用于嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)的干擾素β的制作方法

專利名稱：用于嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)的干擾素β的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及干擾素(IFN)在制備用于治療和/或預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)的藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
肺炎(pneumonitis)是一種包括肺泡腔和間質(zhì)組織的肺實(shí)質(zhì)的急性感染。它可累及整個肺葉(肺葉肺炎)、肺葉的某區(qū)段(區(qū)段或小葉肺炎)、鄰近肺泡到支氣管(支氣管肺炎)、或間質(zhì)組織(間織肺炎)。這些通常根據(jù)X-線觀察進(jìn)行區(qū)別。
在30歲以上的成人中，細(xì)菌是肺炎的最常見病因。其中，肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)最為常見。其它病原體包括厭氧細(xì)菌、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、流感嗜血桿菌(Haemopholus influenzea)、肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniea)、鸚鵡熱衣原體(C.psittaci)、砂眼衣原體(C.trachomatis)、黏膜炎莫拉菌(Moraxella(Branhamella)catarrhalis)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)、和其它革蘭陰性桿菌。肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)是一種細(xì)菌樣微生物，在較年長的兒童和年輕成人中特別常見，通常是在春季。在嬰兒和兒童中，主要的肺部病原體是病毒呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus)、副流感病毒(parainfluenza virus)、和流感A，B病毒。這些病原體也可在成人中引起肺炎；但是，在本來健康的成人中唯一常見的病毒是流感A病毒，偶爾是流感B病毒，罕見水痘-帶狀皰疹病毒。其它病原體是較高級的細(xì)菌，包括諾卡菌屬(Nocardia)和放線菌屬(Actinomyces sp.)；分支桿菌屬(Mycobacteria)，包括結(jié)核分支桿菌(Mycobacteria tuberculosis)和非典型的菌株(主要是堪薩斯分支桿菌(M.kansasii)和鳥-細(xì)胞內(nèi)分支桿菌(M.avium-intracellulare))；真菌，包括莢膜組織胞漿菌(Histoplasma capsulatum)、球孢子菌屬(Coccidioides immitis)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)、煙曲霉(Aspergillus fumigatus)、和卡氏肺囊蟲(Pneumocystiscarinii)；和立克次體族(rickettsiae)，主要是伯納特立克次體(Coxiella bumetii)(Q熱)。
典型的癥狀包括咳嗽、發(fā)熱、多痰，通常延續(xù)數(shù)日，有時伴隨胸膜炎。體檢可檢出呼吸急促和實(shí)變體征，如伴有支氣管呼吸聲的爆裂聲。該綜合征通常由細(xì)菌引起，如肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌。
診斷的根據(jù)是特征性癥狀結(jié)合X-線胸透。
盡管有細(xì)菌性肺炎的臨床印象，但30-50％的病人沒有可鑒定的病原體。雖然經(jīng)受時間考驗(yàn)的鑒定細(xì)菌病原體方法是培養(yǎng)咳出的痰液，但由于痰液經(jīng)過上氣道時可能受到口咽部正常菌群的污染，這些標(biāo)本常常造成誤導(dǎo)。最可靠的標(biāo)本取自正常無菌部位，如細(xì)菌性肺炎病人的血或膿胸病人的胸膜液。需要特殊的培養(yǎng)技術(shù)、特殊的染色、血清學(xué)試驗(yàn)、或肺活檢來鑒定某些病原體分支桿菌、支原體、厭氧細(xì)菌、衣原體、病毒、真菌、軍團(tuán)菌、立克次體、和寄生蟲。
治療包括呼吸支持(明確指出使，可包括O2)和抗生素(根據(jù)革蘭染色結(jié)果選用)。如果沒有進(jìn)行革蘭染色，或者革蘭染色不能診斷，就應(yīng)根據(jù)病人年齡、流行病學(xué)、病人的風(fēng)險因子、和疾病嚴(yán)重程度的可能性選用抗生素。
一種嚴(yán)重的非典型性肺炎，即嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)，是病因?qū)W未知的一種疾病，該病最近已在亞洲、北美和歐洲有所描述。
大多數(shù)被鑒定為患有SARS的病人是原來健康的25-70歲的成人。少數(shù)SARS疑似病例在年齡不到15歲的兒童中有報(bào)道。
SARS的潛伏期一般是2-7天，但一些獨(dú)立的報(bào)告提示潛伏期可長達(dá)10天。發(fā)病的前驅(qū)癥狀一般是發(fā)熱(＞100.4°F，〔＞38.0℃〕)。常常是高熱，有時伴有發(fā)冷和寒戰(zhàn)，還可伴有其它癥狀，包括頭痛、不適和肌痛。發(fā)病時，一些人有輕度的呼吸癥狀。通常沒有皮疹和神經(jīng)或胃腸道發(fā)現(xiàn)；然而，有些病人在發(fā)熱前驅(qū)癥狀期間報(bào)告有腹瀉。
3-7天后，開始出現(xiàn)呼吸狀態(tài)減弱，同時發(fā)生無痰干咳或呼吸困難，可能伴有或發(fā)展成低氧血癥。在10-20％病例中，呼吸不良嚴(yán)重到需要插喉管和機(jī)械供氣。符合現(xiàn)行WHO的SARS病例定義的病人中病例死亡率大約是3％。
在發(fā)熱前驅(qū)癥狀期和整個病程中胸部放射照片都可能是正常的。但是，在相當(dāng)一部分病人中，呼吸狀態(tài)的特征表現(xiàn)為早期病灶性間質(zhì)滲出進(jìn)展到更普遍的斑片狀間質(zhì)滲出。有些SARS晚期病人的胸部放射照片還顯示實(shí)變區(qū)域。
在病程早期，絕對淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)常常降低。總白細(xì)胞計(jì)數(shù)一般正常或降低。在呼吸不良高峰時，大約50％的病人白細(xì)胞減少和血小板減少或血小板計(jì)數(shù)低于正常(50000-150000個/微升)。在呼吸不良早期，可見肌酸磷酸激酶水平升高(高達(dá)3000國際單位/升)和肝轉(zhuǎn)氨酶水平升高(正常值上限的2-6倍)。大多數(shù)病人，腎功能保持正常。
疾病的嚴(yán)重程度很不同，從輕度不適到死亡。雖然一些SARS病人的親密接觸者罹患了類似的疾病，但大多數(shù)人保持良好。一些親密接觸者報(bào)告有輕度發(fā)熱不適，而無呼吸病征或癥狀，提示該病可能并非一定發(fā)展成呼吸不良狀態(tài)。
SARS傳播的主要途徑是人與人的親密接觸。大多數(shù)SARS病例涉及護(hù)理SARS病人的人或與之一起生活的人，或直接接觸SARS病人排出的傳染性物質(zhì)(例如呼吸分泌物)的人。SARS傳播的潛在途徑包括觸摸過被傳染性飛沫污染的別人的皮膚或物體，然后又去觸摸自己的眼睛、鼻子、或嘴。當(dāng)某些SARS病人咳嗽或打噴嚏把飛沫撒到自己身上或別人身上或附近表面上時，就會發(fā)生這種情況。也有可能通過空氣或目前未知的其它途徑，可將SARS傳播得更廣。
迄今的信息表明，當(dāng)人們出現(xiàn)癥狀(如發(fā)熱或咳嗽)時，最具傳染性。但是，尚不知道在癥狀出現(xiàn)之前或之后多久，SARS病人可能會將疾病傳染給他人。
疾病控制預(yù)防中心(CDC)和其它實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家已經(jīng)在SARS病人中檢測到一種先前未認(rèn)識到的冠狀病毒。
目前，關(guān)于此病的病因只得到初步的資料。主要假說是一種新的冠狀病毒引起了SARS(Ksiazek等人，一種與嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的新型冠狀病毒。The New England Journal of Medicine.www.nejm.org16 April2003)。但是，作為潛在的病因，仍在研究其它病毒。
冠狀病毒是一族病毒，當(dāng)在顯微鏡下觀察時，它們具有暈輪樣或冠狀(暈邊)外觀。這些病毒是人的輕度到中度上呼吸道疾病的常見的病因，并與動物的呼吸道、胃腸道、肝臟和神經(jīng)疾病有關(guān)。冠狀病毒在環(huán)境中可存活達(dá)3小時之久。
CDC科學(xué)家從兩位SARS病人的組織分離到一種病毒，并用幾種實(shí)驗(yàn)室方法對其進(jìn)行了鑒定。電鏡觀察揭示，該病毒具有冠狀病毒的獨(dú)特形狀和外觀，遺傳學(xué)分析提示，這種新的病毒確實(shí)屬于冠狀病毒科，但與已先前鑒定的該科成員不同。SARS病人的血清樣品試驗(yàn)表明，他們看來最近曾被該病毒感染過。其它試驗(yàn)說明，這種先前未認(rèn)識到的冠狀病毒存在于其它與這次爆發(fā)直接或間接有關(guān)的SARS病人的臨床樣品中(包括通過鼻和喉拭子得到的樣品)。參與世界衛(wèi)生組織(WHO)網(wǎng)絡(luò)的實(shí)驗(yàn)室報(bào)告的這些結(jié)果和其它發(fā)現(xiàn)，對支持這種新的冠狀病毒是SARS病因的假說提供了日益增加的證據(jù)。關(guān)于該冠狀病毒和SASR之間的聯(lián)系的其它研究還正在進(jìn)行。
冠狀病毒偶爾與人的肺炎有關(guān)，特別是免疫系統(tǒng)衰弱的人。該病毒也能引起動物的嚴(yán)重疾病，包括貓、狗、豬、鼠和鳥。
幾個參與WHO網(wǎng)絡(luò)的實(shí)驗(yàn)室的研究者已經(jīng)報(bào)告了在SARS病人的臨床樣品中鑒定到副黏病毒。這些實(shí)驗(yàn)室還在研究副黏病毒是SARS病因的可能性。
現(xiàn)在，還不知道最有效的治療方案(如果有的話)。在一些地區(qū)，治療包括抗病毒藥物，如奧賽他米韋(oseltamivir)或利巴韋林(ribavirin)。類固醇也可與利巴韋林和其它抗微生物劑聯(lián)用，口服或靜脈內(nèi)給予病人。但是，因?yàn)槿鄙賹φ盏呐R床試驗(yàn)，這些方案的效果仍然未知。實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)的早期信息提示，利巴韋林并不能抑制病毒生長或被測的該新型冠狀病毒一種分離物的細(xì)胞-至-細(xì)胞的擴(kuò)散。正在進(jìn)行利巴韋林和其它抗病毒藥物的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)室檢測來觀察，是否能發(fā)現(xiàn)一種有效的治療方法。
干擾素是細(xì)胞因子，即在細(xì)胞之間傳遞信息并通過幫助摧毀引起感染的微生物和修補(bǔ)任何造成的損傷，因而在免疫系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的可溶性蛋白質(zhì)。干擾素由受感染的細(xì)胞自然分泌，于1957年首次得到鑒定。它們的名字源于它們能“干擾”病毒復(fù)制和產(chǎn)生。
干擾素表現(xiàn)出抗病毒和抗增殖活性。根據(jù)其生物化學(xué)和免疫學(xué)性質(zhì)，天然產(chǎn)生的人干擾素可分為三大類干擾素-α(白細(xì)胞)、干擾素-β(成纖維細(xì)胞)和干擾素-γ(免疫)。α-干擾素現(xiàn)已在美國和其它國家被批準(zhǔn)用于治療毛細(xì)胞白血病、性病疣、卡波氏肉瘤(通常發(fā)生在患有獲得性免疫缺陷綜合癥(AIDS，艾滋病)病人中的一種癌)、以及慢性非甲非乙肝炎。
而且，干擾素(IFN)是機(jī)體對病毒感染應(yīng)答反應(yīng)中產(chǎn)生的糖蛋白。它們能抑制受保護(hù)細(xì)胞中的病毒增殖。由于由低分子量蛋白質(zhì)構(gòu)成，IFN的作用是顯著非特異性的，即，一種病毒誘生的干擾素對其它廣范圍的病毒有效。但它們是物種特異性的，即，由一種動物產(chǎn)生的IFN只在相同或密切相關(guān)種類動物的細(xì)胞中才能刺激抗病毒活性。IFN是因其潛在抗腫瘤和抗病毒活性而被開發(fā)利用的第一類細(xì)胞因子。
這三類主要的IFN稱為IFN-α、IFN-β和FN-γ。它們最初是按其細(xì)胞來源(白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞或T細(xì)胞)分類的。但是，后來知道一種細(xì)胞能產(chǎn)生幾類IFN。因此白細(xì)胞IFN現(xiàn)稱為IFN-α，成纖維細(xì)胞IFN稱為IFN-β，T細(xì)胞IFN稱為IFN-γ。還有第四類IFN，即“Namalwa”細(xì)胞系(衍生自Burkitt氏淋巴瘤)產(chǎn)生的成淋巴細(xì)胞樣IFN，該細(xì)胞系似乎能產(chǎn)生白細(xì)胞IFN和成纖維細(xì)胞IFN的混合物。
干擾素單位(U)或干擾素國際單位(IU)報(bào)告為IFN活性的量度，其定義是能保護(hù)50％的細(xì)胞免受病毒傷害所需的量?？捎糜跍y定生物活性的試驗(yàn)方法是細(xì)胞病變效應(yīng)抑制試驗(yàn)(見Rubinstein等人，1981；Familletti，P.C.，等人，1981中所述)。在該干擾素抗病毒試驗(yàn)中，能產(chǎn)生50％細(xì)胞病變作用所需的量約為1單位/毫升干擾素。該單位是用國立衛(wèi)生研究院提供的Hu-IFN-β國際參照標(biāo)準(zhǔn)品確定的(Pestka，S.1986)。
每一類IFN都含有幾個不同的型。IFI-β和IFN-γ各是單一基因的產(chǎn)物。
歸類為IFN-α的蛋白質(zhì)是多樣性最大的一組，含有大約15個型。在9號染色體上有一簇IFN-α基因，含有至少23個成員，其中15個是活性和被轉(zhuǎn)錄的。成熟的IFN-α沒有糖基化。
IFN-α和IFN-β長度相同(165或166個氨基酸)，具有類似的生物活性。IFN-γ的長度為146個氨基酸，與α和β類類似性較少。只有IFN-γ能激活巨噬細(xì)胞或誘導(dǎo)殺傷性T細(xì)胞的成熟。這些新型的治療劑有時可稱為生物應(yīng)答修飾劑(BRM)，因?yàn)樗鼈冊跈C(jī)體對腫瘤的應(yīng)答中具有作用，通過免疫調(diào)節(jié)影響識別。
人成纖維細(xì)胞干擾素(IFN-β)具有抗病毒活性，也能激治自然殺傷細(xì)胞對抗腫瘤細(xì)胞。它是一種約20000Da的多肽，由病毒和雙鏈RNA誘生。從用重組DNA技術(shù)克隆的成纖維細(xì)胞干擾素基因核苷酸序列，(Derynk等人，1980)推導(dǎo)出了該蛋白質(zhì)的完全氨基酸序列。它的長度為166個氨基酸。
Shepard等人(1981)描述了堿基842的突變(141位Cys→Tyr)，該突變廢除了它的抗病毒活性，還描述了一個變體克隆，該克隆刪除了1119-1121位的核苷酸。
Mark等人(1984)通過用(A)代替堿基469(T)，造成17位氨基酸從Cys轉(zhuǎn)換為Ser插入一個人造突變。據(jù)報(bào)道，所產(chǎn)生的IFN-β具有與“天然”IFN-β同樣的活性并且在長時間儲存(-70℃)中穩(wěn)定。
Rebif(重組的人干擾素-β)是最近開發(fā)的用于多發(fā)性硬化病(MS)干擾素治療的，是哺乳動物細(xì)胞系產(chǎn)生的干擾素(IFN)-β1a。
在文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道干擾素單用或與其它抗病毒制劑聯(lián)用來治療SARS。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的是干擾素(IFN)單獨(dú)或與抗病毒制劑聯(lián)用來制備用于治療和/或預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)的藥物。
干擾素對抗SARS-CoV(嚴(yán)重急性呼吸道綜合征相關(guān)的冠狀病毒)的兩種臨床分離物的抗病毒作用業(yè)已由法蘭克福大學(xué)的幾位科學(xué)家證明(見J.Cintal等人，The Lancet，362，293-294，2003)。在該論文中這些科學(xué)家表明，干擾素能在體外抑制SARS-CoV的復(fù)制。具體說，他們評價了重組干擾素(IFN-α，IFN-β和IFN-γ)對抗從法蘭克福和香港病人的SARS-CoV-FFM-1兩種臨床分離物在Vero和Caco2細(xì)胞中復(fù)制的抗病毒潛力。
干擾素-β是最強(qiáng)的，在注射兩種分離物后顯示了預(yù)防性保護(hù)作用和抗病毒潛力。而且，這些科學(xué)家還測試了病毒感染之前24小時和病毒感染后立即用干擾素-β處理的培養(yǎng)物中抑制病毒復(fù)制與抑制病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞病變效應(yīng)之間的關(guān)聯(lián)性。在培養(yǎng)物中干擾素-β顯示了對感染病毒產(chǎn)生的劑量依賴性抑制作用。
術(shù)語“治療”在本文中指對于疾病進(jìn)展的任何有益的作用，包括疾病發(fā)作后病理學(xué)發(fā)展的減弱、減輕、減少或降低。
術(shù)語“干擾素”或“IFN”在本文中包括文獻(xiàn)中如此定義的任何分子，包含例如在上一節(jié)“發(fā)明背景”中提到的任何類型的IFN。具體說，在上述定義中包括IFN-α，IFN-β和IFN-γ。本發(fā)明優(yōu)選的IFN是IFN-β。適合于本發(fā)明的IFN-β可從市場購得，如Rebif(Serono)，Avonex(Biogen)，或Betaferon(Schering)。本發(fā)明也優(yōu)選采用人源干擾素。本文中，干擾素包括它的鹽、功能性衍生物、變體、突變蛋白質(zhì)、融合蛋白質(zhì)、類似物以及其活性片段。
術(shù)語“干擾素-β(IFN-β)”在本文中包括成纖維細(xì)胞干擾素，特別是人源的，從生物體液中分離得到的，或通過DNA重組技術(shù)從原核或真核宿主細(xì)胞得到的，以及它的鹽、功能性衍生物、變體、類似物和活性片段。
本文中術(shù)語“突變蛋白質(zhì)”指IFN的類似物，該類似物中天然IFN的一個或多個氨基酸殘基被不同的氨基酸殘基替代，或被刪除，或一個或多個氨基酸殘基被加入天然IFN的序列中，但與野生型IFN相比較，所得產(chǎn)物的活性沒有顯著改變。這些突變蛋白質(zhì)可用已知的合成技術(shù)和/或定點(diǎn)誘變技術(shù)，或適合的任何其他已知技術(shù)制備。優(yōu)選的突變蛋白質(zhì)包括如Shepard等人(1981)或Mark等人(1984)所敘述的那些。
任何這樣的突變蛋白質(zhì)優(yōu)選具有與IFN序列足夠相同的氨基酸序列，從而具有與IFN基本類似或甚至更好的活性。干擾素的生物功能是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，其生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品例如已由國立生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)品和控制研究所建立并可從該處獲得(http//immunology.org/links/NIBSC)。
業(yè)已描述了測定IFN活性的生物試驗(yàn)方法。例如可按Rubinstein等人1981所述進(jìn)行IFN試驗(yàn)。因此，通過常規(guī)的實(shí)驗(yàn)可測定任何給定的突變蛋白質(zhì)是否具有與IFN基本類似的活性，或甚至其活性比IFN更好。
因此，可用于本發(fā)明的IFN突變蛋白質(zhì)或其編碼核酸，包括明確的一組基本上相應(yīng)的序列作為肽或多肽替代物，本領(lǐng)域技術(shù)人員無需過多的實(shí)驗(yàn)便可按照本文所提供的說明和指南常規(guī)地得到它們。
本發(fā)明優(yōu)選的突變蛋白質(zhì)的改變是所謂的“保守”性替代。本發(fā)明多肽或蛋白質(zhì)的保守性氨基酸替代可包括一組內(nèi)的同義氨基酸，它們具有足夠類似的理化性質(zhì)，使得同組成員之間的替代將保留該分子的生物學(xué)功能。顯然也可在以上定義的序列中進(jìn)行氨基酸的插入或刪除而不改變它們的功能，特別是如果該插入或刪除只涉及少數(shù)氨基酸，例如，在三十個以下，優(yōu)選十個以下，并且不要除去或取代對功能性構(gòu)象至關(guān)重要的氨基酸，如半胱氨酸殘基。蛋白質(zhì)和通過這種刪除和/或插入產(chǎn)生的突變蛋白質(zhì)包括在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
優(yōu)選同義氨基酸分組是表I所定義的那些。更優(yōu)選同義氨基酸分組是表II中所定義的那些，最優(yōu)選同義氨基酸分組是表III中所定義的那些。
表I優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸 同義分組SerSer，Thr，Gly，AsnArgArg，Gln，Lys，Glu，HisLeuMe，Phe，Tyr，Met，Val，LeuProGly，Ala，Thr，ProThrPro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrAlaGly，Thr，Pro，AlaValMet，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValGlyAla，Thr，Pro，Ser，GlyIleMet，Tyr，Phe，Val，Leu，IlePheTrp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTyrTrp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrCysSer，Thr，CysHisGlu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGlnGlu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnAsnGlu，Asp，Ser，AsnLysGlu，Gln，His，Arg，LysAspGlu，Asn，AspGluAsp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluMetPhe，Ile，Val，Leu，MetTrpTrp表II更優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸 同義分組SerSerArgHis，Lys，ArgLeuLeu，Ile，Phe，MetProAls，ProThrThrAlaPro，AlaValVal，Met，IleGlyGly
IleIle，Met，Phe，Val，LeuPheMet，Tyr，Ile，Leu，PheTyrPhe，TyrCysCys，SerHisHis，Gln，ArgGlnGlu，Gln，HisAsnAsp，AsnLysLys，ArgAspAsp，AsnGluGlu，GlnMetMeL，Phe，Ile，Val，LeuTrpTrp表III最優(yōu)選的同義氨基酸分組氨基酸 同義分組SerSerArgArgLeuLeu，Ile，MetProProThrThrAlaAlaValValGlyGlyIleIle，Met，LeuPhePheTyrTyrCysCys，SerHisHisGlnGlnAsnAsnLysLysAspAspGluGluMetMet，Ile，LeuTrpMet
可用于本發(fā)明在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生氨基酸替代以獲得IFN突變蛋白質(zhì)的例子包括任何已知的方法步驟，如授予Mark等人的美國專利4,959,314，4,588,585和4,737,462；授予Koths等人的5,116,943；授予Namen等人的4,965,195；授予Chong等人的4,879,111；和授予Lee等人的5，017,691；以及在美國專利4,904,584(Shaw等人)中所述的賴氨酸取代的蛋白質(zhì)。IFN-β的特異性突變蛋白質(zhì)例如已經(jīng)由Mark等人在1984年敘述。
術(shù)語“融合蛋白”指包含融合于另一個蛋白的IFN或其突變蛋白的多肽，例如其在體液中停留時間延長。因此，IFN可與另一個蛋白質(zhì)、多肽等，例如免疫球蛋白或其片段融合。
“功能性衍生物”本文包括IFN的衍生物、它們的突變蛋白和融合蛋白，可通過本領(lǐng)域已知的方法，從殘基側(cè)鏈的功能基團(tuán)或N-或C-末端基團(tuán)等來制備，并且只要它們?nèi)匀皇撬帉W(xué)上可接受的，即它們不破壞基本上類似于活性IFN的該蛋白質(zhì)的活性，并且不使含有它們的組合物具有毒性，那么它們都包括在本發(fā)明之中。這些衍生物例如可包括，能遮蔽抗原位點(diǎn)并延長IFN在體液中滯留的聚乙二醇側(cè)鏈。其它衍生物包括羧基的脂肪族酯、羧基與氨或與伯胺或仲胺反應(yīng)產(chǎn)生的酰胺、氨基酸殘基的游離氨基與酰基部分(如烷?；蛱辑h(huán)芳酰基)形成的N-?；苌?，或游離羥基(如絲氨?；蛱K氨酰殘基的游離羥基)與酰基部分形成的O-?；苌铩?br> 作為IFN的“活性部分”，或突變蛋白質(zhì)和融合蛋白質(zhì)，本發(fā)明涵蓋蛋白質(zhì)分子的多肽鏈的任何片段或前體，所述蛋白質(zhì)分子是單獨(dú)的或與連于其上的結(jié)合分子一起，如糖或磷酸殘基，或蛋白質(zhì)分子或糖殘基自身的聚集體，前提是所述的部分與相應(yīng)的IFN比較沒有顯著降低活性。
術(shù)語“鹽”本文指上述蛋白質(zhì)或其類似物的羧基鹽和氨基的酸加成鹽。羧基鹽可通過本領(lǐng)域已知的方法形成，包括無機(jī)鹽，例如鈉、鈣、銨、鐵或鋅鹽等，以及與有機(jī)堿如與胺，如三乙醇胺、精氨酸或賴氨酸、哌啶、普魯卡因等形成的鹽。酸加成鹽包括例如與無機(jī)酸如鹽酸或硫酸的鹽，以及與有機(jī)酸例如乙酸或草酸形成的鹽。當(dāng)然，任何這類鹽必須保留本發(fā)明相關(guān)的此蛋白質(zhì)(IFN)的生物活性，即，與相應(yīng)受體結(jié)合并啟動受體信號傳遞的能力。
根據(jù)本發(fā)明，可將抗病毒制劑與干擾素聯(lián)用以強(qiáng)化其有益作用。根據(jù)本發(fā)明，特別優(yōu)選將利巴韋林(1-β-呋喃核糖基-1H-1，2，4-三唑-3-甲酰胺)作為抗病毒制劑。
根據(jù)本發(fā)明，還特別優(yōu)選采用重組的人IFN-β和本發(fā)明化合物。
最近已經(jīng)報(bào)道了一種特別類型的干擾素變體。所謂的“復(fù)合干擾素”(“consensus interferons”)是非天然存在的IFN變體(美國專利6,013,253)。按照本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的化合物與共有序列干擾素聯(lián)用。
如本發(fā)明所用，人復(fù)合干擾素(IFN-con)應(yīng)指一種非天然存在的多肽，它主要包含以IFN-α為代表的大部分天然存在的人白細(xì)胞干擾素亞型序列的亞組所共有的氨基酸殘基，在一個或多個不存在所有亞型共有氨基酸的位置上，復(fù)合干擾素包含在該位置上主要出現(xiàn)的氨基酸，在任何情況下，復(fù)合干擾素都不包含在至少一個天然存在的亞型的該位置上都不存在的氨基酸殘基。IFN-con包括但不限于美國專利4,695,623，4,897,471和5,541,293所公開的稱為IFN-con1，IFN-con2和IFN-con3的氨基酸序列。編碼IFN-con的DNA序列可按上述專利所述的方法或用其它標(biāo)準(zhǔn)方法產(chǎn)生。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，融合蛋白質(zhì)包括Ig融合物。融合可以是直接的，或通過短接頭肽，該接頭肽可短至1-3個氨基酸殘基或更長，例如13個氨基酸殘基的長度。所述的接頭可以例如是序列為E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，或包含Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13個氨基酸接頭序列，引入在IFN和免疫球蛋白序列之間。形成的融合蛋白質(zhì)可具有改善的性質(zhì)，如在體液中滯留時間(半壽期)延長，比活性提高，表達(dá)水平提高，或有利于該融合蛋白質(zhì)的純化。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，IFN與Ig分子的恒定區(qū)融合。優(yōu)選與重鏈區(qū)，例如人IgG11的CH2和CH3域融合。Ig分子的其它同工型也適用于產(chǎn)生本發(fā)明的融合蛋白質(zhì)，如同工型IgG2，IgG3或IgG4，或其它Ig類，如IgM或IgA。融合蛋白質(zhì)可以是單體的或多聚體的，雜合-或純合多聚體。
在另一優(yōu)選實(shí)施方案中，該功能性衍生物包含至少一個連接于一個或多個功能基團(tuán)的部分，該功能基團(tuán)位于一個或多個氨基酸殘基側(cè)鏈上。優(yōu)選該部分是聚乙二醇(PEG)部分。聚乙二醇化可用已知方法，如WO99/55377中所述的方法進(jìn)行。
給予個體的劑量(單劑或多劑)根據(jù)多種因素而不同，包括藥物動力學(xué)性能、給藥途徑、病人狀況和特征(性別、年齡、體重、健康、身材)、癥狀的程度、并行的治療、治療的頻率和所希望的效果。
人IFN-β的標(biāo)準(zhǔn)劑量范圍為每日80000IU/kg-200000IU/kg，或每人每天6-12MIU(百萬國際單位)，或每人22-44μg(微克)。按照本發(fā)明，優(yōu)選給予IFN每人每天約1-50μg，更優(yōu)選約10-30μg，或約10-20μg。
本發(fā)明活性成分的給藥可通過靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)或皮下途徑。IFN給藥的優(yōu)選途徑是皮下途徑。
IFN可每日或隔日或以更低的頻率給予。優(yōu)選IFN每周給予一次、兩次或三次。
給藥的優(yōu)選途徑是皮下給藥，如每周給藥三次。另一個優(yōu)選的給藥途徑是肌肉內(nèi)給藥，如每周一次。
優(yōu)選每周皮下注射三次22-44μg或6MIU-12MIU的IFN-β。
IFN-β可皮下給藥，劑量為隔日25-30μg或8-9.6MIU。
還可每周一次肌肉內(nèi)給予IFN-β30μg或9.6MIU。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，利巴韋林和IFN-β聯(lián)合給藥，給藥劑量為約每人每日100-2000mg，優(yōu)選每人每日約400-1200mg，更優(yōu)選每人每日約800-1000mg，或每人每日約1000-1200mg。對于體重小于65kg的病人，常用劑量為每天800mg，對于體重65-85kg的病人，常用劑量為每天1000mg，對于體重超過85kg的病人，常用劑量為每天1200mg。應(yīng)用的實(shí)際劑量可根據(jù)病人的需要和待治療疾病的嚴(yán)重程度而不同。具體情況的合適劑量方案的確定在本領(lǐng)域技能范圍內(nèi)。為方便起見，可按需要在一天里把總?cè)談┝糠殖蓭追萁o藥。
在一優(yōu)選實(shí)施方案中，利巴韋林口服給藥。
利巴韋林可通過注射或優(yōu)選口服給藥。取決于給藥模式，該化合物可與合適的稀釋劑和運(yùn)載體配制形成含有該化合物約0.01-15重量％，優(yōu)選約1-10重量％的油膏、霜劑、泡沫劑、和溶液。用于注射，利巴韋林是溶液形式或懸浮液形式，溶解或懸浮在生理上相容的溶液中，濃度為約10mg/ml-1500mg/ml?？梢造o脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腦內(nèi)、皮下或腹腔內(nèi)注射。
用于口服，利巴韋林可以是膠囊、藥片、口服懸浮液或糖漿劑型。藥片或膠囊可含有約10-500mg利巴韋林。它們優(yōu)選含有約300mg利巴韋林。膠囊可采用常用的明膠膠囊，除上述量的利巴韋林外，還可含有少量的(如低于5重量％的)硬脂酸鎂或其它賦形劑。藥片可含有上述量的該化合物和黏合劑，黏合劑可以是明膠溶液、水淀粉糊、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇水溶液等，可有通常的糖包衣。
本發(fā)明化合物和IFN可配制在藥物組合物中。
術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”指包含不干擾活性組分的生物活性效力，對接受的宿主無毒性的任何運(yùn)載體。例如，對于胃腸道外給藥，可將該活性蛋白質(zhì)配制在如鹽水、右旋糖溶液、血清白蛋白或Ringer氏溶液等運(yùn)載體中，配成單位劑量形式用于注射。
本發(fā)明藥物組合物的活性成分可以多種途徑給予個體。給藥途徑包括皮內(nèi)、透皮(如緩釋制劑)、肌肉內(nèi)、腹腔內(nèi)、靜脈內(nèi)、皮下、經(jīng)口、硬膜外、局部、和鼻內(nèi)途徑?？刹捎萌魏纹渌委熡行У慕o藥途徑，例如通過上皮或內(nèi)皮組織吸收或通過基因治療，其中將編碼活性制劑的DNA給予病人(如通過載體)，使該活性制劑在體內(nèi)表達(dá)分泌。此外，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可與生物活性制劑的其他組分，如藥學(xué)上可接受的表面活性劑、賦形劑、載體、稀釋劑和運(yùn)載體一起給予。
本發(fā)明優(yōu)選皮下途徑(給藥)。
實(shí)施本發(fā)明的另一種可能是內(nèi)源激活I(lǐng)FN基因。在此情況下，采用能誘導(dǎo)和/或增強(qiáng)正常情況下IFN表達(dá)沉默的細(xì)胞或IFN表達(dá)量不足的細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性IFN的載體來治療SARS。該載體可包含調(diào)控序列，能在需要表達(dá)IFN的細(xì)胞中發(fā)揮功能。這類調(diào)控序列可以例如是啟動子或增強(qiáng)子。然后可將該調(diào)控序列通過同源重組引入染色體組的正確位置，從而使該調(diào)控序列與需要誘導(dǎo)或增強(qiáng)其表達(dá)的基因操作性相連接。這種技術(shù)一般稱為“內(nèi)源基因活化”(EGA)，在WO91/09955中有描述。
本發(fā)明還涉及經(jīng)遺傳修飾以產(chǎn)生IFN的細(xì)胞在制備用于治療和/或預(yù)防SARS的藥物中的用途。
對于胃腸道外給藥(如靜脈內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi))，可將IFN與藥學(xué)上可接受的胃腸道外運(yùn)載體(如水、鹽水、右旋糖溶液)和能保持等滲性(如甘露醇)或化學(xué)穩(wěn)定性的添加劑(如防腐劑和緩沖劑)一起配制為溶液、懸浮液、乳液或凍干粉末。該制劑用普通技術(shù)滅菌。
按照本發(fā)明，可將治療有效量的本發(fā)明的化合物和IFN，在其它治療方案或藥物(如多種藥物方案)之前，同時或之后，預(yù)防性或治療性地給予個體。與其它治療藥物同時給予的活性制劑可在相同或不同的組合物中給予。
所有本文引用的參考文獻(xiàn)，包括雜志論文或摘要、已出版的或未出版的美國或外國專利申請書、已發(fā)布的美國或外國專利或其它參考文獻(xiàn)，全部納入作為參考，包括所引用的參考文獻(xiàn)中所有的數(shù)據(jù)、表、圖和文字。此外，本文引用參考文獻(xiàn)中所引用的全部參考內(nèi)容也納入作為參考。
對已知方法步驟、常規(guī)方法步驟、已知方法或常規(guī)方法的參考絕不是承認(rèn)說本發(fā)明的任何方面內(nèi)容，闡述或?qū)嵤┓桨敢言谙嚓P(guān)的領(lǐng)域中公開、說明或提出。
前面具體實(shí)施方案的敘述已完全揭示了本發(fā)明的總體性質(zhì)，所以其他人無需過多的實(shí)驗(yàn)就可以通過應(yīng)用本領(lǐng)域的知識(包括本文引用參考文獻(xiàn)的內(nèi)容)不難修改和/或修正這些具體實(shí)施方案的各種應(yīng)用，這并不脫離本發(fā)明的總體思路。因此，根據(jù)本文提供的說明和指南，這些修改或修正均在本發(fā)明所公開的實(shí)施方案的等價物含義范圍之內(nèi)。應(yīng)該理解，本文的用辭或術(shù)語是為了敘述而不是限制本發(fā)明，因此本說明書的術(shù)語或用辭應(yīng)由本領(lǐng)域技術(shù)人員借助本文提供的說明和指南，結(jié)合本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的知識加以解釋。
實(shí)施例臨床試驗(yàn)采用2種不同劑量的IFN-β進(jìn)行臨床試驗(yàn)。目的是測量SARS CoV-感染的病人的臨床結(jié)果。該臨床結(jié)果是定量測定病人鼻咽吸出物中SARS-CoV病毒的滴度和患者的PBMC，以及檢測可預(yù)見該結(jié)果的免疫學(xué)參數(shù)。
臨床試驗(yàn)的設(shè)計(jì)第一項(xiàng)臨床試驗(yàn)是為兒童設(shè)計(jì)的。在兒童中進(jìn)行該試驗(yàn)的理由如下。首先，該疾病在兒童中嚴(yán)重性較小，至今還沒有登記到死亡。這可最大程度減少治療病得很重因而不能耐受該藥物初始劑量的病人的風(fēng)險。而且，從兒科試驗(yàn)得到的經(jīng)驗(yàn)可安全地應(yīng)用到成年病人上。
募集18歲以下的年輕病人進(jìn)行隨機(jī)對照試驗(yàn)。選擇病人的根據(jù)是他們的臨床狀態(tài)和肺透視片，按照世界衛(wèi)生組織所定義的標(biāo)準(zhǔn)。將病人分為3組，每組10個病人(1)不用IFN-β的對照組，(2)低劑量IFN-β(1百萬單位/m2/天)，(3)中等劑量IFN-β(3百萬單位/m2/天)。根據(jù)他們的臨床病程，治療病人1-4周。治療結(jié)束時評價他們的臨床結(jié)果，病毒負(fù)荷，和免疫應(yīng)答。
測量CoV-SARS感染的病人的臨床結(jié)果在該試驗(yàn)過程中收集了以下病人資料用于分析發(fā)熱*、發(fā)冷或寒戰(zhàn)、咳嗽*、呼吸困難或呼吸窘迫*、肌痛、不適、昏睡或興奮、營養(yǎng)差、鼻溢、咽喉疼痛、厭食、腹瀉或嘔吐、頭暈或神經(jīng)學(xué)抱怨，以及發(fā)疹。(*號指SARS病人的主要癥狀)。臨床結(jié)果的測量根據(jù)病人的住院過程、呼吸狀態(tài)(呼吸困難或發(fā)紺)、動脈血?dú)怏w測定結(jié)果、對通氣支持的需要和肺透視改變。
病人鼻咽吸出物和糞便中SARS-CoV病毒滴度的測定收集三周期間治療前，第3，6，9，12，15和21天受感染病人的一系列鼻咽吸出物和糞便樣品。用FRhK-4細(xì)胞培養(yǎng)樣品中的SARS-CoV。進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)來鑒定被感染的細(xì)胞。細(xì)胞用光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)胞病變效應(yīng)以及測定每毫升病毒滴度。此外，提取樣品的總RNA作逆轉(zhuǎn)錄和隨后的定量-PCR試驗(yàn)，用特異性寡核苷酸引物鑒定SARS-CoV。
收集血清樣品用于測定SARS-CoV抗體。
預(yù)示治療結(jié)果的免疫學(xué)參數(shù)測定IFN-激活的基因的表達(dá)，它是外源性IFN體內(nèi)效果的指標(biāo)。待測定的IFN激活的基因包括2-5合成酶、PKR和Mx。這些基因是已明確確定的細(xì)胞中IFN活性的標(biāo)志。此外，選出典型的反應(yīng)者(臨床結(jié)果較好和治療后病毒負(fù)荷降低)和非反應(yīng)者(臨床結(jié)果差和IFN-β治療后病毒負(fù)荷改變很少或沒有改變)。
在表述時，用微陣列系統(tǒng)(如Affimetrix)研究病人外周血單核細(xì)胞的基因表達(dá)譜并進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究。這些結(jié)果可用于鑒定治療反應(yīng)的標(biāo)志物。
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權(quán)利要求
1.干擾素(IFN)在制備用于治療和/或預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)的藥物中的用途。
2.IFN與抗病毒制劑聯(lián)用在制備用于治療和/或預(yù)防SARS的藥物中的用途，所述IFN與抗病毒制劑同時、依次或分別使用。
3.如權(quán)利要求1或2所述的用途，其特征在于，所述的抗病毒制劑是利巴韋林。
4.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述的IFN是重組的人IFN-β。
5.如權(quán)利要求1-9任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述的IFN是復(fù)合干擾素。
6.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述的IFN是至少含有一個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域的融合蛋白質(zhì)。
7.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述的IFN給藥劑量是每人每天約1-50μg，或每人每天約10-30μg，或每人每天約10-20μg。
8.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述的IFN每天或隔天給藥。
9.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述IFN每周給藥兩次或三次。
10.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述的IFN皮下給藥。
11.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述的IFN肌肉內(nèi)給藥。
12.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，所述抗病毒制劑的給藥劑量是每人每天約100-2000mg，或每人每天約400-1200mg，或每人每天約800-1000mg，或每人每天約1000-1200mg。
13.如前述權(quán)利要求任何一項(xiàng)所述的用途，其特征在于，利巴韋林為口服給藥。
全文摘要
本發(fā)明描述了干擾素在制備用于治療和/或預(yù)防嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(SARS)的藥物中的用途。
文檔編號A61K31/7056GK1798572SQ200480014651
公開日2006年7月5日 申請日期2004年4月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月17日
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