭的指定，從芬蘭國(guó)家專利與注冊(cè)委員會(huì)(the NationalBoard of Patents and Registration)授予該申請(qǐng)專利權(quán)的公告被公開(kāi)起，或者如果芬蘭國(guó)家專利與注冊(cè)委員會(huì)最終決定不授予該申請(qǐng)專利權(quán)，則自其申請(qǐng)日起計(jì)算20年起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
4)對(duì)GB(英國(guó))的指定對(duì)于對(duì)英國(guó)的指定，申請(qǐng)人聲明其意愿(give(s)notice of my/ourintention)，僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
5)對(duì)IS(冰島)的指定對(duì)于對(duì)冰島的指定，從冰島專利局授予該申請(qǐng)專利權(quán)起，或者如果冰島專利局最終決定不授予該申請(qǐng)專利權(quán)，從冰島專利局作出最終決定起，被保藏生物材料的樣本的提供才對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員生效。
6)對(duì)SE(瑞典)的指定對(duì)于對(duì)瑞典的指定，從瑞典專利局決定該申請(qǐng)對(duì)公眾查閱開(kāi)放起，或者從瑞典專利局最終決定不對(duì)公眾查閱開(kāi)放起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
7)對(duì)SG(新加坡)的指定根據(jù)專利細(xì)則第4版(1995)第3款(paragraph 3 of the FourthSchedule to the Patents Rule 1995)，申請(qǐng)人聲明其意愿，僅對(duì)專業(yè)技術(shù)人員提供上述已鑒定培養(yǎng)物的樣本。
申請(qǐng)人STRITTMATTER，Stephen，M.等申請(qǐng)?zhí)朠CT/US04/011728申請(qǐng)日2004年4月16日標(biāo)題治療淀粉樣蛋白斑相關(guān)性病癥的NOGO-受體拮抗劑代理人號(hào)A229 PCT針對(duì)說(shuō)明書(shū)所指的被保藏生物材料的專業(yè)技術(shù)人員獲得方案(expert solution)的相關(guān)說(shuō)明對(duì)于被保藏生物材料的說(shuō)明已經(jīng)全部包括在說(shuō)明書(shū)中。如下附加說(shuō)明不要求作為說(shuō)明書(shū)的一部分，而應(yīng)被視為“單獨(dú)的說(shuō)明”。它們僅涉及專業(yè)技術(shù)人員獲得方案。
如下附加說(shuō)明涉及在說(shuō)明書(shū)中被稱為“HB 2F7”的被保藏生物材料；出現(xiàn)在說(shuō)明書(shū)第4頁(yè)1-2行；以及權(quán)利要求書(shū)第3頁(yè)35項(xiàng)。
它在2002年8月9日以保藏號(hào)PTA-4585保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)10801 University BoulevardManassas，Virginia 20110-2209美國(guó)該附加說(shuō)明是針對(duì)1)對(duì)CA(加拿大)的指定對(duì)于對(duì)加拿大的指定，根據(jù)加拿大專利法的專利細(xì)則(patent Rule)107和108條，從該申請(qǐng)被授予加拿大專利起，或從該申請(qǐng)被駁回、放棄并不再恢復(fù)、或撤回之日起，才可以將所述被保藏生物材料的樣本僅僅以發(fā)放樣本的方式(by the issue of a sample)來(lái)提供給由委托人提名的獨(dú)立專業(yè)技術(shù)人員(Rule 104(4))。
2)對(duì)EP(歐洲專利)的指定對(duì)于對(duì)歐洲專利組織(EPO)的指定，根據(jù)EPC實(shí)施細(xì)則條款(Rule)28(3)，從授予該申請(qǐng)歐洲專利的公告(mention)被公開(kāi)起，或者如果該申請(qǐng)被駁回或撤回或視撤，自其申請(qǐng)日起計(jì)算20年起，才可以將所述被保藏生物材料的樣本僅僅以發(fā)放樣本的方式來(lái)提供給由請(qǐng)求者(requester)提名的專業(yè)技術(shù)人員(Rule 28(4)EPC)。
3)對(duì)FI(芬蘭)的指定對(duì)于對(duì)芬蘭的指定，從芬蘭國(guó)家專利與注冊(cè)委員會(huì)(the NationalBoard of Patents and Registration)授予該申請(qǐng)專利權(quán)的公告被公開(kāi)起，或者如果芬蘭國(guó)家專利與注冊(cè)委員會(huì)最終決定不授予該申請(qǐng)專利權(quán)，自其申請(qǐng)日起計(jì)算20年起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
4)對(duì)GB(英國(guó))的指定對(duì)于對(duì)英國(guó)的指定，申請(qǐng)人公開(kāi)其意愿(give(s)notice of my/ourintention)，僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
5)對(duì)IS(冰島)的指定對(duì)于對(duì)冰島的指定，從冰島專利局授予該申請(qǐng)專利權(quán)起，或者如果冰島專利局最終決定不授予該申請(qǐng)專利權(quán)，從冰島專利局作出最終決定起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
6)對(duì)SE(瑞典)的指定對(duì)于對(duì)瑞典的指定，從瑞典專利局決定該申請(qǐng)對(duì)公眾查閱開(kāi)放起，或者從瑞典專利局最終決定不對(duì)公眾查閱開(kāi)放起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
7)對(duì)SG(新加坡)的指定對(duì)于對(duì)新加坡的指定，根據(jù)專利細(xì)則第4版(1995)第3款(paragraph 3 of the Fourth Schedule to the Patents Rule 1995)，申請(qǐng)人公開(kāi)其意愿，僅對(duì)專業(yè)技術(shù)人員提供上述已鑒定培養(yǎng)物的樣本。
申請(qǐng)人STRITTMATTER，Stephen，M.等申請(qǐng)?zhí)朠CT/US04/011728申請(qǐng)日2004年4月16日標(biāo)題治療淀粉樣蛋白斑相關(guān)性病癥的NOGO-受體拮抗劑代理人號(hào)A229 PCT針對(duì)說(shuō)明書(shū)所指的被保藏生物材料的專業(yè)技術(shù)人員獲得方案(expert solution)的相關(guān)說(shuō)明對(duì)于被保藏生物材料的說(shuō)明已經(jīng)全部包括在說(shuō)明書(shū)中。如下附加說(shuō)明不要求作為說(shuō)明書(shū)的一部分，而應(yīng)被視為“單獨(dú)的說(shuō)明”。它們僅涉及專業(yè)技術(shù)人員獲得方案。
如下附加說(shuō)明涉及在說(shuō)明書(shū)中被稱為“HB 3G5”的被保藏生物材料；出現(xiàn)在說(shuō)明書(shū)第3頁(yè)31行至第4頁(yè)1行；以及權(quán)利要求書(shū)第3頁(yè)35項(xiàng)。
它在2002年8月9日以保藏號(hào)PTA-4586保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)10801 University BoulevardManassas，Virginia 20110-2209美國(guó)該附加說(shuō)明是針對(duì)1)對(duì)CA(加拿大)的指定對(duì)于對(duì)加拿大的指定，根據(jù)加拿大專利法的專利細(xì)則(Patent Rule)107和108條，從該申請(qǐng)被授予加拿大專利起，或從該申請(qǐng)被駁回、放棄并不再恢復(fù)、或撤回之日起，才可以將所述被保藏生物材料的樣本僅僅以發(fā)放樣本的方式(by the issue of a sample)來(lái)提供給由委托人提名的獨(dú)立專業(yè)技術(shù)人員(Rule 104(4))。
2)對(duì)EP(歐洲專利)的指定對(duì)于對(duì)歐洲專利組織(EPO)的指定，根據(jù)EPC實(shí)施細(xì)則條款(Rule)28(3)，從授予該申請(qǐng)歐洲專利的公告(mention)被公開(kāi)起，或者如果該申請(qǐng)被駁回或撤回或視撤，自其申請(qǐng)日起計(jì)算20年起，才可以將所述被保藏生物材料的樣本僅僅以發(fā)放樣本的方式來(lái)提供給由請(qǐng)求者(requester)提名的專業(yè)技術(shù)人員(Rule 28(4)EPC)。
3)對(duì)FI(芬蘭)的指定對(duì)于對(duì)芬蘭的指定，從芬蘭國(guó)家專利與注冊(cè)委員會(huì)(the NationalBoard of Patents and Registration)授予該申請(qǐng)專利權(quán)的公告被公開(kāi)起，或者如果芬蘭國(guó)家專利與注冊(cè)委員會(huì)最終決定不授予該申請(qǐng)專利權(quán)，自其申請(qǐng)日起計(jì)算20年起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
4)對(duì)GB(英國(guó))的指定對(duì)于對(duì)英國(guó)的指定，申請(qǐng)人公開(kāi)其意愿(give(s)notice of my/ourintention)，僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
5)對(duì)IS(冰島)的指定對(duì)于對(duì)冰島的指定，從冰島專利局授予該申請(qǐng)專利權(quán)起，或者如果冰島專利局最終決定不授予該申請(qǐng)專利權(quán)，從冰島專利局作出最終決定起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
6)對(duì)SE(瑞典)的指定對(duì)于對(duì)瑞典的指定，從瑞典專利局決定該申請(qǐng)對(duì)公眾查閱開(kāi)放起，或者從瑞典專利局最終決定不對(duì)公眾查閱開(kāi)放起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
7)對(duì)SG(新加坡)的指定對(duì)于對(duì)新加坡的指定，根據(jù)專利細(xì)則第4版(1995)第3款(paragraph 3 of the Fourth Schedule to the Patents Rule 1995)，申請(qǐng)人公開(kāi)其意愿，僅對(duì)專業(yè)技術(shù)人員提供上述已鑒定培養(yǎng)物的樣本。
申請(qǐng)人STRITTMATTER，Stephen，M.等申請(qǐng)?zhí)朠CT/US04/011728申請(qǐng)日2004年4月16日標(biāo)題治療淀粉樣蛋白斑相關(guān)性病癥的NOGO-受體拮抗劑代理人號(hào)A229 PCT針對(duì)說(shuō)明書(shū)所指的被保藏生物材料的專業(yè)技術(shù)人員獲得方案(expert solution)的相關(guān)說(shuō)明對(duì)于被保藏生物材料的說(shuō)明已經(jīng)全部包括在說(shuō)明書(shū)中。如下附加說(shuō)明不要求作為說(shuō)明書(shū)的一部分，而應(yīng)被視為“單獨(dú)的說(shuō)明”。它們僅涉及專業(yè)技術(shù)人員獲得方案。
如下附加說(shuō)明涉及在說(shuō)明書(shū)中被稱為“HB 7E11”的被保藏生物材料；出現(xiàn)在說(shuō)明書(shū)第3頁(yè)30-31行；以及權(quán)利要求書(shū)第3頁(yè)35項(xiàng)。
它在2002年8月9日以保藏號(hào)PTA-4587保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)10801 University BoulevardManassas，Virginia 20110-2209美國(guó)該附加說(shuō)明是針對(duì)1)對(duì)CA(加拿大)的指定對(duì)于對(duì)加拿大的指定，根據(jù)加拿大專利法的專利細(xì)則(Patent Rule)107和108條，從該申請(qǐng)被授予加拿大專利起，或從該申請(qǐng)被駁回、放棄并不再恢復(fù)、或撤回之日起，才可以將所述被保藏生物材料的樣本僅僅以發(fā)放樣本的方式(by the issue of a sample)來(lái)提供給由委托人提名的獨(dú)立專業(yè)技術(shù)人員(Rule 104(4))。
2)對(duì)EP(歐洲專利)的指定對(duì)于對(duì)歐洲專利組織(EPO)的指定，根據(jù)EPC實(shí)施細(xì)則條款(Rule)28(3)，從授予該申請(qǐng)歐洲專利的公告(mention)被公開(kāi)起，或者如果該申請(qǐng)被駁回或撤回或視撤，自其申請(qǐng)日起計(jì)算20年起，才可以將所述被保藏生物材料的樣本僅僅以發(fā)放樣本的方式來(lái)提供給由請(qǐng)求者(requester)提名的專業(yè)技術(shù)人員(Rule 28(4)EPC)。
3)對(duì)FI(芬蘭)的指定對(duì)于對(duì)芬蘭的指定，從芬蘭國(guó)家專利與注冊(cè)委員會(huì)(the NationalBoard of Patents and Registration)授予該申請(qǐng)專利權(quán)的公告被公開(kāi)起，或者如果芬蘭國(guó)家專利與注冊(cè)委員會(huì)最終決定不授予該申請(qǐng)專利權(quán)，自其申請(qǐng)日起計(jì)算20年起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
4)對(duì)GB(英國(guó))的指定對(duì)于對(duì)英國(guó)的指定，申請(qǐng)人公開(kāi)其意愿(give(s)notice of my/ourintention)，僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
5)對(duì)IS(冰島)的指定對(duì)于對(duì)冰島的指定，從冰島專利局授予該申請(qǐng)專利權(quán)起，或者如果冰島專利局最終決定不授予該申請(qǐng)專利權(quán)，從冰島專利局作出最終決定起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
6)對(duì)SE(瑞典)的指定對(duì)于對(duì)瑞典的指定，從瑞典專利局決定該申請(qǐng)對(duì)公眾查閱開(kāi)放起，或者從瑞典專利局最終決定不對(duì)公眾查閱開(kāi)放起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
7)對(duì)SG(新加坡)的指定對(duì)于對(duì)新加坡的指定，根據(jù)專利細(xì)則第4版(1995)第3款(paragraph 3 of the Fourth Schedule to the Patents Rule 1995)，申請(qǐng)人公開(kāi)其意愿，僅對(duì)專業(yè)技術(shù)人員提供上述已鑒定培養(yǎng)物的樣本。
申請(qǐng)人STRITTMATTER，Stephen，M.等申請(qǐng)?zhí)朠CT/US04/011728申請(qǐng)日2004年4月16日標(biāo)題治療淀粉樣蛋白斑相關(guān)性病癥的NOGO-受體拮抗劑代理人號(hào)A229 PCT針對(duì)說(shuō)明書(shū)所指的被保藏生物材料的專業(yè)技術(shù)人員獲得方案(expert solution)的相關(guān)說(shuō)明對(duì)于被保藏生物材料的說(shuō)明已經(jīng)全部包括在說(shuō)明書(shū)中。如下附加說(shuō)明不要求作為說(shuō)明書(shū)的一部分，而應(yīng)被視為“單獨(dú)的說(shuō)明”。它們僅涉及專業(yè)技術(shù)人員獲得方案。
如下附加說(shuō)明涉及在說(shuō)明書(shū)中被稱為“HB 5B10”的被保藏生物材料；出現(xiàn)在說(shuō)明書(shū)第4頁(yè)1行；以及權(quán)利要求書(shū)第3頁(yè)35項(xiàng)。
它在2002年8月9日以保藏號(hào)PTA-4588保藏于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(the American Type Culture Collection)(ATCC)10801 University BoulevardManassas，Virginia 20110-2209美國(guó)該附加說(shuō)明是針對(duì)1)對(duì)CA(加拿大)的指定對(duì)于對(duì)加拿大的指定，根據(jù)加拿大專利法的專利細(xì)則(Patent Rule)107和108條，從該申請(qǐng)被授予加拿大專利起，或從該申請(qǐng)被駁回、放棄并不再恢復(fù)、或撤回之日起，才可以將所述被保藏生物材料的樣本僅僅以發(fā)放樣本的方式(by the issue of a sample)來(lái)提供給由委托人提名的獨(dú)立專業(yè)技術(shù)人員(Rule 104(4))。
2)對(duì)EP(歐洲專利)的指定對(duì)于對(duì)歐洲專利組織(EPO)的指定，根據(jù)EPC實(shí)施細(xì)則條款(Rule)28(3)，從授予該申請(qǐng)歐洲專利的公告(mention)被公開(kāi)起，或者如果該申請(qǐng)被駁回或撤回或視撤，自其申請(qǐng)日起計(jì)算20年起，才可以將所述被保藏生物材料的樣本僅僅以發(fā)放樣本的方式來(lái)提供給由請(qǐng)求者(requester)提名的專業(yè)技術(shù)人員(Rule 28(4)EPC)。
3)對(duì)FI(芬蘭)的指定對(duì)于對(duì)芬蘭的指定，從芬蘭國(guó)家專利與注冊(cè)委員會(huì)(the NationalBoard of Patents and Registration)授予該申請(qǐng)專利權(quán)的公告被公開(kāi)起，或者如果芬蘭國(guó)家專利與注冊(cè)委員會(huì)最終決定不授予該申請(qǐng)專利權(quán)，自其申請(qǐng)日起計(jì)算20年起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
4)對(duì)GB(英國(guó))的指定對(duì)于對(duì)英國(guó)的指定，申請(qǐng)人公開(kāi)其意愿(give(s)notice of my/ourintention)，僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
5)對(duì)IS(冰島)的指定對(duì)于對(duì)冰島的指定，從冰島專利局授予該申請(qǐng)專利權(quán)起，或者如果冰島專利局最終決定不授予該申請(qǐng)專利權(quán)，從冰島專利局作出最終決定起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
6)對(duì)SE(瑞典)的指定對(duì)于對(duì)瑞典的指定，從瑞典專利局決定該申請(qǐng)對(duì)公眾查閱開(kāi)放起，或者從瑞典專利局最終決定不對(duì)公眾查閱開(kāi)放起，才僅對(duì)本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員提供被保藏生物材料的樣本。
7)對(duì)SG(新加坡)的指定對(duì)于對(duì)新加坡的指定，根據(jù)專利細(xì)則第4版(1995)第3款(paragraph 3 of the Fourth Schedule to the Patents Rule 1995)，申請(qǐng)人公開(kāi)其意愿，僅對(duì)專業(yè)技術(shù)人員提供上述已鑒定培養(yǎng)物的樣本。
權(quán)利要求
1.一種用于降低哺乳動(dòng)物中Aβ肽水平的方法，包含給予治療有效量的可溶性Nogo受體多肽。
2.權(quán)利要求1的方法，其中Aβ肽水平的升高與疾病、紊亂或病癥相關(guān)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述疾病、紊亂或病癥是阿爾茨海默病。
4.權(quán)利要求1的方法，其中可溶性Nogo受體多肽通過(guò)大丸藥注射或長(zhǎng)期輸注給予。
5.權(quán)利要求4的方法，其中可溶性Nogo受體多肽經(jīng)靜脈內(nèi)給予。
6.權(quán)利要求4的方法，其中可溶性Nogo受體多肽被直接給予中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中可溶性Nogo受體多肽被直接給予側(cè)腦室。
8.權(quán)利要求1-3任一的方法，其中可溶性Nogo受體多肽是哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式。
9.權(quán)利要求8的方法，其中哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-310(SEQ ID NO3)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。
10.權(quán)利要求8的方法，其中哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-344(SEQ ID NO4)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。
11.權(quán)利要求8的方法，其中哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-310(SEQ ID NO5)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。
12.權(quán)利要求8的方法，其中哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-344(SEQ ID NO6)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。
13.權(quán)利要求8的方法，其中哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式進(jìn)一步包含融合部分。
14.權(quán)利要求13的方法，其中融合部分是免疫球蛋白部分。
15.權(quán)利要求14的方法，其中免疫球蛋白部分是Fc部分。
16.權(quán)利要求1-3任一的方法，其中治療有效量為0.001mg/kg-10mg/kg。
17.權(quán)利要求16的方法，其中治療有效量為0.01mg/kg-1.0mg/kg。
18.權(quán)利要求17的方法，其中治療有效量為0.05mg/kg-0.5mg/kg。
19.一種預(yù)防或治療哺乳動(dòng)物中與Aβ肽斑塊相關(guān)的疾病、紊亂或病癥的方法，包含給予治療有效量的NgR1拮抗劑。
20.權(quán)利要求19的方法，其中所述斑塊位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述疾病、紊亂或病癥是阿爾茨海默病。
22.權(quán)利要求19-21任一的方法，其中NgR1拮抗劑被直接給予中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
23.權(quán)利要求22的方法，其中NgR1拮抗劑被直接給予側(cè)腦室。
24.權(quán)利要求22的方法，其中NgR1拮抗劑通過(guò)大丸藥注射或長(zhǎng)期輸注給予。
25.權(quán)利要求19-21任一的方法，其中NgR1拮抗劑包含哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式。
26.權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-310(SEQ ID NO3)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。
27.權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的人NgR1的氨基酸26-344(SEQ ID NO4)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。
28.權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-310(SEQ ID NO5)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。
29.權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式(a)包含具有至多10個(gè)保守氨基酸取代的大鼠NgR1的氨基酸27-344(SEQ ID NO6)；以及(b)缺少(i)功能性跨膜結(jié)構(gòu)域，和(ii)功能性信號(hào)肽。
30.權(quán)利要求25的方法，其中哺乳動(dòng)物NgR1的可溶性形式進(jìn)一步包含融合部分。
31.權(quán)利要求30的方法，其中融合部分是免疫球蛋白部分。
32.權(quán)利要求31的方法，其中免疫球蛋白部分是Fc部分。
33.權(quán)利要求19-21任一的方法，其中NgR1拮抗劑包含與哺乳動(dòng)物NgR1結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述抗體選自多克隆抗體、單克隆抗體、Fab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、Fv片段、Fd片段、二價(jià)抗體或單鏈抗體。
35.權(quán)利要求33的方法，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段與產(chǎn)生自雜交瘤的單克隆抗體所結(jié)合的多肽結(jié)合，所述雜交瘤選自HB 7E11(ATCC保藏號(hào)PTA-4587)、HB 1H2(ATCC保藏號(hào)PTA-4584)、HB 3G5(ATCC保藏號(hào)PTA-4586)、HB 5B10(ATCC保藏號(hào)PTA-4588)或HB 2F7(ATCC保藏號(hào)PTA-4585)。
36.權(quán)利要求35的方法，其中所述單克隆抗體產(chǎn)生自HB 7E11雜交瘤。
37.權(quán)利要求36的方法，其中多肽包含選自AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO7)、LDLSDNAQLR(SEQID NO8)、LDLSDDAELR(SEQ ID NO9)、LDLASDNAQLR(SEQ IDNO10)、LDLASDDAELR(SEQ ID NO11)、LDALSDNAQLR(SEQID NO12)、LDALSDDAELR(SEQ ID NO13)、LDLSSDNAQLR(SEQID NO14)、LDLSSDEAELR(SEQ ID NO15)、DNAQLRVVDPTT(SEQID NO16)、DNAQLR(SEQ ID NO17)、ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQID NO18)、LALSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO19)、LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ ID NO20)、LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQID NO21)或LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQ ID NO22)的氨基酸序列。
38.權(quán)利要求36的方法，其中多肽由選自AAAFGLTLLEQLDLSDNAQLR(SEQ ID NO7)、LDLSDNAQLR(SEQID NO8)、LDLSDDAELR(SEQ ID NO9)、LDLASDNAQLR(SEQ IDNO10)、LDLASDDAELR(SEQ ID NO11)、LDALSDNAQLR(SEQID NO12)、LDALSDDAELR(SEQ ID NO13)、LDLSSDNAQLR(SEQID NO14)、LDLSSDEAELR(SEQ ID NO15)、DNAQLRVVDPTT(SEQID NO16)、DNAQLR(SEQ ID NO17)、ADLSDNAQLRVVDPTT(SEQID NO18)、LALSDNAQLRVVDPTT(SEQ ID NO19)、LDLSDNAALRVVDPTT(SEQ ID NO20)、LDLSDNAQLHVVDPTT(SEQID NO21)或LDLSDNAQLAVVDPTT(SEQ ID NO22)的氨基酸序列組成。
39.權(quán)利要求19-21任一的方法，其中治療有效量為0.001mg/kg-10mg/kg。
40.權(quán)利要求39的方法，其中治療有效量為0.01mg/kg-1.0mg/kg。
41.權(quán)利要求40的方法，其中治療有效量為0.05mg/kg-0.5mg/kg。
全文摘要
本發(fā)明提供了通過(guò)給予Nogo受體拮抗劑用于治療異常淀粉樣蛋白－β(Aβ)肽沉淀相關(guān)性疾病的方法，所述疾病包括阿爾茨海默病。本發(fā)明也提供了通過(guò)給予可溶性Nogo受體多肽用于降低哺乳動(dòng)物中Aβ肽水平的方法。
文檔編號(hào)A61K38/16GK1832752SQ200480016919
公開(kāi)日2006年9月13日 申請(qǐng)日期2004年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月16日
發(fā)明者斯蒂芬·M·斯特里特馬特, 丹尼爾·H·S·李, 李維維 申請(qǐng)人:耶魯大學(xué), 比奧根艾迪克Ma公司