神經變性疾病的治療的制作方法

專利名稱：神經變性疾病的治療的制作方法
技術領域：
本發明涉及治療神經變性疾病的方法，尤其是治療其中轉化生長因子β(TGF-β)特別是TGF-β1的增加是有益的那些神經變性疾病的方法。更具體而言，本發明提供了如多發性硬化癥和由于頭部創傷、中風和顱內出血引起的退化后遺癥的治療方法，其中神經功能從受損狀態下得到好轉或者恢復。本發明還提供包含不飽和脂肪酸部分的已知的和新的化合物在制備能夠有效治療上述病癥的藥物的新用途，更特別的是對于神經功能恢復能夠達到以前不能到達的水平的成功。
n-3和n-6不飽和型必需脂肪酸(EFAs)對大多數人生理紊亂具有有益作用已有大量報道。WO 02/02105(Laxdale有限公司)描述它們對于非常多的疾病的有益用途和作為全營養補劑的有益用途。Harbige(1998)Proc.Nut.Soc.57，555-562綜述了在自身免疫疾病狀態下含n-3和n-6酸的飲食的補充給藥法，尤其特別提到富含γ-亞麻酸(GLA)和/或亞油酸(LA)的油酯如琉璃苣油在減少類風濕性關節炎臨床重要體癥和癥狀的益處的跡象。
對多發性硬化癥患者的兩項研究特別提到指出使用含有n-6酸部分的油酯的治療方法可以減少該病的復發和嚴重度(Miller等人(1973)和Bates等人(1978))，而確認該效果的進一步研究卻失敗了(Paty等人(1978)。這些論文報道患者每天補充20g亞油酸(18:2n-6)可影響多發性硬化癥復發的持續時間和嚴重度，和對照組相比，復發頻率更低、嚴重度更輕和持續時間更短。Bates特別提到已在1957年被建議的亞油酸與γ-亞麻酸的混合物可在治療炎癥和自身免疫疾病中更有效，并開始這項研究。然而，發現當使用該組合進行實驗時，每天給予3g油的復發患者(Naudicelle月見草油)在試驗組中病情比對照組更嚴重。
其它人的這些亞油酸研究的Meta分析(Dworkin等(1984))表明輕度多發性硬化癥患者在長期的病癥進程中復發率減少和嚴重度降低。后來對多發性硬化癥的開放試驗表明低脂肪飲食和/或控制飲食的n-3和n-6脂肪酸可能是有益的(Swank和Grimsgaard(1988)；Harbige等人(1990)。
雖然MS的病因學尚不清楚，強有力的證據表明是疾病發病機制中存在自身免疫機制[Martino & Hartung 1999]。研究顯示，與健康對照相比，MS患者有較高量的處于激活增長態的神經抗原自體反應T細胞，如髓磷脂堿性蛋白(MBP)和髓磷脂少突神經膠質細胞糖蛋白(MOG)自體激活的T細胞[Fredrikson等人1994，Kerlero de Rosbo等人1993，1997，Chou等人1992，Ota等人1990，Burns等人，1999，Zhang等人1994，Tejada-Simon等人2001]。軸突損傷的實際過程，例如MS中的慢性炎癥、脫髓鞘和astrogliosis是復雜的，但認為白質炎癥和脫髓鞘(作用)可確定該病嚴重度，近來研究表明MS中軸突損傷始于該病早期階段并導致殘疾(De Stefano等人，2001)。
實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是最常用的MS免疫介導作用的動物模型。對豚鼠的研究顯示亞油酸部分地抑制了EAE的發生率和嚴重度(Meade等人(1978))。使用真菌或者植物來源的富含γ-亞麻酸的油脂而得到的全面保護作用可在大鼠和小鼠尊中都得到證實(Harbige等人(1995)，1997b)。這些研究證實了亞油酸和γ-亞麻酸在EAE臨床和組織病理學上的疾病緩和作用。根據劑量，γ-亞麻酸對急性大鼠EAE具有全面保護作用，而亞麻酸對臨床嚴重度有劑量依賴作用但不能取消(abolish)它。
盡管這些是實驗發現，已經認識到人類疾病，多發性硬化癥是極其復雜的，可通過T細胞和其它免疫反應因子的活性而可逆的惡化或者改善。基于只用亞油酸得到的上述結果，認為n-6脂肪酸促進自身免疫和炎癥疾病。體外飼喂小鼠γ-亞麻酸，TGF-β和PEG2的產量顯示非特異性增加；但同時有報道在急性和復發期EAE中TGF-β具有保護作用((Racke等人(1993)；Santambrogio等人(1993))，PG抑制劑如吲哚美辛，因而惡化疾病(Ovadia & Paterson(1982))。
MS的發病機制中涉及的細胞因子，許多研究顯示伴隨該病復發期致脫髓鞘性細胞因子(TNF-α，IL-1β和IFN-γ)增加。與此相反，抗炎癥和免疫抑制細胞因子轉化生長因子(TGF-β1)的水平在復發期出現降低，隨患者進入緩解期而增加。因此，在MS復發-緩解期生物活性TGF-β1與前炎性的TNF-α，IL-1β和IFN-γ之間的平衡出現失調。
在EAE的自然恢復期，分泌TGF-β的T細胞抑制EAE效應細胞TGF-β在CNS中的表達和在EAE中產生的口服-耐受-誘導保護作用，TGF-β和PEG2在腦部表達也受到抑制(Karpus和Swanborg(1991)；Khoury等人(1992))。Harbige(1998)推斷飲食中γ-亞麻酸對EAE的作用是通過涉及TGF-β的Th3樣機制以及可能通過超氧化物歧化酶的抗氧化活性調節。
建議使用，尤其是富含γ-亞麻酸和亞油酸油的琉璃苣油作為提供多發性硬化癥的免疫抑制方法(US 4,058,594)。建議劑量是每天2.4g油，沒有提供有效性的實際證據。
琉璃苣油(典型的每100％脂肪酸含量中有23％γ-亞麻酸和37％亞油酸)顯示明顯減輕伴有活躍型類風濕性關節炎的自身免疫疾病的臨床重要體癥和癥狀(Leventhal et al(1993))。琉璃苣油和真菌油(見

圖1)顯示在用于鑒別MS候選者的EAE動物模型中有效，然而從來沒有顯示對人類疾病明顯有效。含有低水平γ-亞麻酸的高水平亞油酸(EPO亞油酸∶γ-亞麻酸7∶1)可部分抑制大鼠EAE的發生率和嚴重度(Mertin和Stackpoole，1978)，然而Naudicelle研究指出上述物質可導致患者病情惡化。盡管在過去大約30年中多發性硬化癥患者使用琉璃苣油和其它含有GLA/LA的油如月見草油，但是大多數患者沒有從該病中恢復，沒有顯示明顯改善，隨著隱晦的疾病持續發展致死。
其它更引人注目的免疫抑制劑療法，包括T細胞耗竭劑和調節劑例如環磷酰胺，也顯示在EAE模型中有效，但在人類多發性硬化癥使用這些方法癥狀改善，但隱晦的疾病持續發展。人類中T細胞的確產生有益的細胞因子，例如TGF-β1，同時產生有害的細胞因子。英國神經研究所的David Baker總結了對于EAE和MS之間有效性的差異，以“都可以阻止EAE，都不可以阻止MS”(“Everything stopsEAE，nothing stops MS”)為題論文發表在2004年5月10日英國MS學會的2004英國MS前沿會議上。
很顯然，單獨的免疫抑制不能治愈MS。由于MS患者基礎性潛在代謝紊亂導致膜異常、細胞因子失調和隨后的免疫免疫攻擊和損傷，這幾乎是肯定的。盡管患者進入復發-緩解疾病的緩解期，潛在的脫髓鞘作用繼續作用。
治療MS的“金標準”仍然是干擾素，例如β-Avonex、Rebif和其它干擾素制劑。該金標準治療只能滿足部分患者的需要，例如30％，甚至在這些患者中癥狀改善限于減輕復發嚴重度。同時，在一定比率患者中癥狀減輕，由于潛在的惡化，該病易于發展成進一步的殘疾和死亡。
本發明人現令人驚訝的測定到用含有γ-亞麻酸的甘油三酯油伴有適宜的相應脂肪酸含量的順應“高劑量”療法，可實現MS幾乎所有的癥狀的顯著改善，該方法超過了金標準療法所能提供的。考慮到以前使用其它含γ-亞麻酸制劑沒有如此顯著成功，上面成功尤其讓人驚奇。
在18月的時期里，服用高劑量挑選的琉璃苣油的患者顯示在EDSS得分有顯著(p＜0.001)和明顯的改進，復發率減少，肌肉痙攣和痛感癥狀得到緩解，對認知功能的客觀測評得到改善。低劑量琉璃苣油沒有效果。
服用高劑量琉璃苣油的患者在試驗期間維持他們的外周血單核細胞(PBMC)的TGF-β1產量水平，他們的前炎性細胞因子TNF-α和IL-β1顯著和明顯(＜70％)地減少，他們既維持或者增加了PMBC膜中長鏈ω-6脂肪酸，二高-γ-亞麻酸(DHLA)和花生四烯酸(AA)，與此相反，服用安慰劑的患者在整個試驗期間顯示脂肪酸丟失。
盡管期望用免疫抑制來減少活性損傷和神經變性，本發明療法可明顯地靶向維持重要膜脂質成分，否則這些成分在MS中特異性地丟失，這表明對代謝性缺陷的糾正，否則用當前療法無法有效治療。對這個沒有任何效果低劑量(5g/天)的事實支持了該測定。
特別地，發明人測定到含有γ-亞麻酸和亞油酸在甘油三酯分子中具有特定的位置分布的甘油三酯的甘油三酯油，優選油酸，對使用多年的多發性硬化癥能提供EDSS得分的顯著降低，這個結果是目前任何施藥療法所不能達到的。
已知γ-亞麻酸(18:3n-6，GLA)在體內可迅速轉化為更長鏈的ω-6多不飽和脂肪酸二高-γ-亞麻酸和花生四烯酸(Phylactos等人1994，Harbige等人1995，2000)。因此，為在MS中提高了膜長鏈ω-6脂肪酸水平，發明人對從一些將含GLA的油脂作為已知稱作慢復發型實驗性自身免疫性腦脊髓炎(CREAE)的體內MS實驗動物模型中的GLA遞送系統得到的結果進行綜述，所述油脂為真菌的(來自毛霉菌屬爪哇根霉(Mucor javanicus))和植物的(琉璃苣(Boragoofficianalis))月見草夜來香或者黑醋栗)和合成的tri-GLA油。
實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是一種中樞神經系統(CNS)的自身免疫疾病，伴有或者不伴有脫髓鞘，可在嚙齒類和其它哺乳動物中誘導產生。然而在大鼠中誘導(用豚鼠堿性蛋白)并不產生脫髓鞘作用的組織學特征(Brosnan等人，1988)，而誘導出急性單相疾病模式，與以中樞神經系統脫髓鞘作用和在臨床上復發-緩解為特征的MS 不同。慢復發型和脫髓鞘EAE模型(CREAE)，以脫髓鞘作用和復發期為特征，因此當前選作MS研究的動物模型(Fazakerley1997)。隨著證實髓磷脂突膠質細胞糖蛋白(MOG)是MS中重要的神經抗原靶(Genain等人1999)和證實在MS中與MBP相比外周血自體激活淋巴細胞對該抗原有更強烈的反應(Kerlero de Rosbo等人1993，1997)，MOG誘導的CREAE成為具有與在MS中觀察到的更相似特征的動物模型的選擇(Fazakerely等人1997，Genain等人1999，Amor等1994)。
基于這些實驗結果，采納了兩個重要的選擇標準以用于挑選可獲得當前目標且改善的脂類化合物。從CAEAE和大鼠EAE喂養研究的證據表明濃縮的黑醋栗種子油(72％w/w 18:3n-6，GLA)對抗EAE無保護作用(見表3)。重要的是黑醋栗種子油具有低sn-2GLA含量，且大部分GLA位于sn-1和sn-3位(Lawson和Hughes 1988)。此外，有包含三個GLA的結構化三酰甘油(TG-GLA)與CREAE中使用的琉璃苣油提供的保護作用相似(表2)。這也與sn-2GLA是重要的相一致，即GLA的外對sn-1和sb-3在體內可酶去除，并可能只有sn-2GLA留下進行氧化。在體內選擇性水解來自于公知特定功能的脂肪酶，該酶能從甘油三酯分子種去除sn-1和sn-3脂肪酸，但對sn-2位有明顯的保護作用(Lawson和Hughes 1988，Kyle 1990)。
發明人對該數據的綜述也表明在MS的CREAE模型中亞油酸(LA)與γ-亞麻酸殘基的比率可能是包含LA和GLA的油的一個重要有效性特征(表1)。表I顯示了成分分析和真菌油、琉璃苣油、月見草油和紅花油在CREAE中的有效性。在減少CREAE的發生率上最有效的治療方法是含有LA∶GLA比為0.85的真菌油。含有LA∶GLA比為1.5的琉璃苣油也非常有效。此外，用在sn-1、Sn-2和sn-3含有GLA的結構化甘油三酯(TG-GLA)的實驗證實GLA是活性組分。而且低劑量水平的TG-GLA也比琉璃苣油有效(見表2)。
不同的琉璃苣種子油也在sn-2GLA例如10％sn-2GLA(Liu等人2000)和40％sn-2(Lawson和Hughes 1988)水平上顯示有變化，這與我們對sn-2GLA(范圍38-46％)未發表的觀察相一致，這可能是一些琉璃苣油不能在CREAE中產生全面保護作用的原因，盡管其它因素如抗氧化成分可能也是重要的(未發表)。有報道琉璃苣油含有高達60％的sn-2GLA(Huang和Mills(1996)γ-亞麻酸代謝和它在營養學和醫學中的作用第6章)，并特別提到GLA進入淋巴中是有效的。
EP 0520624(Efamol Holdings)的表3比較了月見草油和琉璃苣油中甘油三酯的含量，并教導在許多對GLA敏感的病癥中，前者比后者治療更有效。該文獻指出琉璃苣油具有27種不同的甘油三酯成分，其中只有20％是sn-2GLA。第3頁第40-42行特別提到的生物學測試顯示當GLA由不同油源供應時，相同量的GLA確實具有非常不同的效果。重要的是，然后它向讀者指出月見草油(EPO)中存在一特殊成分，而琉璃苣油中沒有，該成分使得前者在提高PGE1(見EP0520624第4頁圖和表2)和因此的抗炎作用具有優越作用該組分是二亞油酸-單-γ-亞麻酸-丙三醇(DLMG)，表明其占EPO中總甘油三酯的18-19％。第6頁明確教導GLA在sn-1、2或者3位上的位置對該作用并不重要。
在1994年9月14-16日生理學會Aberdeen會議的會議記錄中Dines等人(1994)報告了EP 0520624提出的含有γ-亞麻酸的油類對糖尿病性神經病神經損傷的治療研究，并再次特別提到琉璃苣油對治療這種神經變性不是非常有效，而月見草油卻有效。該論文得出的結論是琉璃苣油包含有干擾GLA活性的其它成分。
與現有技術相比，本發明人使用的選自與其它可在任意時間得到的樣品的低含量相比具有最高sn-2GLA含量(＞40％)的琉璃苣油用于試驗。由于其低sn-2GLA含量，可在任意時間以相對較大量獲得的黑醋栗油并不認為是最佳選擇，另一個選擇標準是總的長鏈單烯脂肪酸應保持低于5％。不同于不同來源的玻璃苣種子油(Borago officinalis)，其含有顯著水平的芥子酸(22:1n-9)，即占總脂肪酸的1.4-2.38％，和其它長鏈單烯脂肪酸24:1n-9(神經酸)和20:1n-9(鱈油酸)(表4)。
另外，由于維生素E對吸收、代謝和免疫作用的潛在影響(Harbige1996，2003)，試驗用油只包含天然水平的維生素E(0.05mg/g)而沒有額外添加維生素E，這是由于通常情況下使用的是市售琉璃苣種子油(如1mg/g)。
據信經過這樣選擇的油酯具有免疫抑制作用，但也明顯具有代謝補充作用，這對降低免疫攻擊造成的損傷和創造修復所必需的環境是有益的，這是以前提供用于治療MS的任何藥物所不能實現的。
本發明的第一個方面，提供用于治療需要治療的患者中神經變性疾病的方法，包括施予患者治療有效劑量的包含γ-亞麻酸和亞油酸殘基的甘油三酯油如甘油三酯，在甘油三酯sn-2位上γ-亞麻油和亞油酸殘基的比率至少為0.8；在sn-2位的γ-亞麻酸殘基的量為至少18％，其中油以足以維持或者提高患者TGF-β1水平在治療水平的劑量施予。
治療水平是指至少與健康受試者相一致的水平。優選劑量是例如在每日服藥18個月后，患者血中產生的TGF-β1/TNF-α的比率是0.4至3，至少0.5，更優選至少0.75，最優選至少1。優選劑量是例如在每日服藥18個月后，患者血中產生的TGF-β1/IL-1β的比率為至少0.5，更優選至是0.75，最優選至少1。優選所說的水平是在12個月后產生的，更優選是在6個月后產生的。
典型地，油的每日口服施用劑量是3-30克，更優選5-20克，最優選7-18克，典型地15克。
最優選的是，除了γ-亞麻酸和亞油酸脂肪酸殘基之外，所述油包含非結構化的酯化脂肪酸，即它代謝能產生能量，例如油酸殘基。殘基是指脂肪酸羧基與甘油分子中的一個羥基酯化后剩余的部分。
最優選地施予的油是來源于琉璃苣油或者真菌油例如來自爪洼根酶(Mucor javanicus)的油。
典型地琉璃苣油和真菌油組分在表1中闡述，其中18:2n-6和18:3n-6分別代表按百分數表示的亞油酸和γ-亞麻酸。典型地，琉璃苣油脂包含占油中脂肪酸殘基百分比為20-25％的γ-亞麻酸殘基和包含占油中脂肪酸殘基百分比為35-40％的亞油酸殘基。優選的琉璃苣油是在sn-2位上的酯化γ-亞麻酸的量占該位脂肪酸殘基為至少35％的琉璃苣油，更優選高于39％，仍更優選高于40％。最優選的油脂是在sn-2位上的酯化γ-亞麻酸的量占該位脂肪酸殘基高于41％的油，例如41至42％sn-2GLA，同時理想地是超過45％。如前面Hutang所述，60％sn-2GLA琉璃苣已制得，并可得到以用于選擇。sn-1和sn-3位殘基優選亞油酸、油酸和γ-亞麻酸，優選油脂在這些位置中的至少一個，或者兩個，具有相對高的油酸含量，如高于12％，更優選高于14％。
適宜用于本發明用途的典型的琉璃苣油含有的脂肪酸分布如下Sn-114％18:1(油酸的)，54％18:2n-6(亞油酸的)和4％18:3n-6(γ-亞麻酸的)Sn-214％18:1(油酸的)，42％18:2n-6(亞油酸的)和40％18:3n-6(γ-亞麻酸的)Sn-319％18:1(油酸的)，18％18:2n-6(亞油酸的)和30％18:3n-6(γ-亞麻酸的)當使用真菌油如來自毛霉菌屬的油時，γ-亞麻酸殘基的總量可能會低于琉璃苣油，只要sn-2γ-亞麻酸∶亞油酸比率為至少0.8，更優選大于1。這是因為真菌油易于含有比亞油酸殘基更多的“代謝”定向性油酸殘基。因此，優選的真菌油是在sn-2位的酯化γ-亞麻酸的量至少占該位的脂肪酸殘基的18％，更優選至少20％，最優選至少22％的真菌油。優選的真菌油含有高于45％，更優選高于50％的sn-2位的脂肪酸殘基例如油酸。
Sn-125％18:1(油酸的)，5％18:2n-6(亞油酸的)和13％18:3n-6(γ-亞麻酸的)Sn-254％18:1(油酸的)，19％18:2n-6(亞油酸的)和20％18:3n-6(γ-亞麻酸的)Sn-340％18:1(油酸的)，3％18:2n-6(亞油酸的)和20％18:3n-6(γ-亞麻酸的)本領域普通技術人員應該認識到通過測試在給定的油脂混合物中所述脂肪酸在每個位置的平均值的占多種甘油三酯的百分比來確定油酯的來源。這是本領域普通技術人員已知的，例如英國蘇格蘭Mylnefiled，Inverghowrie，Dundee DD2，5DA的Mylnefiled ResearchServices Ltd的Lipid Analysis Unit。申請人設法得到大量能夠達到上述標準的油脂，在2003年新西蘭來源的油脂樣品中發現在sn-2上最高的數值是大約46％當然這會隨著年份不同而變化。然而，重要的是給予某些對低劑量(5g/天)的琉璃苣油不起反應的患者上述油脂，想要痊愈的患者的效力可通過對比比需要的日常劑量更低的sn-2％GLA琉璃苣油的低劑量的等效性來確定。
在下面方法部分，還提供了NMR方法用于在選擇過程中分析這些油脂。然而，應該認識到在給定的標準下，所有可得到的油脂是低于35％的sn-2GLA值，如果他們低于40％或者45％，優選地合成的甘油三酯或者甘油三酯混合物給藥是可以的。大量的適宜脂質是本領域已知的，并可以是單獨使用或者與LGL、OGO、OGL、LGO或者在琉璃苣油中存在的其它已知成分的混合物混合(參見EP0520624表3)。甚至可加入TriGLA(FR 2,617,161(1988))，盡管對于本發明的目的而言，優選禁止sn-1和sn-2位GLA水平過高，因為全身GLA的過剩和因而產生的DHGLA和花生四烯酸池的溢出，導致處于過渡前炎性作用的危險。例如，在Y.-S.Huang，X.Lin，P.R.Redden and D.F.Horrobin，J Am.油脂化學學會(Oil Chem.Soc.)，72，625-631(1995)含有天然的和合成的γ-亞麻酸的三酰甘油被胰脂酶的體外水解和K.Osada，K.Takahashi，M.Hatano和M.Hosokawa，Nippon Suisan Gakkaishi.，57，119-125(1991).化學文摘，115278299富含酶合成的聚不飽和脂肪酸的甘油三酯的分子種類中教導了OGO的合成。
對于治療方案，當任意的這些高sn-2GLA油脂以高量施予時，推薦用量為潛在毒性長鏈單烯脂肪酸如芥子酸(22:1n-9)和其它長鏈單烯脂肪酸即24:1n-9(神經酸)和20:1n-9(鱈油酸)的量盡可能的低，優選脂肪酸殘基低于5％，更優選低于3％和更優選低于2％。
優選的油的另一個特征是低或者零添加的維生素E，其只能提供天然水平的維生素E(0.05mg/g)。
本發明還提供了如上所述的甘油三酯在制備治療神經變性疾病的藥物中的用途，尤其涉及潛在神經變性的中止和神經功能的恢復。特別地這些藥品是用于神經膜組分的正常化、健康的TGF-β1/TNFα比率和TGF-β1與其它細胞因子的比率的恢復、在多發性硬化癥的神經變性的中止、和部分或者全部神經功能的恢復，這些可通過例如MRI或者CAT掃描或者EDSS得分來檢測。
也提供了經過挑選的甘油三酯油，其在治療多發性硬化癥中具有特定功效，并影響細胞因子比率在體內有益的變化，打算將這些油脂作為優選用于上述方法。
本發明所使用的油脂可通過藥學上任意常規載體施予。最常規地，它們以純油脂或者與食物混合以包含這些油脂的膠囊或者以腸包衣的形式施予。隨著遞送技術發展，本領域普通技術人員可想到其它形式。
本領域普通技術人員會認識到其它有益的試劑可與油脂聯合用于本發明中。所述試劑可以是離子通道阻滯劑如鈉通道阻滯劑、干擾素、T細胞耗竭劑、激素或者其它姑息劑。還將認識到對免疫和炎癥反應進行調節，考慮到這些系統的復雜性質，這樣的聯合應當小心處理。然而，假如對本發明的油脂產生延遲反應，只要附加的治療不阻礙TGF-β1水平的正常化過程，在恢復該TGF-β1水平正常之前在治療的第一個月短效劑可能是有效的。
本發明將按照僅參照下述非限定性的表、實施例和附圖的實施例進行描述。根據這些，落入本發明范圍的另外的實施方案可被本領域技術人員想到。
表表1顯示多種甘油三酯油脂中總脂肪酸的組分％和在EAE中的保護作用表2顯示高sn-2GLA琉璃苣油試驗中三個治療組的參數表3顯示各種形式的GAL對SJL小鼠的EAE發生率和臨床得分的影響表4顯示富含黑醋栗油，高GLA含量但低sn-2GLA的植物油與真菌油和琉璃苣油在EAE中的競爭失敗表5顯示對四批試驗用琉璃苣油尤其是單烯的結果分析。
表6顯示對非試驗用油尤其是單烯的分析。
附1顯示在18個月用安慰劑和試驗用油處理的MS患者的外周血單核細胞細胞因子生成量。
圖2顯示與高劑量(15g/天)相比，安慰劑和低劑量(5g/天)高sn-2GLA琉璃苣油對人MS患者EDSS得分影響，以直方圖表示。
圖3顯示安慰劑、低劑量和高劑量高sn-2GLA琉璃苣油對人MS患者EDSS的影響，以曲線圖表示。
圖4顯示安慰劑、低劑量和高劑量高sn-2GLA琉璃苣油對人MS患者平均復發率(％)的影響，以直方圖表示。
圖5顯示安慰劑、低劑量和高劑量高sn-2GLA琉璃苣油對人MS患者平均復發率(％)的影響，以曲線圖表示。
圖6顯示油脂中一定比率的亞油酸∶γ-亞麻酸的作用相對于它們對小鼠CREAE的保護作用。
方法使用定量-13C-NMR進行琉璃苣油樣品中的γ-亞麻酸(GLA)的位置分析確定三酰基甘油中的脂肪酸組分和位置分布的分析方法通常需要用酶或者化學過程水解三酰基甘油，然后用色譜技術分析單和二酰基甘油組分。這些方法具有破壞性且不能許回收原始樣品。水解過程通常引起某些酰基遷移，導致位置分布的大量錯誤。
13C核磁共振(NMR)具有的某些性質使得其能有效地用于位置分析。首先，化學位移對分子結構敏感，因此產生頻譜，其中每個原子對應于特定頻率的峰。每種環境下原子核的分辨率決定于線寬和相鄰峰之間化學位移差異。第二，由每個原子核產生的峰下面積與所處環境中原子核數成比例的，因為所有的13C顯示出相同的吸收。因此，化學位移和每個峰的積分面積可用作每個原子核定性和定量的測量方法。第三，用于這種應用的樣品制備簡單。最后，NMR是一種非破壞性技術，它可以回收樣品以用于其它目的。13C NMR方法通常是基于對羰基碳信號束的分析。通常可觀察到兩束信號對應于sn 1，3-和2-位的酸。由于兩種環境產生大約0.4ppm的間隔，它們很容易區分開。在兩束信號中的每一束內，都必須分離出酸中每種酸或者基團的信號。當酸中具有碳-碳雙鍵(即是不飽和的)且接近于羧基例如n＝4，5或者6時，這個準則非常容易實現。具有同樣雙鍵基團的酸的羰基碳信號(例如EPA和AA)通常不會被區分開。這些方法似乎對分析含有GLA的三酰基甘油很有價值，事實已證實了這點。
參考文獻M.M.Bergan和T.W.Lee，美國油化學學會雜志(J.Am.Oil Chem.Soc).，73，551-556(1996)G.Vlahov，核磁共振化學(Magn.Reson.Chem.)，36，359-362(1998)實驗材料/樣品-制劑單酸三酰基甘油購自Sigma Chemicals和Nu-Chek-Prep Inc棕櫚精(Tri-16:0)三硬脂酸甘油酯(Tri-18:0)甘油三油酸酯 (Tri-18:1n-9)三亞麻油酸甘油酯 (Tri-18:2n-6)三γ亞麻精(Tri-18:3n-6)Trieicosenoin (Tri-20:1n-9)三芥酸精 (Tri-22:1n-9)Trinervonin (Tri-24:1n-9)整個研究中使用了約180mg的脂質的700μL氘代氯仿溶液。
13C-NMR-數據在21℃下，在于125.728MHz下運行的Jeol 500MHz波譜儀中的mm的寬頻探測器內收集帶有抑制NOE的質子去耦13C NMR數據E。選擇去耦模式并且在僅僅14.89s的探測時間內導通Waltz去耦。設置弛豫延遲為30秒和脈沖角度為90°。使用的光譜窗口為大約35ppm(173.5至172.6ppm)，并具有170ppm的偏轉。光譜內置參考為77.0ppm的CDCl3光譜。典型地，為得到足夠的信噪比，收集的大約掃描次數為300-1200次，其取決于混合物的復雜度。試驗的總探測時間為1-4h(琉璃苣油1272次掃描/4h)。數據點65,536。
結論在2-和1，3-位的GLA羰基信號可從三酰基甘油波譜中所有的羰基峰中很好的分離出來。這使得在所有情形下測定的2-GLA/1，3-GLA比率具有可信度和精確度。通過分析測試混合物來證實所述方法，該測試組合物含有包括三γ-亞麻精的8種與琉璃苣油中存在的那些具有相似比率的三酰基甘油。粗組分先前已用GLC測定。使用了兩種計算方法。第一種是自備的NMR方法，計算2-GLA百分比如下GLA的sn-2峰的積分×3×100所有sn-1，2和3的積分的總和第二種使用從NMR得到的2-GLA/1，3GLA積分與通過GLC測定的粗組分的比率如下GLA的sn-2峰的積分×得自GC分析的％GLA×3Sn-1，2和3位的GLA的總積分兩種算法得到的結果是一致的。我們認為復合NMR-GLC方法更精確，因為使用得自按最大精確度測定的每種方法的參數。GLA是琉璃苣油的主要成分，因此2-/1，3-GLA比率可用精確的NMR測定，`如結果所示。通常GLC在測定更小的脂肪酸組分上優于NMR，但不能給出位置信息。
概述表格和光譜中已給出具體的實驗數據。概述如下。膠囊D和B是與下面報道的臨床實驗中提供的相同的膠囊。
1.8-TG-測試混合物sn-2GLA實測值22.2％實際值22.6％誤差 1.8％(n)＝2
2.膠囊-D粗GLA 實測值21.4％(n＝3)GLC測得sn-2GLA實測值42.5％(n＝2)NMR測得誤差 +/-1％3膠囊-B粗GLA 實測值21.1％(n＝3)GLC測得sn-2GLA實測值40.8％(n＝2)NMR測得誤差 +/-1％在這些琉璃苣油樣品中，在sn-2位的GLA的含量是41-42％，即幾乎兩倍(1.95×)于粗組分。文獻報道顯示一種可能的典型樣品是1.8倍的粗組分。
可使用NMR方法提供在sn-2位上的GLA可靠的分析數據。事實上，由于存在的其它脂肪酸的不干擾，該方法尤其適于琉璃苣油。有趣的是，據報道從NMR方法得到的結果與從更早的衍生化-色譜法得到的數據是一致的。我們先前從那些舊方法得到的估計(40％)也與NMR結果一致。
治療實施例28個活性復發緩解型(在此前18個月中兩人復發)多發性硬化癥患者(年齡18至65歲)參加一項18個月的雙盲安慰劑對照實驗以研究膠囊化琉璃苣油對臨床活性和實驗室參數的影響。所用油具有高Sn-2γ-亞麻酸(GLA)含量(GLA在Sn-2位置上＞40％)和低單烯含量(例如芥子酸)，并且不含有添加的公知免疫調節劑維生素E。
患者從兩家市內醫院的神經科門診患者中招募；在第一次(基線)就診即可得到醫院知情同意書。排除標準包括任何形式的類固醇或者免疫抑制藥物治療、懷孕、高脂血癥、在此前三個月內固定使用阿司匹林或者相關藥物和補充維生素或者脂肪酸。
實驗僅包括符合所有下列標準患者(a)能夠在治療前提供知情同意書，并充分了解在不帶有偏見下可隨時退出；(b)包含門診患者年齡18至60歲的男性或女性；(c)已確診為臨床定義的復發型MS；(d)在過去兩年中至少有三次可證明的臨床復發；(e)如果他們證明是惡化的，應具有包括0.0-5.5的基線值擴大殘疾等級評分(EDSS)得分括；(f)通過病史、體檢和臨床化學、尿和血液學檢驗證實除MS相關癥狀外是健康的。
患者由藥學部門隨機分配至三組中的一組，每組有12個患者。
·第一臨床組(n＝12)服用安慰劑(5g的聚乙二醇400)·第二臨床組(n＝12)服用低劑量(5g)精制琉璃苣·第三臨床組(n＝12)服用高劑量(15g)精制琉璃苣在18個月期間中，以每天1克油膠囊(5/天為低劑量，15/天為高劑量)的形式給藥。琉璃苣油和ω-6多不飽和脂肪酸為一般公認安全(GRAS)的用于人類消費的食品成分。EC條例沒有分類和標記要求。臨床評估包括擴大殘疾等級評分(EDSS)和臨床復發記錄。在給藥第1、3、6、12、15和18月取靜脈血(50mls)用于實驗室研究。
在每次就診時研究下列生化和免疫參數，并與治療前數據和組間比較。
·受激的和不受激的體外外周血液單核細胞細胞細胞因子產量TGF-β1、IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6和IFN-β，它們涉及MS的發病機制。細胞因子和相關基因表達。
·血清中可溶性黏附分子，尤其是ICAM-1和VCAM-1·外周血液單核細胞膜脂肪酸和血漿磷脂脂肪酸組合物。
結果列于表1、2和圖1-5。
初級產出準則參數是基線(第0月)與治療結束(第18月)之間的臨床復發次數。次級產出準則參數包括第一次臨床復發的時間；用EDSS得分和使用類固醇治療來評估的復發嚴重度；與基線水平相比，第3、6、9、12和18個月的EDSS改變了，并以持續3個月EDSS增加至少1.0個點或者持續3個月比基線EDSS增加至少1.5個點來的定義。由于本試驗沒有接受外部資助，出于財政原因，不可能用磁共振成像來評估MS疾病的活性。
安慰劑組有11個患者，7名患者服用低劑量琉璃苣油，10名患者服用高劑量琉璃苣油。該研究藥物是耐受性良好的，在18個月試驗期沒有發生嚴重不良反應事件。
結果兩名患者患有發展性腹瀉(developed diarrhoea)，后來它們兩人均確認服用高劑量琉璃苣油。一個患者的腹瀉較輕，但是另一個患者是中度嚴重，后來他中止了服用研究藥物。代碼沒有公開，中止藥物后腹瀉停止，再次給藥后再發。因此，該患者退出試驗。用高劑量琉璃苣油處理的剩余患者在所有初級和次級產出準則上顯示出良好的臨床改善。例如，6個月治療后，他們的平均EDSS得分比基線EDSS(圖1)提高了。更重要的是，6個月的治療后，與安慰劑組復發次數(圖2)相比，臨床復發的平均次數顯著下降。相反，與安慰劑組相比，服用低劑量琉璃苣油的患者沒有顯示任何臨床改善。除了對MS疾病活性的有益作用，高劑量琉璃苣油可提供某些肌肉痙攣(僵硬)和痛感癥狀的癥狀緩解，并改善了認知功能。
從下面圖中可看出，在高劑量組9、12和18個月后的復發率下降至0。在第15個月可見的增加是由于一名患者退出該組。
下述為三個簡要的病史，用以闡述高劑量的高sn-2GLA琉璃苣油的治療益處。前兩位來自于本試驗，第三位是一名試驗后的患者，因為可以得到他的MRI研究。
患者1(治療)第一個患者是一位患有臨床活躍性復發緩解型MS 9年的48歲婦女。本來她有份當地衛生部門一名全職管理人員的工作，但由于她的嚴重的MS，她不能履行她的職責。因此，后來她成為兼職秘書，但由于肌肉僵直和感覺障礙她仍然活動困難。她也經歷了平均9個月復發一次的嚴重臨床復發。大多數這些復發導致其住院接受類固醇治療。考慮到她的活躍性MS，她被招募參加琉璃苣油試驗。沒有與研究相關的不良反應，服用藥物四個月后，她體驗到在行走和感覺癥狀上的相良好改善。
治療大約九個月后，她恢復健康至能夠開始全職工作。此外，在18個月的臨床試驗期間沒有復發。在得出試驗結論之后，治療代代碼顯示她服用高劑量琉璃苣油。
患者2(對照)
第二個患者是一位也患有臨床活躍性復發緩解型MS 8年的46歲的婦女。本來她有份店員的工作，但診斷患MS就失業了。
她的癥狀包括雙腿的活動困難和痛感癥狀。在本臨床試驗之前的兩年里，她經歷了三次臨床復發，兩次住院進行類固醇治療。因此，她被招募進琉璃苣油試驗，但她的行走持續惡化。在試驗的六個月中，她需要使用拐杖，也使用巴氯酚來治療以減輕下肢痙攣狀態。大約開始琉璃苣油試驗十個月后，由于嚴重的臨床復發，她住院接受類固醇治療。后來她發展為膀胱紊亂癥，并開始使用輪椅用于長途旅程。當18個月的試驗得出結論之后，公開了治療代碼，發現她服用的是安慰劑。從那時起，她開始使用行走支架用于超過50碼的路程。
患者3治療(附加試驗)第三個病例是一位在2001年四月確診患有MS的26歲男性，。他的癥狀始于1999年，當時他訴說影響身體多個部位的彌漫性、頑固性疼痛，尤其是左側胸腹部。接著手和腳出現周期性麻木，同時伴有波動性虛弱。他也有以尿頻和尿急形式出現的令人苦惱的膀胱癥狀。2001年對MS的診斷是基于他的復發緩解癥狀，并通過陽性腦脊液分析和腦部磁共振成像(MRI)顯示兩側大腦半球有多重白質異常來確診。該癥狀多種藥物治療沒有反應。
2003年4月，開始口服給藥本發明的高劑量琉璃苣油。患者報道在開始這種口服給藥的三個月內他的癥狀有了引人注目的改善。他的痛感癥狀完全消失。他報道從2003年5月沒有出現麻木和虛弱，并注意到他的排尿控制有顯著改善。口服給藥沒有產生任何不良反應。復查腦部MRI以證實N先生所報道的癥狀改善。復查MRI顯示異常白質的大小和分布減少。
表1多種油脂的組成特征(％總脂肪酸)和它們在EAE中的保護作用
FGO，真菌油；BOO，琉璃苣油；EPO，月見草油，SAF，紅光油。
表2處理組-琉璃苣油-MS試驗
表3在由MOG誘導的CREAE型SJL小鼠中三酰基甘油-GLA(TG-GLA)、GLA乙酯(EE-GLA)和琉璃苣油-GLA(BOR-GLA)的分子種類比較
a給予動物100μl測試脂質體；給予動物b250μl BOR-GLA。與對照組比較的顯著性差異cp＜0.05
表4濃縮的黑醋栗種子油(73％GLA)對EAE發生率的影響
注釋黑醋栗油延遲了發生率，但是沒有提供完全保護。動物在免疫后飼喂7天。
表5試驗用琉璃苣油的分析報告(％總脂肪酸)
表6.非試驗用琉璃苣油的分析(％總脂肪酸)
權利要求
1.用于治療需要治療的患者中神經變性疾病方法，包括施予患者治療有效量的包含γ-亞麻酸和亞油酸殘基的甘油三酯油如甘油三酯，在甘油三酯sn-2位上γ-亞麻油和亞油酸殘基比率至少為0.8；在該sn-2位上γ-亞麻酸殘基的量為至少18％，其中所述的油以足夠維持或者提高患者TGF-β1水平在治療水平的劑量施予。
2.如權利要求1所述的方法，其中治療水平為例如在18個月的每日給藥后，在患者血液中產生TGF-β1/TNF-α的比率為至少0.5。
3.如權利要求2所述的方法，其中比率為至少0.75。
4.如權利要求2所述的方法，其中比率為至少1。
5.如權利要求1所述的方法，其中油的施用量為每天3至30克。
6.如權利要求1所述的方法，其中油是口服給藥。
7.如權利要求1所述的方法，其中劑量為足夠給予除去油中其它γ-亞麻酸含量外至少1克γ-亞麻酸殘基，如在sn-2位的殘基。
8.如前述任一項權利要求所述的方法，其中油的劑量中在sn-2位的γ-亞麻酸的量足夠給予至少2克所述的sn-2γ-亞麻酸。
9.如前述任一項權利要求所述的方法，其中劑量是8至20克。
10.如前述任一項權利要求所述的方法，其中除了γ-亞麻酸和亞油酸殘基之外，甘油三酯中包含非結構酯化脂肪酸。
11.如權利要求10所述的方法，其中甘油三酯包含油酸殘基。
12.如權利要求1所述的方法，其中油得自選自包括毛霉菌屬和琉璃苣菌屬的真菌或者植物或者。
13.如權利要求12所述的方法，其中真菌或者植物選自爪洼根霉和琉璃苣。
14.如權利要求1所述的方法，其中油是在sn-2位的酯化γ-亞麻酸占在該位的脂肪酸殘基的的百分比為至少35％的琉璃苣油。
15.如權利要求14所述的方法，其中在sn-2位的酯化γ-亞麻酸占在該位的脂肪酸殘基的百分比為至少39％。
16.如權利要求14所述的方法，其中在sn-2位的酯化γ-亞麻酸占在該位的脂肪酸殘基的百分比為至少45％。
17.如前述任一項權利要求所述的方法，其中在sn-1和sn-3位的脂肪酸殘基包括亞油酸、油酸和γ-亞麻酸殘基。
18.如前述任一項權利要求所述的方法，其中甘油三酯含有含量超過12％的在sn-1和sn-3位的一個或者兩個位上的油酸。
19.如前述任一項權利要求所述的方法，其中油是毛霉油，并且在sn-2位的酯化γ-亞麻酸占該位上脂肪酸殘基的百分比為至少20％。
20.如權利要求19所述的方法，其中甘油三酯油含有超過45％的sn-2脂肪酸殘基，如油酸殘基。
21.如權利要求19所述的方法，其中甘油三酯油含有超過50％的sn-2脂肪酸殘基，如油酸殘基。
22.如前述任一項權利要求所述的方法，其中甘油三酯油含有占總脂肪酸殘基的％不超過5％的單烯脂肪酸殘基。
23.如權利要求22所述的方法，其中甘油三酯油包含占總脂肪酸殘基百分比不超過5％的芥酸(22∶1n-9)，24∶1n-9(神經酸)和20∶1n-9(鱈油酸)。
24.如權利要求22或者23所述的方法，其中所述的酸的含量為油中脂肪酸殘基的1％至5％。
25.如前述任一項權利要求所述的方法，其中油中不含有添加的維生素E。
26.如前述任一項權利要求所述的方法，其中油中添加維生素E的含量為0至0.1mg/g。
27.如前述任一項權利要求所述的方法，其中神經變性疾病休止性的或者神經功能恢復性的。
28.如前述任一項權利要求所述的方法，其中治療是針對多發性硬化癥或者由頭部創傷、中風和顱內出血引起的退化性后遺癥。
29.如權利要求28所述的方法，其中治療修復損傷。
30.如權利要求1或者28所述的方法，其中治療使用足以減輕肌肉痙攣和/或疼痛的劑量。
31.如權利要求1或者28所述的方法，其中劑量足以改善認知功能。
32.如權利要求1或者28所述的方法，其中劑量足以減少復發。
33.如權利要求1或者28所述的方法，其中劑量為在1年的治療期后足以提高患者EDSS得分至少1單位。
34.如權利要求1或者28所述的方法，其中劑量為在1年的治療期后足以恢復患者的EDSS從高于2.5的EDSS降至低于2。
35.如權利要求1至34任一項權利要求所述的油在制備治療神經變性疾病的藥物中的用途。
36.用于治療神經變性疾病的組合物，包含如權利要求14至26中任一項所述的琉璃苣菌屬或者毛霉菌屬的甘油三酯油。
全文摘要
提供用于治療需要治療的患者中神經變性疾病的方法，包括施予患者治療有效量的包含γ－亞麻酸和亞油酸殘基的甘油三酯油如甘油三酯，在甘油三酯sn－2位上γ－亞麻油和亞油酸殘基比率為至少0.8；在sn－2位上γ－亞麻酸殘基的量為至少18％，其中油以足夠維持或者提高患者中TGF－β1水平在治療水平的劑量施予。優選地，所述方法是在18個月每日給藥后，其治療水平是例如在患者血液中生成TGF－β1/INF－α的比率為至少0.5。優選的油脂是在sn－2位脂肪酸殘基如γ－亞麻酸至少為35％的琉璃苣油或者毛霉菌油。
文檔編號A61K36/00GK1901898SQ200480012982
公開日2007年1月24日 申請日期2004年5月14日 優先權日2003年5月14日
發明者L·S·哈比格, M·J·利奇, M·夏里 申請人:英國技術集團國際有限公司