胞內復合物作為生物標記的制作方法

專利名稱：胞內復合物作為生物標記的制作方法
技術領域：
本發明主要涉及生物標記，具體來說，涉及使用胞內分子復合物來作為生物標記。
背景技術：
生物標記是一種能夠客觀地測量并計算的特征物，作為正常的生物學過程、致病過程、或者針對治療介入手段的藥理學反應的指示物，Atkinson等，Clin.Pharmacol.Ther.，6989-95(2001)。生物標記在性質、測量難易程度、以及與目標物生理狀態的關系上有很大的不同，例如Frank等，Nature Reviews Drug Discovery，2566-580(2003)。人們相信，開發新型有效的生物標記既可以顯著減少保健和藥物開發的成本，又可以大大改善對多種疾病和身體狀況的治療。為此，人們作了大量的努力，旨在利用新技術來發現新類型的生物標記，例如，Petricoin等，Nature Reviews Drug Discovery，1683-695(2002)。
分子復合物的形成和解離是一種普遍的生物學現象，其對于活有機體中的調控過程來說十分重要。特別是胞外環境與細胞核之間的信號通道涉及許多分子復合物的形成，多種蛋白質在其中組裝以直接或間接地引起分子活動，例如磷酸化或去磷酸化作用，它們是信號發送過程中的步驟，Gomperts等，Signal Transduction(Academic Press，New York，2002)。這種通道及其成分是人們密切研究的對象，因為異常通道的行為在許多疾病條件下起作用，特別是癌癥，例如，McCormick，Trends inCell Biology，953-56(1999)；Blume-Jensen和Hunter，Nature，411355-365(2001)；Nicholson等，Cellular Signalling，14381-395(2002)等等。例如，現已觀察到許多癌癥都與影響信號通道成分的突變或者其他的基因改變的積聚有關，例如，通過過表達的方式影響信號通道組合物，尤其是那些涉及細胞增殖、細胞運動性、分化和細胞死亡的通道，例如Blume--Jensen和Hunter(引用如上)；Evan和Vousden，Nature，411342-348(2001)。
研究信號通道較為困難，不僅是因為其復雜性和互相聯系性，還因為其需要破壞性的步驟用于分析胞內復合物，例如Weng等，Science，28492-96(1999)；Machida等，Molecular & Cellular Proteomics，2.4215-233(2003)；Price等，Methods in Molecular Biology，218255-267(2003)。已有多種技術用于研究細胞的蛋白-蛋白相互作用和復合物，包括免疫沉淀反應、化學交聯、酵母雙雜交體系、標記融合蛋白、生物發光共振能量傳遞(BRET)、熒光共振能量傳遞(FRET)、質譜法等等，例如Golemis主編，Protein-Protein Interactions(ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York，2002)；Price等，(引用如上)；Sorkin等，Curr.Biol.，101395-1398(2000)；McVey等，J.Biol.Chem.，1714092-14099(2001)；Salim等，J.Biol.Chem.，27715482-15485(2002)；Angers等，Proc.Natl.Acad.Sci.，973684-3689(2000)；Jones等，Proteomics，276-84(2002)；以及Petricoin III等，The Lancet，359572-577(2002)。遺憾的是，這些技術難以應用，其通常缺乏足夠的靈敏度來提供信號通道狀態的準確圖像，和/或不能夠測定對通道活化具有重要作用的多種成分或相互作用成分。因此，通過這些技術所做的測定不能產生有用的基于復合物形成的生物指標。
鑒于上述原因，根據涉及關鍵胞內過程，如信號轉導過程的胞內復合物的存在、不存在、和/或特征或比例，提供了新種類的生物標記，其對于診斷、預后、患者分級以及藥物開發提供了新式的工具，從而將促進醫學領域的發展。
發明概述本發明涉及包含胞內分子復合物的生物標記，其存在于在患者細胞或組織樣品，尤其是通過常規方法如冷凍或固定法所保存的樣品中。在一個方面，本發明包括一種或多種胞內分子復合物的數量與疾病狀態或健康狀況的關系。特別地，本發明提供了用于指示與疾病或健康狀況有關的信號通道狀態的生物標記，其中該生物標記是信號復合物的數量。
在一個方面，本發明可以確定患者的疾病狀態，所述患者所患疾病的特征是，一種或多種胞內分子復合物的異常表達，步驟如下(i)測定患者樣品中一種或多種胞內分子復合物中每種的數量；(ii)將上述每種數量與其在標準樣品中的相應數量相比較；以及(iii)將患者樣品中的數量與標準樣品中分別相對應的數量之差與患者的疾病狀態相關聯。患者樣品可以是固定或者冷凍的；然而優選地，患者樣品為采用常規方法固定的。
在一個方面，本發明提供了一種通過同時測定信號通道復合物的相對數量來確定患者中癌癥狀態的方法。在一個實施方式中，這些復合物可以利用至少兩種對每種復合物的不同成分具有特異性的試劑來測定，這里稱為“試劑對”一種成分，這里稱作裂解探針，具有裂解引發部分，其可以被引發以在其直接近程內裂解敏感鍵；以及另一種成分，這里稱作結合化合物，具有一種或多種分子標簽，通過可由所述裂解引發部分裂解的連接物連接。根據該實施方式，這些不同成分無論何時形成復合物，都在該裂解引發部分的有效裂解近程內引入可裂解連接物，使得分子標簽被釋放。接著將釋放的分子標簽從反應混合物中分離并定量以測定復合物的形成。
在本發明的另一個方面，患者樣品中胞內復合物的數量可以表示成復合成分與未復合成分的參比測量值，或者多種該復合物的相對數量圖像。也就是說，胞內分子復合物的數量表示成該復合物中存在的一種成分的測量值與該復合物的其他成分的總量測量值的比例，無論該其他成分存在于復合物中還是成游離或單體狀態。在一個實施方式中，典型的測量值包括與特定分子標簽相關的電泳圖譜中鋒值的峰高度或者峰面積。在另一個實施方式中，本發明將一種或多種蛋白-蛋白復合物的參比測定值與疾病狀態相關聯。
在一個特定的方面，本發明提供了一種通過對患者樣品，尤其是固定的樣品的測量來確定患有疾病，如癌癥的患者的凋亡狀態的方法，所述疾病特征在于異常的凋亡狀態，其中該測定是針對形成凋亡信號轉導通道成分的胞內分子復合物的種類和/或數量。該胞內復合物包括但不限于，一種或多種14-3-3//BAD、BID//BAX、BAX//BAX、Bcll-XL//BAD、Bcll-2//BAD、14-3-3//BID、BID//BAK、BAX//Bcll-2、Bcll-XL//BIK、Bcll-2//BIK、NF-kB//I-kB、BID//Bcll-2、Bcll-XL//BID、Bcll-2//BID、FADD//caspase-9、BID//Bcll-XL、Bcll-XL//Hrk、Bcll-2//Hrk、TRADD//caspase-9、BID//A1/Bfl-1、Bcll-XL//BIM、Bcll-2//BIM、Apaf-1//caspase-9、Bcll-XL//Noxa、Bcll-2//Noxa、Bcll-XL//Bmf、Bcll-2//Bmf、Bcll-XL//Puma、Bcll-2//Puma、Bcll-XL//Bcll-G、Bcll-2//Bcll-G、Bcll-XL//NIP3、Bcll-2//NIP3、Bcll-XL//Nix和Bcll-2//Nix。在另一個方面，該胞內復合物包括但不限于，14-3-3//BAD、Bcll-2//BAD、14-3-3//BID、BAX//Bcll-2、Bcll-2//BIK、BID//Bcll-2、Bcll-2//BID、Bcll-2//Hrk、Bcll-2//BIM、Bcll-2//Noxa、Bcll-2//Bmf、Bcll-2//Puma、Bcll-2//Bcll-G、Bcll-2//NIP3和Bcll-2//Nix。在另一個方面，該胞內復合物包括但不限于NF-kB//I-kB。在個方面又一個方面，該胞內復合物包括測定NF-kB//I-kB復合物以確定患者的疾病狀態，該患者患有癌癥或者炎癥，例如風濕性關節炎、發炎性腸道疾病、多發性硬化、或者哮喘。優選地，上述測定為參比測定，提供游離和與復合物結合的蛋白質比值。
在一個特定的方面，本發明提供了一種通過對患者樣品，尤其是固定的樣品的測量來確定患有疾病，如癌癥的患者的疾病狀態的方法，所述疾病特征在于異常的信號轉導通道活化，其中該測定是針對形成選定信號轉導通道成分的胞內分子復合物的種類和/或數量。該胞內復合物包括但不限于，一種或多種Her1//Shc、Grb2//Sos、Her1//Grb7、Her1//RasGAP、Grb2//Shc、Her2//Shc、Her3//PI3K、Her3//Shc、Her3//Grb7、YAP//Her4、IGF-1R//PI3K、IGF-1R//Shc、IGFR//IRS1、VEGFR//Shc、VEGFR//PI3K、VEGFR//Src、VEGFR//FRS2、PDGFRa//Crk、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck；PDGFR//Shc、DGFR//STAT5、PDGFRa//Crk、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck，PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、PDGFR//STAT5、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck、PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、PDGFR//STAT5、Kit//Shp-1、Kit//PI3K、Kit//Grb2、Kit//CRKL、FGFR//PLCg1、FGFR//Crk、FGFR//FRS2、GFR//Shp2、FGFR//Shb、Trk//p75NTR以及Trk//PI3K。在另一個方面，這種胞內復合物包括但不限于，Her1//Shc、Grb2//Sos、Her1//Grb7、Her1//RasGAP、Grb2//Shc、Her2//Shc、Her3//PI3K、Her3//Shc、和Her3//Grb7。在另一個方面，這種胞內復合物包括但不限于，IGF-1R//PI3K、IGF-1R//Shc、和IGFR//IRS1。在另一個方面，這種胞內復合物包括但不限于，VEGFR//Shc、VEGFR//PI3K、VEGFR//Src、和VEGFR//FRS2。在另一個方面，這種胞內復合物包括但不限于，PDGFRa//Crk、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck、PDGFR//Shc、DGFR//STAT5、PDGFRa//Crk、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck；PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、PDGFR//STAT5、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck、PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、和PDGFR//STAT5。
在另一個方面，本發明提供了一種確定患者中癌癥狀態的方法，其中同時測定了包括Bcll-2蛋白和BH3-only蛋白的凋亡通道復合物和包括14-3-3蛋白和BAD蛋白的復合物的相對數量。在一個實施方式中，這些復合物可以利用至少兩種對每種復合物的不同成分具有特異性的試劑來測定一種成分，這里稱作裂解探針，具有裂解引發部分，其可以被引發以在其直接近程內裂解敏感鍵；以及另一種成分，這里稱作結合化合物，具有一種或多種分子標簽，通過可由所述裂解引發部分裂解的連接物連接。根據該實施方式，這些不同成分無論何時形成復合物，都在該裂解引發部分的有效裂解近程內引入可裂解連接物，使得分子標簽被釋放。接著將釋放的分子標簽從反應混合物中分離并定量以測定復合物的形成。
本發明提供的生物標記包含對患者樣品中胞內分子復合物數量的測定值。特別地，可將胞內分子復合物數量的圖形與患者的疾病狀態相關，并且在一些實施方式中，可將其與預后、藥物對被測復合物的功效、以及患者對治療的反應可能性相關聯。根據本發明，通過直接測定患者樣品中的胞內分子復合物，可以克服現有技術中的缺點，無需培養或以其他方式處理細胞或組織樣品，例如異種移植，那樣會增加成本和工作量并且會給最終測定讀數帶來噪聲和可能的假象。本發明還提供了一種對胞內受體和/或復合物的磷酸化，或其他在樣品制備過程中容易被破壞的翻譯后修飾的替代性測量方法。該替代性測量方法是基于對復合物的測定，例如PI3K或SHC-受體復合物等等，它取決于對其形成的上述修飾，并且其較少地受到樣品制備過程的影響，在其制備過程中較穩定。
附圖簡述

圖1A-1E圖示性說明用于測定胞內復合物存在的本發明方法的一些實施方式。
圖1F-1G圖示性說明使用可釋放的分子標簽來測定固定的組織樣本中細胞表面受體復合物。
圖1H說明對兩種二聚體復合物的參比測定。
圖2A-2E圖示性說明將分子標簽連接在抗體上的方法。
圖3A-3F說明易氧化連接物以及其通過單線態氧介入的相應的裂解反應。
圖4A-4J顯示設計并合成的標簽的結構。
圖5A-5D說明圖6中所示的標簽部分的合成化學方法。
圖6A-6C圖示性說明用于實施電泳分離分子標簽步驟的微流控裝置。
圖7A-7D說明用于檢測PI3激酶-Her3受體活化復合物的測定設計和實驗結果。
圖8A-8D說明用于檢測Shc/Her3受體-適配體復合物的測定設計和實驗結果。
圖9A-9C說明用于同時測定BAD//14-3-3和BAD//Bcll-2復合物的本發明實施方式。
圖10A-10C顯示腫瘤細胞中Her2-Her3異型二聚體和PI3K//Her3復合物表達之間的相關性數據。
定義“14-3-3蛋白”是指能夠與Ser-112和/或Ser-155處磷酸化的人類BAD形成穩定復合物的人類蛋白，該蛋白具有與NCBI登錄號AAH56867或Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，9916899-16903(2002)中所述的物質基本上相同的氨基酸序列。在一個方面，以下的14-3-3蛋白為至少百分之八十相同于，更優選百分之九十相同于NCBI登錄號AAH56867或Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，9916899-16903(2002)中所述的氨基酸。
“Akt蛋白”是指PKBa/Akt1、PKBb/Akt2、PKBg/Akt3、PKBg-1組中成員的人類蛋白，以及與其氨基酸序列基本上相同的蛋白質，并且其無論何時被PI3K蛋白磷酸化后都具有蛋白激酶活性。在一個方面，無論何時位置數在305至310的酪氨酸被磷酸化和/或位置數在470至475的絲氨酸被磷酸化后，Akt蛋白都具有激酶活性。Akt蛋白有多個NCBI登錄號，包括NP_005154，以及Nicholson等，Cellular Signalling，14381-395(2002)；Kandel等，Exp.Cell.Res.，253210-229(1999)；以及類似的參考文獻，在此將其引入作為參考。
“抗體”是指能與另一個分子的特定空間和極性結構特異性地結合，并因此定義為與之互補的免疫球蛋白。抗體可以是單克隆或多克隆的，并能夠用本領域熟知的技術制備，如免疫宿主并采集血清(多克隆)，或通過制備持續性雜交細胞系并收集分泌蛋白(單克隆)，或通過克隆和表達核苷酸序列或其誘變型，所述核苷酸序列至少編碼與天然抗體特異性結合所需的氨基酸序列。抗體可包括完整的免疫球蛋白或其片段，免疫球蛋白包括各種類型和亞型，如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等。抗體片段可包括Fab、Fv、F(ab’)2、Fab’等等。此外，適當時可以使用免疫球蛋白的聚集體、聚合物和偶聯物或其片段，只要維持了對特定多肽的結合親和力。免疫測定，包括采用可釋放分子標簽(如下所述)的這類測定中使用的抗體的制造和選擇的指導性技術可以很容易地在教科書和手冊中找到，例如，Harlow和Lane，AntibodiesA Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，1988)；Howard和Bethell，Basic Methods in AntibodyProduction and Characterization(CRC Press，2001)；Wild主編，The Immunoassay Handbook(Stockton Press，New York，1994)，等等。
“抗體結合組合物”是指包含一個或多個抗體、或其片段的分子或分子復合物，并且其結合特異性來自于該抗體或抗體片段。抗體結合組合物包括但不限于，(i)抗體對，其中第一個抗體與靶分子特異性結合，第二個抗體與第一個抗體的恒定區特異性結合；生物素化抗體，其通過生物素部分(moiety)特異性結合于靶分子和鏈親和素蛋白，其中該鏈親和素的蛋白由諸如分子標簽或光敏劑等等的部分衍化成；(ii)對靶分子特異并且與聚合物，如葡聚糖偶聯的抗體，其中該聚合物是由諸如分子標簽或光敏劑的部分衍化而成，其直接通過共價鍵連接或者間接通過鏈親和素-生物素聯接；(iii)對靶分子特異并與珠、微珠、或其他固相支持物偶聯的抗體，其中該支持物直接或間接地由諸如分子標簽或光敏劑的部分衍化而成，或者是含有后者的聚合物。
“抗原決定簇”，或“表位”是指分子，通常是蛋白質分子，表面上的位點，該位點能與單個的抗體分子結合；通常蛋白質具有幾個或多個不同的抗原決定簇并能與多種不同的特異性抗體反應。優選的抗原決定簇為蛋白質的磷酸化位點。
“凋亡”或“程序性細胞死亡”是指一種細胞通過一系列的步驟破壞其自身的過程，該過程包括釋放蛋白水解酶，如caspase酶。“凋亡通道”或等同的“凋亡信號通道”涉及一系列特殊的導致細胞破壞的步驟，其中該步驟包括特征分子的活動，如特定蛋白質的磷酸化或去磷酸化過程，在特定蛋白質之間形成復合物，復合物的解離等等。“凋亡復合物”是指構成特定凋亡通道的一部分的蛋白-蛋白復合物。“凋亡狀態”是一個相對程度的術語，指在一個或多個凋亡通道中與細胞死亡或細胞存活相關的一種或多種復合物的相對數量的圖案或圖像。例如，同一樣品中14-3-3//BAD復合物的數量超過Bcll-2//BAD復合物的數量時，表明細胞存活；因此，其凋亡狀態的值很低。凋亡狀態的特定水平或值或測量規模取決于一些因素，包括樣品中的細胞種類，是否存在疾病狀況，靶定的復合物的種類等等。凋亡狀態的水平或值可通過參考已知或正常水品的選定凋亡復合物的標準樣品來確定。這里所使用的“狀態”涉及癌癥患者，是指來自癌癥患者的樣品、樣本或活檢樣品的細胞凋亡狀態。該“狀態”可以涉及疾病確定或分類、預后、藥物功效、患者對治療的反應、是否推薦輔助治療、疾病復發的可能性等等。
“BAD”蛋白是指無論何時在Ser-112和/或Ser-155處磷酸化后都能夠與人類14-3-3蛋白形成穩定復合物，并且在Ser-112和Ser-155處沒有連接上磷酸基團的任何時候能夠與人類Bcl-2蛋白形成穩定復合物的人類蛋白質，該BAD蛋白具有與NCBI登錄號AAH01901或Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，9916899-16903(2002)中所述的物質基本上相同的氨基酸序列。在一個方面，以下的BAD蛋白為至少百分之八十相同于，更優選百分之九十相同于NCBI登錄號AAH01901或Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，9916899-16903(2002)中所述的氨基酸。
“Bcl-2蛋白”是指在BAD蛋白的Ser-112和Ser-155處沒有連接上磷酸基團的任何時候都能夠于能夠與人類BAD形成穩定復合物的人類蛋白，其具有與NCBI登錄號AAH17214或Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，9916899-16903(2002)中所述的物質基本上相同的氨基酸序列。在一個方面，以下的Bcl-2蛋白為至少百分之八十相同于，更優選百分之九十相同于NCBI登錄號AAH17214或Strausberg等，Proc.Natl.Acad.Sci.，9916899-16903(2002)中所述的氨基酸。
“Bcl-XL蛋白”是指在BAD蛋白的Ser-112和Ser-155處沒有連接上磷酸基團的任何時候都能夠與人類BAD形成穩定復合物的人類蛋白，其具有與NCBI登錄號NP_620120或Oltvai等，Cell，74609-619(1993)中所述的物質基本上相同的氨基酸序列。在一個方面，以下的Bcl-XL蛋白為至少百分之八十相同于，更優選百分之九十相同于NCBI登錄號NP_620120或Oltvai等，Cell，74609-619(1993)中所述的氨基酸。
“BH3 only蛋白”是指含有BH3域但不含BH1、BH2或BH4域的人類蛋白，其能夠與Bcl-2蛋白形成穩定的復合物。多肽域BH1、BH2、BH3和BH4是蛋白質的Bcl-2家族的特征域，這在以下參考文獻中有所描述Baell和Huang，Biochem.Pharmacology，64851-863(2002)；Sattler等，Science，275983-985(1997)；Gross等，Genes & Development，131899-1911(1999)；以及Puthalakath等，Cell Death andDifferentiation，9505-512(2002)，引入它們作為參考。BH3域由以下12個氨基酸的共有序列表示“-I-A-X1-X2-L-R-R-I-G-D-E-F-”，其中X1是任何氨基酸，X2是帶電荷的氨基酸。優選地，BH3域包含共有序列的氨基酸序列，或者是共有序列中有1至4個保守氨基酸被取代和/或缺失的序列，同時滿足第五位上的亮氨酸(L)和第10位上的天冬氨酸(D)未被取代或缺失。示范性的BH3 only蛋白包括BID、BAD、BIK、BLK、HRK、BIM、NIP3和NIX/BNIP3，其說明可從National Centerfor Biotechnology Information(NCBI)獲得。優選的BH3 only蛋白是BAD。
“結合部分”是指能夠特異性地與分析物結合、并且分子標簽能夠直接或間接地附著于其上的任何分子。結合部分包括但不限于，抗體、抗體結合組合物、肽、蛋白質、核酸，以及分子量達到1000道爾頓并且由選自以下物質構成的組中的原子所構成的有機分子氫、碳、氧、氮、硫和磷。優選地，結合部分為抗體或抗體結合組合物。
“癌癥”和“癌的”涉及或描述了哺乳動物中典型地以無規則細胞生長為特征的生理狀態。癌癥實例包括但不限于，癌、淋巴瘤、胚細胞瘤、肉瘤、和白血病。這些癌癥的更具體實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸道癌、胰腺癌、成膠質細胞瘤、宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞瘤、乳腺癌、結腸癌、直腸癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌和各種類型的頭部和頸部癌癥。
“毛細尺寸的”涉及分離柱，是指板或微流控裝置中的毛細管或通道，其中該分離柱的直徑或最大尺寸在大約25-500微米之間，使得在整個分離介質中可以有效地散熱，因而在介質內具有較低的熱對流。
這里所使用的“色譜法”或“色譜分離”是指或涉及一種分析方法，其中是根據一種或多種物理或化學性質在移動相和固定相之間的不同分布，使含有化合物如分子標簽的混合物的移動相促進對該化合物的分離，所述移動相通常為液體，所述固定相通常為固體。構成分析物，如分子標簽色譜分離的基礎的一種或多種物理性質包括但不限于，分子量、形狀、溶解度、pKa、疏水性、電荷、極性等等。在一個方面，這里所使用的“高壓(或高效)液相色譜法”(“HPLC”)涉及一種液相色譜分離，其中(i)采用長度達300mm內徑達5mm的剛性圓柱形分離柱，(ii)固定相包括直徑相同并長達5μm的剛性球狀顆粒(如硅石、氧化鋁等等)，填充在分離柱中，(iii)在35℃至80℃的溫度范圍，柱壓達150bar的條件下操作，以及(iv)采用的流速范圍在1μl/min至4mL/min。優選地，用于HPLC的固定相顆粒進一步具有以下特征(i)平均顆粒直徑分布范圍窄，基本上所有的顆粒直徑在平均值的10％以內，(ii)孔大小相同的，范圍在70至300埃，(iii)表面積范圍在50至250m2/g，以及(iv)結合相密度(即每單位面積保持的配體數目)范圍在1至5每nm2。用于分離分子標簽的示范性反相色譜介質包括顆粒，如如硅石或氧化鋁，其具有連接到其表面上的保留配體，如苯基、氰基、或選自C8至C18的脂肪族基團。涉及本發明的色譜法包括“毛細管電色譜法”(“CEC”)，以及相關的技術。CEC是一種液相色譜技術，其中流體通過電滲流動通過毛細尺寸的柱體，例如其內徑在30至100μm的范圍內。CEC在Svec，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.761-47(2002)；Vanhoenacker等，Electrophoresis，224064-4013(2001)等等文獻中有公開。CEC柱可采用與常規的反相HPLC相同的固定相材料，還可以使用所說的“整體式”非特殊填充。在一些形式的CEC中，壓力和電滲作用驅動含分析物的溶劑通過柱體。
“復合物”在這里指的是直接或間接彼此接觸的分子的集合體或聚集體。這里所使用的“接觸”，或者更具體地說，“直接接觸”涉及分子的復合物，或者涉及特異性或特異的結合，指的是兩個分子足夠接近使得弱非共價的化學相互作用，如范德華力、氫鍵、離子和疏水相互作用等等，為分子作用力的主導作用。一般來說，由于在測定條件下該復合物在熱力學上比其組成分子的非聚集狀態更為有利，因此該分子復合物較穩定。這里所使用的“復合物”通常涉及兩種或多種蛋白質的穩定聚集體，還被等價地稱為“蛋白-蛋白復合物”。這里所使用的“胞內復合物”或“胞內蛋白-蛋白復合物”指的是通常出現在生物細胞的細胞質或細胞核中的蛋白質復合物，其可以包括一種或多種胞內蛋白質和表面膜受體的復合物。屬于這類復合物的示范性胞內蛋白包括但不限于，PI3K蛋白、Grb2蛋白、Grb7蛋白、Shc蛋白、和Sos蛋白、Src蛋白、Cbl蛋白、PLCγ蛋白、Shp2蛋白、GAP蛋白、Nck蛋白、Vav蛋白、和Crk蛋白。在一個方面，該復合物包括PI3K或Shc蛋白。在另一個方面，復合物為包含兩種蛋白質，或2至4種蛋白質，或2至6種蛋白質的穩定聚集體。這里所使用的“信號復合物”是一種作為信號通道成分的胞內蛋白-蛋白復合物。示范性的信號復合物列于表IIIA-B中。在一個方面，術語“復合物”包括核類固醇或者脂肪酸受體與它們的輔助因子，例如過氧化物酶體增殖活化因子的復合物。
“二聚體”指兩種或多種相同或不同蛋白的復合物，包括膜結合受體。相同蛋白的二聚體稱為“同型二聚體”，不同蛋白的二聚體稱為“異型二聚體”。二聚體通常由兩種彼此接觸的蛋白組成。二聚體可通過被動的過程，如范德華作用等等，如上在“復合物”的定義中所述，形成于細胞表面膜上，或者二聚體也可以通過主動的過程形成，例如通過配體引發的二聚化作用，磷酸化作用、共價連接，與胞內成分的相互作用等等，例如Schlessinger，Cell，103211-225(2000)。
“疾病狀態”包括但不限于以下的特征染上疾病的可能性，疾病的存在與否，疾病嚴重性的預后，以及通過胞內復合物作用的特殊治療試劑引起的患者對治療的反應可能性。至于癌癥，“疾病狀態”或“癌癥狀態”進一步包括對癌癥前期或癌細胞或組織的檢測，對病人的選擇，其通過一種或多種胞內復合物，如一種或多種蛋白-蛋白二聚體，作用的治療劑的治療后的可能反應，以及這種治療劑的改進治療效果。
“ErbB受體”或“Her受體”是屬于ErbB受體家族的受體蛋白酪氨酸激酶，包括EGFR(“Her1”)、ErbB2(“Her2”)、ErbB3(“Her3”)以及ErbB4(“Her4”)受體。ErbB受體通常包含可以連接ErbB配體的胞外區域；親脂性跨膜區域；保守胞內酪氨酸激酶域；以及帶有幾個可磷酸化的酪氨酸殘基的羧基端信號域。ErbB受體可以是天然序列的ErbB受體或者是其氨基酸序列的變異體。優選該ErbB受體為天然序列人類ErbB受體。在一個方面，ErbB受體包括Her受體的截短形式，包括但不限于，EGFRvIII和p95Her2，在Chu等，Biochem.J.，324855-861(1997)；Xia等，Oncogene，23646-653(2004)；等等中公開。
術語“ErbB1”，“表皮生長因子受體”和“EGFR”以及“Her1”在這里可以互相替換使用，指天然序列EGFR，例如在Carpenter等，Ann.Rev.Biochem.56881-914(1987)中公開，包括其變異體(例如，EGFR的缺失突變體，如Humphrey等，PNAS(USA)874207-4211(1990))。erbB1指編碼EGFR蛋白產物的的基因。能結合EGFR的抗體實例包括MAb579(ATCC CRL RB 8506)、MAb 455(ATCC CRL HB 8507)、MAb 225(ATCC CRL 8508)、MAb 528(ATCC CRL 8509)(參見美國專利No.4943533，Mendelsohn等)以及其變異體，例如嵌合的225(C225)以及重塑的人類抗體225(H225)(參見WO 96/40210，Imclone SystemsInc)。
“Her2”、“ErbB2”、“c-Erb-B2”可以互相替換使用。除非另有說明，這里使用術語“ErbB2”、“c-Erb-B2”和“Her2”時是指人類蛋白質。該人類ErbB2基因和ErbB2蛋白質例如描述于，Semba等，PNAS(USA)826497-650(1985)和Yamanoto等，Nature319230-234(1986)(Genebank登錄號X03363)。與Her2特異性結合的抗體實例在美國專利5677171；5772997；Fendly等，Cancer Res.，501550-1558(1990)等中公開。
“ErbB3”和“Her3”指受體多肽，例如在美國專利No.5183884和5480968以及Kraus等PNAS(USA)869193-9197(1989)中公開，包括其變異體。能結合Her3的抗體實例在美國專利No.5968511中有描述，例如8B8抗體(ATCC HB 12070)。
術語“ErbB4”和“Her4”這里指受體多肽，例如在歐洲專利申請No.599274；Plowman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，901746-1750(1993)；以及Plowman等，Nature，366473-475(1993)中所述，包括其變異體，如WO 99/19488中公開的Her4異構型。
“胰島素樣生長因子-1受體”或“IGF-1R”指人類受體酪氨酸激酶，其基本上與Ulrich等EMBO J.，52503-2512(1986)或Steele-Perkins等，J.Biol.Chem.，26311486-11492(1988)中披露的那些相同。
“I-kB蛋白”或者“NF-kB蛋白抑制物”是指在I-kB蛋白處于部分磷酸化狀態的任何時候能夠與人類NF-kB蛋白形成穩定復合物的人類蛋白。在一個方面I-kB蛋白具有與NCBI登錄號000221或Baeuerle和Baltimore，Science，242540-546(1988)中所述的物質基本上相同的氨基酸序列。
“分離的”涉及多肽或蛋白質，是指基本上從其天然環境的成分中分離出。優選地，分離的多肽或蛋白質是一種與其天然環境成分相比由至少百分之八十重量的相同序列多肽或蛋白質構成的組合物；更優選地，該組合物與其天然環境成分相比由至少百分之九十五重量的相同序列的多肽或蛋白質構成；并且更優選地，該組合物與其天然環境成分相比由至少百分之九十九重量的相同序列的多肽或蛋白質構成。最優選地，該分離的多肽或蛋白質為同質的組合物，通過基于分子量和等電點的二維凝膠電泳的常規分離之后，其能夠被分辨成單個的點。通過常規的二維凝膠電泳來進行這種分析的方案對本領域普通技術人員來說是公知的，例如，Hames和Rickwood主編，Gel Electrophoresis ofProteinsA Practical Approach(IRL Press，Oxford，1981)；Scope，Protein Purfication(Springer-Verlag，New York，1982)；Rabilloud主編，Proteome ResearchTwo-Dimensioned Gel Electrophoresis andIdentification Methods(Springer-Verlag，Berlin，2000)。
“試劑盒”指的是用于運送材料的任何輸送系統。就反應測定而言，這種輸送系統包括可以從一個地點到另一個地點進行儲藏、運送或交付反應試劑(例如，在適當容器中的探針、酶等)和/或支持材料(例如，緩沖液，對實現測定的書面說明等)的系統。例如，試劑盒包括一個或多個裝有相關反應試劑和/或支持材料的外包裝(如盒子)。這些內容物可以一起或分別地交給預定的接受者。例如，第一個容器可含有測定中所用的酶，而第二個容器包含探針。
“NF-kB蛋白”或者“核因子κB蛋白”是指作為由Rel(也叫作c-Rel)、RelA(也叫作p65和NF-kB3)、RelB、NF-kB1(也叫作p50)和NF-kB2(也叫作p52)構成的相關轉錄因子組中的成員的人類蛋白。在一個方面，NF-kB蛋白為p50-RelA二聚體，并且在I-kB蛋白處于部分磷酸化的任何時候能夠與人類I-kB蛋白形成穩定的復合物。NF-kB蛋白以及其與I-kB蛋白的關系在以下參考文獻中有所描述Karin等，Nature Reviews Drug Discovery，317-26(2004)；Karin等，NatureReviews Cancer，2301-310(2002)；Li等，Nature ReviewsImmunology，2725-734(2002)；和Baldwin，Annu.Rev.Immunol.，14649-681(1996)。
“百分比相同的”或類似術語在此涉及參照序列與另一序列(即“候選”序列)的比對，指在兩個序列之間的最佳比對中，候選序列與參照序列在許多亞單位位點上相同達到了指明的百分比，所述亞單位對于多核苷酸的比對來說是核苷酸，對于多肽的比對來說是氨基酸。這里所使用的術語被比對序列的“最佳比對”是指亞單元之間的最大匹配程度和構建比對中所采用差別數量的最小化。百分相同比可以采用市場上可購得的算法工具來測定，該算法在Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48443-453(1970)(Wisconsin Sequence Analysis Package“GAP”程序，Genetics Computer Group，Madison，WI)中有描述。本領域中用于構建比對和計算百分相同比或其他相似性測量的其他軟件包包括“BestFit”程序，基于Smith和Waterman的算法，Advances in AppliedMathematics，2482-489(1981)(Wisconsin Sequence AnalysisPackage，Genetics Computer Group，Madison，WI)。換句話說，例如，為獲得具有與參照氨基酸序列至少95％相同氨基酸序列的多肽，該參照序列中有多達5％的氨基酸殘基可以缺失或被另一氨基酸所取代，或者占參照序列總氨基酸殘基數目5％的氨基酸可以插入該參照序列中。參照序列的這些變換可能發生在該參照氨基酸序列的氨基或者羧基端位點處或者那些端點位置之間的任何位置，或者單個地散布在作為整體的參照序列的殘基中間，或者以較鄰近基團的形式散布在該參照序列中。應當明白，在與本發明的參照序列進行比對時，候選序列可以為較大多肽或多核苷酸的組分或片段，并且為計算百分相同比目的進行的這種比對涉及相關的組分或片段。
“磷脂酰肌醇3激酶蛋白”或者等同的“PI3K蛋白”指人類蛋白質組中的一種人類胞內蛋白，NCBI登錄號NP_852664、NP_852556和NP_852665，以及氨基酸序列基本與之相同的蛋白質。
“血小板衍生生長因子受體”或者“PDGFR”指與PDGFRα或PDGFRβ或其變異體基本上相同的人類受體酪氨酸激酶蛋白，在Heldin等，Physiological Reviews，791283-1316(1999)中有描述。在一個方面，本發明包括通過測定以下組中的一種或多種二聚體來確定癌癥狀態，癌癥早期狀態，纖維化或硬化狀態PDGFRα同型二聚體、PDGFRβ同型二聚體以及PDGFRα-PDGFRβ異型二聚體。特別地，纖維化狀態包括肺或腎纖維化，硬化狀態包括動脈硬化癥。癌癥包括但不限于，乳腺癌、直腸癌、成膠質細胞瘤以及卵巢癌。單獨涉及“PDGFR”時應理解成指“PDGFRα”或“PDGFRβ”。
“多肽”是指由氨基酸殘基組成的一類化合物，氨基酸殘基通過酰氨鍵去除了一個氨基酸羧基和另一個氨基酸氨基之間的水的而化學連接在一起。多肽是氨基酸殘基的聚合體，它可以含有大量的這種殘基。通常，除了由較少數量的氨基酸所組成以外，肽與多肽類似。肽有時被稱作寡肽。多肽和肽之間沒有明確的區分。為了方便起見，在此公開說明和權利要求中，術語“多肽”一般將用于指肽和多肽。氨基酸殘基可以是天然的或合成的。
“蛋白質”指多肽，通常由生物細胞合成，折疊成固定的三維結構。蛋白質的分子量通常在約5,000至約5,000,000或以上，更常見在約5,000至約1,000,000的分子量，并且可包括翻譯后的修飾，如乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰氨化、共價連接核黃素、共價連接血紅素部分、共價連接核苷酸或核苷酸衍生物、共價連接脂質或脂質衍生物、共價連接磷脂酰肌醇、交聯、環化、形成二硫鍵、法尼基化(farnesylation)、脫甲基化、形成共價交聯、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸化合物、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI錨、羧基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、磷酸化、異戊二烯化、外消旋、selenoylation、硫酸化，以及泛醌化，如Wold，F.的Post-translational Protein ModificationsPerspectives and Prospects，1-12頁，B.C.Johnson 主編，AcademicPress，New York，1983。蛋白質包括，例如而并非限制，細胞因子或白介素，酶如激酶、蛋白酶、半乳糖苷酶等等，魚精蛋白，組蛋白，白蛋白，免疫球蛋白，硬蛋白，磷蛋白，粘蛋白，色蛋白，脂蛋白，核蛋白，糖蛋白，T-細胞受體、蛋白多糖等等。
“受體酪氨酸激酶活化狀態”、“受體酪氨酸激酶通道活化狀態”或“RTK通道活化狀態”或類似術語，是指在一個或多個通道中與RTK相關的一種或多種信號復合物的相對數量的圖案或圖像。例如，同一樣品中PI3K//RTK復合物的數量超過Shc//Grb2復合物的數量時，表明PI3K-Akt通道相對于Ras-MAPK通道占優勢活性。RTK通道活化狀態的特定水平或值或測量規模取決于一些因素，包括樣品中的細胞種類，是否存在疾病狀況，各通道中靶定的復合物的種類等等。RTK通道活化狀態的水平或值可通過在標準或預定條件下參考已知或正常水品的選定復合物的標準或參照樣品來確定。這里所使用的“狀態”涉及癌癥患者，是指來自癌癥患者的樣品、樣本或活檢樣品的RTK通道活化狀態。該“狀態”可以涉及疾病確定或分類、預后、藥物功效、患者對治療的反應、是否推薦輔助治療、疾病復發的可能性等等。
“受體酪氨酸激酶”或者“RTK”指具有胞內激酶活性并且選自蛋白質RTK家族的人類受體蛋白，如Schlessinger，Cell，103211-225(2000)；和Blume-Jensen與Hunter(引用見上)中所述。“受體酪氨酸激酶二聚體”指細胞表面膜中包含兩種受體酪氨酸激酶蛋白的復合物。在一些方式中，受體酪氨酸激酶二聚體可包含兩種共價連接的受體酪氨酸激酶蛋白。示范性的RTK二聚體列于表I中。特別受到關注的RTK二聚體有Her受體二聚體和VGEFR二聚體。
“標準樣品”指代表正常或非疾病狀態的一種或多種細胞、異種移植物、或組織樣品，將患者樣品的測量值與其對照以確定受體復合物的存在是否過量或者在患者樣品中的存在量減少。標準樣品的性質對于特定的測定來說是設計選擇的問題，可以從患者自己的正常組織中獲得或測得，或者從健康個體的人群的組織中獲得。優選地，標準樣品中涉及受體復合物數量的值是在與被測患者樣品中相應值基本上相同的實驗條件下獲得的。標準樣品可以來自與患者樣品同種的組織，或者可以來自不同的組織類型，并且用以獲得該標準樣品組織的人群可以選擇與患者具有相符合的特征，例如年齡、性別、種族等等。典型地，在本發明的測定中，將患者樣品中受體復合物的數量與標準樣品中相應的值相比較，該標準樣品預先制成表格并提供平均范圍、平均值和標準偏差，或類似表示方式。
“樣品”或“組織樣品”或“患者樣品”或“患者細胞或組織樣品”或“樣本”都是指從受試者或患者的組織中獲得的相似細胞集合。組織樣品的來源可以是固體組織，如來自于新鮮、冷凍和/或保存的器官或組織樣品或活檢或吸入氣；血液或任何血液成分；體液例如腦脊液、羊水、腹水、或者組織液；或者是來自于受試者懷孕或成長中任何時期的細胞。組織樣品可包含與該組織非自然混合的化合物，其本質是例如防腐劑、抗凝血劑、緩沖液、固定劑、營養物、抗生素等等。在本發明的一個方面，組織樣品或患者樣品為固定的，特別是常規的福爾馬林固定的石蠟包埋樣品。這些樣品典型地用在對固定組織的薄切片形式的受體復合物測定中，例如3-10μm厚，其中該固定組織設置在顯微鏡載玻片，或等同物的表面上。這些樣品還典型地經過常規的再水合過程，并且可選擇地，進行了抗原修復過程作為測定試驗預處理過程的一部分。
“分離圖像”(separation profile)涉及分子標簽的分離，是指表、圖、曲線、柱形圖，或者其他表示信號強度數據與有關分子標簽的參數例如停留時間、質量等之間關系的方法，它提供了測定試驗中產生的各種類型分子標簽的數量讀數或測量值。分離圖像可以是電泳圖譜、色譜圖、電色譜圖、質譜圖，或類似的根據所采用的分離技術的數據圖形表示。涉及分離圖像的“峰”或“帶”或“區”是指分離化合物所集中的區域。一個測定試驗可能有多個分離圖表，例如，當不同的分子標簽具有獨特發射光譜的不同熒光標記，并且在多個波長下采集和記錄數據時。在一個方面，所釋放的分子標簽由于電泳遷移率的差異而形成電泳圖譜從而被分離，其中不同的分子標簽對應于電泳圖譜上不同的峰。電泳圖譜中對不同或者較少重疊的相鄰峰值的測量值即為“電泳分辨率”，它可被視為相鄰峰值最大值之間的距離除以該峰值的兩個標準偏差中較大值的4倍。優選地，相鄰峰值的分辨率至少為1.0，更優選至少為1.5，最優選至少為2.0。在給定的分離和檢測系統中，所需的分辨率可通過選擇多個分子標簽來獲得，這些分子標簽成分的電泳遷移率至少有分辨峰數量的區別，該數量依賴于幾個本領域普通技術人員公知的因素，包括信號檢測系統，熒光部分的性質，標簽的擴散系數，篩選基質的存在與否，電泳設備的特性，例如有無通道、分離通道的長度等等。利用分析程序可以分析電泳圖譜，從而與分子標簽的存在、不存在或者數量的數據特征相關聯，該程序例如在William等人的美國專利公開2003/0170734A1中所披露。
“SHC”(代表“Src同源2/α-膠原蛋白有關的”)指與Pelicci等在Cell，7093-104(1992)中所述基本相同的、RTK信號通道中的適配體蛋白家族(66，52和46kDalton)中的任何一個。在一個方面，SHC指這種適配體蛋白的人類形式。
“信號通道”或者“信號傳導通道”指一系列的分子活動，其開始通常是細胞表面受體與胞外配體的相互作用或者胞內分子與細胞表面受體的磷酸化位點相結合，其導致了對細胞核中基因表達的調控。“Ras-MAPK通道”指的是一種信號通道，其包括在形成Ras-GTP復合物之后對MAPK蛋白的磷酸化。“PI3K-Akt通道”指的是一種信號通道，其包括通過PI3K蛋白對Akt蛋白的磷酸化。
“特異”或“特異性”涉及一個分子與另一個分子的結合，例如對靶分析物或復合物的結合化合物或探針，指的是探針與靶之間的識別、接觸并形成穩定的復合物，同時該探針與其他的分子基本上較少地識別、接觸或形成復合物。在一個方面，“特異”涉及第一分子與第二分子相結合，是指第一分子與反應或樣品中的另一分子進行識別并形成復合物的程度，其能與該第二分子形成最大數目的復合物。在一個方面，該最大數目至少占第一分子所形成全部這種復合物的50％。一般來說，涉及特異性結合過程的分子在其表面或空穴中有一些區域，能在彼此結合的分子之間產生特異的識別。特異性結合的實例包括抗體-抗原相互作用、酶-底物相互作用、在多核苷酸和/或寡核苷酸中形成雙重體或三重體、受體-配體相互作用等等。
這里所使用的“光譜分辨的”涉及多個熒光標記，指該標記的熒光發射波段足夠明顯，即足以不發生重疊，使得各標記物連接的分子標簽可以根據相應標記物所產生的熒光信號通過標準光電檢測系統來區分，例如，采用帶通濾波器和光電倍增管等等，如示例性地描述于美國專利No.4230558；4811218等等，或者Wheeless等，21-76頁，in FlowCytometryInstrumentation and Data Analysis(Academic Press，New York，1985)。
“基本相同”涉及被比對的蛋白質或者相關蛋白質家族中的蛋白質氨基酸序列，指的是或者一種蛋白質的氨基酸序列有至少百分之五十與另一種蛋白質相同，或者一種蛋白質是另一種蛋白質相同基因的異構型或剪接變異體。在一個方面，基本上相同指一種蛋白質，或其氨基酸序列，與另一種蛋白質或其氨基酸序列有至少百分之八十相同。
這里所使用的“VEGF受體”或“VEGFR”涉及血管內皮生長因子(VEGF)的細胞受體，是一種存在于血管內皮細胞上，以及保持有結合人類VEGF能力的其變異體上的常見的細胞表面受體。VEGF受體包括VEGFR1(也叫作Flt1)、VEGFR2(也叫作Flk1或KDR)和VEGFR3(也叫作Flt4)。這些受體描述于DeVries等，Science255989(1992)；Shibuya等，Oncogene 5519(1990)；Matthews等，Proc.Nat.Acad.Sci.889026(1991)；Terman等，Oncogene 61677(1991)；Terman等，Biochem.Biophys.Res.Commun.1871579(1992)。VEGF受體二聚體公開于Shibuya，Cell Structure and Function，2625-35(2001)；和Ferrara等，Nature Medicine，9669-676(2003)。
發明詳述本發明提供了一種用胞內復合物作為生物有機體中疾病狀態或其他生理狀態，特別是人類癌癥狀態的生物標記的方法。在一個方面，直接測定來自于患者樣品的胞內復合物；也就是說，進行測量而不作培養，形成異種移植物，或采用類似的技術，這需要額外勞動和費用并且可能在測量中引入假象和/或噪聲。在本發明的一個特定方面，直接在冷凍患者樣品的組織裂解物或者固定患者樣品的切片上測定一種或多種受體復合物。在優選實施方式中，在福爾馬林固定的石蠟包埋(FFPE)樣品切片中測定一種或多種胞內復合物。
在另一個方面，本發明提供了一種間接測量胞內蛋白磷酸化的方法，通過測定其形成依賴于這種翻譯后修飾的復合物而實現。
在另一個方面，本發明提供了一種在同一測定反應混合物中同時測定多個胞內復合物的方法。優選地，采用可釋放性地連接著一個或多個分子標簽的結合化合物來測定該復合物，這樣在結合了復合物中的蛋白質之后，該分子標簽可以從反應或測定混合物中釋放和分離出來用以檢測和/或定量。
在另一個方面，本發明提供了一種測定患者疾病狀態的方法，包括以下步驟測定一種或多種胞內蛋白-蛋白復合物在患者樣品中每種的數量；將該每種的數量與其標準樣品中的相應數量相比較；以及將患者樣品中的數量與標準樣品中的各相應數量之差與患者疾病狀態的存在或嚴重性相關聯。在優選實施方式中，測定步驟包括(i)提供一種或多種結合化合物，其對一種或多種復合物的每種中的蛋白質具有特異性，使得每種結合化合物具有一種或多種分子標簽，分別通過可裂解連接物連接于其上，并且使該一種或多種分子標簽連接著具有不同分離特性的不同結合化合物，這樣通過將分子標簽從不同的結合化合物上分離，而形成了分離圖像上的獨特峰；(ii)將該結合化合物與一種或多種復合物混合，使得結合化合物特異性地結合于其相應的復合物蛋白從而形成可檢測的復合物；(iii)裂解形成可檢測的復合物的每種結合化合物的可裂解連接物，以及(iv)分離和鑒定所釋放的分子標簽以確定該一種或多種蛋白復合物的存在與否或者數量。
在另一個方面，測定一種或多種復合物的數量的方法包括以下步驟i)向一種或多種復合物的每種提供裂解探針，其對所述一種或多種復合物的每種的第一蛋白具有特異性，各裂解探針具有有效近程的裂解引發部分；(ii)提供一種或多種結合化合物，其對所述一種或多種復合物的每種的第二蛋白具有特異性，使每種結合化合物具有一種或多種分子標簽，分別通過可裂解連接物連接與其上，并且使所述一種或多種分子標簽連接著具有不同分離特性的不同結合化合物，這樣通過將分子標簽從不同的結合化合物上分離，而形成了分離圖像上的獨特峰；(iii)將裂解探針、結合化合物與所述一種或多種復合物混合，使得裂解探針特異性地結合于復合物的第一蛋白，而結合化合物特異性地結合于復合物的第二蛋白，這樣結合化合物的可裂解連接物處于裂解探針裂解引發部分的有效近程內，使分子標簽被釋放；以及(iv)分離和鑒定所釋放的分子標簽以確定該一種或多種蛋白復合物的存在與否或者數量。優選地，復合物和第一與第二蛋白選自表IIA和IIB中列出的復合物。
在另一個方面，本發明通過采用能產生局部作用的裂解劑的裂解探針和由可釋放分子標簽標記的結合化合物的方法來實現，其中所述分子標簽可通過所述裂解劑來釋放。通過設計裂解探針和結合化合物，使得至少一種裂解探針特異性地結合到與至少一種結合化合物不同的復合物成分上，從而可以檢測復合物的形成。在該方式下，預定類型的分子標簽僅在復合物形成時被釋放出來。
在本發明的另一個方面，從患者獲得生物樣品，其中包括懷疑含有稀少目標細胞的混合細胞群體。接著通過將該生物樣本與偶聯生物特異性配體的磁性顆粒混合來制備樣品，所述生物特異性配體能與所述稀少細胞上不同于或不存在于血細胞上的抗原特異性反應(這里稱為“捕獲抗原”)，這樣可以基本去除其他的樣品成分。使樣品處于磁場中，該磁場可有效地分離磁性顆粒標記的細胞，包括所述稀少的目標細胞，如果其存在于樣本中的話。然后采用對胞內復合物特異的結合部分所偶聯的分子標簽來分析上述分離的細胞群體，以確定稀少細胞的存在與否和/或數量。在優選實施方式中，該方法中使用的磁性顆粒為膠體磁性納米顆粒。優選地，該稀少細胞群體為循環上皮細胞，其可以利用上皮特異性捕獲抗原從患者血液中分離，該抗原例如以下文獻中所公開Hayes等，Internation J.of Oncology，211111-1117(2002)；Soria等，Clinical Cancer Research，5971-975(1999)；Ady等，BritishJ.Cancer，90443-448(2004)；其均引入作為參考。特別地，可采用單克隆抗體BerEP4(Dynal A.S.，Oslo，Norway)通過磁性顆粒來捕獲人類表皮細胞。
在另一個方面，本發明提供了一種確定患者癌癥狀態的方法，包括以下步驟(i)通過將患者血液樣品與一種或多種抗體組合物接觸來免疫磁分離包含循環上皮細胞的患者樣品，每種抗體組合物對捕獲抗原具有特異性并連接著磁性顆粒；(ii)測定患者樣品中一種或多種胞內復合物每種的數量；將每種這些數量與其對應的標準樣品中的數量相比較；并將患者樣品中的數量與標準樣品中的各相應數量之差與患者癌癥狀況的存在性或嚴重性相關聯。在優選的實施方式中，測量方法包括步驟(i)提供一種或多種結合化合物，其對一種或多種胞內復合物的每種中的蛋白質具有特異性，使得每種結合化合物具有一種或多種分子標簽，分別通過可裂解連接物連接于其上，并且使該一種或多種分子標簽連接著具有不同分離特性的不同結合化合物，這樣通過將分子標簽從不同的結合化合物上分離，而形成了分離圖像上的獨特峰；(ii)將該結合化合物與一種或多種胞內復合物混合，使得該結合化合物特異性地結合于該一種或多種胞內復合物中的相應蛋白從而形成可檢測的復合物；(iii)裂解形成可檢測的復合物的每種結合化合物的可裂解連接物，以及(iv)分離和鑒定所釋放的分子標簽以確定該一種或多種胞內復合物的存在與否或者數量。
形成可檢測復合物的示范性蛋白質在一個方面，通過同時測定蛋白-蛋白復合物，可用本發明的測定來確定一種或多種凋亡通道是否被活化。特別受關注的蛋白-蛋白復合物包括但不限于下表中的蛋白質。優選的是下列蛋白的人類形式和蛋白質家族。
表I.
在凋亡通道中形成胞內復合物的示范性蛋白質
表IIA凋亡通道中的示范性蛋白-蛋白復合物(其中“蛋白1//蛋白2”表示由蛋白質1和蛋白質2組成的復合物)
表IIB示范性的RTK二聚體和胞內復合物(其中“蛋白1//蛋白2”表示由蛋白質1和蛋白質2組成的復合物)
樣品制備含有分子復合物的樣品可以廣泛地來自于適用于本發明的各種來源，從而使受體復合物的數量與疾病狀態或健康狀態相關，包括細胞培養物、動物或植物組織、患者活組織切片等等。優選地，樣品為人類患者樣品。可利用常規的技術來制備樣品用于本發明的測定，所用技術可根據取得樣品的來源確定。
A.固體組織樣品。
對于活檢和醫學樣本來說，以下參考文獻中提供了技術指導Bancroft JD & Stevens A主編，Theory and Practice of HistologicalTechniques(Churchill Livingstone，Edinburgh，1977)；Pearse，Histochemistry.Theory and applied.第四版(ChurchillLivingstone，Edinburgh，1980)。
在癌癥狀態區域中，可以采用的患者組織樣品實例包括但不限于，乳腺、前列腺、卵巢、結腸、肺、子宮內膜、胃、唾液腺、或胰腺。所述組織樣品可通過多種方法獲得，包括但不限于，外科切除、抽吸或活組織切片。組織可以是新鮮的或者是冷凍的。在一個實施方式中，本發明的測定是在固定并用石蠟或類似物包埋的組織樣品上實施的；因此，在該實施方式中，要進行脫去石蠟的步驟。組織樣品可以通過常規的方法固定(即防腐)[參見例如，“Manual of Histological Staining Methodof the Armed Forces Institute of Pathology”，第3版(1960)，Lee G.Luna，HT(ASCP)主編，The Blakston Division McGraw-Hill BookCompany，New York；The Armed Forces Institute of PathologyAdvanced Labotatory Methods in Histology and Pathology(1994)Ulreka V.Miked主編，Armed Forces Institute of Pathology，American Registry of Pathology，Washington，D.C.。本領域技術人員應當明白，固定劑的選擇是根據被組織染色或作其他分析所用的組織的用途來決定的。本領域技術人員還應當明白，固定的長度取決于組織樣品的尺寸和所使用的固定劑。舉例來說，可用中性緩沖液福爾馬林、布安氏液或多聚甲醛來固定組織樣品。
一般來說，首先固定組織樣品，然后通過遞增系列的乙醇脫水，用石蠟或其他切片介質滲透和包埋，使該組織樣品形成切片。或者，可以將組織進行切片并固定所獲得的切片。舉例來說，可用常規的方法在石蠟中包埋和處理該組織樣品(參見例如，“Manual of HistologicalStaining Method of the Armed Forces Institute of Pathology”，supra)。可使用的石蠟實例包括但不限于，Paraplast、Broloid和Tissuemay。一旦組織樣品被包埋后，該樣品就可通過顯微切片機或類似儀器進行切片(參見例如，“Manual of Histological Staining Methodof the Armed Forces Institute of Pathology”，supra)。對于該步驟舉例來說，切片厚度可在約三微米至約十二微米的范圍內，優選地，厚度在約5微米至約10微米的范圍內。在一個方面，切片面積可以從約10mm2至約1cm2。一旦切片之后，可通過一些標準的方法將該切片加到載玻片上。載玻片粘合劑的實例包括但不限于硅烷、凝膠、聚-L-賴氨酸等等。舉例來說，可將該石蠟包埋的組織粘貼到帶正電的載玻片上和/或涂附有聚-L-賴氨酸的載玻片上。
如果使用了石蠟作為包埋材料，該組織切片一般來說要脫去石蠟并與水進行再水合。該組織切片可通過幾種常規的標準方法來脫去石蠟。例如，可采用二甲苯和逐漸遞減系列的乙醇(參見例如，Manual ofHistological Staining Method of the Armed Forces Institute ofPathology”，supra)。或者，可采用市場上可購買到的脫石蠟無機試劑，如Hemo-De(CMS，Houston Tex.)。
對于哺乳動物的組織培養細胞、新鮮組織或類似來源來說，可以通過常規的細胞裂解技術來制備樣品(例如0.14M NaCl，1.5mM MgCl2，10mM Tris-Cl(pH8.6)，0.5％Nonidet P-40以及所需的蛋白酶和/或磷酸酶抑制劑)。對于新鮮的哺乳動物組織來說，樣品的制備還可以包括組織解聚步驟，例如破碎、剁碎、研磨、超聲處理等等。
B.細胞的磁性分離。
在一些應用中，例如在測定來自于患者血液的稀少轉移性細胞上的二聚體時，可以在進行表面受體二聚體數量測定之前實施一個富集的步驟。可以利用各種本領域已知的技術和材料來進行免疫磁性分離或者富集過程，如以下代表性參考文獻中所公開，引入其作為參考Terstappen等的美國專利6365362；Terstappen等的美國專利5646001；Robr等的美國專利5998224；Kausch等的美國專利5665582；Kresse等的美國專利6048515；Kausch等的美國專利5508164；Miltenyi等的美國專利5691208；Molday的美國專利4452773；Kronick的美國專利4375407；Radbruch等，Methods in Cell Biology，Vol42中第23章，(AcademicPress，New York，1994)；Uhlen等，Advances in BiomagneticSeparation(Eaton Publishing，Natick，1994)；Safarik等，J.Chromatography B，72233-53(1999)；Miltenyi等，Cytometry，11231-238(1990)；Nakamura等，Biotechnol.Prog.，171145-1155(2001)；Moreno等，Urology，58386-392(2001)；Racila等，Proc.Natl.Acad.Sci.，954589-4594(1998)；Zigeuner等，J.Urology，169701-705(2003)；Ghossein等，Seminars in SurgicalOncology，20304-311(2001)。
優選用于實施本發明的磁性顆粒是性質如膠體的顆粒。這種顆粒的特征在于其亞微密級的顆粒尺寸，通常小于約200納米(nm)(0.20微米)，并且其穩定性對于溶液中的重力分離能持續較長時間。除了許多其他的優點之外，該尺寸范圍還使其對于細胞分析中常用的分析技術來說基本上不可見。預計在90-150nm范圍內并且磁質量在70-90％之間的顆粒適用于本發明。適合的磁性顆粒由周圍圍繞著分子的超順磁性材料晶核構成，該分子例如通過物理吸附或共價連接而結合到磁性核心上并賦予其穩定的膠體特性。涂覆材料優選的施加量應有效地防止生物樣品中的生物大分子與磁性核心之間的非特異性相互作用。這種生物大分子可包括非目標細胞表面上的唾液酸殘基、外源凝集素、糖蛋白以及其他的膜成分。此外，該材料應當含有盡可能多的磁質量/納米顆粒。包括核心的磁性晶體尺寸應足夠小使其不含有完整的磁疇。納米顆粒的尺寸足夠小使得其布朗能量超過了其磁矩。結果，這些膠體磁性顆粒幾乎不出現北極、南極的對齊以及之后的相互吸引/排斥作用，甚至于在適度強大的磁場下也是，這有助于其溶液的穩定性。最后，該磁性顆粒應當可在高磁場梯度的外部場分離器中被分離。該特征有利于樣品處理，并且具有比加載鐵磁性珠或鋼絲絨的較復雜內部梯度柱更經濟的優點。具有上述特性的磁性顆粒可以通過美國專利No.4795698、5597531、5698271中所述的基本材料來制備，引入這些專利作為參考。
采用可釋放分子標簽的測定試驗采用可釋放分子標簽來測定胞內復合物的數量具有許多優點，包括(1)從測定混合物中分離所釋放的分子標簽可以大大降低本底和顯著提高靈敏度；以及(2)使用為簡化分離和檢測過程而特別設計的分子標簽提供了便利的多元化性能，這樣很容易在同一測定中同時測得多個受體復合物成分。采用了這種標簽的測定可具有多種形式并在以下參考文獻中所公開Singh等的美國專利6627400；Singh等的美國專利公開2002/0013126；以及2003/0170915，和Williams等的2002/0146726；和Chan-Hui等的國際專利公開WO2004/011900，所有文獻在此引入作為參考。例如，可采用根據被分離分子之間的物理、化學或光學特性差異來區分分子的多種分離技術，所述特性包括但不限于電泳遷移率、分子量、形狀、溶解度、pKa、疏水性、電荷、荷/質比、極性等等。在一個方面，多個或一組分子標簽在電泳遷移率和光學檢測特性上有所不同，因而通過電泳來分離。在另一個方面，多個或一組分子標簽可以在分子量、形狀、溶解度、pKa、疏水性、電荷、極性上有所不同，因而通過正相或反相HPLC、離子交換HPLC、毛細管電泳、質譜法、氣相色譜法等等技術來分離。
提供成組的分子標簽，在其從結合化合物上釋放之后通過分離技術分離成不同的帶或峰。鑒定并定量這些峰可提供對受體二聚體種類和數量的測定值或圖像。一組分子標簽可具有不同的化學性質；然而，為方便起見，成組的分子標簽通常化學性質相關。例如，其可以都為肽，或者其可以由相同堿基構建區或單體的不同組合構成，或者其可以采用具有不同取代基的相同堿基骨架來合成以賦予不同的分離特性，如下面所詳細描述。多個分子標簽的數量根據一些因素可以有所不同，包括采用的分離模式，分子標簽上使用的檢測標記物，結合部分的靈敏度，裂解可裂解連接物的效率等等。在一個方面，用于測定受體二聚體數量的多個分子標簽的數量在2到10的范圍內。在其他方式中，多個分子標簽的數量可在2到8，2到6，2到4，或2到3的范圍內。
可以在均勻相或非均勻，即多相的測定試驗中檢測胞內復合物。在均勻相中，不需要任何步驟來將特異性結合于靶復合物的結合化合物從未結合的結合化合物中分離。在優選實施方式中，均勻相采用的試劑對包括(i)具有可釋放分子標簽的一種或多種結合化合物和(ii)能夠產生活性物質的至少一個裂解探針，該活性物質可與分子標簽反應并在該裂解探針的有效近程內釋放分子標簽。
胞內復合物還可以通過采用多相形式的測定試驗來測定。多相技術通常涉及分離步驟，其中將具有特異性結合的結合化合物的胞內復合物從未結合的結合化合物中分離，并且可選擇地從其他樣品成分，如蛋白質、膜碎片等中分離出來。可以通過各種方式實現分離過程，例如采用結合著固相支持物的試劑，其可以區分出結合的復合物和未結合的結合化合物。固相支持物可以是容器壁，例如微滴定孔板的孔、毛細管、平板、載玻片、微珠，包括磁珠，脂質體等等。該固體支持物的主要特征是(1)可以分離結合的與未結合的結合化合物，以及(2)不干擾結合復合物的形成，或者在確定胞內復合物時的其他操作。通常，在固定樣品中，未結合的結合化合物通過洗滌可容易地去除掉。
在多相形式中利用分子標簽檢測時，在洗滌之后，可將樣品與溶劑混合，在其中釋放分子標簽。根據可裂解鍵的性質和裂解方法，該溶劑中可包括用于裂解的任何附加試劑。在不需要裂解試劑的情況下，該溶劑可以方便地作為分離緩沖液，例如，電泳分離介質。例如，通過光敏劑產生的活性物質，該可裂解連接物具有光敏感性的或易分解性時，可以用適當波長的光照射該介質以將該分子標簽釋放到緩沖液中。
無論哪種形式下，如果測定反應的條件干擾了所采用的分離技術，則可能需要在裂解和分離分子標簽之前去除或交換該測定反應緩沖液。例如，在一些實施方式中，測定條件包括鹽濃度(例如特異性結合所需的)，當分子標簽在電泳遷移率基礎上進行分離時，該鹽濃度其會使分離的性能降低。在該實施方式中，釋放和分離分子標簽之前，要用分離緩沖液或介質來替代測定緩沖液。
采用了可釋放分子標簽和裂解探針的測定試驗根據被檢測或測定的復合物可以采取多種不同的形式和構造。根據本公開說明書，對于本領域普通技術人員來說選擇特定的結合化合物和裂解探針的數量和特異性是一種設計選擇。
圖1A說明本發明一個實施方式的操作。分子復合物(100)由蛋白(104)和(102)的結合形成，例如14-3-3和磷酸化BAD。本發明的試劑(107)包含裂解探針(108)(在該圖示中連接有光敏劑“PS”)和結合化合物(106)，將其與含有復合物(100)的樣品混合，在該混合條件下裂解探針(108)和結合化合物(106)與復合物(100)上其相應的抗原決定簇發生特異性結合(112)，其中其相應的抗原決定簇位于復合物的不同蛋白上。結合之后，選擇性地進行洗滌或緩沖液交換，活化裂解探針(108)以產生活性物質，例如單線態氧，其從光敏劑上擴散出來在有效近程(110)內。該近程內的可裂解連接物被裂解并釋放出分子標簽(114)。接著分離(117)所釋放的分子標簽(116)并制作分離圖像(120)，例如電泳圖譜，其中識別出峰(118)并與分子標簽“mT1”相對應。采用其他的結合化合物和分子標簽可以測定其他的復合物。圖1B表示了一個更復雜的實施方式，其中采用了額外的結合化合物來測定樣品中蛋白(104)的總量。本發明的反應試劑(122)包含(i)裂解探針(108)、第一結合化合物(106)和第二結合化合物(107)，其中第一結合化合物(106)對蛋白(102)具有特異性，第二結合化合物(107)對蛋白(104)在與裂解探針(108)特異性不同的抗原決定簇處具有特異性。與圖1A的實施方式類似，在結合反應試劑之后，裂解探針(108)被活化產生活性物質，其可以在光敏劑的有效近程內裂解該分子標簽的可裂解連接物。在該實方式中，分子標簽從同時連接著反應試劑(107)和(108)蛋白(104)的單體上，以及連接著試劑(108)并單獨或同時連接著試劑(106)和(107)的異型二聚體上釋放出來。將釋放的分子標簽(123)分離，分離圖像(126)中的峰(118和124)與所釋放分子標簽的數量相關。在該實施方式中，相關峰的高度或面積可以反映(i)第一和第二結合化合物對其相應抗原決定簇的親和性差異，和/或(ii)對結合化合物具有特異性的抗原決定簇的存在與否。無論何時將結合化合物用于監測蛋白質的翻譯后狀態，如磷酸化狀態，后一種情況都很重要。
對凋亡信號分子的同型二聚體以及異型二聚體復合物的測定如圖1A-1C中所示。圖1C說明了一種用于測定同型二聚體復合物的方法。如上所述，測定可包括三種反應試劑(128)裂解探針(134)、第一結合化合物(130)和第二結合化合物(132)。第一結合化合物(130)和裂解探針(134)被構建成對樣品中以同型二聚體(136)或單體(138)形式存在(140)的蛋白(138)上相同的抗原決定簇(135)具有特異性。在能促進反應試劑和其相應靶之間形成穩定復合物的條件下，反應試劑(128)與樣品混合之后，測定混合物中形成了多種復合物(142至150)。由于裂解探針(134)和結合化合物(130)特異于相同的抗原決定簇(135)，反應試劑的四種不同組合(144至150)可形成具有同型二聚體的復合物。在測定混合物中的復合物中，只有那些(143)同時具有裂解探針(134)和至少一個結合化合物的復合物能夠貢獻出釋放的分子標簽(151)用以分離和檢測(154)。在該實施方式中，峰(153)的大小與測定混合物中同型二聚體的數量成正比，而峰(152)的大小與測定混合物中蛋白(138)的總量成正比，其既有單體形式(142)又有同型二聚體形式(146和148)。
本發明的另一個方面如圖1D和1E所示，其中提供了對細胞樣品中的多種復合物的同時檢測或測定。將細胞(160)，其可來自于體外培養或者來自于患者組織樣本，裂解(172)以提供可接近的分子復合物，其連接著細胞膜，和/或在細胞質中，和/或在細胞核中。與凋亡信號相聯系的復合物包括但不限于，表面受體復合物，如受體二聚體，包括適配體或多種類型的分子骨架的受體復合物，二聚體和較高度有序化的胞內蛋白復合物，該復合物中的蛋白質磷酸化位點等等。裂解之后，得到的裂解物(174)與包含多個裂解探針(175)和多個結合化合物(177)的測定試劑(176)混合。選擇(178)測定條件使得試劑(176)與其相應的靶特異性結合，這樣經過活化后，裂解引發部分的有效近程(180)內的可裂解連接物被裂解，并釋放出(182)分子標簽。如上所述，裂解之后，將釋放的分子標簽分離(184)并在分離圖像(186)如電泳圖譜中進行鑒定，并根據所測得的分子標簽數和量來獲得樣品細胞中選定分子復合物的圖像。
圖1F和1G說明了本發明測定固定或冷凍的組織樣品中受體復合物的實施方式。將固定的組織樣品(1000)，例如福爾馬林固定的石蠟包埋樣品，利用顯微切片機或類似儀器切割獲得切片(1004)，放置在表面(1006)如顯微載玻片上之后，進行脫蠟和再水化以便加入測定試劑。放大圖(1007)表示了部分(1014)顯微載玻片(1006)上的部分(1008)切片(1004)。所示胞內復合物(1018)與固定樣品的殘余膜結構(1016)在一起。根據本發明的這個方面，裂解探針和結合化合物與固定樣品一起溫育，使得它們與其靶分子結合。例如，裂解探針(1012)(圖中表示為連接著光敏劑(“PS”)的抗體)與第一結合化合物(1010)(表示為連接著分子標簽“mT1”的抗體)特異性地結合著通用于所有所示復合物的蛋白(1011)，第二結合化合物(1017)(具有“mT2”)特異性地結合著蛋白(1015)，以及第三結合化合物(1019)(具有“mT3”)特異性地結合著蛋白(1013)。洗滌以去除未特異性結合其相應靶分子的結合化合物和裂解探針之后，加入緩沖液(1024)(圖中稱為“照射緩沖液”)。為方便起見，可通過在載玻片(1006)上形成疏水性載體，例如用蠟筆，將緩沖液(1024)包含在切片(1004)或其一部分上。照射光敏劑并釋放分子標簽(1026)之后，將當前含有釋放的分子標簽(1025)的緩沖液轉移到分離裝置中，例如毛細管電泳儀，用以在例如電泳圖譜(1030)中分離(1028)和鑒別所釋放的分子標簽。
對直接在組織樣品上進行的測定，尤其如圖1F和1G所示，可以進行標準化處理，其包括測定對樣品中總細胞數和/或樣品中特性亞型的細胞具有代表性的靶細胞或組織。這種靶組織在此稱為“組織指示物”。優選甚至必須進行額外的測定，因為患者樣品，尤其是腫瘤樣品中的細胞和組織具有不均勻性，其可能包含正常細胞的基本片段。例如，圖1H中，受體(1011)的總量值可作為以下兩個測量值的比例給出分子標簽(“mT1”)的峰(1032)面積和與樣品中所有細胞共有的細胞或組織成分，如微管蛋白，有關的分子標簽的相應峰面積。在一些情況下，樣品中所有細胞都是上皮細胞時，或者目標細胞是侵入非上皮組織的上皮細胞時，可以采用細胞角蛋白，或者細胞角蛋白和微管蛋白。因此，基于可釋放分子標簽的方法可以包括額外的步驟，即提供特異于標準化蛋白如微管蛋白的結合化合物(具有獨特的分子標簽)。
圖1H說明用于測定含有共有成分受體的受體二聚體的相關數量優選實施方式。在該測定設計中，可根據該共有成分參比測量兩種不同的受體二聚體(“1-2”(240)和“2-3”(250))，其中每種都含有共有成分“2”。所示的測定設計是用于測定包含受體“1”(222)和受體“2”(220)的受體異型二聚體(240)，以及包含受體“2”(220)和受體“3”(224)的受體異型二聚體(250)。該實施方式的一個關鍵特征是裂解探針(227)對異型二聚體對的共有受體具有特異性。特異于受體“2”的結合化合物(228)提供了與測定中受體“2”總量相關的信號(234)，而特異于受體“1”的結合化合物(226)和特異于受體“3”的結合化合物(230)提供的信號(分別是232和236)分別僅與受體“1”和受體“3”的數量相關，所述受體“1”和受體“3”分別存在于與受體“2”形成的異型二聚體中。圖1H的設計可以推廣到含有共有成分的兩種以上的受體復合物中，僅需要加入特異于額外復合物成分的結合化合物。
A.結合化合物如上所述，本發明的一個方面包括提供多種不同結合化合物的混合物，其中每種不同的結合化合物具有一種或多種通過可裂解連接物連接的分子標簽。結合化合物、可裂解連接物以及分子標簽的性質可以在很大范圍內變化。結合化合物可包含抗體結合組分、抗體、肽、針對細胞表面受體的肽或非肽配體、蛋白、寡核苷酸、寡核苷酸類似物如肽核酸，外源凝集素，或者其他的能夠與目標分析物特異性結合或者形成穩定復合物，如蛋白質復合物，的分子實體。在一個方面，結合化合物可用以下通式表示，包含一種或多種連接著結合部分的分子標簽。
B-(L-E)k其中B為連接部分；L為可裂解連接物；E為分子標簽。在均相測定中，可裂解連接物L可以為易氧化的連接物，更優選是能夠被單線態氧裂解的連接物。部分“-(L-E)k”表示單個結合化合物可具有多個分子標簽，通過可裂解連接物連接。在一個方面，k是大于或等于一的整數，而在其他實施方式中，k可以大于幾百，例如100至500，或者k大于幾百并多達幾千，例如500至5000。通常多個不同類型的結合化合物的每個都具有不同的分子標簽E。可裂解連接物，例如易氧化連接物，與分子標簽E通過常規的化學方法連接到B上。
優選地，B為抗體結合組合物。這種組合物很容易由市場上可購買的各種抗體制得，其可以是單克隆和多克隆的，對目標蛋白質具有特異性。特別地，以下專利中公開了對表皮生長因子受體具有特異性的抗體，引入其作為參考5677171；5772997；5968511；5480968；5811098。美國專利6488390，這里引入作為參考，其公開了對G蛋白偶聯受體CCR4具有特異性的抗體。美國專利5599681，這里引入作為參考，其公開了對蛋白質的磷酸化位點具有特異性的抗體。供應商如Cell Signaling Technology(Beverly，MA)；BiosourceInternational(Camarillo，CA)，和Upstate(Charlottesville，VA)，也提供對多種蛋白具有特異性的單克隆和多克隆抗體，例如凋亡通道中的蛋白質，包括表II中列出的蛋白質。
可裂解連接物L，實質上可以是任何化學連接基團，其可以在不降解所釋放分子標簽E的結構或影響其檢測特性的條件下發生裂解。無論何時將裂解探針用于均相測定，可裂解連接物L都會被該裂解探針產生的裂解劑裂解，其中裂解探針在短距離中起作用使得僅在該裂解探針的直接近程中的可裂解連接物會發生裂解。典型地，這種試劑必須通過反應混合物發生物理或化學變化才能被活化，使得該試劑產生短暫的活性物質擴散到可裂解連接物處進行裂解作用。在均勻相中，裂解劑優選連接著結合部分，如抗體，其在活化之前使裂解試劑靶向特定的位點，該位點位于具有可釋放分子標簽的結合化合物的近程內。在該實施方式中，裂解劑在此被稱為“裂解引發部分”，其將在下面更為詳細的論述。
在非均勻相中，由于特異性結合的結合化合物從未結合的結合化合物中分離出來，所以可以更廣泛地選擇使用可裂解連接物和連接試劑。可裂解連接物不僅包括容易與局部作用反應物質，如過氧化氫、單線態氧等起反應的連接物，也包括對整個反應混合物中的試劑不穩定的連接物，例如對堿不穩定的連接物、可光裂解的連接物、可由還原反應裂解的連接物、由氧化反應裂解的連接物、對酸不穩定的連接物、可由特異性蛋白酶裂解的肽鍵等等。參考文獻中描述了許多這類連接物，包括Greene和Wuts，Protective Groups in OrganicSynthesis，第二版(John Wiley & Wons，New York，1991)；Hermanson，Bioconjugate Techniques(Academic Press，New York，1996)；以及Still等的美國專利5565324。示范性的可裂解連接物如表III中所示。
表III連接基團裂解試劑
示例性的可裂解連接基團和裂解劑(L)表示了分子標簽(E)的連接位點

在一個方面，本發明可以采用市場上可購買的可裂解反應物體系。例如，可在抗體結合組合物與分子標簽之間利用雜官能試劑引入二硫鍵連接物，這些試劑如N-琥珀酰亞胺3-(2-吡啶二硫代)丙酸酯(SPDP)、succinimidyloxycarbonyl-α-甲基-α(2-吡啶二硫代)甲苯(SMPT)等等，購自供應商如Pierce Chemical Company(Rockford，IL)。以還原劑處理可以破壞通過這種連接物引入的二硫鍵，所述還原劑例如二硫蘇糖醇(DTT)、二硫赤蘚糖醇(DTE)、2-巰基乙醇、硼氫化鈉等等。能有效裂解二硫鍵的還原劑的典型濃度在10到100mM的范圍內。利用同雙功能的NHS酯交聯劑，二琥珀酰亞胺酒石酸酯(DST)(購自Pierce)，其中含有容易被高碘酸鈉裂解的順-二醇(例如15mM高碘酸在生理pH下4小時)，可在抗體結合組合物與分子標簽之間引入對氧化劑不穩定的連接物。含有酯化間隔物成分的連接物可以用強親核試劑裂解，例如羥胺，例如0.1N羥胺，pH8.5，37℃下3-6小時。通過同雙功能的交聯劑如購自Pierce(Rockford，IL)的乙二醇二(琥珀酸琥珀酰亞胺酯)(EGS)可以引入這種間隔物。例用砜基可引入對堿不穩定的連接物。可用于向可裂解連接物中引入砜基的同雙功能的交聯劑包括二[2-(succinimidyloxycarbonyloxy)ethyl]砜(BSOCOES)，和4，4-二氟-3，3-二硝基苯砜(DFDNPS)。示范性的裂解的堿性條件包括0.1 M磷酸鈉、加入Tris堿調節至pH11.6，含有6M尿素、0.1％SDS，以及2mM DTT，37℃下溫育2小時。可光裂解連接物包括Rothschild等的美國專利5986076中所公開的那些物質。
當L易被氧化時，L可以是硫醚或其硒類似物；或含有碳-碳雙鍵的烯烴，其中雙鍵裂解成含氧基團，釋放出分子標簽E。Willner等人的美國專利5622929中公開了硫醚鍵的例子，在此引入作為參考。烯烴的實例包括二乙烯硫、乙烯醚、烯胺、碳原子處用亞胺取代的α-次甲基(CH，具有至少一個氫原子的碳原子)，其中乙烯基可以在環中，雜原子可以在環中，或者在環烯烴的碳原子上取代，并且可有至少一個和至多四個雜原子連接到烯烴碳原子上。得到的dioxetane通過加熱到環境溫度以上，通常在大約75℃以下，與酸或堿反應，或者在光敏劑存在或不存在的情況下通過光活化，可以自發地分解。這類連接物和反應在以下示范性參考文獻中有所描述美國專利No.5756726，5800999和5886238。
示范性的可裂解連接物及其裂解產物如圖3A-F所示。噻唑可裂解連接物，“-CH2-噻唑-(CH2)n-C(＝O)-NH-蛋白”，如圖3A所示，形成了具有“-CH2-C(＝O)-NH-CHO”部分的分子標簽。優選地，n的范圍在1至12，更優選地，在1至6。惡唑可裂解連接物，“-CH2-惡唑-(CH2)n-C(＝O)-NH-蛋白”，如圖3B所示，形成了具有“-CH2-C(＝O)O-CHO”部分的分子標簽。所示烯烴可裂解連接物(圖3C)與上述結合化合物實施方式“B-L-M-D”有關，其中D為檢測部分，如熒光素染料。烯烴可裂解連接物也可以用于其他的實施方式中。所示烯烴連接物裂解產生的分子標簽形式為“R-(C＝O)-M-D”，其中“R”可以是上述分子標簽E的主要說明內的任何取代物。優選地，R是供電子基團，例如Ullman等的美國專利6251581；Smith和March，March’sAdvanced Organic ChemistryReactions，Mechanisms，andStructure，第五版(Wiley-Interscience，New York，2001)等等。更優選地，R為具有1-8個碳原子和0-4個選自O、S和N的雜原子的供電子基團。進一步優選地，R為-N(Q)2、-OQ、p-[C6H4N(Q)2]、furanyl、n-烷基吡咯、2-indolyl等等，其中Q是烷基或芳基。進一步參見圖3C的烯烴可裂解連接物，取代基“X”和“R”等價于以上在說明可裂解連接物“L”的通式中的取代基“X”和“Y”。特別地，圖3C中的X優選為嗎啉基，-OR’或-SR”，其中R’和R”為脂肪族基、芳基、脂環族或具有1至8個碳原子和0至4個選自雜原子O、S和N的雜環。優選硫醚可裂解連接物如圖3D所示，形式為“-(CH2)2-S-CH(C6H5)C(＝O)NH-(CH2)n-NH-”，其中n在2至12的范圍內，更優選在2至6的范圍內。圖3D所示的硫醚可裂解連接物可通過圖3E和3F中所示的前體化合物的方式連接到結合部分T和分子標簽E。為與結合部分T的氨基基團相連，要通過常規的化學方法將其末端羥基轉化成NHS酯。與氨基基團反應并連接之后，去除Fmoc保護基團以生成游離的氨基，之后其與分子標簽的NHS酯反應。
當通過氣相色譜法或質譜法對多個分子標簽進行分離時，分子標簽E，在本發明中可包含電泳標簽，如以下文獻中所描述Zhang等，Bioconjugate Chem.，131002-1012(2002)；Giese，Anal.Chem.，2165-168(1983)；以及美國專利4650750；5360819，5516931，5602273等等。
分子標簽E優選為對活性物質尤其是單線態氧穩定的，并且包含檢測或報告基團的水溶性有機化合物。另外，E的大小和結構可以在很大范圍內變化。在一個方面，E的分子量在約50至約2500道爾頓范圍內，更優選地，在約50至約1500道爾頓。E的優選結構在下面有更為詳細的描述。E可包含檢測基團用以產生電化學、熒光、或顯色信號。在利用質量檢測的實施方式中，E可以不含用于檢測目的的分離部分。優選地，檢測基團產生熒光信號。
在許多量中選擇分子標簽應使得每個對于同一量中的其他成員來說都具有獨特的分離特性和/或獨特的光學特性。在一個方面，色譜或電泳分離特性是在本領域常規的一套標準分離條件下的停留時間，所述條件例如壓力、柱壓、柱類型、移動相、電泳分離介質等等。在另一個方面，光學特性為熒光特性，例如發射光譜、熒光壽命、給定波長或波段的熒光強度等等。優選地，熒光特性為熒光強度。例如，許多量中的每種分子標簽可具有相同的熒光發光特性，但每種由于獨特的保持時間而與其他的相區別開。另一方面，或者許多量中的兩種或更多種的分子標簽可具有相同的遷移率或停留時間，但它們具有獨特的熒光特性，例如光譜可分辨的發射光譜，這樣許多量中的所有成員通過分子分離和熒光測定的組合而可以被區分開。
優選地，釋放的分子標簽可通過電泳分離以及檢測基團的熒光而測得。在這些實施方式中，具有基本相同熒光特性的分子標簽具有不同的電泳遷移率，這樣在分離條件下電泳圖譜上會形成不同的峰。優選地，本發明的多個分子標簽通過常規的毛細管電泳設備來分離，在存在或不存在常規的篩選基質的情況下進行。示范性的毛細管電泳設備包括Applied Biosysterms(Foster City，CA)310、3100和3700型；Beckman(Fullerton，CA)P/ACE MDQ型；Amersham Biosciences(Sunnyvale，CA)MegaBACE1000或4000；SpectRuMedix geneticanalysis system，等等。電泳遷移率與q/M2/3成正比，其中q為分子上的電荷數，M是分子質量。理想地，在測定條件下最接近的電泳標記物之間的遷移率之差至少約為0.001，通常為0.002，更通常為至少約0.01，并且可以為0.02以上。優選地，在這種常規設備中，許多量中的分子標簽的電泳遷移率至少有百分之一的差別，更優選范圍在至少百分之1至10。
在一個方面，分子標簽E為(M，D)，其中M是移動改變部分，D是檢測部分。符號“(M，D)”用于表明M和D部分的順序是這樣的，其中每部分都可以鄰近于可裂解連接物L。也就是說，“B-L-(M，D)”表示了結合化合物的兩種形式中的任何一種“B-L-M-D”或“B-L-D-M”。
檢測部分D可以是熒光標記或染料，顯色標記或染料，電化學標記等等。優選地，D為熒光染料。用于本發明的示范性熒光染料包括水溶性羅丹明染料、熒光素、4，7-二氯熒光黃、苯并氧雜蒽染料、以及能量轉移染料，如以下參考文獻中所公開Handbook of MolecularProbes and Research，第八版，(Molecular Probes，Eugene，2002)；Lee等的美國專利6191278；Lee等的美國專利6372907；Menchen等的美國專利6096723；Lee等的美國專利5945526；Lee等，NucleicAcids Research，252816-2822(1997)；Hobb，Jr.的美國專利4997928；Khanna等的美國專利4318846；等等。優選地，D為熒光素或熒光素衍生物。
移動改變部分M的大小和組成可以是鏈中的一個鍵到大約100個原子，通常不大于約60個原子，更常見的是不大于約30個原子，其中所述原子是碳、氧、氮、磷、硼和硫。一般來說，當其非鍵時，該移動改變部分具有約0至約40個，更常見從約0至約30個雜原子，其除了上述雜原子之外還可以包括鹵素或其他的雜原子。除氫外原子總數目一般小于約200個原子，通常小于約100個原子。在存在酸根的情況下，根據該移動改變部分所存在介質的pH值，該酸根可以與多種陽離子相結合。所述酸可以是有機或無機酸，包括羧酸、thionocarboxyl、thiocarboxyl、羥肟酸、磷酸、亞磷酸、膦酸鹽、亞膦酸、磺酸、亞磺酸、硼酸、硝酸、亞硝酸等等。對于正電荷來說，取代基包括氨基(包括銨)、膦、锍、氧 等等，其中取代基通常為大約1-6個碳原子的脂肪族，每個雜原子的碳原子總數通常小于約12，通常小于約9。側鏈包括胺、銨鹽、羥基、包括苯酚基、羧基、酯類、酰胺、磷酸根、雜環類。M可以是同型寡聚體或異型寡聚體，具有相同或不同化學性質的不同的單體，例如核苷酸和氨基酸。
B.分子標簽連接到結合部分用于將分子標簽共價連接到結合化合物如抗體上的普遍性技術指導可在文獻中找到，例如Hermanson，Bioconjugate Techniques，(Academic Press，New York，1996)等等。在本發明的一個方面，一種或多種分子標簽直接或間接地連接到結合化合物上的共有反應基團上。共有反應基團包括胺基、硫醇基、羧酸根、羥基、醛基、酮基等等，并且可以通過市場上可購買的交聯劑與分子標簽偶聯，例如Hermanson(引用如上)；Haugland，Handbook of Fluorescent Probesand Research Products，第九版(Molecular Probe，Eugene，OR，2002)。在一個實施方式中，分子標簽的NHS-酯與結合化合物上的游離氨基進行反應。
在圖2A所示的另一個實施方式中，結合化合物包含作為結合部分的生物素化抗體(200)。分子標簽通過親和素或鏈親和素橋(206)連接到結合部分(200)。優選地，在操作中，結合部分(200)首先與靶復合物反應，之后加入(204)親和素或鏈親和素以形成抗體-生物素-親和素復合物(205)。向該復合物(205)加入(208)生物素化分子標簽(210)以形成結合化合物(212)。
在圖2B所示的另一個實施方式中，結合化合物包含由多官能部分(216)衍生的抗體(214)，該多官能部分含有多官能團(218)，其能與分子標簽前體反應(220)得到連接著多個分子標簽(222)的最終結合化合物。示范性的多官能部分包括氨基葡聚糖以及類似物質。
一旦每種結合化合物通過不同的分子標簽分別衍生后，其即與其他的結合化合物匯合形成多個結合化合物。通常，每個不同種類的結合化合物以相同的比例存在于組合物中；然而，作為設計選擇比例可以改變，使得根據特定實施方式或測定的期望或需要，特定結合化合物的一類或小類以較高或較低的比例存在。可能影響該設計選擇的因素包括但不限于，對特定靶的抗體親和性和親和力，靶的相對優勢度，分子標簽檢測部分的熒光特性等等。
C.產生活性物質的裂解引發部分裂解引發部分或裂解劑是一種能產生活性物質的基團，所述活性物質能夠裂解可裂解連接物，優選通過氧化的方式。優選地，該活性物質為表現出短時活性的化學物質，這樣其裂解引發效果僅僅在其產生位點的近程內起作用。要么該活性物質本身壽命短，這樣由于超出了其產生近程將不會產生明顯的本底，要么采用能有效清除該活性物質的清除劑，使得其不會與其產生位點短距離之外的可裂解連接物反應。示例性的活性物質包括單線態氧，過氧化氫，NADH，和氫氧根，苯氧基，超氧化物等等。產生氧化反應的活性物質的說明性猝滅劑包括聚烯類、類胡蘿卜素、維生素E、維生素C、酪氨酸的氨基酸-吡咯N-偶聯物，組氨酸、和谷胱甘肽等等，例如Beuther等，Meth.Enzymol.，319226-241(2000)。
對于裂解引發部分和可裂解連接物來說，一個重要考慮是當結合于靶蛋白時它們彼此去除的距離不能太遠，以至于該由敏化劑產生的活性物質在其能夠與可裂解連接物發生作用之前就擴散并失去了活性。因此，可裂解連接物優選在所結合的裂解引發部分的1000nm之內，并優選在20-200nm之內。裂解引發部分的該有效范圍在此稱為其“有效近程”。
活性物質的產生物質包括酶，例如氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、嘌呤素氧化酶(xanthene oxidase)、D-氨基酸氧化酶、NADH-FMN氧化還原酶、半乳糖氧化酶、磷酸甘油氧化酶、肌氨酸氧化酶、膽堿氧化酶以及能生成過氧化氫的乙醇氧化酶、能生成羥基的辣根過氧化物酶、能生成NADH或NADPH的各種脫氫酶、能生成氨從而形成局部高pH的脲酶。
敏化劑是一種能夠被引導產生反應中間物或物質，通常為單線態氧的化合物。優選地，根據本發明使用的敏化劑是光敏劑。包括在本發明范圍內的其他敏化劑有通過熱、光、電離輻射，或化學活化而激活后，將釋放單線態氧分子的化合物。該類化合物中最熟知的成員包括內過氧化物，例如1，4-biscarboxyethy1-1，4-萘內過氧化物，9，10-聯苯蒽-9，10-內過氧化物以及5，6，11，12-四苯基萘5，12-內過氧化物。這些化合物加熱或直接吸收光從而釋放出單線態氧。以下文獻中公開了另一些敏化劑DiMascio等，FEBS Lett.，355287(1994)(過氧化物酶和加氧酶)；Kanofsky，J.Biol.Chem.2585991-5993(1983)(乳過氧物酶)；Pierlot等，Meth.Enzymol.，3193-20(2000)(內過氧化物的熱裂解)等等。
結合劑連接到裂解引發部分的方式可以是直接或間接的，共價或非共價的，并可通過公知的技術實現，其在許多文獻中可以獲得。參見例如，“Immobilized Enzymes”，Ichiro Chibata，Halsted Press，New York(1978)；Cuatrecasas，J.Biol.Chem.，2453059(1970)。現已存在或者可以加入許多種類的官能團。官能團包括羧酸、醛類、氨基、氰基、乙烯、羥基、巰基等等。連接各種化合物的方法是公知的，并且在文獻中有詳細的說明(如上)。結合劑上連接基團的長度范圍很寬，其根據被連接的化合物性質、對特定連接特性的距離效果等等而定。
裂解引發部分可與支持物結合，共價或非共價地結合到支持物的表面上或者加入支持物主體中。可通過上面所討論的方法連接到表面上。裂解引發部分可以在支持物制備過程中或者之后加入支持物主體中。一般來說，與支持物結合的裂解引發部分的數量必須能獲得所需數量的活性物質。一般來說，裂解引發部分的數量根據經驗確定。
如上所述，根據本發明優選的裂解引發部分是能產生單線態氧的光敏劑。這里所使用的“光敏劑”涉及光吸收分子，其在光活化時將分子氧轉換成單線態氧。光敏劑可由共價或非共價的連接物直接或間接地連接到類特異性反應物的結合劑上。對于構建這種組合物，尤其是作為結合劑的抗體的技術指導可在文獻中獲得，例如在光動力性療法、免疫診斷等等領域。以下是示例性的參考文獻Ullman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA91，5426-5430(1994)；Strong等，Ann.NewYork Acad.Sci.，745297-320(1994)；Yarmush等，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Syst.，10197-252(1993)；Pease等的美國專利5709994；Ullman等的美國專利5340716；Ullman等的美國專利6251581；McCapra的美國專利5516636等等。
同樣，文獻中有對于適用于本發明的光敏劑的特性和選擇的技術指導。以下是參考文獻的例子Wasserman和R.W.Murray.SingletOxygen.(Academic Press，New York，1979)；Baumstark，SingletOxygen，Vol.2(CRC Press Inc.，Boca Raton，FL1983)；和Turro，Modern Molecular Photochemistry(University Science Books，1991)。
光敏劑是通過光激發可生成單線態氧的敏化劑。光敏劑包括染料和芳香族化合物，通常是由共價鍵連接的原子構成的化合物，通常具有多個共軛雙鍵或三鍵。典型地，該化合物的吸收波長范圍在約200至約1100nm，通常在約300至約1000nm，優選約450至約950nm，其吸收最大值處的消光系數大于約500M-1cm-1，優選地，在其激發波長處約5000M-1cm-1，更優選地大約50000M-1cm-1。在沒有氧時光吸收之后所產生的激發態壽命通常至少大約100納秒，優選至少大約1毫秒。一般來說，其壽命必須足夠長以便可以裂解根據本發明的試劑中的連接物。這類試劑通常以下面所討論的濃度存在。光敏劑的激發態通常具有與其基態不同的自旋量子數(S)，并且當基態是如同通常情況的單線態(S＝0)時，激發態通常是三線態(S＝1)。優選地，光敏劑具有高度的系統間跨越形成。也就是說，光敏劑的光激發通常以至少約10％，希望至少約40％，優選大于約80％的效率形成三線態。
所選擇的光敏劑是相對光穩定的，并且優選地，不與單線態氧有效地反應。大多數有用的光敏劑中存在數種結構特征。大多數光敏劑具有至少一個，有時三個或更多的共軛雙鍵或三鍵，其存在于剛性的，通常是芳香族結構中。其通常含有至少一個能加速系統間跨越的基團，如羰基或亞胺基，或者選自周期表3-6排的重原子，尤其是碘或溴，或者其可具有加長的芳香族結構。
已存在大量的光源用以光活化光敏劑以產生單線態氧。多色和單色光源都可以采用，只要該光源在實際的持續時間內有足夠的強度產生足夠的單線態氧。照射波長取決于光敏劑的性質，可裂解連接物的性質，照射源的功率，以及其到樣品的距離等等。一般來說，照射時間可以是小于大約一微秒至長達10分鐘，通常在大約一毫秒至大約60秒的范圍內。照射的強度和波長應足夠激發至少大約0.1％的光敏劑分子，通常至少大約30％的光敏劑分子，優選幾乎所有的光敏劑分子。示范性的光源包括，舉例而并非限制性地說，激光器，如氦-氖激光器、氬激光器、YAG激光器、He/Cd激光器、以及紅寶石激光器，光電二極管，汞、鈉和氙蒸汽燈，白熾燈例如鎢和鎢/鹵素，閃光燈等等。舉例來說，采用Bjornson等的國際專利公開WO 03/051669中披露的光活化裝置。簡而言之，光活化裝置是一種安裝在外殼中的發光二極管(LED)的陣列，其可以同時照亮96孔板中的所有的板孔。適用于本發明的LED有高功率GaAIAs IR發射器，例如由OPTO DIODE CORP.(Newbury Park，CA)生產的OD-880W型。
可用于本發明的光敏劑實例應具有上述特性，列舉在以下文獻中Singh和Ullman的美國專利5536834；Li等的美國專利5763602；Martin等，Methods Enzymol.，186635-645(1990)；Yarmush等，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Syst.，10197-252(1993)；Pease等的美國專利5709994；Ullman等的美國專利5340716；Ullman等的美國專利6251581；McCapra的美國專利5516636；Thetford的歐洲專利公開0484027；Sessler等，SPIE，1426318-329(1991)；Magda等的美國專利5565552，Roelant的美國專利6001673等等。
在一些實施方式中，如同敏化劑一樣，光敏劑可與固相支持物結合，共價或非共價地結合到支持物的表面上或者加入支持物主體中。一般來說，與支持物結合的光敏劑的數量必須能獲得所需數量的單線態氧。一般來說，光敏劑的數量根據經驗確定。在一個優選的實施方式中，將光敏劑加入乳膠顆粒中以形成光敏劑膠珠，例如Pease等的美國專利5709994，Pollner的美國專利6346384，和Pease等的PCT公開WO 01/84157中有披露。這種光敏劑膠珠的使用如圖2C所示。如圖1B中所描述的用于異源雙鏈核酸分子的檢測中，試劑(122)與樣品混合之后形成了復合物(230)。在這種情況下，為代替直接將光敏劑連接到結合化合物如抗體上，裂解探針可包含兩種成分用捕獲部分衍生出的抗體(232)，例如生物素(圖2C中標為“bio”)，和光敏劑膠珠(238)，該膠珠的表面用與捕獲部分如親和素或鏈親和素特異性結合的試劑(234)衍生得到。接著將復合物(230)通過光敏劑膠珠的捕獲部分來捕獲(236)。光敏劑膠珠可用于均勻或非均勻的測定相中。
在另一個示例性實施方式中，光敏劑玫瑰紅通過乳膠上的氯甲基而共價連接到0.5微米的乳膠珠上，從而提供了酯連接基團，如J.Amer.Chem.Soc.，973741(1975)中所述。
測定條件下面對方法、特定條件和材料的大致論述出于示例目的而非限制。本領域普通技術人員應明白如何使這里所述的方法適用于其他的應用，特別是采用不同樣品、細胞類型和靶復合物的應用。
在實施本發明的方法中，混合測定成分，包括被測樣品、結合化合物、以及可選擇的裂解探針。一般來說，測定成分可以以任何順序混合。然而在一些應用中，加入的順序會有關系。例如，有人希望監測競爭性結合，例如在定量測定中。或者有人希望監測所組成的復合物的穩定性。在這些應用中，可以分步進行反應，并且在全部混合物組合好之前，或者在啟動裂解反應之前可能需要溫育過程。
每種反應試劑的數量通常根據經驗來確定。測定中所用的樣品數量由存在的靶復合物的預測數量以及用于監測測定信號的分離和檢測方法所決定。一般來說，所提供的結合化合物和裂解探針數量的摩爾數應相對大于樣品中靶分子的預計量，通常摩爾數應過量至少1.5倍，更優選過量10倍或更多。在特定應用中，使用的濃度可較高或較低，根據結合劑的親和性和單個細胞上存在的靶分子預計數目而定。在測定化學化合物對形成寡聚細胞表面復合物的作用的情況下，該化合物可以在加入探針之前，同時或之后加入，根據被監測的作用而定。
在用于將探針連接到細胞表面分子的條件下，混合并溫育測定混合物，通常是在水溶液介質中，一般在生理pH(類似培養細胞的pH)下，通過濃度在大約10至200mM范圍內的緩沖液來保持。可采用常見的緩沖液，以及所需的其他常見添加劑，例如鹽類、培養基、穩定劑等。通常采用生理和恒定的溫度。溫育溫度的正常范圍在大約4°至70℃，一般在大約15 °至45℃，更常見的在25 °至37℃。
測定混合物組成并進行溫育使探針結合到細胞表面分子上之后，處理該混合物以活化裂解劑，從而將裂解劑有效近程內的標簽從結合化合物上裂解下來，將相應的標簽從細胞表面釋放到溶液中。該處理的性質取決于裂解劑的作用機制。例如，在采用光敏劑作為裂解劑的情況下，裂解活化包括在適用于所使用的特定敏化劑的波長光下照射該混合物。
裂解之后，接著分析樣品以測定被釋放的標記身份。在采用多個結合化合物的情況下，其檢測之前通常要對所釋放的標記進行分離。分離和檢測的方法在設計用于該測定的標記的過程中已確定。優選的分離方式是采用電泳法，即根據其電泳遷移率的已知差異來分離各種標記。
如上所述，在一些實施方式中，如果測定反應的條件可能干擾所采用分離技術，就需要在裂解和分離分子標簽之前去除或改變測定反應緩沖液。例如，測定條件可包括鹽濃度(例如特異性結合所需的)，當在電泳遷移率基礎上分離分子標簽時其會降低分離性能。因此，可去除這種高鹽緩沖液，例如在裂解分子標簽之前，并通過過濾、抽吸、稀釋或其他的手段用另一種適合電泳分離的緩沖液替換。
所釋放分子標簽的分離如上所述，所設計的分子標簽用于分離，其中分離技術是基于一種或多種物理、化學、和/或光學特征(這里稱為“分離特性”)來區分分子標簽。上面還提到，可用于本發明的各種實施方式的分離技術包括正常相或反相HPLC、離子交換HPLC、毛細管電色譜法、質譜法、氣相色譜法等等。優選地，選擇的分離技術能夠提供有關分子標簽存在與否的定量信息以及定性信息(并因而對應于分析物)。在一個方面，采用了液相分離技術，這樣處理含有分子標簽混合物的溶液，如緩沖溶液、反應溶劑等以引起單個種類的分子標簽分離。通常，該分離伴隨著分子標簽從這類起始混合物沿著通道的進行的差別運動，直到形成了對應于各分子標簽濃度增加區域的可辨別的峰或帶。這種通道可以通過流體流動、電場、磁場等等來限定。對特定分離技術的選擇取決于不同的因素，包括使用該技術的成本和便利程度，該技術對分子標簽化學特征的分辨能力，被分離的分子標簽數目，采用的檢測方法類型等等。優選地，通過電泳分離分子標簽以形成電泳圖譜，其通不同的峰表示被分離的分子標簽。
用于電泳的方法是公知的，并且對于本領域普通技術人員來說有豐富的技術指導來進行設計選擇用以形成和分離特定的多個分子標簽。以下是示范性的電泳的參考文獻Krylov等，Anal.Chem.，72111R-128R(2000)；P.D.Grossman和J.C.Colburn，CapillaryElectrophoresisTheory and Practice，Academic Press，Inc.NY(1992)；美國專利5374527，5624800；5552028；ABI PRISM 377 DNASequencer User’s Manual，Rev.A，January 1995，Chapter 2(AppliedBiosystems，Foster City，CA)等等。在一個方面，通過毛細管電泳來分離分子標簽。在本領域普通技術人員知識范圍內的設計選擇包括但不限于，從數種市場上可購買的型號中選擇儀器，選擇操作條件，包括分離介質類型和濃度、pH、預期的分離時間、溫度、電壓、毛細管種類和尺寸、檢測模式、被分離的分子標簽數目等等。
在本發明的一個方面，在電泳分離過程中或之后，通過記錄所分離化合物的熒光信號和遷移時間(或遷移距離)，或者通過構建分子標簽的相對熒光和遷移順序的圖表(例如電泳圖譜)，可檢測和鑒別分子標簽。優選地，利用一種或多種標準來測定分子標簽的存在與否和/或數量，如Williams等的美國專利公開2003/0170734A1中所述，在此引入作為參考。在分離過程中或者之后，可用標準方法照射熒光分子標簽，例如，高強度的水銀蒸氣燈、激光器等等。典型地，通過He-Ne氣體激光器或固態二極管激光器產生的激光來照射分子標簽。接著通過光敏檢測器，例如光電倍增管、電耦合裝置等等來檢測該熒光信號。示范性的電泳檢測系統在其他地方也有所描述，例如美國專利No.5543026，5274240，4879012，5091652，6142162等等。在另一個方面，可通過電化學檢測法來檢測分子標簽，例如美國專利No.6045676中所述。
電泳分離涉及根據移動性的不同在電場中形成的分子遷移和分離。各種形式的電泳分離包括，例如而并非限制地，自由區帶電泳、凝膠電泳、等電聚焦、等速電泳、毛細管電泳、以及膠束電動層析法。毛細管電泳包括電分離，優選通過電動流動，包括電泳、介電泳(dielectrophoretic)和/或電滲流動的方式，其中在橫截面直徑約1至約200微米，通常為約10至約100微米的管道或通道中進行。所述毛細管通常是在硅、石英、玻璃或塑料構成的薄片或薄膜中的長獨立毛細管道或者通道。
在毛細管電分離中，將含有分子標簽的分裝反應混合物進行電分離，其中將該分裝物引入作為毛細管裝置一部分，或者連接于其上的電分離通道中，所述毛細管裝置中還進行擴增和其他的反應。然后向通道中包含的電解質施加電壓以實現混合物中成分的遷移。一般來說，根據本領域公知的技術，所施加的電壓要足以達到預期成分的電分離。本領域普通技術人員應當能夠確定用于本發明的給定試劑組的合適電壓，和/或所裂解標記物的特征，反應介質的特征等等。電分離的參數包括介質和電壓的參數，其通常進行優化以實現預定化合物的最大分離。這可以根據經驗獲得，并且是技術人員公知的。通過任何已知的有關毛細管電泳柱分析的方法可進行檢測，包括美國專利No.5560811(11欄，19-30行)，4675300，4274240和5324401中所述，其相關說明在此引入作為參考。電泳領域的技術人員應當明白可以采用的電壓或電場強度范圍很寬，例如，10至1000V/cm的電場，更典型的是約200至約600V/cm的電場。商用系統的電壓上限是大約30kV，毛細管長度為約40至約60cm，最大場強約600V/cm。對于DNA來說，典型的毛細管具有涂層以減小電滲流動，并且毛細管的注入端保持在負電勢下。
為了簡化檢測，整個設備可以用光學透明的塑料材料制成，其通常可以通過波長范圍在約180至約1500nm，一般在約220至約800nm，更常見在約450至約700nm的光，并且透射損失低。適合的材料包括熔融硅石、塑料、石英、玻璃等等。
在本發明的一個方面，在微流控裝置中電泳分離分子標簽，如圖6A-6C中圖解所示。微流控裝置在例如，美國專利5750015，5900130，6007690，和WO 98/45693，WO 99/19717和WO 99/15876中所述。方便的是，將分裝物，一般不大于約5μl，直接通過電泳或者氣動注入集成式系統中的方式，或者通過注射器、毛細管等方式轉移到微流控裝置的樣品儲液池中。實施分離的條件是常規的并且根據產物的性質而有所不同。
如圖所示，圖6A-6C表示了上述應用中詳細描述的微流控裝置類型中的微通道網絡100，用于加載樣品和電泳分離上述測定中產生的探針和標簽的樣品。簡而言之，該網絡包括主分離通道102，分別以上游和下游的儲液池104、106為端點。該主通道通過端點位于儲液池110的側通道108和端點位于儲液池114的側通道112而在分支軸位置處形成交叉點。兩個側通道之間的分支點形成了主通道內的樣品加載區116。
在操作中，將測定混合物置于樣品儲液池110中，如圖6A所示。正如所述那樣，該測定混合物含有一種或多種具有表面結合裂解劑的靶細胞，一種或多種蛋白質探針，以及可選擇地，分子標簽標準物。測定反應，包括原始探針與靶細胞的結合，可在樣品儲液池110中進行，或者該測定反應可通過反應樣品組分加入樣品儲液池的情況下在另一個反應容器中進行，之后在結合探針的細胞中進行探針連接物的裂解。
為將所釋放的分子標簽加載到樣品加載區中，可在圖6B所示的方向上施加跨儲液池110、114的電場，其中使帶負電的釋放的分子標簽從儲液池110牽引到加載區116，同時未帶電荷或者帶正電荷的樣品成分保留在樣品儲液池中。現在即可由常規的毛細管電泳法，通過在圖6C所示的方向上施加跨儲液池104、106的電場，來分離加載區中的釋放標簽。
從得到的電泳圖案中可以鑒別出分子標簽和相應的分析物。典型地，該方法的實施是，將熒光檢測器設置在分離通道的下游端附近并構建分離分子標簽的電泳圖譜，首先測定上述分離特性(該情況下是電泳遷移率)，然后測定信號強度，例如峰高度或峰面積，作為與各種探針相關的分子標簽相對數量的測定值。用于檢測和定量可檢測探針水平的方法是公知的。在一個優選的方法中，分子標簽為熒光標記的。標準的熒光發射源針對分離介質下游部分中的檢測區，通過標準的光檢測器來檢測該區域的熒光發射。所記錄的信號高度或面積提供了樣品中產物和底物濃度的測定值。利用上述檢測信息，就可以將每種測得的分子標簽指定到探針組中的一個特定的探針，并且比較各種可檢測探針的相對水平，以作為其相對底物轉化率或配體結合率的測定值。
在本發明的一個方面，針對分離設計了多個分子標簽，通過基于一種或多種物理特性的色譜法實現，所述物理特性包括但不限于分子量、形狀、溶解度、pKa、疏水性、電荷、極性等等。色譜分離技術的選擇是根據參數例如柱類型、固定相、移動相等等，接著選擇多種可在單次操作中可分離形成獨特峰或帶的分子標簽。一些因素決定了本發明應選擇的HPLC技術，包括被檢測的分子標簽數量，(即所述許多量的量)，測定中可能生成的每種分子標簽的估計量，合成用于多元測定中的一組候選分子標簽的可能性和容易程度，采用的檢測形式，以及HPLC儀器、柱和溶劑的的可獲得性、耐用程度、成本和操作容易程度。一般來說，優選那些適合于分析有限量樣品并能提供最高分辨率的分離的柱和技術。對進行該選擇的技術指導可以在以下文獻中找到例如Snyder等，Practical HPLC Method Development，(JoheWiley & Sons，New York，1988)；Millner，“High ResolutionChromatographyA Practical Approach”，Oxford UniversityPress，New York(1999)，Chi-San Wu，“Column Handbook for SizeExclusion Chromatography”，Academic Press，San Diego(1999)和Oliver，“HPLC of MacromoleculesA Practical Approach，Oxford University Press”，Oxford，England(1989)。特別地，可采取措施對色譜分離的給定條件，如柱類型，固定相等進行系統開發和優化，例如，Haber等，J.Chromatogr.Sci.，38386-392(2000)；Outinen等，Eur.J.Pharm.Sci.，6197-205(1998)；Lewis等，J.Chromatogr.，592183-195和197-208(1992)等等。
在一個方面，對分子標簽候選物的最初選擇受到典型地由選定柱和固定相來分離的分子的生理化學性質的制約。然后通過以下常規的優化步驟根據經驗改進該最初選擇，如上述參考文獻中所述，并可用更適合的候選分子標簽來代替特定實施方式的分離對象。在一個方面，本發明的分離對象包括(i)將許多量中的分子標簽分離成可區分的峰或帶中，其分離時間小于60分鐘，更優選小于40分鐘，更加優選地在10至40分鐘的范圍內，(ii)形成的峰或帶應使任意結合對的分辨率至少為1.0，更優選至少為1.25，更將優選至少為1.50，(iii)分離過程中的柱壓小于150bar，(iv)分離的溫度在25℃至90℃的范圍內，優選在35℃至80℃的范圍內，以及(v)多個可區別的峰的數量在5至30個的范圍并且所有的峰都在同一個色譜圖中。這里所使用“分辨率”涉及兩個峰或帶，是這兩個峰或帶之間的距離除以該峰基部寬度的平均值，如Snyder等(引用如上)。多種市場上可購買到的系統都十分適合于對分子標簽的高通量色譜分析。本領域技術人員能夠確定合適的設備用于對分子標簽的自動化HPLC分析，例如自動樣品制備系統和自動注射系統。自動化方法可用于對分子標簽進行高通量分析，例如，當處理大量樣品時，或者當本發明方法用于多元化應用以檢測靶分析物時。適用于本發明的示范性HPLC儀器有Agilent 1100 Series HPLC系統(Agilent Technologies，PaloAlto，C A)。
測定試劑的合成用于本發明的結合化合物按照以下參考文獻中的方法合成，在此引入其作為參考國際專利公開WO 00/66607，WO 01/83502，WO02/95356，WO 03/06947，以及美國專利6322980和6514700。用于合成結合化合物的示范性試劑如圖4A-J中所示。示范性合成方法如圖5A-7D所示。
實施例實施例中所使用的材料來源對Her受體具有特異性的抗體、適配體分子、以及標準化的標準可從市場供應商處購得，包括Labvision，Cell SignalingTechnology和BD Biosciences。所有細胞系從ATCC處購得。所有的人類速凍組織樣品購自William Baibridhe Genome Foundation(Seattle，WA)或者Bio Research Support(Boca Raton，FL)，并通過了供應商處的Institutional Reseach Board(IRB)認可。
以下所使用的分子標簽-抗體偶聯物由分子標簽的NHS酯與指示抗體上的游離氨基通過常規的步驟反應而形成。分子標簽，以下標記為名稱“Pro_N”，在以下參考文獻中有披露Singh等的美國專利公開2003/017915和2002/0013126，引入其作為參考。簡而言之，下面的結合化合物是由分子標簽的NHS酯與抗體的游離氨基通過常規反應形成的分子標簽-單克隆抗體偶聯物。
實施例1
PI3K/Her-3受體活化復合物在該實施例中，測定設計如圖7A和7C中所示，用以測定乳腺癌細胞系MCF-7中含有Her2、Her3和PI3K的受體復合物。具有第一分子標簽(圖中為“mT1”，以下為“eTagl”)結合化合物(1106)對Her3受體(1102)的胞外區域具有特異性，具有第二分子標簽(圖中為“mT2”，以下為“eTag2”)結合化合物(1110)對PI3K蛋白(1100)的p185成分具有特異性，而連接有光敏劑的裂解探針(1108)對Her3受體(1102)的胞內區域具有特異性。這兩個測定設計類似，除了圖7A的設計中裂解探針特異于Her3受體，而圖7C的設計中裂解探針特異于PI3激酶的p85成分之外。該測定操作如下。
樣品制備1.血清饑餓的乳腺癌細胞系在使用前培養過夜。
2.37℃下在培養基中用HRG刺激細胞系10分鐘。用于MCF-7細胞的HRG劑量例如0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM。
3.抽吸培養基，轉移到冰上，并加入如上所述的裂解緩沖液以裂解原位細胞。
4.刮取并轉移裂解物至微離心管。冰育30min。14000rpm，4℃下微離心10min。(可選擇進行離心)5.收集上清液作為裂解產物，分裝儲存于-80℃待使用。裂解緩沖液(新制作并在冰上保存)終濃度ul 儲存量1％Triton X-100 1000 10％20mM Tris-HCl(pH7.5) 200 1M100mM NaCl200 5M50mM NaF 500 1M50mM β-甘油磷酸Na1000 0.5M1mM Na3VO4100 0.1M5mM EDTA 100 0.5M10ug/ml胃蛋白酶抑制劑 100 1mg/ml1片(每10ml)Roche Complete蛋白酶抑制劑(#1836170) N/A N/A
水6500 N/A共計 10ml測定設計根據各圖中所示的圖解來參比定量受體復合物的形成。也就是說，測定讀數是分子標簽eTag2/eTag1的峰值比。
總測定體積為40ul。用裂解緩沖液將裂解物體積調整到10ul。抗體用裂解緩沖液稀釋至20ul。典型地，每個反應中使用相當于～5000至500000個細胞的裂解產物。
步驟在加入反應之前預先混合的抗體工作濃度為對于在Her-3處具有裂解探針的Her-3/PI3K復合物(圖11A的設計)eTag1_抗Her-3為10nM(該測定中eTag1為Pro14)eTag2_抗PI3K為10nM(該測定中eTag2為Pro1)生物素_抗Her-3為20nM通用標準US-1為700nM[所述通用標準US-1為偶聯著生物素和分子標簽Pro8的BSA，其用于使測定中鏈親和素-光敏劑膠珠的量標準化]。利用常規技術例如Hermanson(引用如上)使分子標簽前體(見圖4A-4J)的NHS-酯與抗體上的游離氨基反應，從而使分子標簽直接連接到抗體上。對于在PI3K處具有裂解探針的Her-3/PI3K復合物(圖7C的設計)eTag1_抗PI3K為10nM(該測定中eTag1為Pro1)eTag2_抗Her-3為10nM(該測定中eTag2為Pro14)生物素_抗PI3K為20nM通用標準US-1為700nM1.向測定的96孔滴定板(Millipore MAGVN2250)中加入20ul抗體混合物到10ul的裂解物中并4℃下溫育1小時。
2.加入10ul的鏈親和素衍生的裂解探針(終濃度4ug/孔)到測定的孔中并溫育45min。
3.加入200ul洗滌緩沖液并施加負壓抽空。
4.加入30ul照射緩沖液并照射。
5.轉移每個反應中10ul至CE測定板上分析。
數據分析1.使每個分子標簽的相對熒光單位(RFU)信號按照其國際通用標準US-1而標準化。
2.從相應的標準化eTag報告物信號中減去“無裂解產物”本底對照的RFU。
3.報告受體復合物的形成，作為標準化eTag2/eTag1信號的參比(如圖7B和7D所示)。
實施例2Shc/Her-3受體-適配體相互作用在該實施例中，測定設計如圖8A和8C中所示。圖8A中，Her2受體(1200)和Her3受體(1202)在細胞表面膜(1204)中形成二聚體，并且所表示的每個受體都具有磷酸化位點(1209和1210)。Shc蛋白(1206和1208)分別結合于磷酸化位點(1210)和(1209)上。第一結合化合物(1214)和裂解探針(1216)對Her2受體(1200)胞外區域的不同抗原決定簇具有特異性。第二結合化合物(1212)對Shc蛋白(1206和1208)具有特異性。圖8A和8C的測定設計類似，除了圖8A的設計中裂解探針特異于Her2受體，而圖8C的設計中裂解探針特異于Her3受體之外。因此，在前一種情況中，測定了總的Her2受體，而后一種情況中測定了總的Uer3受體。測定操作如下。樣品的制備操作如上(實施例1)。
測定設計根據各圖中所示的圖解來參比定量受體復合物的形成。也就是說，圖8B和8D中，測定讀數是作為HRG濃度的函數的mT2/mT1峰值比。
總測定體積為40ul。用裂解緩沖液將裂解物體積調整到10ul。抗體用裂解緩沖液稀釋至20ul。典型地，每個反應中使用相當于～5000至500000個細胞的裂解產物。
步驟在加入反應之前預先混合抗體工作濃度為對于在Her-3處具有裂解探針的Her-3/Shc復合物(圖8B的設計)
eTag1_抗Her-3為10nM(該測定中eTag1為Pro14)eTag2_抗Shc為10nM(該測定中eTag2為Pro12)eTag3_抗磷-Tyr為10nM(該測定中eTag3為Pro2)生物素_抗Her-3為20nM通用標準US-1為700nM對于在Her-2處具有裂解探針的Her-2/Shc復合物(圖8A的設計)eTag1_抗Her-2為10nM(該測定中eTag1為Pro14)eTag2_抗Shc為10nM(該測定中eTag2為Pro12)eTag3_抗磷-Tyr為10nM(該測定中eTag3為Pro2)生物素_抗Her-2為20nM通用標準US-1為700nM1.向測定的96孔滴定板(Millipore MAGVN2250)中加入20ul抗體混合物到10ul的裂解物中并4℃下溫育1小時。
2.加入10ul的鏈親和素衍生的裂解探針(終濃度4ug/孔)到測定的孔中并溫育40min。
3.加入200ul洗滌緩沖液并施加負壓抽空。
4.加入30ul照射緩沖液并照射。
5.轉移每個反應中10ul至CE測定板上分析。
數據分析1.使每個分子標簽的相對熒光單位(RFU)信號按照其國際通用標準US-1而標準化。
2.從分子標簽相應的標準化信號中減去“無裂解產物”本底對照的RFU。
3.報告受體復合物的形成，作為標準化mT2/mT1信號的參比(如圖8B和8D所示)，以及受體磷酸化程度(數據未示出)作為mT3/mT1信號。
實施例3同時測定14-3-3//BAD和Bcl-2//BAD凋亡復合物在該實施例中，如圖9A-9C所示，描述了一種用于測定含BAD蛋白的兩種化合物的相對數量的測定試驗(i)14-3-3蛋白//BAD蛋白，和(ii)Bcl-2蛋白//BAD蛋白。裂解探針(906)對BAD蛋白(900)的第一抗原決定簇具有特異性，結合化合物(908)對BAD蛋白(900)的第二抗原決定簇具有特異性，結合化合物(910)對14-3-3蛋白(902)具有特異性，結合化合物(912)對Bcl-2蛋白(904)具有特異性。裂解探針和結合化合物應如此選擇，使得其結合位點不會彼此干擾，并且該位點在任何復合物形成之時不會被擋住。測定步驟實施如下樣品制備1.血清饑餓的乳腺癌細胞系在使用前培養(MCF-7)過夜。
2.37℃下在培養基中用HRG刺激細胞系10分鐘。用于MCF-7細胞的HRG劑量例如0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM。
3.抽吸培養基，轉移到冰上，并加入裂解緩沖液(說明如下)以裂解原位細胞。
4.刮取并轉移裂解物至微離心管。冰育30min。14000rpm，4℃下微離心10min。(可選擇進行離心)5.收集上清液作為裂解產物，分裝儲存于-80℃待使用。
裂解緩沖液(新制作并在冰上保存)終濃度ul 儲存量1％Triton X-1001000 10％20mM Tris-HCl(pH7.5) 200 1M100mM NaCl 200 5M50mM NaF 500 1M50mM β-甘油磷酸Na 1000 0.5M1mM Na3VO4100 0.1M5mM EDTA 100 0.5M10ug/ml胃蛋白酶抑制劑 100 1mg/ml1片(每10ml)Roche Complete蛋白酶抑制劑(#1836170) N/A N/A
水6500 N/A共計10ml總測定體積為40ul。用裂解緩沖液將裂解物體積調整到10ul。抗體用裂解緩沖液稀釋至20ul。典型地，每個反應中使用相當于～5000至500000個細胞的裂解產物。
步驟在加入反應之前預先混合的抗體工作濃度為對于在Her-3處具有裂解探針的Her-3/PI3K復合物(圖9A的設計)eTag1_抗BAD為10nMeTag2_抗Bcl-2為10nMeTag3_抗14-3-3為10nM生物素_抗BAD為20nM通用標準US-1為700nM[所述通用標準US-1為偶聯著生物素和分子標簽Pro8的BSA，其用于使測定中鏈親和素-光敏劑膠珠的數量標準化]。利用常規技術例如Hermanson(引用如上)使分子標簽前體(參見圖4A-4J)的NHS-酯與抗體上的游離氨基反應，從而使分子標簽直接連接到抗體上。
6.向測定的96孔滴定板(Millipore MAGVN2250)中加入20ul抗體混合物到10ul的裂解物中并4℃下溫育1小時。
7.加入10ul的鏈親和素衍生的裂解探針(終濃度4ug/孔)到測定的孔中并溫育40min。
8.加入200ul洗滌緩沖液并施加負壓抽空。
9.加入30ul照射緩沖液并照射。
10.轉移每個反應中10ul至CE測定板上分析。
數據分析1.使每個分子標簽的相對熒光單位(RFU)信號按照其國際通用標準US-1而標準化。
2.從相應的標準化eTag受體信號中減去“無裂解產物”本底對照的RFU。
測定讀數如圖9B和9C中所示的條形圖。這些圖表說明了14-3-3和Bc1-2之間的BAD的分布是如何表現的。在圖9B和9C中，代表分子標簽1“mT1”的最左邊條為該測定中的BAD總量測定值，既包括與14-3-3形成復合物中的，與Bc1-2形成復合物中的，也包括單體形式的。圖9B表示結合到14-3-3的BAD比結合到Bc1-2上的相對更多的情況下，如圖所示，最右邊的條比中間的條大。圖9C表示了相反的情況，即，結合到Bc1-2上的BAD比結合到14-3-3上的相對更多，如圖所示，最右邊的條比中間的條小。
實施例4乳腺腫瘤樣品中Her2-Her3異型二聚體測量值與Her3-PI3K復合物測量值之間的關系在該實施例中，利用上述方法分別測定人類乳腺腫瘤樣品以確定Her2-Her3異型二聚體的數量和Her3-PI3K復合物的數量。圖10表示了從該測定中獲得的數據，表明這兩個測量值有關聯。
實施例5福爾馬林固定的石蠟包埋組織樣品中的胞內復合物測定在該實施例中，測定由球狀細胞系制成的典型固定組織中是否存在PI3K-Her3復合物。對異型二聚體的測定設計與圖7A中所述的基本上相同，除了以下所述的不同點之外。
典型的固定組織制備如下用EGF或者HRG刺激組織培養基上生長的細胞，如前面實施例中所述，之后將其洗滌并刮取。離心所取下的細胞以形成球狀，然后加入福爾馬林并在4℃下將混合物溫育過夜。用Miles Tissue Tek III Embedding Center在石蠟中包埋該固定球，之后用顯微切片機(Lecia 2145型)從該球上切下10μm的組織切片。將組織切片放置在帶正電的玻璃顯微載玻片上(通常每片上有多個組織切片)并在60℃下烘烤1hr。
對載玻片上的組織切片測定如下用EZ-Dewax試劑(Biogenex，San Ramon CA)采取制造商推薦的方法脫去載玻片上組織切片的石蠟。簡而言之，向每個組織切片中加入500μL EZ-Dewax并在室溫下溫育該切片5min，之后用70％的EtOH洗滌該載玻片。重復該步驟并最后用去離子水沖洗該載玻片，之后將該載玻片在室溫下水中溫育20min。接著將載玻片浸入pH10的1X Antigen Retrieval溶液(Biogenesis，Brentwood，NH)，之后在微波爐中加熱15min(高功率設定下5min然后在低功率設定下10min)。冷卻到室溫后(大約45min)將載玻片放在水中水浴5min，然后干燥。將干燥載玻片上的組織切片用疏水蠟筆圈上從而形成了能夠容納置于組織切片上的試劑的區域(如圖1F-1G所示)，之后在1X Perm/Wash(BDBiosciences)中洗滌載玻片三遍。向每個切片加入50-100μL阻斷緩沖液，將該載玻片放在含有去離子水的封閉潮濕盒子中4℃下2hr，之后通過抽吸去掉各切片中的阻斷緩沖液。(阻斷緩沖液為含有蛋白酶抑制劑(Roche)、磷酸酶抑制劑(氟化鈉、釩酸鈉、β-磷酸甘油)和10％鼠血清的1X Perm/Wash溶液)。向各切片加入含有結合化合物和裂解探針的40-50μL抗體混合物(每種5μg/mL，除了Her1-Her2測定中生物素-Ab5(抗Her1)為10μg/mL之外)，并將載玻片放置在潮濕的盒子中4℃下過夜。然后用100μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑的Perm/Wash洗滌切片三遍，之后加入50μL在1X Perm/Wash溶液(含有蛋白酶和磷酸酶抑制劑)中的光敏劑。接著將載玻片在黑暗潮濕的盒子中4℃下溫育1-1.5hr，之后在保持載玻片在黑暗中的同時通過抽吸去除光敏劑。當保持在黑暗中時，接著將載玻片浸入.01XPBS中并冰育1hr。從PBS中取出載玻片，干燥，并向各切片加入40-50μL具有2pM熒光素的0.01X PBS，之后用高功率的激光二極管(GaAIAs IR發射器，型號OD-880W，OPTO DIODE CORP，Newbury Park，CA)照射1hr。熒光素作為一個標準有助于將電泳圖上峰值與分子標簽相關聯。照射之后，將包裹著各個組織切片的溶液用吸球輕柔地混勻并轉移到Applied Biosystems(Foster City，CA)3100型毛細管電泳儀上的CE板上進行分析。
圖15A顯示對MCF-7固定球切片中的Her2-Her3異型二聚體和PI3K-Her3二聚體的分析數據，其中細胞未受刺激或者受到40nM HRG刺激。用于PI3K-Her3的該測定設計基本上如圖7A中所描述。在兩種情況下都接著進行上述固定化方法，除了都不用抗原修復試劑處理樣品之外。數據顯示通過HRG處理，Her2-Her3二聚體增加，但PI3K-Her3二聚體的數量基本保持不變。
圖15B顯示對總PI3K，總Her2-Her3二聚體，以及總Her3的分析數據，其均與微管蛋白的數量相關。用常規的夾心式測定法來測定微管蛋白，該方法采用了裂解探針和具有分子標簽的結合化合物。測定微管蛋白用來測試針對代表樣品中總細胞數目的靶的標準化二聚體測定的步驟，這在測定具有不同細胞類型的樣品時可能需要。數據表明PI3K-Her3和Her2-Her3與微管蛋白的比例與直接在PI3K-Her3和Her2-Her3上進行的測定的定性相同。
權利要求
1.一種確定患者疾病狀態的方法，該患者所患疾病的特征在于一種或多種胞內復合物的異常表達，該方法包括以下步驟直接測定患者樣品中一種或多種胞內復合物中每種的數量；將上述每種數量與其在標準樣品中的相應數量相比較；以及將患者樣品中的數量與標準樣品中分別相對應的數量之差與患者的疾病狀態相關聯。
2.權利要求1所述的方法，其中所述患者樣品是所述固定的組織樣品、所述冷凍的組織樣品或者循環上皮細胞。
3.權利要求2所述的方法，其中所述一種或多種胞內復合物選自以下物質構成的組14-3-3//BAD、BID//BAX、BAX//BAX、Bc1-XL//BAD、Bc1-2//BAD、14-3-3//BID、BID//BAK、BAX//Bc1-2、Bc1-XL//BIK、Bc1-2//BIK、NF-kB//I-kB、BID//Bc1-2、Bc1-XL//BID、Bc1-2//BID、FADD//caspase-9、BID//Bc1-XL、Bc1-XL//Hrk、Bc1-2//Hrk、TRADD//caspase-9、BID//A1/Bf1-1、Bc1-XL//BIM、Bc1-2//BIM、Apaf-1//caspase-9、Bc1-XL//Noxa、Bc1-2//Noxa、Bc1-XL//Bmf、Bc1-2//Bmf、Bc1-XL//Puma、Bc1-2//Puma、Bc1-XL//Bc1-G、Bc1-2//Bc1-G、Bc1-XL//NIP3、Bc1-2//NIP3、Bc1-XL//Nix和Bc1-2//Nix。
4.權利要求2所述的方法，其中所述一種或多種胞內復合物選自以下物質構成的組 14-3-3//BAD、Bc1-2//BAD、14-3-3//BID、BAX//Bc1-2、Bc1-2//BIK、BID//Bc1-2、Bc1-2//BID、Bc1-2//Hrk、Bc1-2//BIM、Bc1-2//Noxa、Bc1-2//Bmf、Bc1-2//Puma、Bc1-2//Bc1-G、Bc1-2//NIP3和Bc1-2//Nix。
5.根據權利要求4所述的方法，其中所述疾病是癌癥。
6.權利要求2所述的方法，其中所述一種或多種胞內復合物是NF-kB//I-kB。
7.權利要求6所述的方法，其中所述疾病是炎癥狀態。
8.權利要求2所述的方法，其中所述一種或多種胞內復合物選自以下物質構成的組Her1//Shc、Grb2//Sos、Her1//Grb7、Her1//RasGAP、Grb2//Shc、Her2//Shc、Her3//PI3K、Her3//Shc、Her3//Grb7、YAP//Her4、IGF-1R//PI3K、IGF-1R//Shc、IGFR//IRS1、VEGFR//Shc、VEGFR//PI3K、VEGFR//Src、VEGFR//FRS2、PDGFRa//Crk、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck、PDGFR//Shc、DGFR//STAT5、PDGFRa//Crk、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck，PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、PDGFR//STAT5、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck、PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、PDGFR//STAT5、Kit//Shp-1、Kit//PI3K、Kit//Grb2、Kit//CRKL、FGFR//PLCg1、FGFR//Crk、FGFR//FRS2、GFR//Shp2、FGFR//Shb、Trk//p75NTR以及Trk//PI3K。
9.根據權利要求8所述的方法，其中所述疾病是癌癥。
10.權利要求2所述的方法，其中所述一種或多種胞內復合物選自以下物質構成的組Her1//Shc、Grb2//Sos、Her1//Grb7、Her1//RasGAP、Grb2//Shc、Her2//Shc、Her3//PI3K、Her3//Shc、和Her3//Grb7。
11.根據權利要求10所述的方法，其中所述疾病是癌癥。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述癌癥是乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌或前列腺癌。
13.權利要求2所述的方法，其中所述疾病是癌癥并且其中所述一種或多種胞內復合物選自以下物質構成的組IGF-1R//PI3K、IGF-1R//Shc、和IGFR//IRS1。
14.權利要求2所述的方法，其中所述疾病是癌癥并且其中所述一種或多種胞內復合物選自以下物質構成的組VEGFR//Shc、VEGFR//PI3K、VEGFR//Src、和VEGFR//FRS2。
15.權利要求2所述的方法，其中所述疾病是癌癥并且其中所述一種或多種胞內復合物選自以下物質構成的組PDGFRa//Crk、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck；PDGFR//Shc、DGFR//STAT5、PDGFRa//Crk、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck；PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、PDGFR//STAT5、PDGFRb//GAP、PDGFR//Grb2、PDGFR//Grb7、PDGFR//Nck、PDGFR//Shc、PDGFR//Shp2、PDGFR//RasGAP、如PDGFR//STAT5。
16.根據權利要求1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15所述的方法，其中每種所述一種或多種胞內復合物通過以下步驟確定向所述一種或多種胞內復合物的每種提供一種試劑對，該試劑對包含具有有效近程的裂解引發部分的裂解探針，以及一種或多種結合化合物，每種具有一種或多種分子標簽，通過可裂解連接物連接于其上，不同結合化合物的所述分子標簽具有不同的分離特征；將所述裂解探針和針對每種所述一種或多種胞內復合物的一種或多種結合化合物與所述患者樣品混合，使得裂解探針和一種或多種結合化合物特異性結合于其相應的胞內復合物上，并且所述一種或多種結合化合物的可裂解連接物處于裂解引發部分的有效近程內，使分子標簽被釋放；以及分離和鑒定所釋放的分子標簽，從而確定在所述患者樣品中所述一種或多種胞內復合物的存在與否或者數量。
17.一種確定樣品中細胞凋亡狀態的方法，該方法包括步驟同時測定至少一種復合物的數量，所述復合物選自以下物質構成的組包含Bc1-2蛋白和BH3-only蛋白復合物，和包含14-3-3蛋白和BAD蛋白復合物。
18.權利要求17所述的方法，進一步包括同時測定游離的NF-kB蛋白和游離的I-kB蛋白，并且其中所述組進一步由包含NF-kB蛋白和I-kB蛋白的復合物組成。
19.權利要求18所述的方法，其中所述組進一步由包含BAX蛋白的同型二聚體組成。
20.根據權利要求17、18或19所述的方法，其中每種所述一種或多種胞內復合物通過以下步驟來確定向所述一種或多種胞內復合物的每種提供一種試劑對，該試劑對包含具有有效近程的裂解引發部分的裂解探針，以及一種或多種結合化合物，每種具有一種或多種分子標簽，通過可裂解連接物連接于其上，不同結合化合物的所述分子標簽具有不同的分離特征；將所述裂解探針和針對每種所述一種或多種胞內復合物的一種或多種結合化合物與所述患者樣品混合，使得裂解探針和一種或多種結合化合物特異性結合于其相應的胞內復合物上，并且所述一種或多種結合化合物的可裂解連接物處于裂解引發部分的有效近程內，使分子標簽被釋放；以及分離和鑒定所釋放的分子標簽，從而測定在所述患者樣品中所述一種或多種胞內復合物的存在與否或者數量。
21.一種測定患者中癌癥狀態的方法，該方法包括步驟同時測定來自患者的樣品中至少一種胞內復合物的數量，所述胞內復合物選自以下物質構成的組包含Bc1-2蛋白和BH3-only蛋白的第一復合物，和包含14-3-3蛋白和BAD蛋白的第二復合物。
22.根據權利要求21所述的方法，其中所述至少一種胞內復合物通過以下步驟來確定向所述一種或多種胞內復合物的每種提供一種試劑對，該試劑對包含具有有效近程的裂解引發部分的裂解探針，以及一種或多種結合化合物，每種具有一種或多種分子標簽，通過可裂解連接物連接于其上，不同結合化合物的所述分子標簽具有不同的分離特征；將所述裂解探針和針對每種所述一種或多種胞內復合物的一種或多種結合化合物與所述患者樣品混合，使得裂解探針和一種或多種結合化合物特異性結合于其相應的胞內復合物上，并且所述一種或多種結合化合物的可裂解連接物處于裂解引發部分的有效近程內，使分子標簽被釋放；以及分離和鑒定所釋放的分子標簽，從而測定在所述患者樣品中所述第一和第二胞內復合物的存在與否或者數量。
23.一種測定樣品中細胞凋亡狀態的方法，該方法包括步驟同時測定至少一種復合物的數量以及游離NF-kB蛋白和游離I-kB蛋白的數量，所述復合物選自由包含NF-kB蛋白和I-kB蛋白的復合物構成的組。
全文摘要
本發明提供了一種通過測定選定的胞內復合物表達水平來測定患者疾病狀態的方法。在本發明的一個方面，通過測定以凋亡通道為特征的蛋白－蛋白復合物的相對數量來檢測患者樣品中的凋亡通道活化狀態。特別地，本發明提供了一種測定線粒體凋亡通道的活化狀態的方法，其中一方面同時測定14－3－3蛋白和BAD蛋白之間復合物的相對數量，另一方面同時測定Bc1－2蛋白與BAD蛋白之間復合物的相對數量。優選地，本發明的方法通過采用成組的具有可釋放分子標簽的結合化合物來實現，其中所述分子標簽對凋亡通道內形成的一種或多種復合物的多種成分具有特異性。結合之后該分子標簽被釋放并從測定混合物中分離出來用以分析。
文檔編號A61K39/395GK1997393SQ200480015235
公開日2007年7月11日 申請日期2004年3月30日 優先權日2003年4月1日
發明者S·辛, M·Y·巴達爾, X·金, H·薩利米－穆薩維 申請人:莫諾格蘭姆生物科技公司