來源于蜱的補體抑制劑的制作方法

專利名稱：來源于蜱的補體抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及抑制經典和替代補體通路的補體抑制劑。具體的，本發明涉及來源于噬血節肢動物唾液腺、抑制經典和替代補體通路的補體抑制劑。本發明也涉及這些補體抑制劑在疾病的治療和預防中的用途。
文本中提到的和本說明書結尾處列出的所有文獻都引入此處作為參考。
補體蛋白形成效應物免疫系統的主要力量(Law and Reid，1995；Dodds and Sim，1997；Whaley，1993)。血清中和細胞表面上超過30種蛋白質參與補體系統功能和調節。該系統由外來抗原的存在而被激活。存在兩種激活通路(1)經典通路，被IgM和IgG復合體或被碳水化合物識別激活；和(2)替代通路，被非自身表面(缺乏特異性調節分子)和細菌內毒素激活。兩種通路包含平行的級聯事件，通過在細胞表面形成相似的C3和C5轉化酶而導致釋放急性炎癥介質(C3a和C5a)并形成膜攻擊復合體，從而導致產生補體激活，如圖1所示。
補體激活的效應范圍寬廣并包括啟動炎癥，具體通過釋放急性介質C3a和C5a；通過沉淀C4b和C3b調理并吞噬病原體；通過募集巨噬細胞清除免疫細胞復合體；通過抗原和C3d的共價結合增加抗原提呈到B細胞受體的效率；保留抗原在生發中心；增強抗原提呈細胞對抗原的攝入；和膜攻擊復合體(MAC)介導的對外來或疾病細胞(例如，細菌、寄生蟲、腫瘤細胞)的破壞。
補體激活必須嚴謹控制，以防止對自身組織的破壞。控制由短半衰期的活化蛋白和血漿中與細胞膜上存在的控制蛋白介導。當補體控制出錯時，對身體組織的破壞會引起疾病。Sahu和Lambris(2000)已經編輯了補體激活控制出錯在其中起作用的29種病理狀態的列表。它們包括急性胰腺炎、阿爾茨海默病、變應性腦脊髓炎、異體移植、哮喘、成人呼吸窘迫綜合征、燒傷、局限性回腸炎、腎小球性腎炎、溶血性貧血、血液透析、遺傳性血管性水腫、缺血再灌注損傷、多系統器官衰竭、多發性硬化、重癥肌無力、心肌梗死、銀屑病、類風濕性關節炎、敗血癥性休克、系統性紅斑狼瘡、中風、血管滲漏綜合征和異種移植。Ward等人，2000綜述了表明補體激活在這些疾病的一些中的重要作用、來源于動物模型(敲除和轉基因小鼠)的數據。
補體激活中出現的組織破壞由MAC和過敏毒素C3a與C5a介導。這兩種肽通過它們對嗜中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、巨噬細胞、小膠質細胞、嗜堿性粒細胞和肥大細胞的作用誘導損傷。過敏毒素刺激的細胞釋放促炎介質、組織降解酶、氧自由基并增加粘附分子和炎性細胞因子表達(Ember et al.，1998)。這又導致產生免疫應答并激活止血機制如凝血和纖維蛋白溶解。過敏毒素在感染性和非感染性炎癥中的作用近來已被Kohl(2001)綜述。MAC的促炎活性主要通過引起粘附分子、組織因子和趨化因子的表達增加由誘導細胞激活而間接介導。
由于補體控制在治療醫學疾病和病癥中的重要性，正在開發多種補體抑制劑用于治療用途(表1)。盡管這些抑制劑中的一些當前處于I/II期臨床試驗中，但這些抑制劑仍沒有在臨床上使用。開發中的抑制性分子是高分子量的天然抑制劑(Hebell etal.，1991；Weisman et al.，1990)，經常被特異性工程化(Mulligan et al.，1999；Smith andSmith，2001；Zhang et al.，2001)。它們一般是針對特異性補體成分的抗體(Frei et al.，1987；Link et al.，1999)、小分子包括RNA適配子(aptamer)(Biesecker et al.，1999)或特異性靶向補體受體的分子。
表1(來自Sahu and Lambris，2000)開發中的補體抑制劑
由于補體抑制劑在治療各種疾病和狀態中的重要性，需要更多的補體抑制劑。

發明內容
根據本發明的一個方面，提供抑制經典和替代補體激活通路的補體抑制劑分子。
“抑制”意思是替代和經典的補體激活通路的作用被降低。分子降低經典補體通路和替代補體通路作用的能力可以用本領域已知的標準溶血測試來確定，如在實施例中和Giclas et al(1994)中描述的那些。與缺少補體抑制劑分子的標準測試比較，優選的，在經典和替代補體激活通路的標準溶血測試中本發明補體抑制劑分子的存在降低紅細胞裂解至少20％，更優選至少30％、40％、50％、60％、70％或80％。
優選的，本發明補體抑制劑分子抑制經典通路中C5轉化酶和替代通路中C5轉化酶對C5的切割。如圖1所示，C5轉化酶將C5轉化為C5b在替代補體通路和經典補體通路中都發生。經典通路中的C5轉化酶是C4b3b2a，而替代通路中的C5轉化酶是C3b2Bb。抑制這兩種C5轉化酶切割C5因而就抑制經典和替代補體激活通路。分子抑制經典和替代通路的C5轉化酶切割C5的能力可以用標準體外測試確定。與缺少補體抑制劑分子的標準測試比較，優選的，本發明補體抑制劑分子的存在降低經典和替代通路中C5轉化酶切割C5至少20％，更優選至少30％、40％、50％、60％、70％或80％。優選的，本發明補體抑制劑分子能抑制一定范圍哺乳動物物種中經典和替代通路的C5轉化酶切割C5。
根據本發明的第二個方面，提供抑制C5轉化酶切割C5的補體抑制劑分子。根據本發明此方面的補體抑制劑分子可以抑制經典補體激活通路中C5轉化酶切割C5。作為替代方案，根據本發明此方面的補體抑制劑分子可以抑制替代補體激活通路中C5轉化酶切割C5。分子抑制經典或替代通路的C5轉化酶切割C5的能力可以用上述標準體外測試確定。與缺少補體抑制劑分子的標準測試比較，優選的，本發明補體抑制劑分子的存在降低經典或替代通路中C5轉化酶切割C5至少20％，更優選至少30％、40％、50％、60％、70％或80％。
通過直接結合C5或C5轉化酶或同時結合C5和C5轉化酶，本發明補體抑制劑分子可以抑制經典通路、替代通路或同時抑制經典和替代通路的C5轉化酶切割C5。優選的，本發明補體抑制劑分子通過直接結合C5而抑制C5的切割。作為替代方案，所述補體抑制劑分子可通過結合C5和C5轉化酶的復合體而抑制C5的切割。本發明進一步提供與C5形成復合體、與C5轉化酶形成復合體或同時與C5和C5轉化酶形成復合體的補體抑制劑分子。這些復合體中的C5轉化酶可以是經典或替代通路中的C5轉化酶。
優選的，所述補體抑制劑分子來源于噬血節肢動物。術語“噬血節肢動物”包括以合適宿主的血為食的所有節肢動物，如昆蟲、蜱、虱、蚤和螨、
補體是吸血蜱試圖進食時最先遇到的免疫防御系統之一。如果進食的蜱不迅速控制補體激活，它們會被宿主的炎癥應答破壞。肩板硬蜱(Ixodes scapularis)的抑制替代補體激活通路的18.5kDa蛋白已經被克隆并表達(Valenzuela et al.，2000)。安德遜革蜱(Dermacentor andersoni)(Ribeiro，1987)和毛白鈍緣蜱(Ornithodoros moubata)(Astigarraga et al.，1997)唾液腺提取物中的補體抑制活性已經被描述但還沒有鑒定活性成分。以前未在蜱中鑒定出同時抑制替代和經典補體通路的分子。
當本發明補體抑制劑分子來源于噬血節肢動物時，優選來源于蜱。優選的，所述補體抑制劑分子來源于毛白鈍緣蜱。
優選的，來源于毛白鈍緣蜱的補體抑制劑分子是包含圖4中氨基酸序列的第19到168位氨基酸的蛋白質或其功能等價物。具體的，所述補體抑制劑分子是包含圖4中氨基酸序列的第1到168位氨基酸的蛋白質或其功能等價物。
具有圖4中給出氨基酸序列的蛋白質此處也稱為“OmCI蛋白”，從毛白鈍緣蜱的唾液腺中分離，并已經發現其抑制經典和替代補體通路。更具體的，已經發現它同時抑制經典和替代補體激活通路的C5轉化酶切割C5，靶向C5激活步驟而不影響C3激活。OmCI蛋白抑制一定范圍哺乳動物中的C5轉化酶切割C5。圖4中給出的OmCI蛋白序列的前18個氨基酸形成補體抑制活性不需要的信號序列。如此處所用，術語“OmCI蛋白”表示具有或不具有信號序列的圖4中給出的序列。
術語“功能等價物”此處用于描述OmCI蛋白的保留抑制經典和替代補體通路能力的同源物和片段。優選的，功能等價物保留抑制經典和替代通路的C5轉化酶切割C5的能力。功能等價物也包括OmCI蛋白的這些同源物和片段，它們保留通過抑制經典通路的C5轉化酶切割C5而抑制經典通路的能力，或保留通過抑制替代通路的C5轉化酶切割C5而抑制替代補體通路的能力。
術語“同源物”意思包括圖4中明確表示的OmCI序列的同種異形物和同源異種物，例如包括，來自其它種蜱的OmCI蛋白序列，所述蜱包括具尾扇頭蜱(Rhipicephalus appendiculatus)、血紅扇頭蜱(R.sanguineus)、囊狀扇頭蜱(R.bursa)、美洲花蜱(A.americanum)、卡延花蜱(A.cajennense)、希伯來花蜱(A.hebraeum)、微小牛蜱(Boophilus microplus)、具環牛蜱(B.annulatus)、消色牛蜱(B.decoloratus)、網紋革蜱(Dermacentor reticulatus)、安德遜革蜱(D.andersoni)、邊緣革蜱(D.marginatus)、變異革蜱(D.variabilis，Haemaphysalis inermis)、犬血蜱(Ha.Ieachii)、長棘血蜱(Ha.punctata)、小亞璃眼蜱(Hyalomma anatolicum anatolicum)、Hydromedarii、邊緣璃眼蜱(Hy.marginatum marginatum)、蓖子硬蜱(Ixodes ricinus)、全溝硬蜱(I.persulcatus)、肩板硬蜱(I.scapularis)、六角形硬蜱(I.hexagonus)、波斯銳緣蜱(Argas persicus)、鴿銳緣蜱(A.reflexus)、乖異鈍緣蜱(Ornithodoroserraticus)、毛白鈍緣蜱、O.m.porcinus和薩氏鈍緣蜱(O.savignyi)。術語“同源物”意思也包括來自下列物種的OmCI蛋白序列蚊物種，包括庫蚊屬、按蚊屬和伊蚊屬，具體是致倦庫蚊、埃及伊蚊和岡比亞按蚊；蚤物種，如貓櫛頭蚤(貓蚤)；馬蠅(horseflies)；白蛉；黑蠅；采采蠅；虱；螨；水蛭和扁形蟲。
鑒定與圖4給出的OmCI序列的同源物的方法對本領域技術人員是清楚的。例如，可以經同源性搜索公共和私人序列數據庫而鑒定同源物。方便的，可以使用公眾可用的數據庫，但私人或商業可用的數據庫可同等使用，尤其是如果它們含有公共數據庫中未示出的數據。一級數據庫是一級核苷酸或氨基酸序列數據存放位點，可以公開或商業提供。公眾可用的一級數據庫的實例包括GenBank數據庫(http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)、EMBL數據庫(http//www.ebi.ac.uk/)、DDBJ數據庫(http//www.ddbj.nig.ac.jp/)、SWISS-PROT數據庫(http//expasy.hcuge.ch/)、PIR(http//pir.georgetown.edu/)、TrEMBL(http//www.ebi.ac.uk/)、TIGR數據庫(見http//www.tigr.org/tdb/index.html)、NRL-3D數據庫(http//www.nbrfa.georgetown.edu)、Protein Data Base(http//www.rcsb.org/pdb)、NRDB數據庫(ftp//ncbi.nlm.nih.gov/pub/nrdb/README)、OWL數據庫(http//www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/OWL/)和二級數據庫PROSITE(http//expasy.hcuge.ch/sprot/prosite.html)、PRINTS(http//iupab.leeds.ac.uk/bmb5dp/prints.html)、Profiles(http//ulrec3.unil.chlsoftware/PFSCAN form.html)、Pfam(http//www.sanger.ac.uk/software/pfam)、Identify(http//dna.stanford.edu/identify/)和Blocks(http//www.blocks.fhcrc.org)數據庫。商業提供的數據庫或私人數據庫的實例包括PathoGenome(Genome Therapeutics Inc.)和PathoSeq(Incyte PharmaceuticalsInc.)。
通常認為兩個肽之間大于30％的一致性(優選的，在指定區域)是功能等價的跡象，因此也是兩種蛋白質同源的跡象。優選的，同源蛋白與圖4中確定的OmCI蛋白序列具有大于60％的序列一致程度。更優選的同源蛋白與圖4中給出的OmCI蛋白序列分別具有大于70％、80％、90％、95％、98％或99％的序列一致程度。此處所指的百分比一致性用BLAST 2.1.3版用NCBI(National Center for BiotechnologyInformation；http//www.ncbi.nlm.nih.gov/)指定的默認參數[Blosum 62 matrix；gap openpenalty＝11和gap extension penalty＝1]確定。
圖4中給出的OmCI蛋白序列的同源物包括由野生型序列中含氨基酸替換、插入或缺失的突變體，前提是所述野生型蛋白序列表現的對經典或替代補體通路的抑制作用被保留。優選的，所述突變體保留同時抑制經典和替代補體通路的能力。優選的，這些突變體保留抑制經典和替代補體通路的C5轉化酶切割C5的能力。那些保留抑制經典或替代補體通路能力的突變體也包括在術語同源物內，只要它們保留抑制替代通路的C5轉化酶或者經典通路的C5轉化酶切割C5的能力即可。因此突變體包括含保守氨基酸替換的蛋白質，這種替換不以不利方式影響所述蛋白質的功能或活性。這個術語的意思也包括天然生物學變體(例如OmCI蛋白來源物種中的等位基因變體或地理變體)。也可以通過系統性或定向突變所述蛋白質序列的特定殘基，設計與野生型蛋白序列相比對經典或替代通路具有更高抑制活性的突變體。優選的，這些突變體顯示對經典通路的C5轉化酶或者替代通路的C5轉化酶切割C5更高的抑制作用。優選的，這些突變體顯示對經典和替代通路的C5轉化酶切割C5更高的抑制作用。
本發明也提供OmCI蛋白和OmCI蛋白同源物的片段。這些片段不僅包括圖4明確給出的毛白鈍緣蜱OmCI蛋白的片段，也包括上述的該蛋白同源物的片段。同源物的這些片段與圖4中OmCI蛋白序列的片段通常具有大于60％一致性，盡管同源物的更優選的片段與圖4中OmCI蛋白序列的片段分別顯示大于70％、80％、90％、95％、98％或99％的序列一致程度。包含圖4中序列的OmCI蛋白片段及其同源物的片段優選抑制經典和替代補體通路，優選通過抑制經典和替代通路的C5轉化酶切割C5而實現。抑制經典補體通路或替代補體通路的OmCI蛋白及其同源物的片段也包括在本發明中，只要它們保留抑制經典通路的C5轉化酶或者替代通路的C5轉化酶切割C5的能力即可。當然可以經野生型序列的系統性突變或片段化并隨后經適當的活性測試而合理設計對經典或替代補體通路具有更高抑制活性、尤其是對C5轉化酶切割C5具有更高抑制活性的片段。
術語“功能等價物”也指與OmCI蛋白結構相似的分子或含有相似或一致三級結構的分子，尤其是在OmCI的活性位點環境中含有相似或一致三級結構的分子。OmCI抑制C5轉化酶切割C5被認為是通過直接結合到C5或C5轉化酶或C5和C5轉化酶的復合體而實現。在此處實施例中顯示OmCI結合C5，支持以下建議，即通過直接結合單獨的C5，或C5是與C5轉化酶的復合體的部分時與之結合，OmCI抑制C5轉化酶切割C5。盡管申請人不希望被此理論約束，但假定OmCI與C5結合可以防止C5轉化酶進入C5切割位點。因此優選的OmCI功能等價物包括保留直接結合C5能力的分子，如同源物和片段。
OmCI也被認為是內部結合小配體的lipocalin蛋白家族的成員。因此OmCI也可以通過結合小配體而間接抑制C5切割和或MAC沉積，這些小配體正常情況下結合C5、C5轉化酶或MAC并且是正常功能所必需的。盡管MAC的C8γ成分是可結合小配體的lipocalin，之前并沒有描述過對補體系統功能重要的小配體。因此功能等價物包括那些分子，它們含有與結合C5或C5轉化酶的OmCI蛋白的活性位點或結合小配體的OmCI的活性位點相似或一致的三級結構。具體而言，設計用于模擬OmCI蛋白三級結構或活性位點的合成分子被認為是功能等價物。
本發明還提供與C5形成復合體、與C5轉化酶形成復合體或與C5和C5轉化酶一起形成復合體的OmCI蛋白或其片段或其功能等價物。這些復合體中的C5轉化酶可以是經典或替代通路的C5轉化酶。
如前面更詳細的討論，仍然需要補體抑制劑，特別是同時抑制經典和替代補體激活通路的補體抑制劑。包括OmCI蛋白及其功能等價物的本發明補體抑制劑分子將有廣泛的醫學應用，用于治療、預防和診斷疾病和病癥，并用于補體抑制研究，用作經典和替代補體激活通路抑制研究中有用的研究工具。對于這些應用OmCI蛋白自身將特別有用，因為它抑制多種哺乳動物物種中的補體級聯。
包括OmCI蛋白及其功能等價物的本發明的補體抑制劑分子可通過在宿主細胞中表達以重組形式制備。這些表達方法對本領域技術人員是熟知的并由Sambrook等人(2000)和Femandez & Hoeffler(1998)詳細描述。也可以用常規蛋白質化學技術制備本發明的蛋白質及片段。例如可通過化學合成制備蛋白質片段。
根據另一個實施方案，本發明提供與上述補體抑制劑分子結合的抗體。具體的，本發明提供與OmCI蛋白或其功能等價物結合的抗體。可以使用補體抑制劑分子如OmCI蛋白或其功能等價物作為免疫原，用標準方法(例如見AntibodiesA LaboratoryManual ed.By Harlow and Lane，Cold Spring Harbor Press，1988)制備抗血清和單克隆抗體。如此處所用，術語“抗體”包括也與補體抑制劑分子特異性結合的抗體片段。術語“抗體”還包括對本發明補體抑制劑分子具有特異性的嵌合和人源化抗體。在某些情況下，為了輔助檢測，希望將標記基團連接到抗體上。優選的，所述標記物是酶、放射性標記物或熒光標簽。
上述補體抑制劑分子的衍生物也作為本發明的實施方案包括在內。具體的，本發明提供OmCI蛋白或其功能等價物的衍生物。這些衍生物包括含補體抑制劑分子的融合蛋白，所述補體抑制劑分子基因水平融合或化學融合到一個或更多肽或多肽上。附加肽或多肽的目的可以是幫助檢測、表達、分離或純化所述蛋白質或提供所述蛋白質期望的其他特性。潛在融合伴侶的實例包括β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-轉移酶、熒光素酶、多聚組氨酸標簽、T7聚合酶片段和分泌信號肽。其它潛在的融合伴侶包括潛在的生物藥物，如正被開發用作治療特定疾病的蛋白質。
所述補體抑制劑分子也可以與標記結構域融合。優選的，標記結構域是熒光標簽、允許通過親和結合純化的表位標簽、允許組化或熒光標記的酶標簽或放射性化學標簽。在一個優選實施方案中，標記結構域是放射性化學標簽。
用于產生融合蛋白的方法是本領域的標準方法，并且對技術讀者已知。例如多數常用的分子生物學、微生物學、重組DNA技術和免疫學技術可以在Sambrook et al.(2000)或Ausubel et al.(1991)中查到。一般的，可以從兩個核酸序列讀碼框內融合在一起的核酸分子最方便地重組產生融合蛋白。這些融合蛋白將由含有所討論的融合蛋白的相應編碼序列的核酸分子編碼。
根據本發明的另一方面，提供含編碼根據本發明上述方面的補體抑制劑分子的核苷酸序列的核酸分子。這些分子包括單或雙鏈DNA、cDNA和RNA，以及合成核酸。優選的，所述核酸序列包含DNA。
優選的，所述核酸分子包含編碼OmCI蛋白或其功能等價物的核苷酸序列。優選的，這樣的核酸分子包含圖4中核苷酸序列的第53到507位堿基。該核苷酸序列編碼不帶信號序列的OmCI蛋白。圖4中核苷酸序列的前54個堿基編碼補體抑制活性不需要的OmCI信號序列。本發明也提供包含圖4中核酸序列的第1到507位堿基的核酸分子，它編碼帶信號序列的OmCI蛋白。如此處所用，詞組“編碼OmCI蛋白的核酸分子”包括編碼帶信號序列的OmCI蛋白的核酸分子和編碼不帶信號序列的OmCI蛋白的核酸分子。
本發明也包括包含本發明此方面的核酸分子的克隆載體和表達載體。這些表達載體可以帶有適當的轉錄和翻譯調控序列，例如增強子元件、啟動子-操縱子區、終止序列、mRNA穩定性序列、起始和終止密碼子或核糖體結合位點，它們與本發明的核酸分子在讀碼框內連接。
另外，可以方便的使重組蛋白從某些宿主中分泌。因此，這些載體的其他成分可以包括編碼分泌、信號傳遞和加工序列的核酸序列。
根據本發明的載體包括質粒和病毒(包括噬菌體和真核病毒)，以及其它線狀或環狀DNA載體，如使用轉座元件或同源重組技術的那些。很多這些載體和表達系統是已知的并在本領域有記錄(Fernandez & Hoeffler，1998)。特別適合的病毒載體包括基于桿狀病毒、腺病毒和痘苗病毒的載體。
用于重組表達的合適宿主包括常用的原核物種，如大腸桿菌或真核酵母，它們可以表達高水平重組蛋白并能容易的大量生長。優選的，宿主細胞是真核酵母細胞。體外生長的哺乳動物細胞系也是適合的，尤其是當使用基于病毒的表達系統時。另一個合適的表達系統是使用昆蟲細胞作宿主的桿狀病毒表達系統。表達系統也可以組成將DNA整合入基因組中的宿主細胞。蛋白質或蛋白質片段也可以體內表達，例如在昆蟲幼蟲或哺乳動物組織中表達。
可使用多種技術將根據本發明的載體導入原核或真核細胞。合適的轉化或轉染技術在文獻中很好描述(Sambrook et al，1989；Ausubel et al，1991；Spector，Goldman &Leinwald，1998)。真核細胞中，根據系統需要，表達系統可以是瞬時的(例如附加體的)或永久的(染色體整合)。
本發明也提供反義核酸分子，它們在高嚴謹性雜交條件下與編碼所述補體抑制劑分子的核酸分子雜交。具體的，本發明提供反義核酸分子，它們在高嚴謹性雜交條件下與編碼OmCI蛋白的核酸分子雜交。高嚴謹性雜交條件此處定義為在含以下成分的溶液中42℃孵育過夜50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCI，15mM檸檬酸三鈉)，50mM磷酸鈉(pH7.6)，5×Denhardts溶液，10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性剪切的鮭精DNA，隨后在0.1×SSC中在65℃下洗滌濾膜。
在一個優選實施方案中，可檢測的標記物與這些反義核酸分子連接。優選的，所述標記物選自放射性同位素、熒光化合物和酶。
本發明也包括含上述的核酸分子、反義核酸分子或載體的轉化或轉染原核或真核宿主細胞。當這些宿主細胞是原核細胞時，它們優選是大腸桿菌細胞。優選的真核宿主細胞包括真核酵母細胞和哺乳動物細胞。
本發明也提供制備上述補體抑制劑分子的方法，包括在表達所述蛋白質的條件下培養含根據本發明的核酸分子的宿主細胞，并回收由此生產的蛋白質。優選的，宿主細胞是酵母細胞。
如上有關功能等價物的討論，OmCI被認為是lipocalin蛋白家族的成員，并可以通過結合未鑒定的小配體發揮其部分作用。本發明的其它補體抑制劑分子及其功能等價物也可以通過結合小配體發揮其抑制補體激活通路的作用。希望鑒定這些天然存在的小配體，因為它們自身可以作為經典和/或替代補體激活通路的激動劑或拮抗劑。這些天然存在的配體自身可用于治療與異常高或低補體通路激活相關的疾病，或可以是開發治療這些疾病的合成配體的出發點。作為替代方案，天然存在的配體可以是開發與之結合的其它補體抑制劑分子的有用靶點。根據本發明的另一方面，提供鑒定前述補體抑制劑分子或其功能等價物的配體的方法，包括以下步驟(a)使補體抑制劑分子或其功能等價物與候選配體接觸；和(b)檢測配體一補體抑制劑分子復合體的形成。
此方法中可使用任何候選配體。例如，候選配體可以分離自細胞、無細胞制備物、化學庫或天然產物混合物。一旦鑒定了所述補體抑制劑分子的天然存在的配體，就期望可以設計模擬所述天然存在配體三級結構的小合成分子。這些合成分子結合所述補體抑制劑分子的能力也可以用本發明方法測試。
用于此方法的補體抑制劑分子可以游離在溶液中、固定于固相載體上、位于細胞表面或位于細胞內。例如，所述補體抑制劑分子可以固定于固相載體上，隨后加入候選配體。作為替代方案，可以將一種或更多候選配體固定于固相載體上并使之與所述補體抑制劑分子接觸。
通過直接或間接與候選配體連接的標記物或在涉及與標記的競爭物競爭的測試中，進行檢測候選配體和補體抑制劑分子間復合體形成的步驟。在另一個實施方案中，可以使用競爭性篩選測試，其中能結合補體抑制劑分子的中和性抗體與候選配體的結合特異性競爭。這樣，所述抗體可用于檢測對所述多肽具有特異性結合親和力的任何測試化合物的存在。
本發明方法可使用本領域已知的高通量篩選技術以同時篩選與補體抑制劑分子具有結合能力的多種候選配體。例如，WO84/03564公開了在固相基質上合成大量不同候選配體的方法，然后它們可以與本發明的補體抑制劑分子反應并洗滌。然后可以用本領域公知的方法檢測補體抑制劑分子是否與候選配體結合。
本發明也提供用上述方法鑒定或可鑒定的補體抑制劑分子的配體。當補體抑制劑分子是OmCI蛋白或其功能等價物時，可以推測所述配體是結合C5或C5轉化酶或MAC成分的小分子。
根據本發明的另一方面，提供一種組合物，其包含根據本發明上述方面的補體抑制劑分子、含補體抑制劑分子的融合蛋白、含編碼補體抑制劑分子的核酸序列的核酸分子或補體抑制劑分子的配體，以及藥學上可接受的遞體(carrier)。具體的，提供一種組合物，其包含OmCI蛋白或其功能等價物、含編碼OmCI蛋白或其功能等價物的核酸序列的核酸分子或OmCI蛋白或其功能等價物的配體，以及藥學上可接受的遞體。
術語“藥學上可接受的遞體”，如此處所用，包括基因、多肽、抗體、脂質體、多糖、聚乳酸、聚羥基乙酸和滅活病毒顆粒或任何其它成分，只要賦形劑自身不誘導毒性作用或引起產生對接受藥物組合物的個體有害的抗體即可。藥學上可接受的遞體可另外含有液體如水、鹽水、甘油、乙醇或輔助物質如潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質等。賦形劑可以使藥物組合物配成片劑、丸劑、糖衣劑、膠囊、液體、凝膠、糖漿、懸漿(slurries)、懸液以幫助患者攝入。藥學上可接受的遞體的全面討論可見Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)。
所述組合物可用作疫苗組合物，并因此任選地包含免疫刺激劑，例如佐劑。根據本發明另一方面，提供配制疫苗組合物的方法，包括將根據本發明上述方面的補體抑制劑分子如OmCI蛋白或其功能等價物與藥學上可接受的遞體，任選地與佐劑，組合。合適的佐劑在本領域公知并且包括水包油乳液制劑、皂苷佐劑、完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)和用作免疫刺激劑以增強組合物效力的其它物質。
根據另一方面，本發明提供用于治療的上述補體抑制劑分子、含補體抑制劑分子的融合蛋白、含編碼補體抑制劑分子的核苷酸序列的核酸分子或補體抑制劑分子的配體。
本發明也提供治療患補體介導疾病或病癥的動物或預防動物發生補體介導疾病或病癥的方法，包括以治療或預防有效的量向所述動物施用根據本發明上述方面的補體抑制劑分子、含補體抑制劑分子的融合蛋白、含編碼補體抑制劑分子的核苷酸序列的核酸分子、補體抑制劑分子的配體或藥物組合物。
優選的，所述動物是哺乳動物，更優選是人。
術語“治療有效量”表示治療或改善靶標疾病或病癥所需要的化合物量。此處所用的術語“預防有效量”表示預防靶標疾病或病癥所需要的化合物量。確切劑量一般取決于給藥時患者的狀態。確定劑量時可以考慮的因素包括患者疾病狀態的嚴重程度、患者的健康狀況、年齡、重量、性別、飲食、給藥時間和頻率、藥物組合、反應靈敏度和患者對治療的耐受或應答。可用常規試驗確定精確量，但最終由臨床醫生判斷。一般的，有效劑量將在0.01mg/kg(藥物質量/患者質量)到50mg/kg，優選0.05mg/kg到10mg/kg。組合物可以單獨施用于患者或可以與其它物質、藥物或激素組合施用。
本發明也提供根據本發明的補體抑制劑分子、含編碼補體抑制劑分子的核苷酸序列的核酸分子或補體抑制劑分子的配體在制造治療或預防補體介導的疾病或病癥的藥物方面的用途。
本發明的補體抑制劑分子，具體是OmCI蛋白及其功能等價物，在治療補體參與作用的所有病理狀況中具有潛在臨床用途(Sahu and Lanbris，2000)。
根據本發明優選的補體抑制劑分子如OmCI蛋白及其功能等價物，通過抑制經典和替代通路的C5轉化酶切割C5而抑制經典和替代補體通路。對兩種C5轉化酶切割C5的特異性抑制作用阻斷所有三種導致產生C5a和MAC的補體激活通路，但保留依賴于C3b的補體的免疫清除和調理功能。這樣的情形(profile)可用于治療性干預某些疾病，如阿爾茨海默病、類風濕性關節炎、腎小球性腎炎和遲發型超敏疾病(Kohl，2001)。
例如，在與顯著的腦部炎癥相關(這可能部分由補體介導)的阿爾茨海默病(AD)小鼠模型中，抑制C3增加β-淀粉樣斑塊沉積(Wyss-Coray et al.，2002)。因此，抑制C5而非C3可能對AD治療有益。
對C5轉化酶作用的研究顯示抑制C5轉化酶切割C5的本發明補體抑制劑分子，如OmCI蛋白及其功能等價物，也將可用于治療其它各種疾病和病癥。因為沒有報道過C5轉化酶的天然抑制劑，至今研究人員靶向此步驟是通過開發抑制性抗C5抗體、抑制性RNA適配子和靶向C5a受體的合成肽(綜述見Sahu and Lambris，2000)。用抗C5mAb BB5.1的早期研究(Frie et al.，1987)已經明確確定了C5a和MAC在多種疾病模型中的病理作用，這些模型包括免疫復合體腎炎(Wang et al.，1996)、膠原誘導的關節炎(Wang et al.，1995)、心肌缺血和再灌注(Vakeva et al.，1998)和心肺分流術患者(Rollins et al.，1998)。抗C5mAb(18A10)已經顯示可以改善大鼠神經移植物的存活(Ciccheti et al.，2002)。
通過抑制兩種通路的C5轉化酶切割C5而抑制經典和替代補體通路的本發明補體抑制劑分子，如OmCI蛋白及其功能等價物，因此將可用于治療三種關鍵領域的這些疾病和病癥(1)控制自身免疫病如類風濕性關節炎；(2)降低手術后補體造成的組織破壞；和(3)抑制組織排斥，尤其是在轉基因器官移植領域中。
自身免疫病如類風濕性關節炎和腎小球性腎炎的病理有很多誘因。由于存在自身抗體而導致在滑液和腎小球內形成IgG和IgA抗體一抗原免疫復合體(Daha，1993)從而引起不適當的補體激活和組織破壞，經典補體激活通路在兩種疾病中都有作用。過表達可溶性Crry(CR1小鼠同源物)保護轉基因小鼠免于發生抗體誘導的急性腎衰(Schiller et al.，2001)。由于IgM類風濕因子的存在，它可以阻礙補體介導的免疫沉淀抑制(Jarvis et al.，1993)，并且使滑膜細胞免受MAC介導的細胞作用和裂解的保護作用降低(Kontinnen，1996)，致使類風濕性關節炎免疫復合體復雜化。通過替代補體通路起作用的C5在K/BxN小鼠類風濕性關節炎模型中似乎具有關鍵作用(Solomonet al.，2002)。本發明的補體抑制劑，如OmCI蛋白及其功能等價物，將可用于治療這些自身免疫病。
補體激活引起心肌功能降低和冠狀動脈再灌注壓力與淋巴液流速增加。很多這些變化可由MAC介導(Homeister，1992)。由重組DNA技術生產的可溶性CR1蛋白可有效抑制短時心肌缺血再灌注損傷大鼠模型中的補體激活及隨后的炎癥活性(Weisman et al.，1990)。Crry降低小鼠腸的缺血再灌注損傷(Rehrig et al.，2001)。對于人，單鏈人源化抗體h5G1.1-ScFV對C5的抑制顯著減弱了心肺分流術患者的術后心肌損傷、認知缺陷和血液損失(Fitch et al.，1999)。因此抑制經典和替代通路的C5轉化酶活性的本發明補體抑制劑分子將可用于預防和治療術后心肌損傷，如再灌注損傷。
對于可用于超急性同種和異種移植器官(心和肝)排斥的經典和替代補體抑制劑有很多關注(Diamond et al.，1995；Thomas et al.，1996；Pratt et al.，1996；Tanaka et al.，1996；Fiorante et al.，2001；Bao et al.，2002)。人和豬間異種移植的主要免疫學屏障是由預先形成的天然抗體和補體介導即通過經典通路激活的快速排斥過程。異種器官移植對補體介導的損傷尤其敏感，因為正常情況下保護細胞免受損傷的補體調節蛋白在異源補體調節中的功能很差。本發明的補體抑制劑分子因此將可用于預防移植排斥。OmCI蛋白及其功能等價物將在預防移植排斥方面特別有用，因為OmCI蛋白抑制寬范圍哺乳動物物種(目前驗證了嚙齒類和靈長類)的C5轉化酶。
過敏毒素C5a在C5轉化酶轉化C5的過程中產生，已經發現它參與膿毒癥、免疫復合體疾病和遲發型超敏反應。OmCI蛋白及其功能等價物，以及抑制C5轉化酶的本發明其它補體抑制劑蛋白將可用于治療這些疾病。已經證明通過防止C5a形成和終止MAC沉積(引起移植動物模型中組織因子和P-選擇素表達上調)(Fecke et al.，2002)，OmCI蛋白及其功能等價物可用作異種移植期間的輔助治療。
其它可能的特定用途包括(1)防止血小板濃縮物保存期間補體激活血小板(Miletic and Popovic，1993)，(2)輸血期間生物材料表面的補體激活，(3)生育能力治療(Bedford and Witkin，1983)和(4)基因治療期間保護基因治療逆轉錄病毒載體免受天然抗體和補體的裂解(Rollins et al.，1996)。
噬血節肢動物如蜱是及其有效的疾病傳播者。常規上，控制蜱種群的技術已經用化學品如殺螨劑(acaracides)治療動物。這種策略導致產生抗性蜱，意味著必須引入新種類的化學品。另外，所述化學品很少有剩余效應，意味著它們必須頻繁使用。第二種方法是培育抗蜱動物，但達到的抗性程度遠不理想。
在與寄生蟲傳播疾病作斗爭的工作中，已經有很多嘗試用蜱內臟或全蜱提取物免疫動物以抗蜱。某些報道使用重組蜱蛋白(例如見國際專利申請WO88/03929)。然而，盡管有這些發展，唯一商業可用的蜱疫苗僅有抗微小牛蜱成年階段的活性，其療效根據該物種的地理位置而顯示有變化。
根據本發明的另一方面，提供免疫接種動物抵抗噬血節肢動物傳播的疾病或病癥的方法，包括向所述動物施用根據本發明上述方面的補體抑制劑分子、含補體抑制劑分子的融合蛋白、編碼補體抑制劑分子的核酸分子或組合物。
免疫接種的合適候選者包括人和家養動物，如牛、山羊、綿羊、狗、貓和需要對抗噬血節肢動物尤其是蜱及它們傳播的感染的其它動物。所述疫苗可以單獨施用，或與其它免疫原組合施用。本發明這方面的方法可用于免疫接種所述動物抵抗由噬血節肢動物傳播的任何疾病或病癥。優選的，所述噬血節肢動物是蜱，優選毛白鈍緣蜱。由鈍緣蜱屬的蜱傳播的疾病和病癥包括人的回歸熱(Borreliosis)和西尼羅病毒(WestNile virus)和豬的非洲豬熱病毒(African swine fever virus)。
本發明還提供根據本發明上述方面的補體抑制劑分子用作診斷工具的用途。鑒定本發明的補體抑制劑分子可以使研究人員研究同時抑制經典和替代補體通路的作用。具體而言，鑒定OmCI蛋白將使研究人員可研究通過抑制C5轉化酶而同時抑制經典和替代補體通路的作用。
本發明也提供在細胞、組織或非人生物體中抑制經典和替代補體通路的方法，包括向所述細胞、組織或生物體施用根據本發明上述方面的補體抑制劑分子、含補體抑制劑分子的融合蛋白或編碼所述補體抑制劑分子的核酸分子。具體而言，本發明提供在細胞、組織或非人生物體中抑制C5轉化酶活性的方法，包括向所述細胞、組織或生物體施用OmCI蛋白或其功能等價物、含OmCI蛋白或其功能等價物的融合蛋白、或編碼OmCI蛋白或其功能等價物的核酸分子。這種方法將使研究人員可以闡明C5在多種疾病和病癥中的作用。例如已經建議C5可能在預防哮喘中起積極作用(Kohl，2000)。本發明的C5轉化酶抑制劑可被用于確認是否真是如此。
將通過實施例的方式更詳細描述本發明的各個方面和實施方案。應該認識到可以在不偏離本發明范圍的情況下修改細節。


圖1經典和替代補體激活通路的示意圖。酶活性成分，暗灰。過敏毒素用放射狀星圈起來。
圖2純化毛白鈍緣蜱補體抑制劑(OmCI)。a.陽離子交換色譜。含抑制劑的峰用箭頭表示。b.經典溶血測試。樣品1(黑色條)，100％溶解；樣品2，0％溶解；樣品3，(網線條)僅血清；樣品4，血清加1μl SGE；樣品5-23(灰色條)血清加10μl圖a中顯示的組分10-28。三次重復的平均值。
圖3通過a.變性SDS-PAGE，b.等電聚焦(IEF)和c.高壓液相色譜(HPLC)分析純化的OmCI。圖a和b中的組分f15和f17相同。回收組分f15并經HPLC分析，圖c。分子量標記物和等電點(pI)標記物表示在圖a和b左側。
圖4OmCI的一級序列。信號序列用下劃線表示。半胱氨酸殘基以黑體表示。核苷酸和氨基酸編號表示在右側。
圖5Clustal X序列比對分析OmCI與蜱唾液腺蛋白2和3(TSGP2和3)和moubatin。相同殘基用灰色(半胱氨酸用黑色)突出表示并用星號標記。
圖6基因組中插入有OmCI的酵母克隆(13.1-13.5)和基因組中僅插入有載體的克隆(對照)的a.上清液和b.細胞沉淀物中的抑制活性。
圖7表達rOmCI的酵母細胞的表達(a)和去糖基化(b)。a.來自Superdex-75凝膠過濾柱的組分9-13的SDS-PAGE。b.PNGaseF處理對高度糖基化rOmCI(圖a中組分9-11)遷移率的影響。箭頭表示PNGaseF(向上箭頭)和天然OmCI(向下箭頭)。EV504與OmCI遠相關并已知被糖基化。分子量標記物(kDa)表示在圖左側。
圖8不同濃度的天然OmCI對經典(CH50)和替代(AH50)補體激活通路所致溶解的抑制。4次重復的平均值。
圖9OmCI對C8和C9加入部分形成的膜攻擊復合體(MAC)的影響。示出由于100％和0％溶解和缺少(PBS)和存在(SGE)抑制劑的吸光度。6次重復的平均值。
圖10表示缺少OmCI對經典通路從C3α切割C3a影響的時間過程，經以下分析a.變性SDS-PAGE和b.用C3a抗血清的免疫印跡。a.自反應開始算起的分鐘數(min)。用(OmCI)或不用(PBS)抑制劑、或存在10mM EDTA下進行反應。示出了牛血清白蛋白(BSA)和血紅蛋白(HAE)的位置。分子量標記物(kDa)表示在圖b左側。圖a中表示出C3a和C3α。
圖11OmCI對經典、替代和眼鏡蛇毒液因子(CVF)C5轉化酶從C5α切割C5a的影響，經ELISA分析。用水100％裂解綿羊紅細胞、僅在GVB2+中0％裂解、和(OmCI)或不和(PBS)抑制劑反應后測量pg/μl C5a釋放。4次重復的平均值。
圖12向去除C3和C5的血清中加入純C3和C5在存在(+)和缺少(-)OmCI時對綿羊紅細胞經典通路溶解的影響，所述OmCI是過量倍數的對數為1(1 log foldexcess)時完全抑制溶解的最少量OmCI。4次重復的平均值。
圖13煮沸對CH50測試中OmCI抑制活性的影響。
圖14pH處理對CH50測試中OmCI抑制活性的影響。
圖15檢測與nOmCI結合的C5。轉移到硝酸纖維素膜上的nOmCI和RaHBP2(對照)用I125標記的C3或C5檢測然后放射自顯影。蛋白質分子量標記物(kDa)在圖左側表示。
圖16通過凝膠過濾色譜檢測與C5結合的nOmCI。放射性標記的nOmCI a.加或不加純化的C3和C5(純C3/C5)和b.加或不加NHS，和去除C3或C5的血清(ΔC3/C5)。蛋白質分子量標記物(kDa)用箭頭表示。
實施例材料和方法材料綿羊和兔紅細胞來自Tissue Culture Services.，溶血素、收集的正常人血清(NHS)和去除后血清都來自Sigma。豚鼠血清來自飼養動物。純C3、C4、C5、C8和C9、和因子B和D購買自Calbiochem。抗人C3a兔多克隆抗血清來自Calbiochem，眼鏡蛇毒液因子(CVF)來自Quidel。C5a ELISA檢測試劑盒購買自Immuno-BiologicalLaboratories(IBL)。
蜱毛白鈍緣蜱根據Jones et al.，(1988)飼養。
唾液腺樣品制備和純化在顯微鏡下解剖唾液腺，在冷PBS緩沖液(0.01M磷酸鹽緩沖液和0.15M NaCl，pH7.2)中簡單漂洗，然后轉移到放置于干冰中的Eppendorf管中并在-20℃冷凍保存。需要時，解凍30對唾液腺并用1ml Dounce勻漿器中在500μl PBS中破碎。勻漿液在臺式離心機中15k RPM離心并收集上清液(稱為唾液腺提取物，SGE)，保存于-70℃，或用于測試補體抑制活性和用于分離活性成分。
經典補體通路溶血測試(CH50)5ml在Alsever’s溶液中的新鮮綿羊血液(1∶1 v/v)用50ml Gelatin veronalbarbital-EDTA(GVB-EDTA)洗滌一次，并用50ml GVB2+(加Mg2+和Ca2+的GVB緩沖液)洗滌三次。血液稀釋到濃度1×109細胞/ml。用兔溶血素敏化紅細胞，如文獻描述測定效價(Coligan，1994)。用100μl 1∶40稀釋于GVB2+中的NHS或豚鼠血清作為補體來源和100μl 2×108敏化紅細胞(EA)在總體積200μl中根據標準方法進行測試(Giclas，1994)。最后加入SGE、天然或重組OmCI(nOmCI或rOmCI)或PBS(1-5μl)，將反應物在37℃孵育。在時程結束時(直到32分鐘)12000×g離心5秒將完整細胞離心下來并在412nm經分光光度測量溶血(Coligan，1994)。所有測試至少重復3次。替代補體通路溶血測試(AH50)5ml在Alsever’s溶液中的新鮮兔血液(1∶1 v/v)用50ml GVB/Mg(10mM)EGTA緩沖液洗滌三次，洗滌之間1500×g離心10分鐘。兔血液稀釋到濃度2×108細胞/ml。將NHS稀釋于GVB/Mg EGTA中。用50μl準備好的血液補充到150μl進行測試。最后加入1-5μl SGE、PBS、天然OmCI或重組OmCI，并將反應物在37℃孵育。在時程結束時(直到60分鐘)12000×g離心5秒將完整細胞離心下來并在412nm經分光光度測量溶血(Coligan，1994)。所有測試至少重復3次。
用去除特異性補體成分的血清進行溶血測試根據制造商說明使用去除后的人血清，但每個反應的總體積減少到200μl。產生90％溶解的純補體成分的體積和稀釋度根據經驗確定。反應物在37℃孵育30分鐘。所有測試至少重復3次。
從SGE中純化毛白鈍緣蜱補體抑制劑(OmCI)150μl SGE稀釋于5ml 25mM磷酸鈉緩沖液μH6.8，50mM NaCl中并以1ml/min流速加載到1ml Q-Sepharose HP陽離子交換柱(Pharmacia)上。用10個柱體積工作緩沖液洗滌之后，在0.5ml/min流速和280nm監測下用40分鐘0.05-0.75M NaCl梯度洗脫結合蛋白。收集1ml組分，取10μl在200μl總體積CH50測試中測試補體抑制活性。用Centricon 3過濾裝置(Amicon)濃縮代表性的活性和無活性組分到50μl，加入2ml PBS，再將組分濃縮到50μl，每種取1.5μl跑4-12％Tris-Tricine變性SDS凝膠(Invitrogen)。5μl/泳道的活性和無活性組分跑pH3-7IEF凝膠(Invitrogen)并用0.7％乙酸電印跡到ImmobilonTM-P(Millipore)。用Ponceau-S染膜并切下主要帶，并經振蕩1分鐘和15K rpm離心10分鐘重復三次將其洗脫到200μl 50mM Tris pH8，2％Triton-X100中。用上述條件在Q-Sepharose HP柱上再純化所述蛋白質以除去Triton-X100。經Centricon 3濃縮和緩沖液交換成PBS后，測試樣品的補體抑制活性并在4-12％凝膠上檢測或經HPLC分離和蛋白質序列分析。
檢測溶血測試中C3a產生用1∶80最終稀釋度的NHS或豚鼠血清在總體積200μl中進行CH50/AH50測試，加或不加天然OmCI。在指定時間點從水浴中取出放置于37℃的反應物，然后12000g離心10秒并取出上清液進行隨后的免疫印跡分析。每種回收上清樣品取10μl用MES跑膠緩沖液(Invitrogen)在4-12％Bis-Tris凝膠上電泳，然后轉移到硝酸纖維素膜上。通過麗春紅染色的血清白蛋白帶強度判斷并確認所有泳道等量上樣并均勻轉移。用抗人C3a兔單特異性抗血清(Calbiochem)經免疫印跡檢測C3a從C3的切割。用磷酸鹽緩沖液0.1％Tween20、5％脫脂干奶粉(PBSTM)過夜封閉硝酸纖維素膜。除非特別指明，該緩沖液用于所有以后的稀釋和洗滌步驟。1∶500稀釋抗C3a抗血清并與膜孵育2小時。然后洗膜兩次20分鐘，加入1∶3000稀釋于PBSTM中的抗兔堿性磷酸酶偶聯物(Sigma)。再孵育2小時后洗滌膜兩次5分鐘，簡單用水漂洗，加入10ml BCIP/NBT紫色液體堿性磷酸酶底物(Sigma)。
檢測溶血測試中C5a產生如檢測C3a所述進行溶血測試。用C5a ELISA試劑盒(IBL)檢測C5a從C5的切割。為防止與未切割C5的交叉反應，溶血測試上清液中存在的C5用試劑盒制造商提供的試劑沉淀。試劑盒測量范圍從0.1到10μg/L。檢測低限是0.02μg/L。
用眼鏡蛇毒液因子(CVF)去除血清中補體0.25μg CVF(0.25μg/μl貯液)和1μl天然OmCI或者1μl PBS加入到5μl人血清中并在37℃孵育1小時。取一半CVF處理的血清加入97.5μl GVB2+和100μl EA中。37℃孵育20分鐘后檢測反應上清液中的溶血百分比和C5a濃度(見上文)。
活性成分HPLC、蛋白質序列分析和胰酶消化從IEF分離的蛋白中洗脫的20μl活性成分上Jupiter C4柱/150×1.0mm，運行條件為10-40％含0.1％三氟乙酸(TFA)的乙腈(ACN)梯度，流速1ml/min并每分鐘增加0.5％乙腈，并在215nm下監測。將c.53min處四個接近的峰轉移到Immobilon-P膜上并用Applied Biosystems Mini-Blott裝置測序。每個蛋白質進行25個循環。
為對胰酶消化產物進行序列分析，53min主峰(包含第一次HPLC分離中的所有4個峰)用SpeedVac干燥并重溶于6M胍0.5M Tris pH8.0中，然后用4-乙烯基吡啶還原并烷基化。然后重新跑相同的Jupiter C4柱。注意到保留時間沒有改變。在SpeedVac中干燥主峰并重溶于0.1M碳酸氫銨pH8.1中。加入10μl Pierce固定化胰酶，然后在37℃孵育混合物5小時并間或混合。在10K rpm離心混合物并將上清液加到173a微印跡HPLC(Aquapore C18柱/100×0.5mm)上。從膜上切下感興趣峰并測序。每個蛋白質進行15個循環。
構建毛白鈍緣蜱cDNA文庫如上所述切除并收集第三或第四次喂食(feed)后若蟲的60對毛白鈍緣蜱唾液腺，放置于1ml RNAlaterTM(Ambion)(代替PBS)中并保存于-20℃。用FastTrackTM2.0mRNA提取試劑盒(Invitrogen)提取mRNA，并用Stratagene cDNA合成試劑盒(Cat#200401-5)合成cDNA。在sepharose CL-2B柱上分成大cDNA組分和小cDNA組分后，每個組分的乙醇沉淀cDNA重懸于3.5μl ddH2O中。大分子和小分子的cDNA產量分別為約3.0ng/μl和5ng/μl。所有剩余大cDNA和小cDNA連接到StratageneUniZAP XR噬菌體載體(Cat.#237211)中，并用GigapackIII Gold包裝提取物進行包裝。大cDNA文庫中有11500個原代噬斑，而小cDNA文庫中有480500個原代噬斑。擴增后，大文庫和小文庫的滴度分別是1.5×108pfu/ml和4×109pfu/ml。
從每個文庫挑取20個噬斑到0.5ml SM緩沖液(0.1M NaCl，8mM MgS04，50mMTRIS.HCl pH 7.5，0.01％明膠)1％氯仿中并經振蕩從瓊脂糖塊上洗脫。噬菌體插入片段大小用T7(T75′TAA TAC GAC TCA CTA TAG 3′)和T3(5′AAT TAA CCC TCA CTAAAG 3′)引物進行PCT檢測。每100μl反應物中包含2μl洗脫噬菌體、2μl 10mMdNTPs、2μl每種引物(來自0.5μg/ml貯液)、10μl 10×REDTaq(Sigma)PCR反應緩沖液(100mM Tris-HCl pH 8.3，500mM KCl，11mM MgCl2，0.1％明膠)、3μl REDTaq(Sigma)DNA聚合酶(1U/μl溶于20mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM KCl，0.1mM EDTA，1mM DTT，0.5％Tween 20，0.5％Igepal CA-630，惰性染料，50％甘油)和79μl ddH2O。熱循環(Hybaid Touchdown熱循環儀)參數是1×94℃4min，30×94℃1min，48.5℃45s，72℃ 90s，和1×72℃5min。PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳顯示大文庫插入片段≥1000堿基對，而小文庫插入片段≤1000堿基對。
克隆編碼補體抑制劑的cDNA使用對HPLC 53min時洗脫的兩個主峰測定的N端序列設計簡并引物(OF4)，和T7引物(結合到UniZAP XR載體上)一起使用，以擴增編碼所述補體抑制劑的cDNA。OF4序列是5′GTAC WSN GGN WSN GAR CCN GT 3′(其中N＝A或C或G或T；R＝G或A；S＝G或C；W＝A或T)。100μl反應體系中包含3μl大或小cDNA文庫、3μl 10mM dNTPs、2μl T7和4μl OF4(來自0.5μg/ml貯液)、10μl 10×REDTaq PCR反應緩沖液、3μl REDTaq DNA聚合酶和75μl ddH2O。熱循環參數是1×94℃4min，30×94℃1min，48.5℃45s，72℃90s，和1×72℃5min。
瓊脂糖凝膠電泳顯示一定范圍的PCR產物。用Qiaex II凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化來源于OF4引物的兩種產物，并用ABI PRISMTM染料終止循環測序反應試劑盒(ABI PRISMTM dye terminator cycle sequencing ready reaction kit)和ABI測序儀(Perkin E1mer)進行測序。
用OF4和T7引物從小cDNA文庫得到的最大(約500bp)和最強PCR產物的超初步(conceptual)翻譯顯示與毛白鈍緣蜱血小板凝集抑制劑moubatin(Waxmanand Connolly，1993)具有顯著的BlastX(Altschul et al.，1997)匹配。所述序列延伸過編碼所述肽的cDNA的終止密碼子。匹配所述終止密碼子以外區域的反向引物(OR15′GGG AGG CTT TCT GTA TCC 3′)與T3引物(結合到UniZAP XR載體上)一起使用，以獲得所述cDNA的5’端。將650bp PCR產物克隆到pGEM-T Easy載體(Promega)中，然后用另外的引物OR3 5′CGT CCA ATC GGT TGA AG 3′和OF6 5′GAC TCG CAA AGT CAT CAC 3′測序。
序列分析用GCG程序套件(Wisconsin Package Version 10.1，Genetics Computer Group(GCG)，Madison，Wisc.)和Swiss Institute of Bioinformatics(http//expasy.hcuge.ch/)的ExPASy(Expert Protein Analysis System)蛋白質組學服務器進行分析。用BlastX程序(Altschul et al.，1997)將序列與GenBank非冗余(NR)蛋白質數據庫比較，并對Pfam(Bateman et al.，2000)和SMART(Schultz et al.，2000)蛋白質結構域進行檢索。用Clustal X(Jeanmougin et al.，1998)進行多序列比對。
酵母表達和OmCI的純化用正向引物OM1Y(5′-ATAGAGCTCAAAATGCTGGTTTTGGTGACC-3′)和反向引物OR7a (5′ACTGAGCGGCCGCCTAGTGATGGTGATGGTGATGACCGCAGTCCTTGAGATGGGG 3′用于帶His標簽的產物)或OR6(5′ACTGAGCGGCCGCCTAGCAGTCCTTGAGATGGGG 3′用于不帶His標簽的產物)，經聚合酶鏈式反應(PCR；95℃30″，50℃30″，72℃30″；18個循環)擴增OmCI編碼區。引物中有內建的限制位點，如SacI位點被加到起始密碼子上游，NotI位點被加到終止密碼子下游。將產物連接到pMETαC轉移載體(Invitrogen)的SacI和NotI位點之間。根據供應商(Invitrogen)說明，將質粒——在XL1-Blue細胞(Stratagene)中擴增——轉化入甲醇畢赤酵母株pMAD16和pMAD11。陽性克隆在BufferedDextrose-complex Medium BMDY中生長，并在Buffered Methanol-complex Medium中誘導蛋白質表達。連續5天每24小時通過CH50溶血測試檢測6個陽性克隆的上清液和細胞中的蛋白質表達。
96小時孵育后，500ml酵母細胞培養基在6370g離心15分鐘，加入30％(w/v)PEG-8000并在冰上攪拌1小時，從上清液中沉淀抑制劑。23700g離心1小時后，蛋白質沉淀重懸于50ml 25mM磷酸鈉緩沖液pH6.8，50mM NaCl中，然后6000rpm離心去除不溶性物質。澄清溶液加到1ml Q-Sepharose HP陽離子交換柱上并如上所述確定補體抑制活性組分。合并活性組分并用Centricon 3過濾裝置(Amicon)交換到300μlPBS中，18900g離心10分鐘，然后在0.5ml/min下用20mM Tris pH7.6，200mM NaCl作工作緩沖液加載到SuperdexTM75柱(Phamacia)上。在280nm監測并收集0.5ml組分共30分鐘。每個組分取5μl測試抑制活性，活性組分交換到PBS中，然后通過變性SDS-PAGE觀察。
根據制造商說明(New England Biolabs)用肽N-糖苷酶(PNGaseF)處理純化的rOmCI。去糖基化的rOmCI如上述通過凝膠過濾再次純化。經CH50鑒定5個抑制性組分，每個取15μl在變性和非變性條件下跑SDS-PAGE。
天然OmCI的熱穩定性和pH穩定性在總體積100μl中，對于1∶40稀釋的豚鼠血清，抑制經典通路介導的細胞溶解約90％的天然OmCI最小量確定為25ng。為檢測熱穩定性，將1μl天然OmCI(250ng)稀釋到9μl PBS中。樣品煮沸0、3、9或27分鐘，迅速在冰上冷卻，并取1μl(25ng)加到100μl CH50測試(1∶40豚鼠血清稀釋物)中。為檢測pH穩定性，將1μl天然OmCI(250ng)稀釋到9μl 10mM乙酸鈉(pH4.5和5.5)、10mM Tris.Cl(pH7和8.2)或10mM CAPS(pH10和11)緩沖液中。37℃孵育30分鐘后，將1μl(25ng)加到100μl CH50測試(1∶40豚鼠血清稀釋物)中。對照包括存在和缺乏1∶40血清稀釋物的僅1μl每種緩沖液。所有測試作三次重復。
檢測與OmCI結合的C5的方法0.5μg天然OmCI和5μg RaHBP2進行非變性SDS-PAGE，然后轉移到硝酸纖維素膜上，并在PBS，0.05％Tween 20，5％脫脂干奶粉(PBSTM)中封閉過夜。用Iodogen根據制造商說明(Pierce)將I125標記到C3和C5上。印跡膜與2μg I125標記的C3(1440kcpm/min)和2μg I125標記的C5(2160kcpm/min)在15ml PBSTM中室溫孵育4小時。室溫下3×20min在PBSTM中洗滌后，干燥硝酸纖維素膜并放射自顯影。
為進行凝膠過濾層析，0.07μg I125標記的OmCI(1687kcpm/min)與2μg純C3或C5、或23.8μl NHS或去除C3或C5的血清一起孵育。加PBS到總體積100μl，混合物孵育10分鐘，隨后以1ml/min PBS的流速過Superose12 10/30柱進行層析。收集1ml組分并在固定距離用手持蓋革計數器測量cpm。
結果從毛白鈍緣蜱SGE中純化和鑒定活性成分陽離子交換層析后，活性組分以0.25M NaCl(圖2a和b，箭頭)洗脫。將活性組分對照組分(圖3a)從IEF凝膠電印跡到PVDF膜上，然后用Ponceau-S染膜。切下、洗脫、用陽離子交換層析再純化主帶，并測試其補體抑制活性。變性SDS-PAGE顯示抑制活性與質量約19kDa的蛋白質三帶相關(圖3a)。IEF顯示抑制活性與pI約4.2的單個主帶相關(圖3b，組分17的上帶)。PVDF洗脫組分的HPLC顯示4個臨近的峰(圖3c)。使用從最大峰獲得的17氨基酸N-端序列(DSESDXSGSEPVDAFQA)設計簡并引物，以從毛白鈍緣蜱文庫中產生與所述N-端序列匹配的PCR產物。
編碼OmCI的cDNA的一級結構全長克隆的序列顯示OmCI是168個氨基酸長(圖4)。所述蛋白質具有含前18個殘基的N-端分泌信號。N-端序列分析表明信號肽切割位點在Ala18和Asp19之間。成熟蛋白的預測分子量是16.77kDa，等電點是4.3。有兩個預測的N-糖基化位點(Asn78和Asn102)和12個潛在的磷酸化位點(Ser 20，22，25，84，113，115，156，Thr90，Tyr17，43，111，130，162)。然而，這些位點具有高發生概率(蛋白激酶C、酪蛋白激酶II和酪氨酸激酶位點)，位點預測并不一定是真實修飾。
OmCI一級序列顯示與軟蜱Ornithodorus savignyi的蜱唾液腺蛋白2和3(TSGP2和3)(Mans et al.，2001)具有58％一致性，與毛白鈍緣蜱的moubatin(Waxman andConnolly，1993)有49％一致性。所有半胱氨酸殘基以及相應假定的二硫橋模式在這四種蛋白質中是保守的(圖5)。序列比對顯示OmCI有兩個顯著的短氨基酸插入氨基端的SESD和沿成熟肽序列方向約2/3處的PD(圖5)。一級序列與公共數據庫中的包括I.Scapularis抗補體蛋白(Valenzuela et al.，2000)在內的任何其它序列沒有顯著匹配。Moubain、TSGP2和3認為是形成β桶蛋白的lipocalin家族成員，所述lipocalin家族包括蜱特異性蛋白的組胺結合蛋白家族(Paesen et al.，2000)。
表達和純化重組(r)OmCI測試的6個陽性酵母克隆表現不同水平的OmCI表達(圖6a和b)。在檢測到表達的所有情況下，直到第5天的最后測試點抑制活性連續增加。約90％表達蛋白在上清液中(圖6b)。克隆13.1顯示最高表達水平并用于以后的表達研究。PEG沉淀和兩步層析步驟后，部分純化的活性rOmCI以高度糖基化形式(圖7a，組分9、10和11)和非糖基化形式(圖7a，組分12和13)存在。經PNGaseF處理后糖基化形式顯示對應非糖基化形式。糖基化和非糖基化或去糖基化的rOmCI和天然OmCI在CH50測試中同樣有活性(數據未給出)。rOmCI的最終產率是約0.3μg/ml培養基。
OmCI作用機制OmCI抑制兩種補體通路。然而經典通路可被完全抑制，而甚至過量的OmCI抑制替代通路的紅細胞溶解不超過80％(圖8)。
OmCI不阻止C8和C9分別引入到預先形成的C5b-7或C5b-8(圖9)。它也不影響經典或替代通路中C3α切割產生C3a的速率(圖10)。OmCI阻止兩種通路從C5產生C5a(圖11)。在經典溶血測試中過量的純C5而非C3與OmCI抑制劑競爭(圖12)。OmCI不阻止CVF去除血清補體的作用(數據未給出)。它也不阻止由CVF C3/C5轉化酶(CVFBb)產生C5a(圖11)。
天然OmCI的熱穩定性和pH穩定性煮沸OmCI直到9分鐘對該蛋白質的抑制活性沒有顯著影響，盡管到27分鐘時抑制活性降低(圖13)。直至pH11天然OmCI不受暴露于堿性緩沖液的影響(圖14)。暴露于pH4.5的緩沖液顯著降低OmCI的抑制活性(圖14)。銀染膠顯示這不是簡單的由于OmCI在該pH沉淀(數據未給出)。
檢測與OmCI結合的C5用I125標記的C3和C5進行Western印跡表明OmCI直接結合C5，而不結合相關的蛋白C3(圖15)。
OmCI和C5之間直接相互作用的另外證據由凝膠過濾層析獲得。在存在純化C5而非C3的條件下觀察到I125標記的nOmCI組分的表觀質量遷移(mass shift)(圖16a)。在存在NHS和去除C3的血清中明顯觀察到相似的質量遷移，但在去除C5的血清中未觀察到(圖16b)。在1M NaCl中維持質量遷移，但2M NaCl則不行，表明抑制劑和C5之間的強靜電相互作用(數據未給出)。
討論與其它蛋白質和已知補體抑制劑的關系OmCI與與軟蜱即薩氏鈍緣蜱的蜱唾液腺蛋白2和3(TSGP2和3)(Mans et al.，2001)和血小板凝集抑制劑moubatin(Waxman and Connolly，1993)最緊密相關。沒有給出或提示這三種蛋白質的任何一個(圖5)抑制補體。OmCI中存在而緊密相關蛋白中不存在的兩個小氨基酸插入(圖5)是將來誘變研究確定OmCI補體結合位點的明顯受關注位點。
TSGP2和3具有95％氨基酸一致性，并已被提出參與蜱唾液腺的顆粒生物發生(Mans et al.，2001)。TSGP2對小鼠有毒；而TSGP3無毒(Mans et al.，2002)。OmCI極不可能是毒素，因為毛白鈍緣蜱是無毒的(Astigarraga et al.，1997)，而薩氏鈍緣蜱在各種哺乳動物中引起sand tampan毒性(Mans et al.，2002)。另外，用100μg純化的天然OmCI接種豚鼠，在產生抗血清的過程中，不引起明顯病理生理效應(個人觀察)。
OmCI可能是Lipocalin蛋白家族的成員，所述Lipocalin包括蜱特異性蛋白中的組胺結合蛋白家族(Paesen et al.，2000)。Lipocalin主要在其β桶結構中結合小的、疏水性細胞外配體。但是，具尾扇頭蜱的組胺結合蛋白和正常lipocalin相比具有明顯結構差異，使之結合親水性分子(Paesen et al.，1999；Paesen et al.，2000)。尚不清楚OmCI是否可以結合小配體。
OmCI一級序列與補體控制蛋白(CCP)結構域(約60個氨基酸的多個重復)沒有可檢測相似性，所述CCP結構域形成很多體內自身補體抑制劑，包括因子H、C4BP、CR1、CR2、MCP和DAF)。它與公共數據庫中的任何其它已知補體抑制劑也不相似，其它已知補體抑制劑包括Isac，肩板硬蜱的唾液腺補體替代通路抑制劑蛋白(Valenzuela et al.，2000)。它與毛白鈍緣蜱抗原20A1的N-端序列也不相關(Barandaet al.，2000)，20A1被提議是與以前在毛白鈍緣蜱和乖異鈍緣蜱的SGE中觀察到的強補體抑制作用相關的因子(Astigarraga et al.，1997)。
補體抑制機制酵母表達的糖基化和去糖基化rOmCI都和從SGE純化的天然蛋白一樣強效。昆蟲細胞中表達的帶C-端組氨酸標簽的OmCI不夠強效(數據未給出)。OmCI抑制人和豚鼠的經典和替代補體激活通路，還可能抑制其它哺乳動物的經典和替代補體激活通路。這種特性在精確闡明OmCI如何工作方面應是有用的，在現有C5抑制劑的物種特異性阻礙用嚙齒動物進行體內研究時(Link et al.，1999)，將對建立補體介導疾病的動物模型是無價的。
OmCI不抑制經典(C4bC2a)或替代(C3bBb)的C3轉化酶，因為它對C3α的切割速率沒有影響(圖10)。OmCI阻止從C5產生C5a(圖11)。因為過量C5與OmCI抑制劑競爭(圖12)，功能性經典(C4bC2aC3b)和替代(C3b2Bb)的C5轉化酶必須在存在所述蜱抑制劑時形成。OmCI不可能是轉化酶催化組分C2a和Bb的直接絲氨酸蛋白酶抑制劑，否則它會同時阻止C3a和C5a產生。該抑制劑不阻止CVF C3/C5轉化酶(CVFBb)產生C5a(圖11)，這提示OmCI不結合C5并阻斷C5a切割位點。后一種現象不排斥OmCI結合到C5上位點、阻止C5結合到正常血清C5轉化酶而不結合到CVF轉化酶的可能性(Sandoval et al.，2000)。
兩組獨立的證據提示OmCI活性由直接結合到C5所介導(圖15和圖16)。
盡管OmCI抑制兩種補體通路，但甚至用過量抑制劑替代通路也只被抑制最多80％(圖8)。這可以用經典(C4bC2aC3b)或替代(C3b2Bb)通路使用不同的C5轉化酶來解釋，但其機制仍有待闡明。
總的來說，OmCI可能結合C5并阻止它與C5轉化酶相互作用，或者結合C5轉化酶和C5并阻止C5切割。當前我們沒有令人心服的證據支持一種可能而反對其它可能。
天然OmCI的熱穩定性和pH穩定性OmCI是熱穩定的，但活性在煮沸27分鐘后開始喪失。OmCI看起來對酸敏感而對堿不敏感。長時間煮沸和暴露于酸都可能誘導滅活該蛋白質的構象變化。
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權利要求
1.抑制經典和替代補體通路的補體抑制劑分子。
2.根據權利要求1的補體抑制劑分子，其抑制經典和替代的C5轉化酶切割C5。
3.抑制C5轉化酶切割C5的補體抑制劑分子。
4.權利要求3的補體抑制劑分子，其中所述C5轉化酶是經典通路的C5轉化酶。
5.權利要求3的補體抑制劑分子，其中所述C5轉化酶是替代通路的C5轉化酶。
6.根據權利要求2到5中任意一項的補體抑制劑分子，其通過與C5結合而抑制C5的切割。
7.根據權利要求6的補體抑制劑分子，其與C5形成復合體。
8.根據權利要求1到7中任意一項的補體抑制劑分子，其來源于噬血節肢動物。
9.根據權利要求8的補體抑制劑分子，其中所述噬血節肢動物是蜱。
10.根據權利要求9的補體抑制劑分子，其中所述蜱是毛白鈍緣蜱(Ornithodorosmoubata)。
11.根據權利要求10的補體抑制劑分子，包含圖4中氨基酸序列的第19到168位氨基酸或其功能等價物。
12.根據權利要求10的補體抑制劑分子，包含圖4中氨基酸序列的第1到168位氨基酸或其功能等價物。
13.抑制經典補體通路和替代補體通路的補體抑制劑分子，其中所述補體抑制劑是a)包含圖4中氨基酸序列的第19到168位氨基酸或第1到168位氨基酸的蛋白質；b)與a)中定義的蛋白質具有至少60％一致性的同源物；或c)上述a)中蛋白質或上述b)中同源物的活性片段。
14.抑制C5轉化酶切割C5的補體抑制劑分子，其中所述補體抑制劑是a)包含圖4中氨基酸序列的第19到168位氨基酸或第1到168位氨基酸的蛋白質；b)與a)中定義的蛋白質具有至少60％一致性的同源物；或c)上述a)中蛋白質或上述b)中同源物的活性片段。
15.根據權利要求14的補體抑制劑分子，其通過直接結合C5而抑制C5的切割。
16.根據權利要求15的補體抑制劑分子，其與C5形成復合體。
17.一種抗體，其結合根據權利要求1到16中任意一項的補體抑制劑分子或其功能等價物。
18.一種融合蛋白，其包含與一個或多個肽或多肽基因水平融合或化學融合的根據權利要求1到17中任意一項的補體抑制劑分子或其功能等價物。
19.根據權利要求18的融合蛋白，其中所述補體抑制劑分子或其功能等價物與標記結構域基因水平融合或化學融合。
20.根據權利要求19的融合蛋白，其中所述標記結構域是放射性化學標簽。
21.一種核酸分子，其包含編碼根據權利要求1到16中任意一項的補體抑制劑分子或其功能等價物或根據權利要求18到20中任意一項的融合蛋白的核苷酸序列。
22.根據權利要求21的核酸分子，包含圖4中核苷酸序列的第53到507位核苷酸或其功能等價物。
23.根據權利要求21的核酸分子，包含圖4中核苷酸序列的第1到507位核苷酸或其功能等價物。
24.一種反義核酸分子，其在高嚴謹性雜交條件下與根據權利要求21到23中任意一項的核酸分子雜交。
25.一種載體，其包含根據權利要求21到權利要求24中任意一項的核酸分子。
26.一種宿主細胞，其包含根據權利要求21到23中任意一項的核酸分子、根據權利要求24的反義核酸分子或根據權利要求25的載體。
27.制備根據權利要求1到16中任意一項的補體抑制劑分子或其功能等價物或根據權利要求18到20的融合蛋白的方法，包括在表達所述蛋白質的條件下培養根據權利要求26的宿主細胞并回收由此生產的所述蛋白質。
28.鑒定根據權利要求1到16中任意一項的補體抑制劑分子或其功能等價物的配體的方法，包括以下步驟(a)使所述補體抑制劑分子或其功能等價物與候選配體接觸，和(b)檢測配體-補體抑制劑分子復合體的形成。
29.一種組合物，包含根據權利要求1到16中任意一項的補體抑制劑分子、根據權利要求18到20中任意一項的融合蛋白或根據權利要求21到23中任意一項的核酸分子以及藥學上可接受的遞體。
30.根據權利要求29的組合物，其還含有佐劑。
31.用于治療用途的根據權利要求1到16中任意一項的補體抑制劑分子、根據權利要求18到20中任意一項的融合蛋白或根據權利要求21到23中任意一項的核酸分子。
32.治療患補體介導疾病或病癥的動物或預防動物發生補體介導疾病或病癥的方法，包括向所述動物以治療或預防有效的量施用根據權利要求1到16中任意一項的補體抑制劑分子或其功能等價物、根據權利要求18到20中任意一項的融合蛋白、根據權利要求21到23中任意一項的核酸分子或根據權利要求29或30的組合物。
33.根據權利要求1到16中任意一項的補體抑制劑分子、根據權利要求18到20中任意一項的融合蛋白或根據權利要求21到23中任意一項的核酸分子用于制造藥劑的用途，所述藥劑用于治療或預防補體介導的疾病或病癥。
34.根據權利要求32的方法或根據權利要求33的用途，其中所述疾病或病癥是阿爾茨海默病、類風濕性關節炎、腎小球性腎炎、再灌注損傷、移植排斥、膿毒癥、免疫復合體疾病或遲發型超敏反應。
35.向動物接種疫苗以抵抗噬血節肢動物傳播的疾病或病癥的方法，包括向所述動物施用根據權利要求1到16中任意一項的補體抑制劑分子或其功能等價物、根據權利要求18到20中任意一項的融合蛋白、根據權利要求21到23中任意一項的核酸分子或根據權利要求29或30的組合物。
36.根據權利要求1到16中任意一項的補體抑制劑分子或其功能等價物、根據權利要求18到20中任意一項的融合蛋白或根據權利要求21到23中任意一項的核酸分子用于制造疫苗的用途，所述疫苗用于保護動物抵抗噬血節肢動物傳播的疾病或病癥。
37.根據權利要求35的方法或根據權利要求36的用途，其中所述噬血節肢動物是毛白鈍緣蜱。
38.根據權利要求37的方法或用途，其中所述疾病或病癥是回歸熱、非洲豬熱或西尼羅熱。
39.根據權利要求1到16中任意一項的補體抑制劑分子或根據權利要求18到20中任意一項的融合蛋白用作診斷工具的用途。
40.抑制細胞、組織或非人生物體中經典和替代補體通路的方法，包括向所述細胞、組織或生物體施用根據權利要求1到16中任意一項的補體抑制劑、根據權利要求18到20的融合蛋白或根據權利要求21到23中任意一項的核酸分子。
全文摘要
本發明涉及抑制經典和替代補體通路的補體抑制劑。具體的，本發明涉及來源于噬血節肢動物唾液腺的、抑制經典和替代補體通路的補體抑制劑，本發明也涉及這些補體抑制劑在疾病的治療和預防中的用途。
文檔編號A61K38/17GK1798841SQ200480015178
公開日2006年7月5日 申請日期2004年6月2日 優先權日2003年6月2日
發明者邁爾斯·安德魯·納恩 申請人:發展技術有限公司