在細胞中誘導骨形態發生蛋白(BMPs)和轉化生長因子－β蛋白(TGF－βs)表達的方法

專利名稱：在細胞中誘導骨形態發生蛋白(BMPs)和轉化生長因子－β蛋白(TGF－βs)表達的方法
技術領域：
本發明的領域總的涉及用遺傳物質轉染細胞的方法。更具體說，本發明的領域涉及用編碼LIM礦化蛋白(LIM)的核酸轉染細胞，誘導一種或多種骨形態發生蛋白(BMPs)和/或轉化生長因子-β蛋白(TGF-βs)的表達。
背景技術：
成骨細胞被認為是從多能間充質干細胞分化而來。成骨細胞的成熟導致分泌可以礦化和形成骨的細胞外基質。這個復雜過程的調節并不完全了解，但認為，它涉及一組稱為骨形態發生蛋白(BMPs)的信號轉導糖蛋白質。這些蛋白已經顯示出與胚胎背腹模式的形成、肢體芽發生和成年動物的骨折修復相關(B.L.Hogen，Genes &Develop.，10，1580，(1996))。該組轉化生長因子-β超家族分泌蛋白在分化不同階段的各種細胞類型中具有廣譜活性；而這些緊密相關的分子之間生理活性的差異還不清楚(D.M.Kingsley，Trends Genet.，10，16(1994))。
已經有人研究了BMP-6、BMP-2和BMP-4對誘導大鼠顱骨成骨細胞分化的作用(Boden等，Tndocrinology，137，3401(1996))。在需要BMP或糖皮質激素以啟動分化的胎鼠顱骨培養物中，糖皮質激素提供BMP-6的mRNA和蛋白表達誘導能力增加十倍，它們促進了成骨細胞的分化(Boden等，Endocrinology，138，2920(1997))。
已經在體內研究了TTPs的骨形成刺激作用。盡管用BTPs和其他細胞外信號傳遞分子獲得了早期的成功，然而它們的使用存在缺陷。例如，需要較大劑量純化的BTPs以增加新生骨的生成，因此增加了這種治療方法的費用。另外，諸如BMP細胞外蛋白當引入宿主動物中后易受降解。
細胞內信號傳遞或調節分子可能在誘導骨形成通路中起作用。一類細胞內調節分子是LIM蛋白，它有一個特征性的結構基序，稱為LIM結構域。LIM結構域是富含半胱氨酸的結構基序，由雙-氨基酸間隔臂連接的兩個特殊鋅指組成。一些蛋白只有LIM結構域，而其他蛋白包含各種其它功能結構域。LIM蛋白形成多種分子的組別，包括轉錄因子和細胞骨架蛋白。LIM結構域的主要作用看來是通過與相同或不同的LIM結構域形成二聚物，或通過結合不同的蛋白，來介導蛋白的相互作用。
在LIM同源結構域蛋白(同時具有LIM結構域和同源結構域序列的蛋白)中，LIM結構域用作負調節元件。LIM同源結構域蛋白參與細胞譜系的決定和分化調節的控制，雖然僅僅LIM蛋白可能具有相似的作用。僅僅LIM蛋白也涉及細胞增值的控制，因為編碼這類蛋白的幾個基因與致癌性染色體的易位相關。
人和其他哺乳動物種類易患需要骨修復和/或再生過程的疾病或損傷。例如，骨折的治療將為新的治療方案所改進，這種治療方案可以刺激自然的骨修復機制，從而減少骨折痊愈所需的時間。患系統性骨質疾病，如骨質疏松癥的個體，可得益于能產生系統性新骨組織形成的治療方案。這類治療方案可以降低因骨質損失所致骨折的發生率，這正是該疾病的特征。
利用細胞內信號傳遞分子誘導新骨形成的治療方案是理想的。基因治療技術使得在成骨前體細胞(參與骨形成的細胞)或外周血白細胞內，引入編碼介導骨形成的細胞內信號傳遞分子的核苷酸片段成為可能。基因治療提供了很多潛在優點(1)降低了與產生靶治療蛋白相關的成本；(2)與細胞外治療方案相比療效更高，因為它能夠使細胞內信號更長時間表達；(3)對靶細胞的影響不因可用于與治療蛋白相互作用的受體數量有限而受到限制；(4)可將轉染的成骨祖細胞直接輸送至需要局部性骨形成的部位；和(5)該療法可以全身性應用，誘導系統性骨形成并提供對骨質疏松癥和其他代謝性骨疾病的治療方式。
人和其他哺乳動物都會患椎間盤退變，伴有下背疼痛、椎間盤突出和脊柱狹窄。椎間盤退變伴有進行性蛋白聚糖基質損失，這可引起椎間盤更易受生物性機械傷害和退變。因此，需要有一種刺激合適細胞合成蛋白聚糖和/或膠原蛋白的方法，合適的細胞如髓核細胞、纖維環細胞和椎間盤細胞。
發明概要本發明一方面提供了一種在細胞中誘導一種或多種骨形態發生蛋白或轉化生長因子-β蛋白(TGF-βs)表達的方法。該方法包括用含有操作性連接于一啟動子的編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列的分離核酸轉染細胞上。可根據根據本發明的方法誘導一種或多種選自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-β1或它們組合的蛋白質表達。本發明此方面所述的分離核酸可以是能在標準條件下與序列表中第25號序列全長的互補核酸分子雜交的核酸；和/或可在高度嚴謹條件下與序列表中第26號序列全長的互補核酸分子雜交的核酸分子。所述細胞可以是任何體細胞，包括但不限于，暗黃層(buffy coat)細胞、干細胞和椎間盤細胞。
本發明第二方面提供了一種能夠過度表達一種或多種骨形態發生蛋白或轉化生長因子-β(TGF-βs)蛋白的細胞。該細胞可以是能過度表達一種或多種選自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-β1或它們組合的蛋白質的細胞。該細胞可以是暗黃層細胞、椎間盤細胞、間充質干細胞或多能干細胞。也提供了一種包含上述細胞和運載體材料的植入物。本發明也提供在哺乳動物中引入上述細胞或植入物，誘導哺乳動物骨形成的方法；和在哺乳動物的椎間盤中引入上述細胞，治療哺乳動物椎間盤疾病的方法。
本發明的其他優點和新穎特征將在下面的描述中作部分說明，本領域技術人員通過查視下面內容或者通過實施本發明而學習，將更加明白本發明的優點和新穎特征。
附圖簡要說明

圖1說明在轉染了所示感染復數(MOIs)的大鼠椎間盤細胞中，HLMP-1表達后硫酸化葡糖胺多糖(sGAG)的產生；圖2顯示感染了不同MOI的AdHLMP-1后6天，大鼠椎間盤細胞的劑量反應；圖3顯示轉染250個MOI病毒顆粒/細胞6天后，AdHLMP-1轉染的大鼠椎間盤細胞表達的聚集蛋白聚糖和BMP-2的mRNA；圖4A顯示感染不同MOIs的Ad-hLMP-1后12小時，HLMP-1的mRNA表達；圖4B顯示感染后3至6天，培養基中sGAG的產量；圖5顯示sGAG的產生隨時間的變化；圖6A顯示在大鼠纖維環細胞中聚集蛋白聚糖基因表達對LMP-1過度表達的反應；圖6B顯示在大鼠纖維環細胞中BMP-2基因表達對LMP-1過度表達的反應；圖7顯示在以25個AdLMP-1MOI感染后的大鼠纖維環細胞中HLMP-1的mRNA水平與時間的關系；圖8顯示對于HLMP-1過度表達，BMPs和聚集蛋白聚糖的mRNA水平變化；圖9顯示對于HLMP-1過度表達的反應中，sGAG的產生增加與時間的關系；圖10顯示在LMP-1介導sGAG產生的增加受到成頭蛋白(noggin)的阻斷；圖11顯示單層培養6天后，LMP-1對培養基中sGAG的影響；圖12A-12D是A549細胞中，免疫組化染色LMP-1蛋白的顯微照片；圖13A-13F是A549細胞感染AdLMP-1(上排)或Adβgal(下排)48小時后，免疫組化染色的顯微照片；圖14A-14D是A549細胞感染AdLMP-1(上排)或Adβgal(下排)48小時后，免疫組化染色的顯微照片；圖15A-15D是免疫組化染色人暗黃層細胞中的白細胞表面標記CD45的顯微照片，該細胞感染了AdLMP-1(上排)或Adβgal(下排)，先與膠原基質皮下植入到無胸腺大鼠胸部，3天(圖15A和15C)或5天(圖15B和15D)后切下用于此測定。
圖16A-16D是免疫組化染色人暗黃層細胞中BMP-4的顯微照片，該細胞感染了AdLMP-1(上排)或Adβgal(下排)，先與膠原基質皮下植入到無胸腺大鼠胸部，3天(圖16A和16C)或5天(圖16B和16D)后切下用于此測定。
圖17A-17D是免疫組化染色人暗黃層細胞中BMP-7的顯微照片，該細胞感染了AdLMP-1(上排)或Adβgal(下排)，先與膠原基質皮下植入到無胸腺大鼠胸部，3天(圖17A和17C)或5天(圖17B和17D)后切下用于此測定。
圖18是免疫組化染色人暗黃層細胞中BMP-7的高倍放大的顯微照片，該細胞感染了AdLMP-1，先與膠原基質皮下植入到無胸腺大鼠胸部，14天后切下用于此測定。
圖19A-19D是人暗黃層細胞的顯微照片，該細胞感染了AdLMP-1(上排)或Adβgal(下排)，先與膠原基質皮下植入到無胸腺大鼠胸部，1天(圖19A和19C)或3天(圖19B和19D)后切下用于此測定。
圖20A和20B是人暗黃層細胞的高倍放大的顯微照片，該細胞感染了AdLMP-1或Adβgal，先與膠原基質皮下植入到無胸腺大鼠胸部，1天后切下用于此測定。
圖21A-21J是人暗黃層細胞的顯微照片，該細胞感染了AdLMP-1(上排-圖21A-21E)或Adβgal(下排-圖21F-21J)，與膠原基質皮下植入到無胸腺大鼠胸部后，在不同時間點切下用于此測定。
圖22A-22C是人暗黃層細胞的高倍放大的顯微照片，該細胞感染了AdLMP-1，與膠原基質皮下植入到無胸腺大鼠胸部后，在不同時間點切下用于此測定。
優選實施例詳述LMP-1是一種新穎的LIM結構域蛋白，與早期成骨細胞分化相關。LMP-1轉錄物首先在軟骨原基中心出現成骨細胞之前、胚胎長骨發育時鄰近肥大軟骨細胞的間充質細胞中檢測到(參見Boden等，“LIM-1，一種LIM結構域蛋白，介導BMP-6對骨形成的作用”，Endocrinology，139，5125-5134(1998))。LMP-1蛋白是LIM結構域蛋白異質性家族的一員，該家族許多成員與各種細胞類型的生長分化相關。然而，LIM結構域蛋白作用的精確機制鮮為人知。參見Kong等，“肌肉LIM蛋白通過提高MyoD的活性促進肌生成”，Mol.Cell.Biol.，17，4750-4760(1997)；Sadler等，“斑聯蛋白和雙重LIM結構域富含半胱氨酸蛋白質(CCRP)兩種相互作用的、與細胞骨架相關的LIM結構域蛋白”，J.Cell Biol.，119，1573-1587(1992)；Salgia等，“人樁蛋白，即一種被P210(BCCR/ABL)磷酸化的粘著斑蛋白的分子克隆”，J.Biol.Chem.，270，5039-5047(1995)；和Way等，“Mec-3，一種含有同源框的基因，在線蟲中調節觸覺感受器神經元分化”，細胞，54，5-16(1988)。
雖然LMP-1是一種LIM結構域蛋白，但是最近有研究顯示，對于成骨細胞分化，LIM結構域自身并不是必需的(參見Liu等，“過度表達的LIM礦化蛋白并不需要LIM結構域來誘導骨形成”，骨礦化研究雜志，17，406-414(2002))。LMP-1被認為是一種有效的細胞內信號傳遞分子，能以極低劑量誘導體外成骨細胞分化和體內從頭骨形成(Boden等，Endocrinology，139，5125-5134(1998))。
兩個獨立實驗系統的結果表明，LMP-1能誘導幾種BMP的表達。早至體外插入LMP-1cDNA 48小時后、或體內72小時后，就可以檢測到BMP-4和BMP-7。體內研究顯示，大部分植入的表達LMP-1的暗黃層細胞在體內存活小于一周，但證據顯示，流出的宿主細胞可分化為成骨細胞。結果也表明LMP-1誘導的膜狀骨形成沒有清晰的軟骨界面，是許多BMP常見的。
發明人也證明了用AdLMP-1處理的細胞在體外產生LMP-1、BMP-2和較少量的BMP-6和TGF-β1蛋白。BMP-4和BMP-7是受LMP-1誘導的其它分泌性成骨誘導因子。發明人進行的反義寡核苷酸實驗表明BMP-4和BMP-7是LMP-1對其他細胞發揮其成骨誘導作用所必需的。
下述A549實驗顯示腺病毒本身不誘導BMPs，未處理的細胞也不表達BMPs。這些實驗也顯示LMP-1并不誘導兩種與成骨細胞分化不相關的蛋白質(如II型膠原蛋白和MyoD)。
選擇A549肺癌細胞是因為A549細胞不像成骨細胞，它沒有BMP的基礎表達。
采用普通靜脈血的暗黃層細胞作離體基因治療的用法是相當新的方法。參見Viggeswarapu等，“腺病毒輸送LIM礦化蛋白-1在體內和體外誘導新骨形成”，J.Bone Joint Surg.Am.，83-A，364-376(2001)。為確定轉染了LMP-1cDNA的暗黃層細胞能存活多長時間和增加BMPs的合成、分泌和活性，使用CD-45抗原(參見Kurtin等，“白細胞常見抗原-在石蠟切片中用單克隆抗體診斷性鑒別造血性和非造血性腫瘤免疫研究和超微結構定位的相關性”，Hum.Pathol.，16，353-365(1985)；和Pulido等，“對四種不同CD45抗原特異性的比較性生化和組織分布研究”，J.Immunol.，140，3851-3857(1988))。能與抗CD-45一抗特異性反應的細胞數量進行性減少，至植入后10天達到最少。抗CD-45染色的消失、7天后植入物中心的細胞消失和骨形成的向心模式都提示，包括那些表達LMP-1細胞在內的植入細胞并不能長時間存活，提示LMP表達細胞可能通過誘導分泌因子間接參與骨形成過程，這些分泌因子會吸引宿主祖細胞并調節其分化成為成熟的成骨細胞。有證據顯示，LMP-1啟動了一組級聯反應，包括幾種成骨誘導蛋白(BMPs)的分泌。因此LMP-1是一種理想的治療性候選物，因為LMP-1可以產生顯著作用，而不會在體內很多細胞中長時間持續表達。
發明人已證明通過離體基因轉移將LMP-1cDNA轉移給易位植入的外周血暗黃層細胞可進行骨誘導。因此，本發明涉及用編碼LIM礦化蛋白的核酸轉染非骨細胞。發明人已發現，用編碼LIM礦化蛋白的核酸轉染非骨細胞，如椎間盤細胞，可導致蛋白聚糖、膠原蛋白和其他椎間盤組分和組織的合成增加。因此，本發明提供了一種治療與蛋白聚糖、膠原蛋白或其他椎間盤組分喪失相關的椎間盤疾病的方法。
發明人先前從激活的大鼠顱骨成骨細胞培養物中分離得到了LIM礦化蛋白(LMP)(10-4/RLMP)的cDNA序列(序列表，第1、2號序列)(美國專利6,300,127)。該基因已被克隆、測序和測試了其體外增加骨礦化效果的能力。已發現該蛋白(RLMP)能影響骨基質礦化和使細胞分化成為成骨細胞系。與其他已知細胞因子，如骨礦化蛋白(BMPs)不同，RLMP不是分泌蛋白，但它是一種細胞內信號傳遞分子。因此，少量蛋白就可導致細胞內信號放大，體內應用特異性更好。合適的臨床應用包括增強骨折、骨缺損、骨移植的骨修復，和骨質疏松病人骨質的正常體內動態平衡。
其對應于人體蛋白的氨基酸序列，稱為人LMP-1(“HLMP1”)，也已被克隆、測序和推倒(美國專利6,300,127)。此種人蛋白在體外和體內都顯示提高的骨礦化效果。
發明人也分析了HLMP-1的截斷(短)形式-稱為HLMP-1s-的特征(參見美國專利6,300,127)。該蛋白是一種可產生終止密碼子從而產生截斷蛋白的點突變的產物。當HLMP-1s在細胞培養中或體內表達時，它具有完全的功能。
用PCR分析了人心臟的cDNA文庫，鑒定出兩種交替剪接變體(HLMP-2和HLMP-3)(提交于2000年4月28日的美國專利申請09/959,578)。這些蛋白質的核苷酸序列與HLMP-1不同在于HLMP-1序列的325-444堿基對區域。在這個區域，HLMP-2序列有119個堿基對缺失和17個堿基對插入。與HLMP-1相比，編碼HLMP-3的核苷酸序列沒有缺失，但有和HLMP-2相同的17個堿基對插入，這些堿基對插入在與HLMP-1序列的第444個堿基對相對應的位置。
LMP能調節或影響許多生物學過程，所以預計LMP的不同剪接變體在哺乳動物體內具有不同的生物學功能，如各種組織的生長、分化和/或再生。例如，一些形式的LMP不僅在骨中表達，也在肌肉、腱、韌帶、脊椎、外周神經和軟骨中表達。
本發明提供了在哺乳動物中刺激蛋白聚糖或膠原蛋白或兩者合成的方法，該方法通過提供包含操作性連接于一啟動子的編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列的分離核酸；將該分離核酸序列轉染入能夠產生蛋白聚糖的哺乳動物細胞中；并表達編碼LIM礦化蛋白的核酸序列，從而刺激蛋白聚糖的合成。哺乳動物細胞可以是非骨細胞，如椎間盤細胞、纖維環細胞或髓核細胞。轉染可以通過直接注射病毒或裸DNA，如質粒，在離體或體內進行。在特定實施例中，病毒是重組腺病毒，優選AdHLMP-1。
本發明的另一實施例是一種非骨哺乳動物細胞，它包含編碼LIM礦化蛋白的分離核酸序列。該非骨哺乳動物細胞可以是干細胞(如多能干細胞或間充質干細胞)或椎間盤細胞，優選髓核細胞或纖維環細胞。
在一個不同方面，本發明涉及在非骨哺乳動物細胞中表達編碼LIM礦化蛋白的分離核苷酸序列的方法，該方法包括提供包含操作性連接于一啟動子的編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列的分離核酸；將該分離核酸序列轉染入能夠產生蛋白聚糖的哺乳動物細胞中；并表達所述編碼LIM礦化蛋白的核酸序列。該非骨哺乳動物細胞可以是干細胞或椎間盤細胞(如髓核或纖維環細胞)。轉染可以通過直接注射病毒或裸DNA，如質粒，在離體或體內進行。該病毒可以是重組腺病毒，優選AdHLMP-1。
在另一實施例中，本發明涉及通過逆轉、延遲或減慢椎間盤退變治療椎間盤疾病的方法，該方法提供包含操作性連接于一啟動子的編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列的分離核酸；將該分離核酸序列轉染入能夠產生蛋白聚糖的哺乳動物細胞中；并通過度表達編碼LIM礦化蛋白的核酸序列刺激蛋白聚糖的合成，從而逆轉或抑制椎間盤退變。椎間盤疾病可引起下背疼痛、椎間盤突出或脊柱狹窄，此方法可以緩解這些癥狀。哺乳動物細胞可以是非骨細胞，如干細胞或椎間盤細胞(如纖維環細胞或髓核細胞)。
轉染可以通過直接注射病毒或裸DNA，如質粒，在離體或體內進行。在特定的實施例中，該病毒可以是重組腺病毒，優選AdHLMP-1。
本發明涉及新穎的哺乳動物LIM蛋白，本文稱為LIM礦化蛋白或LMPs。本發明更具體地涉及人LMP，稱為HLMP或HLMP-1，或人LMP的交替剪接變體，稱為HLMP-2或HLMP-3。發明人已經發現這些蛋白能增強體外生長的哺乳動物細胞的骨礦化。當LMP在哺乳動物中產生時，它也能誘導體內骨形成。
離體用編碼LIM礦化蛋白(如LMP或HLMP)的核酸轉染骨髓細胞、成骨前體細胞、外周血細胞和干細胞(如多能干細胞或間充質干細胞)，然后將轉染細胞再植入供體動物或人中，這種方法適合于治療各種骨相關病患或損傷。例如，可以用此方法促進長骨骨折的修復、在節段性缺損中產生骨質，為骨折提供骨移植代替物，促進骨體重建或脊柱融合，并為脆弱或骨質疏松骨頭提供局部治療(通過注射)，如臀骨、椎骨或腕骨骨質疏松的治療。轉染編碼LMP或HLMP的核酸也可用于在皮內注射轉染骨髓細胞以加速骨折長骨的修復；治療長骨骨折的延遲愈合或不愈合或脊柱融合的假性關節；和在臀部或膝蓋的無血管壞死中的誘導新骨形成。
除了基因治療的離體方法之外，轉染包含編碼LMP或HLMP核酸序列的重組DNA載體可在體內完成。當將編碼LMP或HLMP的DNA片段插入合適的病毒載體，如腺病毒載體中時，可將該病毒構件直接注射到需要軟骨內骨形成的部位。通過用直接、皮內注射以引入LMP或HLMP序列，而完成對骨形成的刺激，無需為獲得骨髓細胞(為了離體轉染)或將它們重植入病人需要新骨的部位的外科干預。Alden等(Neurosurgical Focus(1998))已經證明可用直接注射克隆腺病毒載體中的BMP-2cDNA方法作基因治療。
也可將含有編碼HLMP核酸序列的，裸露或未包裹的重組質粒直接注射入合適的機體部位進行體內基因治療。在本發明的這個實施例中，轉染發生在裸質粒DNA被靶細胞攝入或內化時。用病毒構件物作體內基因治療時，直接注射裸DNA的優點是，只需很少或不需外科干預。Baumgartner已經在病人身上成功證明了使用編碼內皮細胞有絲分裂原VEGF(血管內皮生長因子)的裸DNA可實現直接基因治療(Circulation，97，12，1114-1123(1998))。
對于椎間盤應用來說，離體轉染可以通過收集椎間盤細胞、用編碼LMP的核酸體外轉染該細胞、再將該細胞引入椎間盤來完成。該細胞可通過任何本領域技術人員已知的方法從椎間盤收集或再引入，例如任何適合脊柱的外科技術。在一個實施例中，將該細胞通過注射引入椎間盤。
也根據本發明，可用編碼LIM礦化蛋白的核酸離體轉染干細胞(如多能干細胞或間充質干細胞)，并將其引入椎間盤，例如通過注射。
離體轉染的細胞也可與一載體結合形成一種椎間盤植入體。然后，可將此含有轉染細胞的載體植入受試者椎間盤中。先前已經報道過合適的載體材料。(例如參見Helm等“為促進脊柱關節固定的骨移植替代物”，Neurosurgical Focus，10(4)(2001))。載體優選地包含生物相容性多孔基質，例如去礦化的骨基質(DBM)、生物相容性合成聚合物基質或蛋白基質。合適的蛋白包括例如，細胞外基質蛋白，如膠原蛋白。可將離體轉染了LMP的細胞在植入前摻入到載體中(如結合至多孔性基質的孔隙中)。
類似地，體內轉染細胞的椎間盤應用中，可將DNA用本領域技術人員已知的任何合適方法引入椎間盤中。在一個實施例中，將核酸直接注射入椎間隙。
因為腺病毒并不整合入感染細胞的基因組內，當用腺病毒載體向成骨細胞輸送LMP時，可獲得LMP的瞬時表達。然而，瞬時表達不足以獲得本發明的目的。然而可利用一種能摻入靶細胞基因組的載體來實現LMP的穩定表達。例如，逆轉錄病毒載體就適合于這個目的。
LMP的穩定表達尤其適用于治療各種系統性骨相關疾病，例如骨質疏松和成骨不全癥。本發明的這個實施例中，可將一個可調節啟動子與LMP的多聚核苷酸序列組合摻入病毒載體。所述啟動子可包含一個接觸外源性誘導劑，如四環素時而受其控制的序列。
用此方法，通過給予有效量的外源性誘導劑即可刺激系統性新骨的形成。一旦達到所需骨質量，即可停止給予該外源性誘導劑。該過程可按需重復以解決如骨質疏松造成的骨損失。
HLMP特異性抗體尤其適用于檢測病人細胞的成骨誘導或骨形成潛力的方法，該方法是為了鑒定危險狀態病人緩慢或受損的骨修復。同時，HLMP特異性抗體也適用于標記試驗，以鑒定骨退變疾病，如骨質疏松中的危險因子。
根據公知和常規的方法，本發明的基因治療載體通過將編碼LMP的多聚核苷酸序列連接于含克隆或表達載體的核酸序列來制備。優選此種載體既能克隆也能表達LMP的DNA序列。構建和分析這些重組載體所需的方法是分子生物學領域技術人員公知的，其描述例如Sambrook等的分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港出版社(1988)；Davis等的分子生物學基本方法，Elsevier(1986)；和Ausubel等的分子生物學現代方法(Current Protocols in Molecular Biology)，WileyInterscience(1988)中。
美國專利4,800,159(Mullis等)描述了提供擴增LMP cDNA序列方法的聚合酶鏈反應。DNA擴增的試劑盒可從市場買到，其包含從有限量樣品中制備多量拷貝cDNA所必需的酶和相關試劑。
LIM礦化蛋白表達載體可包含用于表達具有骨形成活性的LIM礦化蛋白的模板的任何多聚核苷酸序列。保守的氨基酸取代基或其他修飾，如出現氨基末端為甲硫氨酸殘基也在本發明的范圍之內，因為這些取代和修飾是本鄰域技術人員公知的。
將涉及所選擇宿主表達系統的核糖體結合位點，連接于嵌合性LMP編碼序列的5’末端，形成一個可插入表達載體內的合成基因。也可為該嵌合編碼序列的表達提供一個可調節的啟動子，如大腸桿菌lac啟動子。其他合適的可調節啟動子包括，例如trp、tac、recA、T7和λ啟動子。
可將編碼LMP的DNA通過任何本領域技術人員已知方法轉染到受體細胞中，如磷酸鈣沉淀、DEAE-葡聚糖、電穿孔或原生質體融合，以形成穩定的轉染株。磷酸鈣沉淀可根據Graham等(病毒學，52，456(1973))的方法進行。簡要地說，將一等份用鮭魚精子或小牛胸腺DNA作為載體的40-50微克DNA接種于100毫米培養皿的0.5×106個細胞上。用0.5毫升2XHepes溶液(280毫摩爾NaCl，50毫摩爾Hepes和1.5毫摩爾Na2PO4，pH 7.0)混勻DNA，再加入等體積的2xCaCl2(250毫摩爾CaCl2和10毫摩爾Hepes，pH 7.0)。將30-40分鐘后出現的白色粒狀沉淀一滴滴均勻分布在細胞上，37℃孵育細胞4-16小時。取出培養基，使細胞與15％甘油的PBS溶液接觸3分鐘。去除甘油后，用含10％胎牛血清的Dulbecco’s基礎必需培養基(DMEM)培養細胞。
DNA也可下述方法轉染，見Kimura等(病毒學，49394(1972))和Sompayrac等(美國國家科學院院刊，78，7575(1981))的DEAE-葡聚糖方法，Potter(美國國家科學院院刊，81，7161(1984))的電穿孔方法或Goddin等(Molec.Cell.Biol.，1，743(1981))的原生質體融合法。
本發明也包括在標準條件下能與任何編碼本發明的LIM礦化蛋白的核酸序列、或其互補序列雜交的核酸分子。“標準雜交條件”視探針大小、核酸試劑的背景和濃度以及雜交類型而不同。例如，可使用原位、DNA印跡或DNA-RNA雜交(RNA印跡)。“標準雜交條件”的確定是本領域技術人員水平范圍內的。所述條件的描述可見，例如美國專利5,580,775(Fremeau等)，Southern的分子生物學雜志98503(1975)，Alwine等的酶學方法，68220(1979)和Sambrook等的分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港出版社，7.19-7.50(1989)。
一種優選的標準雜交條件在如下述溶液中42℃預雜交2小時，所述溶液為50％甲酰胺，5X SSPE(150納摩爾NaCl，10毫摩爾NaH2PO4[pH 7.4]，1毫摩爾EDTA[pH8.0])15Xdenhardt’s溶液(每100毫升水含20毫克Ficoll，20毫克聚乙烯吡咯烷酮和20毫克牛血清白蛋白)，10％硫酸葡聚糖，1％SDS和100微克/毫升鮭魚精子DNA。加入32P標記的cDNA探針，進行14小時雜交。然后用2X SSPE洗滌印跡點兩次，用0.1％SDS 22℃洗滌20分鐘，用0.1X SSPE、0.1％SDS 65℃洗滌1小時。然后干燥印跡點，在增光屏存在下曝光X射線膠片5天。
在“高度嚴謹條件”下，如果探針與靶序列基本相同，探針就會與靶序列雜交。和標準雜交條件一樣，高度嚴謹條件可由本領域技術人員視特定雜交目而定。
本發明一方面提供了包含編碼LIM礦化蛋白的核酸序列的分離核酸分子。本發明的核酸分子可以是能在標準條件下與序列表中第25號序列全長的互補核酸分子雜交的分子，也可以是能在高度嚴謹條件下與序列表中第26號序列全長的互補核酸分子雜交的分子，或者能與兩者雜交的分子。更具體說，本發明的分離核酸分子可以編碼HLMP-1、HLMP-1s、RLMP、HLMP-2或HLMP-3。
本發明另一方面包括所述核酸序列編碼的蛋白質。在另一實施例中，本發明涉及根據抗LMP抗體鑒定這類蛋白質。在該實施例中，通過裂解細胞并用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白來制備蛋白質印跡分析的蛋白樣品。用Ausubel等的分子生物學現代方法，John Wiley and Sons(1987)中描述的方法，將蛋白通過電印跡轉移至硝酸纖維素膜上。用速溶脫脂奶粉(100毫升PBS中1毫克)封閉膜后，在膜上加入抗LMP抗體室溫孵育1小時。用磷酸鹽緩沖液(PBS)徹底洗滌膜，再與辣根過氧化物酶(HRPO)-抗體偶聯物室溫孵育1小時。再用PBS徹底洗滌膜，然后加入二氨基聯苯胺(DAB)以鑒定抗原條帶。
單一特異性抗體是本發明選擇的試劑，它們具體用于分析病人細胞與LMP表達相關的特定特征。本文使用的“單一特異性抗體”定義為一種或多種具有與LMP同源結合特征的抗體種類。本文使用的“同源結合”指該種類抗體結合于某特定抗原或抗原表位的能力，如上述的那些與LMP相關的抗原或表位。LMP的單一特異性抗體可從含有抗LMP活性抗體的哺乳動物抗血清中純化獲得或用Kohler等(自然，256，495-497(1975))描述的技術制備單克隆抗體。LMP特異性抗體通過用合適濃度的LMP加或不加免疫佐劑免疫動物，如小鼠、大鼠、豚鼠、兔、山羊或馬來生產。第一次免疫之前收集免疫前血清。每個動物接受大約0.1毫克至1000毫克LMP，如果需要，和一種可接受的免疫佐劑。可接受的佐劑包括但不限于弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、明礬沉淀物、含棒狀桿菌的水包油乳液和tRNA佐劑。首次免疫包括將LMP，優選加弗氏完全佐劑的LMP通過皮下(SC)或/和腹腔內(IP)多點注射。每個動物在規則的時間間隔抽血，優選每星期一次，以確定抗體滴度。動物在首次免疫后可以或不必進行加強注射。接受加強注射的那些動物，通常以相同途徑給予用弗氏不完全佐劑配的相同量抗原。加強注射間隔大約3周時間，直到獲得最大滴度。每次加強注射后7天或單次免疫后大約一周，動物采血，收集血清，并等份儲存于大約-20℃。
與LMP反應的單克隆抗體(mAb)通過用LMP免疫純種小鼠，優選Balb/c小鼠制備。如上所述，用溶解于大約0.5毫升緩沖液或鹽水中約0.1毫克至10毫克，優選1毫克的LMP和等體積的可接受的佐劑免疫小鼠。優選弗氏完全佐劑。第0天小鼠接收首次免疫，然后休息3-30周。通過靜脈內(IV)途徑給予免疫的小鼠一次或多次加強免疫，加強免疫劑量是溶解于緩沖液，如磷酸鹽緩沖液的約0.1至10毫克LMP。通過本領域公知的標準程序取得免疫小鼠的脾臟，獲得抗體陽性小鼠的淋巴細胞，優選脾淋巴細胞。雜交瘤細胞通過將該脾淋巴細胞與合適的融合伴侶，優選骨髓瘤細胞在允許形成穩定雜交瘤的條件下相混合而產生。融合伴侶可包括但不限于小鼠骨髓瘤P3/NS1/Ag 4-1；MPC11；S-194和Sp 2/0，優選Sp 2/0細胞。將抗體產生細胞和骨髓瘤細胞在分子量約1000、濃度約30％-50％的聚乙二醇中融合。融合的雜交瘤通過本領域已知程序可在含次黃嘌呤、胸腺嘧啶和氨基喋呤(HAT)的補充Dulbecco’s改良Eagles培養基(DMEM)中生長而得以選擇。在第14、18和21天收集生長陽性孔的上清液，用免疫試驗(LMP作為抗原)如固相免疫放射試驗(SPIRA)篩選抗體產生。也將培養液體在奧脫洛尼氏(Ouchterlony)沉淀試驗中進行測試，以確定該mAb的同功型。用如MacPherson(軟瓊脂技術組織培養方法和應用，Kruse andPaterson(主編)，Academic Press(1973))或Harlow等(抗體實驗室手冊，冷泉港實驗室(1988))描述的軟瓊脂技術克隆抗體陽性孔中的雜交瘤細胞。
單克隆抗體也可通過下述方法體內生產用每鼠0.5毫升的降植烷處理Balb/c小鼠約4天后，給小鼠注射(腹腔內)約2×106至6×106的雜交瘤細胞。細胞注射后約8-12天收集腹水液，用本領域已知技術純化單克隆抗體。
體外生產抗LMP mAb可通過在含有2％胎牛血清的DMEM中培養雜交瘤細胞系，以獲得足夠量的特異性mAb。用本領域已知技術純化該mAb。
用各種血清學或免疫學試驗測定腹水或雜交瘤培養液的抗體滴度，包括但不限于沉淀、被動凝結、酶聯免疫吸附抗體(ELISA)技術和放射免疫試驗(RIA)技術。可用類似試驗檢測體液或組織和細胞抽提物中LMP的存在。
本領域技術人員不難明白，上述生產單克隆抗體的方法可用于生產LMP多肽片段、全長初生LMP多肽或其變體或等位基因產物的特異性抗體。
在另一實施例中，本發明涉及HLMP-1的交替剪接變體。人心臟cDNA的PCR分析揭示了兩種HLMP交替剪接變體，稱為HLMP-2和HLMP-3，它們與HLMP-1的不同之處在于HLMP-1序列的325和444堿基對之間的區域。HLMP-2序列在此區域具有119個堿基對缺失和17個堿基對插入。這些變化保留了閱讀框，產生一種423個氨基酸的蛋白，與HLMP-1相比，該蛋白凈損失34個氨基酸(40個氨基酸缺失加上6個插入氨基酸)。HLMP-2含有HLMP-1中存在的c末端LIM結構域。
與HLMP-1相比，HLMP-3沒有缺失，但其在444位有相同的17個堿基對的插入。該插入使閱讀框漂移，導致459-461堿基對處產生一個終止密碼子。結果是，HLMP-3編碼了一個153個氨基酸的蛋白。該蛋白缺少HLMP-1和HLMP-2中存在的c末端LIM結構域。HLMP-2和HLMP-3編碼蛋白的預計大小已通過蛋白質印跡分析得到確認。
這三種剪接變體組織分布的PCR分析揭示了它們是差別性表達的，特定的同功型在不同組織中占優勢地位。HLMP-1形式明顯優勢表達于白細胞、脾臟、肺、胎盤和胎肝中。HLMP-2看來是骨骼肌、骨髓和心臟組織中的優勢同功型。然而HLMP-3在任何受檢組織中不是優勢同功型。
HLMP-3在次代大鼠成骨細胞中的過度表達誘導了骨節結形成(287±7)，這與糖皮質激素(272±7)和HLMP-1(232±200)引起的效應相似。因為HLMP-3缺少c末端LIM結構域，所以該區域并不是成骨誘導活性所必需的。
然而，HLMP-2的過度表達并不誘導節結形成(11±3)。這些數據表明，缺失的119個堿基對所編碼的氨基酸是成骨誘導所必需的。這些數據也表明，HLMP剪接變體的分布對組織特異性功能是重要的。令人驚訝的是，發明人證明了在次代大鼠成骨細胞培養中，HLMP-2抑制類固醇誘導的成骨細胞形成。因此，當不需要骨形成的臨床情況下，HLMP-2可能具有治療用途。
美國典型培養物保藏中心(ATCC，12301 Parklawn Drive，馬里蘭州羅克維爾20852)于1997年7月22日保存了在載體中的10-4/RLMP樣品，稱為pCMV2/RLMP(載體pRc/CMV2含插入物10-4克隆/RLMP)。該保存的培養物登錄號為209153。美國典型培養物保藏中心(ATCC)于1998年3月19日保存了含插入物HLMP-1s的載體pHis-A樣品。該保存的培養物登錄號為209698。在布達佩斯條約規定的條件下，美國典型培養物保藏中心(ATCC，10801大學路，美國弗吉尼亞州馬納薩斯，20110-2209)于2000年4月14日保存了質粒pHAhLMP(載體pHisA含衍生自人心肌cDNA的cDNA與HLMP-2的插入物)和pHAhLMP-3(載體pHisA含衍生自人心肌cDNA的cDNA與HLMP-3的插入物)的樣品。這些保存的培養物登錄號分別為PTA-1698和PTA-1699。按照布達佩斯條約的要求，這些保存物將在ATCC中至少保存30年，并在授予專利公開它們之后，為公眾可獲得。應理解，獲得保存物不構成在未獲政府行為授予專利權的情況下允許實施該專利。
在評價本發明的核酸、蛋白或抗體中，可采用酶試驗、蛋白純化和其他常規生化方法。DNA和RNA可分別用DNA印跡和RNA印跡技術分析。一般來說，可用凝膠電泳按大小分離分析樣品。然后將凝膠中的DNA和RNA轉移至硝酸纖維素膜或尼龍膜上。使凝膠中樣品模式復制而得的印跡與探針雜交。一般來說，探針是同位素，優選32P標記的，，雖然可用其他本領域技術人員已知的信號產生分子標記探針。然后用檢測系統，如放射性自顯影顯色感興趣的特異性條帶。
為了說明本發明的優選實施例，本文包括了下面的非限制性實施例。這些結果證明用本發明的LIM礦化蛋白，以及編碼這些蛋白的分離核酸分子誘導或增強骨形成是可行的。
實施例1顱骨細胞培養大鼠顱骨細胞，也稱為大鼠成骨細胞(“ROB”)，獲自20天的分娩前大鼠，見之前Boden等(Endocrinology，137，8，3401-3407(1996))所述。當原代培養物生長至融合(7天)，用胰酶消化后傳代至6孔板(1×105細胞/35毫米孔)中，作為第一代亞培養細胞。該亞培養細胞在第0天長至鋪滿后再培養7天。從第0天開始，每3或4天在層流凈化罩下調換培養基并進行處理(Trm和/或BMPs)。標準細胞培養程序如下第1-7天，MEM，10％FBS，50微克/毫升抗壞血酸，±刺激源；第8-14天，BGJb培養基，10FBS，5毫摩爾β-GlyP(作為無機磷酸鹽來源以允許礦化進行)。骨節結形成和骨鈣素分泌的終點分析在第14天進行。基于此系統的選擇50納克/毫升劑量的BMP前導實驗，證明對于所有研究的BMP劑量反應曲線，具有中等范圍的效果。
實施例2反義鏈處理和細胞培養為探索在膜狀骨形成中，LMP的潛在功能作用，我們合成了反義寡核苷酸以阻斷LMP-1的mRNA翻譯并處理正經歷糖皮質激素誘導分化的次代成骨細胞培養物。用高度特異性的、對應于25bp序列跨躍推定翻譯起始位點(序列表，第42號序列)的反義寡核苷酸(與已知大鼠序列沒有明顯同源性)，實現了對RLMP表達的抑制。對照培養物或者不接受寡核苷酸，或者接受正義寡核苷酸。在脂質轉染胺試劑存在(預孵育)或不存在的情況下進行實驗。簡要說，室溫下將22微克正義或反義RLMP寡核苷酸孵育在MEM中45分鐘。孵育后，加入更多MEM或者加入預孵育的脂質轉染胺試劑/MEM(7％v/v；室溫孵育45分鐘)以使寡核苷酸濃度達到0.2微摩爾。產生的混合物在室溫下孵育15分鐘。然后將寡核苷酸混合物與MEM/抗壞血酸鹽/±Trm相混合，以使最終寡核苷酸濃度達到0.1微摩爾。
在存在或不存在合適的寡核苷酸時，將細胞培養于培養基(±刺激源)。最初與脂質轉染胺試劑孵育的細胞再培養(37℃。5％CO2)4小時后，用不含脂質轉染胺試劑或不含寡核苷酸的培養基培養。寡核苷酸濃度通過每24小時加入培養物來維持。
LMP-1反義寡核苷酸以劑量依賴形式抑制礦化節結的形成和骨鈣素分泌，類似于由BMP-6寡核苷酸觀察到的效果。LMP-1反義鏈阻斷成骨細胞分化不能通過加入外源性BMP-6二恢復，但BMP-6反義寡核苷酸抑制可以通過加入BMP-6逆轉，這證實了在成骨細胞分化途徑中，LMP-1處在BMP-6的上游位置。LMP-1反義寡核苷酸在原代大鼠成骨細胞培養中也抑制自發性成骨細胞分化。
實施例3礦化骨節結形成的定量根據實施例1和2制備的ROB的培養物在70％乙醇中固定過夜，然后用Kossa銀染料染色。用半自動計算機視頻圖像分析系統定量測定各孔中的節結數量和節結面積(Boden等，Endocrinology，137，8，3401-3407(1996))。然后將這些值用于計算每個節結值的面積。將此自動化過程以手工計數技術驗證，顯示相關系數為0.92(p＜0.000001)。所有數據都表示為每種條件下5或6孔計算的平均值±該平均值的標準差(標準差)。每種實驗用不同顱骨細胞至少重復兩次。
實施例4骨鈣素分泌的定量用發明人制備的抗大鼠骨鈣素c末端九肽的單一特異性多克隆抗體(Pab)作競爭性放射性免疫試驗，測量培養基中骨鈣素濃度。見Nane等所述(Endocrinology，127588(1990))。簡要說，通過乳糖過氧化物酶方法，用1mCi的125I-Na碘化1微克的九肽。向含有200gl試驗緩沖液(0.02摩爾磷酸鈉，1毫摩爾EDTA，0.001％柳硫汞，0.025％牛血清白蛋白)的試管中加入細胞培養物的培養液或骨鈣素標準品(0-12,000弗摩爾)100gl/管(用試驗緩沖液配)。然后加入Pab(1∶40,000；100微升)，然后是碘化肽(12,000cpm；100微升)。測試非特異性結合的樣品以類似方法制備，但不含抗體。
加入700微升山羊抗兔IgG抗體，4℃孵育18小時分離結合和游離的PABs。樣品1200rpm離心45分鐘后，傾去上清，沉淀在Gamma計數器中計數。骨鈣素值報告為弗摩爾/100微升，然后將這些值除以100轉變為皮摩爾/毫升培養基(3天生產)。數值表示為每種條件下5-6孔三次測定的平均值±標準差。每種實驗用不同顱骨制品的細胞至少確證兩次。
實施例5Trm和RLMP對體外礦化的影響正義或反義寡核苷酸對非刺激的細胞培養系統中骨節結的產生總量幾乎沒有明顯的影響。然而當用Trm刺激ROBs時，RLMP的反義寡核苷酸抑制了＞95％的節結礦化。在寡核苷酸處理的培養物中加入外源性BMP-6不能恢復RLMP反義鏈處理節結的礦化。
長期以來，骨鈣素都與骨礦化同義，骨鈣素濃度與骨節結產生和礦化相關。RLMP反義寡核苷酸明顯降低骨鈣素的產生，但反義鏈處理培養物中的節結計數無明顯變化。在這種情況下，在RLMP反義鏈處理的培養物中加入外源性的BMP-6僅恢復骨鈣素產生10-15％。這提示，RLMP的作用在BMP-6的下游，并且比BMP-6特異性更強。
實施例6收獲并純化RNA用4摩爾異硫氰酸胍(GIT)溶液收集ROBs(根據實施例1和2在6孔培養皿中制備)雙復孔中的細胞RNA，獲得有統計學意義的三個量。簡要說，吸取孔中培養物上清液，然后疊加以GIT溶液，每雙復孔收集0.6毫升。加入GIT溶液后，旋轉該板5-10分鐘。進一步處理前將樣品貯存于-70℃ 7天以上。
用稍微修改的Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，第7.19章，第二版，冷泉港出版社(1989))的標準方法純化RNA。簡要說，在融化樣品中加入60微升2.0摩爾醋酸鈉(pH 4.0)，550微升苯酚(水飽和)和150微升氯仿∶異戊醇(49∶1)。渦旋混勻后，離心樣品(10000x g；20分鐘；4℃)，將水相轉移至一新管，加入600微升異丙醇，-20℃沉淀RNA過夜。
過夜孵育后，離心樣品(10000x g；20分鐘)，然后小心吸棄上清。將沉淀重懸于400微升DEPC處理的水中，用苯酚∶氯仿(1∶1)抽提一次，用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，加入40微升醋酸鈉(3.0摩爾/升；pH 5.2)和1.0毫升無水乙醇后，-20℃沉淀過夜。為回收細胞RNA，離心樣品(10000x g；20分鐘)，用70％乙醇洗滌一次，空氣中干燥5-10分鐘并重懸于20微升DEPC處理的水中。RNA濃度通過分光光度計測定的光密度來計算。
實施例7逆轉錄聚合酶鏈反應將加熱的總RNA(65℃下，5微克RNA在總體積為10.5微升的DEPC-H2O中溶解5分鐘)加入到含有4微升5X MMLV-RT緩沖液、2微升dNTPs、2微升dT17引物(10皮摩爾/毫升)、0.5微升RNA酶抑制劑(40單位/毫升)和1微升MMLV-RT(200單位/微升)的試管中。37℃孵育樣品1小時，然后95℃5分鐘滅活MMLV-RT。然后加入80微升水稀釋樣品。
用標準方法(總體積50微升)對逆轉錄樣品(5微升)進行聚合酶鏈反應。簡要說，將樣品加入含有水和適量PCR緩沖液、25毫摩爾MgCl2、dNTPs、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)和/或BMP-6的正向和反向引物、32P-dCTP和Taq聚合酶的試管中。除非特別注明，引物標準化地連續運行22輪循環(94℃，30秒；58℃，30秒；72℃，20秒)。
實施例8通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)和磷光成像分析定量RT-PCR產物向RT-PCR產物中加入5微升/管的加樣染料，混合，加熱至65℃10分鐘，離心。取每個反應10微升樣品在標準條件下進行PAGE(12％聚丙烯酰胺雙丙烯酰胺；15V/孔；穩流)測定。然后將凝膠在凝膠保存緩沖液(10％v/v甘油，7％v/v醋酸，40％V/v甲醇，43％去離子水)中孵育30分鐘，真空干燥(80℃)1-2小時，用電子增強磷光成像系統顯影6-24小時。分析顯色的條帶。用圖表表示每一條帶上的計數。
實施例9差別顯示PCR提取用糖皮質激素(Trm，1納摩爾)刺激細胞的RNA。對加熱的DNA酶處理的總RNA(65℃下，5微克RNA在總體積為10.5微升的DEPC-H2O中溶解5分鐘)作反轉錄，如實施例7所述，但用H-T11M(序列表，第4號序列)作為MMLV-RT的引物。如上述，PCR擴增產生的cDNA，但采用不同的商品化引物組(例如，H-T11G(序列表，第4號序列)和H-AP-10(序列表，第5號序列)；GenHunter公司，田納西州納什維爾)。在DNA測序凝膠上進行凝膠電泳分離同位素標記的PCR產物。電泳后，真空干燥產生的凝膠，并放射性自顯影過夜。從凝膠上切下代表差異性表達cDNA的條帶，再用Conner等描述的方法(美國國家科學院院刊，88，278(1983))進行PCR擴增。將PCR再擴增產物克隆入載體PCR-11(TA克隆試劑盒，Invitrogen，加利福尼亞州卡爾斯巴德)中。
實施例10對UMR106大鼠骨肉瘤細胞cDNA文庫進行篩選將UMR106文庫(2.5×1010空斑形成單位/毫升)以5×104空斑形成單位/毫升接種在瓊脂平板(底部為LB瓊脂)上，37℃孵育該板過夜。將濾膜覆蓋在平板上2分鐘。一旦取下濾膜，立即將其變性、淋洗、干燥并紫外照射交聯。然后將濾膜在預雜交緩沖液(2xPIPES[pH 6.5]，5％甲酰胺，1％SDS和100微克/毫升變性鮭魚精子DNA)中，42℃培育2小時。在整個雜交混合物/濾膜中加入260個堿基對的同位素標記探針(序列表，第3號序列；通過隨機引物進行32P標記)，然后42℃雜交18小時。室溫洗滌膜一次(10分鐘，1x SSC，0.1％SDS)，55℃洗滌三次(15分鐘，0.1x SSC，0.1％SDS)。
洗滌完畢后，如上所述作放射性自顯影對膜進行分析。陽性克隆作空斑純化。用第二張濾膜重復四次該程序以使假陽性結果減至最小。空斑純化的克隆可用lambda SK(-)噬菌粒拯救。如下所述對克隆的cDNA測序。
實施例11克隆的測序用標準方法對克隆的cDNA插入片段進行測序。簡要說，將合適濃度的終止混合物、模板和反應混合物進行合適的循環程序(95℃，30秒；68℃，30秒；72℃，60秒；25輪循環)。加入停止混合物以終止測序反應。92℃加熱3分鐘后，將這些樣品上樣至變性6％聚丙烯酰胺測序凝膠(29∶1丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺)上。樣品在60伏穩流下電泳大約4小時。電泳后，真空干燥凝膠，并進行放射性自顯影。
手工分析放射性自顯影圖像。用設置了默認參數的BLASTIN程序在國家生物技術信息中心維護的數據庫(NIH，馬里蘭州貝塞斯達；http//www.ncbi.nlm.nih.gov)中對產生的序列進行篩選。根據序列數據，制備新的測序引物并重復進行該步驟直到完成整個基因的測序。所有序列都經過至少3次雙向測定得以確認。
也用PCGENE軟件包(版本號16.0)分析核苷酸和氨基酸序列。用NALIGN程序計算核苷酸序列的同源性百分比值，所用的參數如下非匹配核苷酸權重，10；非匹配缺口權重，10；考慮的最大核苷酸數量，50；和考慮的最小核苷酸數量，50。
用PALIGN計算氨基酸序列的同源性百分比值。所選開放缺口成本和單位缺口成本的值均為10。
實施例12RLMP cDNA的克隆實施例9描述的差別顯示PCR擴增產物含有一個大約有260堿基對的主要條帶。用該序列篩選大鼠骨肉瘤(UMR 106)cDNA文庫。對陽性克隆進行嵌套引物分析，獲得擴增全長cDNA(序列表，第11、12、29、30和31號序列)所需的引物序列。這些陽性克隆中選作進一步研究的一個克隆命名為克隆10-4。
對嵌套引物分析測定的克隆10-4的全長cDNA序列分析，顯不克隆10-4含有差別顯示PCR所鑒定的原始260個堿基對片段。克隆10-4(1696堿基對；序列表，第2號序列)包含一個1371堿基對的開放閱讀框，它編碼一個457個氨基酸的蛋白質(序列表，第1號序列)。終止密碼子TGA位于1444-1446位核苷酸。1675-1680位核苷酸為聚腺苷酸化信號和鄰接的多聚(A)+尾位于3’非編碼區。有兩個潛在的N-糖基化位點，即天冬酰胺-賴氨酸-蘇氨酸和天冬酰胺-精氨酸-蘇氨酸，分別位于序列表第1號序列的113-116和257-259氨基酸位置。有五個潛在的蛋白激酶C絲或蘇氨酸的磷酸化位點位于3、115、166、219、442氨基酸位置。在272-279氨基酸位置測到了一個潛在ATP/GTP結合位點基序A(P-環)，即甘氨酸-甘氨酸-絲氨酸-天冬酰胺-天冬酰胺-甘氨酸-賴氨酸-蘇氨酸。
另外，還在341-391和400-451氨基酸位置發現了兩個高度保守的假定的LIM結構域。該新鑒定的大鼠cDNA克隆中假定的LIM結構域，與其他已知LIM蛋白的LIM結構域具有相當大的同源性。然而，與其他大鼠LIM蛋白的總體同源性小于25％。RLMP(也稱為10-4)與人ENIGMA蛋白有78.5％氨基酸同源性(參見美國專利5,504,192)，然而與其最近的大鼠同源物CLP-36和RIT-18僅分別有24.5％和22.7％的氨基酸同源。
實施例13RLMP表達的RNA印跡分析用甲醛凝膠電泳將30微克實施例1和2制備的ROBs總RNA作大小分離，所用的凝膠是1％瓊脂糖平板凝膠，然后通過滲透轉印至尼龍膜上。用全長10-4cDNA的600堿基對的EcoR1片段探測該印跡，該EcoR1片段通過隨機引物標記了32P-dCTP。
RNA印跡分析顯示一個1.7kb的mRNA與RLMP探針雜交。接觸BMP-624小時后，ROBs中的RLMP mRNA上調了大約3.7倍。而BMP-2或BMP-4刺激ROBs 24小時后，沒有觀察到RMLP的上調。
實施例14統計方法對于每個報告的節結/骨鈣素結果，用代表性實驗的5-6孔得到的數據計算平均值±標準差。對每個參數數據均標準化到最大值繪制圖表，同時對節結數、礦化面積和骨鈣素作圖。
對于每個報告的RT-PCR，RNA酶保護試驗或蛋白質印跡分析，用代表性實驗的三個重復樣品得到的數據確定平均值±標準差。顯示了標準化到第0天或陰性對照的圖表，圖表表示為與對照值相比增加的倍數。
用方差的單程分析評價統計顯著性，該單程分析以Bonferroni的事后多種比較修正(D.V.Huntsberger，“變量分析”，Elements of Statistical Variance，P.Billingsley(主編)，Allyn和Bacon公司，馬薩諸塞州波士頓，298-330(1977)和SigmaStat，Jandel Scientific，加利福尼亞州Corte Madera)為宜。顯著性達到Alpha水平定義為p＜0.05。
實施例15用蛋白質印跡分析檢測大鼠LIM礦化蛋白根據England等(生物化學和生物物理學年鑒，623，171(1980))和Timmer等(J.Biol.Chem.，268，24863(1993))的方法制備了多克隆抗體。
用pCMV2/RLMP轉染Hela細胞。根據Hair等(Leukemia Research，20，1(1996))的方法收集轉染細胞中的蛋白。對天然RLMP的蛋白質印跡分析按Towbin等(美國國家科學院院刊，764350(1979))所述進行。
實施例16合成衍生自人PCR產物的大鼠獨特LMP(RLMPU)根據大鼠LMP-1的cDNA序列，合成正向和反向PCR引物(序列表，第15和16號序列)，PCR擴增大鼠LMP-1cDNA中的223個堿基對的獨特序列。從用同樣PCR引物擴增的人KG63骨肉瘤細胞cDNA分離得到類似的PCR產物。
收集培養在T-75瓶中MG63骨肉瘤細胞的RNA。吸除培養上清液，雙瓶中各覆蓋3.0毫升GIT溶液，渦旋混合5-10秒，將所得溶液轉移至1.5毫升eppendorf管中(6管，0.6毫升/管)。用稍微修改的標準方法(Sambrook等。分子克隆實驗室手冊，第7章，第19頁，第二版，冷泉港出版社(1989)和Boden等，Endocrinology，138，2820-2828(1977))純化RNA。簡要說，在0.6毫升樣品中加入60微升2.0摩爾的醋酸鈉(pH 4.0)，550微升水飽和苯酚和150微升氯仿∶異戊醇(49∶1)。加入這些試劑后，渦旋混合樣品并離心(10000x g；20分鐘；4℃)，將水相轉移至一新試管。加入異丙醇(600微升)，-20℃沉淀RNA過夜。離心樣品(10000x g；20分鐘)，然后小心吸棄上清。將沉淀重懸于400微升DEPC處理的水中，用苯酚∶氯仿(1∶1)抽提一次，用氯仿∶異戊醇(24∶1)抽提，加入40微升醋酸鈉(3.0摩爾；pH 5.2)和1.0毫升無水乙醇，-20℃沉淀過夜。沉淀后，離心樣品(10000x g；20分鐘)，用70％乙醇洗滌一次，空氣干燥5-10分鐘，重懸于20微升DEPC處理的水中。由光密度獲得RNA濃度。
將總RNA(在總體積為10.5微升的DEPC-H2O中含5微克RNA)65℃加熱5分鐘，然后將其加入到含4微升5X MMLV-RT緩沖液、2微升dNTPs、2微升dT17引物(10皮摩爾/毫升)、0.5微升RNA酶抑制劑(40單位/毫升)和1微升MMLV-RT(200單位/微升)的試管中。37℃反應1小時，然后通過95℃加熱5分鐘使MMLV-RT失活。加入80微升水稀釋樣品。
用標準方法(總體積50微升)對轉錄樣品(5微升)進行聚合酶鏈反應，如Boden等(Endocrinology，138，2820-2828(1977))和Ausubel等(“通過聚合酶鏈反應定量少量DNAs”，分子生物學現代方法，第15.31-1章，Wiley&Sons，新澤西州塔倫頓(1990))所述。簡要說，將樣品加入到含水和適量PCR緩沖液(25毫摩爾MgCl2、dNTPs、正向和反向引物(RLMPU的引物；序列表，第15和16號序列))、32P-dCTP和DNA聚合酶的試管中。設計的引物連續運行22輪循環，用作放射性條帶檢測；和引物運行33輪循環所得擴增PCR產物，用作篩選探針(循環程序94℃，30秒；58℃，30秒；72℃，20秒)。
對瓊脂糖凝膠純化的MG-63骨肉瘤產生的PCR產物測序顯示，該序列與RLMPU的PCR產物同源性高于95％。將該序列命名為HLMP獨特區(HLMPU；序列表，第6號序列)。
實施例17逆轉錄酶衍生MG63cDNA的篩選用特定引物(序列表，第16和17號序列)作PCR進行篩選，如實施例7所述。用瓊脂糖凝膠純化得到MG63的PCR產物，具有717個堿基對。然后用給定引物(序列表，第12、15、16、17、18、27和28號序列)測序。至少兩次雙向測序確證這些序列。將MG63諸序列互相排列對比，然后與大鼠LMP cDNA全長序列對比，獲得人LMP的部分cDNA序列(序列表，第7號序列)。
實施例18人心臟cDNA文庫的篩選。
根據RNA印跡實驗，確定LMP-1在幾種不同組織中表達水平有所不同，包括人心肌。因此檢查了人心肌cDNA文庫。
將該文庫以5×104空斑形成單位/毫升接種在瓊脂平板(底部為LB瓊脂)上，該板37℃培養過夜。將濾膜覆蓋在該板上2分鐘。然后將濾膜變性、淋洗、干燥、紫外線照射交聯，在預雜交緩沖液(2xPIPES[pH 6.5]，5％甲酰胺，1％SDS和100克/毫升變性的鮭魚精子DNA)中，42℃培育2小時。加入LMP獨特的、223個堿基對的同位素標記探針(隨機引物32P標記；序列表，第6號序列)，然后42℃雜交18小時。雜交后，室溫洗滌膜一次(10分鐘，1x SSC，0.1％SDS)，55℃洗滌三次(15分鐘，0.1xSSC，0.1％SDS)。根據制造商的操作程序(Strategene，加利福尼亞州拉霍亞)，用lambda噬菌粒拯救放射性自顯影鑒定的雙陽性空斑純化的心肌文庫克隆。
陽性克隆的限制性酶切產生大小不同的cDNA插入物。經測序選擇長度大于600個堿基對的插入物用于初步篩選。用實施例11所述的標準方法測序這些插入物。
也用序列表中第11-14、16和27號序列相對應的引物對第7號克隆進行自動序列分析。這些方法獲得的序列通常97-100％同源。克隆7(心肌文庫的人LMP部分cDNA；序列表，第8號序列)在翻譯區含有一個與大鼠LMP cDNA序列同源性超過87％的序列。
實施例19全長人LMP cDNA序列的測定采用MG62人骨肉瘤細胞cDNA序列和人心臟cDNA克隆7序列的重疊區域排列對比這兩個序列，獲得一個完整的1644個堿基對的人cDNA序列。用PCGENE軟件包中的NALIGN程序對比這兩個序列。這兩個序列的重疊區域包括大約360個堿基對，除有一個核苷酸取代外，完全同源。該取代在克隆7位于MG63 cDNA(序列表，第7號序列)672位核苷酸為“A”，而相應的516位核苷酸(序列表，第8號序列)為“G”。
將這兩個對比序列用PCGENE的另一個亞程序SEQIN相連接，用“G”取代MG63骨肉瘤的cDNA克隆。產生的序列顯示在序列表中第9號序列。用NALIGN進行該全新人序列與大鼠LMP-1cDNA的對比。人LMP-1的cDNA全長序列(序列表，第9號序列)與大鼠LMP-1cDNA序列的翻譯部分87.3％同源。
實施例20人LMP-1氨基酸序列的測定人LMP-1假定氨基酸序列的測定采用PCGENE的TRANSL亞程序。序列表中第9號序列的開放閱讀框編碼一個包含457個氨基酸的蛋白質(序列表，第10號序列)。使用PCGENE的PALIGN亞程序，發現人LMP-1氨基酸序列與大鼠LMP-1氨基酸序列94.1％同源。
實施例21人LMP cDNA的5’非翻譯區的測定用5’快速擴增cDNA末端(5’RACE)實驗程序對MG63總RNA進行嵌套RT-PCR，擴增MG63的5’cDNA。該方法包括采用在3’末端含兩個簡并核苷酸位置的鎖定停靠寡核苷酸(dT)引物，合成第一條鏈(Chenchick等，克隆技術，X5(1995)；Borson等，PC方法應用，2，144(1993))。根據Gubler等(Gene，2，263(1983))的方法，用大腸桿菌DNA聚合酶1、RNA酶H和大腸桿菌DNA連接酶的混合物進行第二條鏈的合成。用T4DNA聚合酶產生平端后，將雙鏈cDNA連接于片段(5’-CTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’)(序列表，第19號序列)。RACE之前，將銜接子連接的cDNA稀釋至適合馬拉松RACE反應的濃度(1∶50)。然后，即可特異性克隆銜接子連接的雙鏈cDNA。
用銜接子特異性寡核苷酸、作為正義引物的5’-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3’(API)(序列表，第20號序列)和實施例16中所述獨特區域(HLMPU)的基因特異性引物(GSP)進行第一輪PCR。用嵌套引物GSP1-HLMPU(反義/反向引物)(序列表，第23號序列)和GSP2-HLMPUF(序列表，第24號序列)進行第二輪PCR(參見實施例16；正義/正向引物)。用商品化試劑盒(Advantage cDNA PCR核心試劑盒；CloneTech Laboratories Inc.，加利福尼亞州帕洛阿爾托)進行PCR，它采用抗體介導的而不是標準化的熱啟動程序。MG63 cDNA的PCR條件包括起始的熱啟動變性(94℃，60秒)，然后是94℃，30秒；60℃，30秒；68℃，4分鐘；30輪循環。第一輪PCR產物長度大約為750個堿基對，而嵌套PCR產物為大約230個堿基對。將第一輪PCR產物克隆到線性化的pCR 2.1載體(3.9kb)中。用M13正向和反向引物(序列表，第11號序列；序列表，第12號序列)對插入物進行雙向測序。
實施例22用5’UTR進行人LMP-1cDNA的全長測定排列對比了重疊的MG63人骨肉瘤細胞cDNA 5’-UTR序列(序列表，第21號序列)、MG63的717個堿基對序列(實施例17；序列表，第8號序列)和人心臟cDNA克隆7的序列(實施例18)，獲得一個全新的1704個堿基對的人cDNA序列(序列表，第22號序列)。用NALIGN進行該項對比，(PCGENE和Omiga 1.0；Inteligenetics)。重疊序列幾乎占全部的717個堿基對區域(實施例17)，同源性100％。用SEQIN進行對比序列的連接。
實施例23構建LIM蛋白表達載體用實施例17和18描述的序列進行pHIS-5ATG LMP-1s表達載體的構建。用ClaI和EcoRV酶切所述717個堿基對的克隆。凝膠純化小片段(～250堿基對)。用ClaI和XbaI酶切克隆7(實施例18；序列表，第8號序列)，凝膠純化1400個堿基對的片段。將分離的250個堿基對和1400個堿基對的限制性片段連接形成～1650堿基對的片段。
由于克隆7中有一個核苷酸取代(相對于717個堿基對的PCR序列和原始大鼠序列)，在翻譯堿基對672處產生了一個終止密碼子。因為這個終止密碼子，而編碼了一個截斷(短)蛋白，因此稱為LMP-1s。這是表達載體(序列表，第32號序列)中所用的構建物。將序列表中的第32號序列與5’RACE序列(序列表，第21號序列)排列對比產生含有5’UTR的全長cDNA序列(序列表，第33號序列)。然后，推導出LMP-1s的氨基酸序列(序列表，第34號序列)為223個氨基酸的蛋白，并經蛋白印跡證實(如實施例15)，電泳時預計分子量為～23.7kD。
用EcoRV和XbaI酶切pHis-ATG載體(Invitrogen，加利福尼亞州卡爾斯巴德)。回收該載體，并將650堿基對的內切片段即連接入線性化pHis-ATG中。克隆并擴增該連接產物。
用標準方法純化pHis-ATG-LMP-1s表達載體，也稱為含有插入HLMP-1s的pHIS-A。
實施例24體外用LMP表達載體誘導骨節結形成和礦化分離大鼠顱骨細胞并按實施例1進行次代培養。用糖皮質激素(GC)刺激或不刺激培養物，如實施例1所述。使用修改的Superfect試劑(Qiagen，加利福尼亞州巴倫西亞)轉染程序在次代大鼠成骨細胞培養物中轉染每種載體3微克/孔，如實施例25所述。
礦化的節結可通過Von Kossa染色觀察，如實施例3所述。人LMP-1s基因產物單獨過度表達，能在體外誘導骨節結形成(～203節結/孔)。節結水平大約是陽性對照GC(～412節結/孔)誘導的50％。其他陽性對照包括pHisA-LMP-大鼠表達載體(～152節結/孔)和pCMV2/LMP-大鼠-正向表達載體(～206節結/孔)，而陰性對照包括pCMV2/LMP-大鼠-反向表達載體(～2節結/孔)和未處理(NT)平板(～4節結/孔)。這些數據證明人cDNA至少具有與大鼠cDNA相當的成骨誘導能力。該效果低于用GC刺激所觀察到的效果，最可能是由于表達載體為亞適劑量。
實施例25在體外和體內LMP誘導的細胞分化通過NotI和ApaI雙酶切(37℃過夜)，將克隆10-4中的大鼠LMP cDNA(參見實施例12)從載體上切下來。用相同的限制性酶酶切載體pCMV2 MCS(Invitrogen，加利福尼亞州卡爾斯巴德)。克隆10-4的線性cDNA片段和pCMV2用凝膠純化、抽提并用T4連接酶連接。凝膠純化、抽提連接的DNA，用于轉化大腸桿菌JM109細胞以擴增。選擇陽性瓊脂菌落，用NotI和ApaI酶切，通過凝膠電泳檢查限制性酶切產物。制備陽性克隆的儲存培養物。
以類似方式制備反向載體，不同的是使用的限制性酶是XbaI和HindIII。因為采用了這些內切酶，可將克隆10-4的LMP cDNA片段反向(即不可翻譯地)插入pRc/CMV2中。產生的重組載體稱為pCMV2/RLMP。
將適量的pCMV10-4(最佳的終濃度為60納摩爾[3微克]；對于本實驗，優選終濃度范圍是0-600納摩爾/孔
)重懸于基礎Eagle培養基(MEM)中，使最終體積為450微升，然后渦旋混合10秒。加入Superfect(最終溶液為7.5微升/毫升)，渦旋混合該溶液10秒，然后室溫孵育10分鐘。孵育后，加入含有10％FBS的MEM(1毫升/孔；6毫升/板)并吹打混勻。
然后將所得溶液迅速吸移(1毫升/孔)至洗滌過的ROB培養物上。將該培養物置于含有5％CO2的潮濕環境中37℃孵育2小時。然后用無菌PBS輕柔洗滌細胞一次，加入合適的正常培養基。
結果證明pCMV10-4在所有大鼠細胞培養物中誘導了明顯的骨節結形成。例如，pCMV10-4轉染細胞產生了429節結/孔。接觸Trm的陽性對照培養物，產生460節結/孔。相反，沒有接受處理的陰性對照產生1節結/孔。類似地，當培養物轉染pCMV10-4(反向)時，沒有觀察到節結。
為證明體內骨可能從頭形成，吸取4-5周齡正常大鼠(rnu/+；隱性無胸腺雜合子)的下肢骨髓。用alpha MEM洗滌吸取的骨髓細胞，離心，將沉淀重懸于含0.83％NH4Cl的10毫摩爾Tris(pH 7.4)溶液中，裂解紅細胞。用MEM洗滌剩余的骨髓細胞3次，每3×106細胞用9微克pCMV-LMP-1s(正向或反向)轉染2小時。然后用MEM洗滌轉染細胞2次，重懸至濃度3×107細胞/毫升。
用無菌微量移液器將細胞懸液(100微升)轉移至一個無菌、2×5毫米的I型牛膠原蛋白盤(Sulzer整形外科，科羅拉多州惠特里)中。將該盤以手術皮下植入4-5周齡無胸腺大鼠(rnu/rnu)的顱骨、胸、腹或背節脊柱。3-4周后將動物處死，此時切取該盤或手術區域在70％酒精中固定。用放射線照相術分析固定的標本，對5微米厚切片用Goldner Trichrome染色進行非脫鈣組織學檢查。還用失活的(胍萃取)去礦化骨基質(Osteotech，新澤西州什魯斯伯里)代替膠原蛋白盤進行實驗。
放射顯影圖顯示了高水平的礦化骨形成，證實形成了含有LMP-1s轉染骨髓細胞的原始膠原蛋白盤。在陰性對照(轉染了不能編碼翻譯蛋白的反向LMP-1s cDNA的細胞)中沒有觀察到礦化骨形成，顯示正在進行載體的吸收。
組織學揭示LMP-1s轉染的植入物中新的骨小梁與成骨細胞線性排列。在陰性對照中，伴隨載體的部分吸收，并沒有觀察到骨(形成)。
在無胸腺大鼠腰椎和胸椎之間交互部位加入18組(9個陰性對照pCMV-LMP-REV和9個實驗pCMV-LMP-1s)植入物的進一步實驗的放射顯影圖顯示9個陰性對照植入物沒有一個顯示在椎骨之間形成了骨(脊椎融合)。而所有9個pCMV-LMP-1s處理的植入物都顯示椎骨之間形成了硬骨融合。
實施例26由實施例2和3顯示的序列合成pHIS-5’ATG LMP-1s表達載體用ClaI和EcoRV(New England Biologicals，馬薩諸塞州城)酶切上述717個堿基對的克隆(實施例17)。凝膠純化獲得小片段(～250堿基對)。用ClaI和XbaI酶切第7號克隆(實施例18)。凝膠純化酶切產物中的1400個堿基對片段。用標準方法連接分離的250個堿基對和1400個堿基對的cDNA片段，形成一個～1650bp的片段。用EcoRV和XbaI酶切pHis-A載體(Invitrogen)。回收該線性化載體連接于嵌合性1650個堿基對cDNA片段。用標準方法克隆并擴增連接產物。如前所述，將phis-A-5’ATG LMP-1s表達載體，也稱為含有插入HLMP-1s的載體pHis-A，已經保存在ATCC。
實施例27體外用pHis-5’ATG LMP-1s表達載體誘導骨節結形成和礦化分離大鼠顱骨細胞并按實施例1進行次代培養。用糖皮質激素(GC)刺激或不刺激培養物，如實施例1所述。培養物用重組pHis-A載體DNA 3微克/孔轉染，如實施例25所述。礦化節結用實施例3的Von Kossa染色觀察。
人LMP-1s基因產物單獨過度表達(如沒有GC刺激時)，能在體外顯著誘導骨節結形成(～203節結/孔)。這大約是接觸陽性對照GC的細胞所產生節結數量(～412節結/孔)的50％。用pHisA-LMP-大鼠表達載體(～152節結/孔)和pCMV2/LMP-大鼠-正向表達載體(～206節結/孔)轉染的培養物中獲得了類似的結果。相反，陰性對照pCMV2/LMP-大鼠-反向表達載體產生～2節結/孔，而未處理平板中觀察到大約4節結/孔。這些數據證明在這個模型系統中，人LMP-1cDNA至少和大鼠cDNA的成骨誘導能力相當。本實驗的效果低于用GC刺激觀察到的效果；但是在某種方面上，該效果是相當的。
實施例28LMP誘導可溶性成骨誘導因子的分泌如實施例24所述，RLMP-1或HLMP-1s在大鼠顱骨成骨細胞培養物中的過度表達，導致骨節結形成顯著增多(與陰性對照觀察到的結果相比)。為了研究LIM礦化蛋白的作用機制，收集不同時間點的條件培養基，濃縮10倍，過濾除菌，用含新鮮血清的培養基稀釋至其最初濃度，用于培養未轉染的細胞4天。
在第4天收集轉染RLMP-1或HLMP-1s細胞的條件培養基，其誘導骨節結形成的效果與直接在轉染細胞中過表達RLMP-1的效果大約相當。轉染反向RLMP-1或HLMP-1細胞的條件培養基對骨節結形成沒有明顯效果。在第4天之前收集的LMP-1轉染培養物的條件培養基不誘導骨節結形成。這些數據表明LMP-1的表達引起了一種可溶性因子的合成和/或分泌，直到轉染4天后，培養基中才會出現有效量的該因子。
因為rLMP-1的過表達可導致成骨誘導因子分泌進入培養基中，故采用蛋白質印跡分析來測定培養基中是否存在LMP-1蛋白。RLMP-1蛋白的存在可用LMP-1特異性抗體(QDPDEE)進行評估，用常規方法檢測。只在培養物的細胞層中發現LMP-1蛋白，而在培養基中沒有檢測到它的存在。
用標準25％和100％硫酸銨逐次處理后，再進行DE-52陰離子交換批量層析(100毫摩爾或500毫摩爾的NaCl)實現了成骨誘導可溶性因子的部分純化。在高濃度的硫酸銨和高濃度的NaCl組分中觀察到所有的活性。這種定位與負責條件培養基單一因子的可能性相一致。
實施例29低劑量腺病毒介導的腰椎融合基因治療本研究確定了在正常的即有免疫能力的家兔中能促進脊椎融合輸送LMP-1cDNA(序列表，第2號序列)的腺病毒的最優劑量。
用AdenoQuestTM試劑盒(Quantum生物科技公司，蒙特利爾)，構建了含CMV啟動子驅動的LMP-1cDNA(序列表，第2號序列)的復制缺陷型人重組腺病毒。用市售(Quantum生物科技公司，蒙特利爾)的含β-半乳糖苷酶的重組腺病毒作為對照。
首先，進行體外劑量反應實驗以確定輸送LMP-1的腺病毒(“AdV-LMP-1”)誘導大鼠顱骨成骨細胞培養物骨分化的最優濃度；即采用60分鐘轉導，每個細胞的病毒感染復數(MOI)分別為0.025、0.25、2.5或25空斑形成單位(pfu)。陽性對照培養物接觸109摩爾的糖皮質激素(GC)7天后發生分化。陰性對照培養物不處理。在第14天，用yon Kossa染色培養物后計數礦化骨節結，用放射性免疫試驗測定分泌到培養基(皮摩爾/毫升)中的骨鈣素濃度(平均值±SEM)。
本實驗的結果見下表I。未處理的陰性對照培養物中基本上沒有自發性節結形成。數據顯示等于0.25pfu/細胞的MOI對成骨誘導骨節結最有效。達到了相當于陽性對照(GC)的水平。較低或較高劑量的腺病毒效果較差。
表I

然后進行體內實驗，確定體外能促進骨骼成熟新西蘭白兔體內脊椎橫突融合的最優劑量。將九只家兔麻醉，用18號針頭從在大腿骨末梢的髁間缺口吸取3毫升骨髓。分離暗黃層，用AdV-LMP-1進行10分鐘轉導，然后將細胞送回手術室供植入。通過脊椎橫突皮質剝除插入含有800-1500萬自身暗黃層有核細胞的運載體(兔失活的骨基質或膠原蛋白海綿)進行單一水平后外側腰椎關節定位術，所述有核細胞轉導有AdV-LMP-1(MOI＝0.4)或AdV-BGal(MOI＝0.4)。5周后，無痛處死家兔，用手工觸診、普通X射線術、CT掃描和非脫鈣組織學評估其脊柱融合。
在所有9只家兔中，接受AdV-LMP-1的脊柱融合部位都誘生了硬的、連續的脊柱融合塊。相反，接受AdV-Bgal或低劑量AdV-LMP-1(MOI＝0.04)的部位幾乎不或不產生骨，其產生的脊柱融合速率與單用載體相當(＜40％)。經手工觸診、CT掃描和組織學分析評價，這些結果是一致的。然而，普通放射顯影有時高估了存在的骨量，尤其是對照部位。用測試的兩種載體材料都成功地進行LMP-1cDNA輸送和骨誘導。沒有證據顯示動物對腺病毒載體有全身或局部免疫反應。
這些數據證明在前面已驗證的兔脊柱融合模型中骨誘導的一致性。此種外科手術離體基因轉導(10分鐘)采用自身骨髓細胞的方法，比其他需要過夜轉導或數周培養擴增細胞的方法在臨床上更可行。另外，重組腺病毒的最有效劑量(MOI＝0.25)大大低于其他基因治療應用報道的劑量(MOI 40-500)。發明人相信這是由于LMP-1是細胞內信號傳遞分子，可能具有強效信號放大級聯反應的緣故。還有，與細胞培養物中誘導骨形成相同濃度的AdV-LMP-1在體內一樣有效，此發現令人驚訝，因為當將其他生長因子從細胞培養中轉換至動物試驗時，通常需要增加劑量。總而言之，這些觀察表明用腺病毒輸送LMP-1cDNA進行局部基因治療是可能的，所需劑量低將可能使對腺病毒載體的免疫反應副作用減至最小。
實施例30采用外周靜脈血有核細胞(暗黃層)作LMP-1cDNA基因治療產生骨。
我們在4只家兔中進行了上述(實施例29)的脊柱融合外科手術，不同之處在于轉導細胞是靜脈血的暗黃層細胞，而不是骨髓。用AdLMP或pHIS-LMP質粒轉染這些細胞，獲得了與用骨髓細胞相等的成功結果。采用普通靜脈血細胞能進行基因輸送的這個發現使基因治療在臨床上更可行，因為它避免了全身麻醉下收集骨髓的痛苦，并且每毫升起始材料可產生兩倍以上的細胞。
實施例31人LMP-1剪接變體的分離內含子/外顯子mRNA轉錄剪接變體是在信號轉導和細胞/組織發育中一種相當普遍的調節機制。已證明各種基因的剪接變體能夠改變蛋白-蛋白、蛋白-DNA、蛋白-RNA和蛋白-底物的相互反應。剪接變體也能控制基因表達的組織特異性，使其在不同組織中的表達形式不同(因此功能不同)。剪接變體是細胞中的普遍調節現象。LMP間接變體可能在其他組織中發揮作用，如神經再生、肌肉再生或其他組織的發育。
為篩選人心臟cDNA文庫中的HLMP-1序列剪接變體，制備了對應于序列表中第22號序列部分的一對PCR引物。用標準技術合成的正向PCR引物對應于序列表中第22號序列的33-54位核苷酸。其序列如下5’GAGCCGGCATCATGGATTCC 3’(序列表，第35號序列)反向PCR引物，即序列表中第22號序列的820-839位核苷酸的反向互補序列，其序列如下5’GCTGCCTGCACAATGGAGGT 3’(序列表，第36號序列)通過標準技術，用該正向和反向PCR引物篩選人心臟cDNA(ClonTech，目錄號7404-1)中與HLMP-1相似的序列，所用的循環程序為94℃ 30秒，64℃ 30秒和72℃1分鐘，重復30次，然后72℃孵育10分鐘。凝膠純化擴增的cDNA序列，然后用EmoryDNA Sequence Core Facility對其測序。用標準技術測序這些克隆，用PCGENE(Intelligenetics；SEQUIN和NALIGN程序)檢查序列以確定與序列表中第22號序列的同源性。然后，用Intelligenetic的程序TRANSL將含有相當于序列表第22號序列的假定交替剪接位點的兩個同源性核苷酸序列各自翻譯成它們的蛋白產物。
這兩個全新的人cDNA序列之一(序列表，第37號序列)包含1456bpCGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCCGGGCCAA GCAGGAGCCG GCATCATGGA TTCCTTCAAG 60
GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACCTTGGGGC TTCCGGCTGC AAGGGGGCAA GGACTTCAAT 120GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCTCACTCCT GGGGGCAAAG CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC 180GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CATCGATGGC GAGAATGCGG GTAGCCTCAC ACACATCGAA 240GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTGCGGGGAG CGCCTCAGCC TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG 300X XCCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAAGGTGCAG ACCCCTGACA AACAGCCGCT CCGACCGCTG 360GTCCCAGATG CCAGCAAGCA GCGGCTGATG GAGAACACAG AGGACTGGCG GCCGCGGCCG 420GGGACAGGCC AGTCGCGTTC CTTCCGCATC CTTGCCCACC TCACAGGCAC CGAGTTCATG 480CAAGACCCGG ATGAGGAGCA CCTGAAGAAA TCAAGCCAGG TGCCCAGGAC AGAAGCCCCA 540GCCCCAGCCT CATCTACACC CCAGGAGCCC TGGCCTGGCC CTACCGCCCC CAGCCCTACC 600AGCCGCCCGC CCTGGGCTGT GGACCCTGCG TTTGCCGAGC GCTATGCCCC GGACAAAACG 660AGCACAGTGC TGACCCGGCA CAGCCAGCCG GCCACGCCCA CGCCGCTGCA GAGCCGCACC 720TCCATTGTGC AGGCAGCTGC CGGAGGGGTG CCAGGAGGGG GCAGCAACAA CGGCAAGACT 780CCCGTGTGTC ACCAGTGCCA CAAGGTCATC CGGGGCCGCT ACCTGGTGGC GTTGGGCCAC 840GCGTACCACC CGGAGGAGTT TGTGTGTAGC CAGTGTGGGA AGGTCCTGGA AGAGGGTGGC 900TTCTTTGAGG AGAAGGGCGC CATCTTCTGC CCACCATGCT ATGACGTGCG CTATGCACCC 960AGCTGTGCCA AGTGCAAGAA GAAGATTACA GGCGAGATCA TGCACGCCCT GAAGATGACC 1020TGGCACGTGC ACTGCTTTAC CTGTGCTGCC TGCAAGACGC CCATCCGGAA CAGGGCCTTC 1080TACATGGAGG AGGGCGTGCC CTATTGCGAG CGAGACTATG AGAAGATGTT TGGCACGAAA 1140TGCCATGGCT GTGACTTCAA GATCGACGCT GGGGACCGCT TCCTGGAGGC CCTGGGCTTC 1200AGCTGGCATG ACACCTGCTT CGTCTGTGCG ATATGTCAGA TCAACCTGGA AGGAAAGACC 1260TTCTACTCCA AGAAGGACAG GCCTCTCTGC AAGAGCCATG CCTTCTCTCA TGTGTGAGCC 1320CCTTCTGCCC ACAGCTGCCG CGGTGGCCCC TAGCCTGAGG GGCCTGGAGT CGTGGCCCTG 1380CATTTCTGGG TAGGGCTGGC AATGGTTGCC TTAACCCTGG CTCCTGGCCC GAGCCTGGGC 1440TCCCGGGCCC TGCCCA 1456119bp片段(X之間)缺失所引起的閱讀框漂移和加入的17bp片段(下劃線)導致產生一種截斷的基因產物，其氨基酸序列如下(序列表，第38號序列)Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1 5 10 15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg20 25 30Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp35 40 45
Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile50 55 60Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly65 70 75 80Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Asn Lys Pro Gln LysVal Gln Thr85 90 95Pro Asp LysGln Pro Leu Arg Pro Leu Val Pro Asp Ala Ser Lys Gln100 105 110Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly Thr Gly115 120 125Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr Glu Phe130 135 140Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu His Leu Lys Lys Ser Ser Gln Val Pro145 150 155 160Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Ser Thr Pro Gln Glu Pro Trp165 170 175Pro Gly Pro Thr Ala Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp Ala Val180 185 190Asp Pro Ala Phe Ala Glu Arg Tyr Ala Pro Asp Lys Thr Ser Thr Val195 200 205Leu Thr Arg His Ser Gln Pro Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gln Ser Arg210 215 220Thr Ser Ile Val Gln Ala Ala Ala Gly Gly Val Pro Gly Gly Gly Ser225 230 235 240Asn Asn Gly Lys Thr Pro Val Cys His Gln Cys His Gln Val Ile Arg245 250 255Ala Arg Tyr Leu Val Ala Leu Gly His Ala Tyr His Pro Glu Glu Phe260 265 270Val Cys Ser Gln Cys Gly Lys Val Leu Glu Glu Gly Gly Phe Phe Glu275 280 285Glu Lys Gly Ala Ile Phe Cys Pro Pro Cys Tyr Asp Val Arg Tyr Ala290 295 300Pro Ser Cys Ala Lys Cys Lys Lys Lys Ile Thr Gly Glu Ile Met His305 310 315 320Ala Leu Lys Met Thr Trp His Val Leu Cys Phe Thr Cys Ala Ala Cys325 330 335Lys Thr Pro Ile Arg Asn Arg Ala Phe Tyr Met Glu Glu Gly Val Pro340 345 350Tyr Cys Glu Arg Asp Tyr Glu Lys Met Phe Gly Thr Lys Cys Gln Trp
355 360 365Cys Asp Phe Lys Ile Asp Ala Gly Asp Arg Phe Leu Glu Ala Leu Gly370 375 380Phe Ser Trp His Asp Thr Cys Phe Val Cys Ala Ile Cys Gln He Asn385 390 395400Leu Glu Gly Lys Thr Phe Tyr Ser Lys Lys Asp Arg Pro Leu Cys Lys405 410 415Ser His Ala Phe Ser His Val420這423個氨基酸的蛋白質與序列表中第10號序列顯示的蛋白，除重點標出區域的序列(94-99號氨基酸)由于上述核苷酸改變而不同外，同源性為100％。
第二個全新的人心臟cDNA序列(序列表，第39號序列)包含1575bpCGACGCAGAG CAGCGCCCTG GCCGGGCCAA GCAGGAGCCG GCATCATGGA TTCCTTCAAG 60GTAGTGCTGG AGGGGCCAGC ACCTTGGGGC TTCCGGCTGC AAGGGGGCAA GGACTTCAAT 120GTGCCCCTCT CCATTTCCCG GCTCACTCCT GGGGGCAAAG CGGCGCAGGC CGGAGTGGCC 180GTGGGTGACT GGGTGCTGAG CATCGATGGC GAGAATGCGG GTAGCCTCAC ACACATCGAA 240GCTCAGAACA AGATCCGGGC CTGCGGGGAG CGCCTCAGCC TGGGCCTCAG CAGGGCCCAG 300CCGGTTCAGA GCAAACCGCA GAAGGCCTCC GCCCCCGCCG CGGACCCTCC GCGGTACACC 360TTTGCACCCA GCGTCTCCCT CAACAAGACG GCCCGGCCCT TTGGGGCGCC CCCGCCCGCT 420GACAGCGCCC CGCAACAGAA TGGGTGCAGA CCCCTGACAAACAGCCGCTC CGACCGCTGG 480TCCCAGATGC CAGCAAGCAG CGGCTGATGG AGAACACAGA GGACTGGCGG CCGCGGCCGG 540GGACAGGCCA GTCGCGTTCC TTCCGCATCC TTGCCCACCT CACAGGCACC GAGTTCATGC 600AAGACCCGGA TGAGGAGCAC CTGAAGAAAT CAAGCCAGGT GCCCAGGACA GAAGCCCCAG 660CCCCAGCCTC ATCTACACCC CAGGAGCCCT GGCCTGGCCC TACCGCCCCC AGCCCTACCA 720GCCGCCCGCC CTGGGCTGTG GACCCTGCGT TTGCCGAGCG CTATGCCCCG GACAAAACGA 780GCACAGTGCT GACCCGGCAC AGCCAGCCGG CCACGCCCAC GCCGCTGCAG AGCCGCACCT 840CCATTGTGCA GGCAGCTGCC GGAGGGGTGC CAGGAGGGGG CAGCAACAAC GGCAAGACTC 900CCGTGTGTCA CCAGTGCCAC AAGGTCATCC GGGGCCGCTA CCTGGTGGCG TTGGGCCACG 960CGTACCACCC GGAGGAGTTT GTGTGTAGCC AGTGTGGGAA GGTCCTGGAA GAGGGTGGCT 1020TCTTTGAGGA GAAGGGCGCC ATCTTCTGCC CACCATGCTA TGACGTGCGC TATGCACCCA 1080GCTGTGCCAA GTGCAAGAAG AAGATTACAG GCGAGATCAT GCACGCCCTG AAGATGACCT 1140GGCACGTGCA CTGCTTTACC TGTGCTGCCT GCAAGACGCC CATCCGGAAC AGGGCCTTCT 1200ACATGGAGGA GGGCGTGCCC TATTGCGAGC GAGACTATGA GAAGATGTTT GGCACGAAAT 1260
GCCATGGCTG TGACTTCAAG ATCGACGCTG GGGACCGCTT CCTGGAGGCC CTGGGCTTCA 1320GCTGGCATGA CACCTGCTTC GTCTGTGCGA TATGTCAGAT CAACCTGGAA GGAAAGACCT 1380TCTACTCCAA GAAGGACAGG CCTCTCTGCA AGAGCCATGC CTTCTCTCAT GTGTGAGCCC 1440CTTCTGCCCA CAGCTGCCGC GGTGGCCCCT AGCCTGAGGG GCCTGGAGTC GTGGCCCTGC 1500ATTTCTGGGT AGGGCTGGCA ATGGTTGCCT TAACCCTGGC TCCTGGCCCG AGCCTGGGCT 1560CCCGGGCCCT GCCCA 1575加入17bp片段(粗體、斜體和下劃線)所引起的閱讀框漂移導致在565-567位(下劃線)產生了一個早期終止密碼子。
獲得的氨基酸序列(序列表，第40號序列)由以下153個氨基酸組成Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1 5 10 15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg20 25 30Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp35 40 45Trp Val Leu Ser Ile Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile50 55 60Glu Ala Gln Asn Lys lie Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly65 70 75 80Leu Ser Arg Ala Gln Pro Val Gln Ser Lys Pro Gln LysAla Ser Ala85 90 95Pro Ala Ala Asp Pro Pro Arcr Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Val Ser Leu100 105 110Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Ala Asp Ser Ala115 120 125Pro Gln Gln Asn Gly Cys Arq Pro Leu Thr Asn Ser Ara Ser Asp Arg130 135 140Trp Ser Gln Met Pro Ala Ser Ser Gly145 150該蛋白質顯示與序列表中第10號序列94位氨基酸之前的同源性為100％，從94號氨基酸開始，在核苷酸序列中加入17bp片段導致閱讀框漂移。在94-153號氨基酸區域，該蛋白與序列表中的第10號序列不同源。由于核苷酸序列中所述的早期終止密碼子，序列表中第10號序列的154-457號氨基酸不存在。
實施例32基因組HLMP-1核苷酸序列申請人鑒定了編碼HLMP-1的基因組DNA序列，包括假定與HLMP-1表達相關的調節元件。整個基因組序列見序列表中的第41號序列。該序列得自AC023788(克隆RP11-564G9)，基因組測序中心，華盛頓大學醫學院，密蘇里州圣路易斯。
HLMP-1的假定啟動子區域包括序列表中第41號序列的2,660-8,773號核苷酸。該區域的其他元件包括至少10個潛在的糖皮質激素反應元件(GREs)(6148-6153，6226-6231，6247-6252，6336-6341，6510-6515，6552-6557，6727-6732，6752-6757，7738-7743和8255-8260號核苷酸)，12個潛在的果蠅dpp基因的Sma-2同源物(SMAD)結合元件位點(3569-3575，4552-4558，4582-4588，5226-5232，6228-6234，6649-6655，6725-6731，6930-6936，7379-7384，7738-7742，8073-8079和8378-8384號核苷酸)和三個TATA框(5910-5913，6932-6935和7380-7383號核苷酸)。這三個TATA框、所有的GRE和8個SMAD結合元件(SBEs)都組成了跨越序列表中第41號序列5,841-8,733號核苷酸的區域內。這些調節元件可用于，例如調節編碼參與骨形成過程蛋白質外源性核苷酸序列的表達。這將得以全身給予治療性骨形成和修復相關因子或基因、以及給予組織分化和發育相關因子和基因。
除假定的調節元件之外，還鑒定了與編碼HLMP-1核苷酸序列相對應的13個外顯子。這些外顯子跨越序列表中第41號序列的下述核苷酸位置外顯子1 8733-8767外顯子2 9790-9895外顯子3 13635-13787外顯子4 13877-13907外顯子5 14387-14502外顯子6 15161-15297外顯子7 15401-15437外顯子8 16483-16545外顯子9 16689-16923外顯子10 18068-18248外顯子11 22117-22240外顯子12 22323-22440外顯子13 22575-22911在HLMP-2中有另一外顯子(外顯子5A)，其跨越核苷酸14887-14904。
實施例33HLMP-1在椎間盤細胞中的表達LIM礦化蛋白-1(LMP-1)是一種細胞內蛋白質，能指導骨或非骨組織細胞分化。本實施例證明，在椎間盤細胞中表達人LMP-1(HLMP-1)能增加蛋白聚糖的合成并促進更強的軟骨細胞表型。另外，通過測定聚集蛋白聚糖和BMP-2基因表達證明了HLMP-1表達對細胞基因表達的作用。用溫和的酶消化收集Sprague-Dawley大鼠的腰椎間盤細胞，以單層培養在含有10％FBS的DMEM/F12中。然后將這些細胞分置于6孔板中，每孔約200,000細胞，繼續培養約6天直到細胞達到每孔約300,000個。將培養基換成1％FBS DMEM/F12，并將這一天視為第0天。
前已描述過(例如美國專利6,300,127)含操作性連接于巨細胞病毒(CMV)啟動子的HLMP-1cDNA的復制缺陷5型腺病毒。除HLMP-1cDNA被LacZ cDNA替換外，陰性對照腺病毒與實驗腺病毒相同。所用的陽性對照是在濃度為100納克/毫升BMP-2連續存在下培養的未感染的培養物。
第0天，將培養物在含有1％FBS的300微升培養基中，37℃感染腺病毒30分鐘。用熒光激活細胞分選儀(FACS)分析用含綠熒光蛋白(GFP)基因腺病毒(AdGFP)處理的細胞，以確定使轉基因表達的最優劑量范圍。用含人LMP-1cDNA的腺病毒(AdHLMP-1)(MOI為0、100、300、1000或3000)或含LacZ標記基因的腺病毒(AdLacZMOI為1000)(陰性對照)處理細胞。感染后第3天和第6天調換細胞培養基。
用二甲基亞甲基藍(DMMB)熱計量試驗測定培養基中存在的硫酸葡糖胺多糖(sGAG)(第0、3和6天)，估計蛋白聚糖的產量。
為了定量測定聚集蛋白聚糖和BMP-2mRNA，在第6天收集細胞，用Trizol技術抽提mRNA。用逆轉錄酶將該mRNA轉變為cDNA并用于實時PCR，這可以確定待測聚集蛋白聚糖和BMP-2信使的相對豐度，先前的實驗中設計并測試了這兩種物質的實時引物。使用了Cybergreen技術。用標準曲線定量mRNA豐度。
對于轉染細胞，用光學顯微鏡記錄細胞形態。用AdHLMP-1(MOI 1000)處理的細胞變得更圓，但用AdLacZ處理的細胞沒有這種變化。AdLacZ感染不明顯改變細胞形態。
用FACS分析感染1000個MOI的ADGFP的大鼠椎間盤細胞，顯示感染細胞達到最高百分比(45％)。
sGAG產生和AdhLMP-1MOI之間存在劑量依賴性增加。這些數據可參見圖1，顯示單層培養的大鼠椎間盤細胞經不同MOI感染過表達HLMP-1后sGAG的產量。結果已標準化到第0天未處理細胞。誤差條代表平均值的標準差。如圖1所示，在第3天觀察到的sGAG產生相當少，表明在感染和細胞產生GAG之間有一段滯后時間。用AdLacZ處理不明顯改變sGAG的產生。如圖1所示，最優劑量的AdhLMP-1是1000個MOI，導致第6天sGAG的產生比未處理對照增加260％。更高或更低劑量的AdhLMP-1都導致反應減小。
AdhLMP-1劑量(MOI)對sGAG產生的影響進一步在圖2中說明。圖2是顯示以不同MOI感染AdhLMP-1處理后第6天，大鼠椎間盤sGAG水平的圖表。從圖2中可以看到，AdhLMP-1的最優劑量為MOI 1000。
圖3顯示聚集蛋白聚糖和BMP-2的mRNA的產量。該圖顯示過表達HLMP-1后聚集蛋白聚糖和BMP-2mRNA增加。對第6天抽提自大鼠椎間盤細胞的mRNA進行實時PCR，比較未處理(NT)細胞和用MOI 250感染AdhLMP-1處理的細胞。圖3的數據表示為相對于未處理樣品的增加百分比。如圖3所示，AdhLMP-1處理后，可見聚集蛋白聚糖和BMP-2mRNA明顯增加。BMP-2表達的增加提示BMP-2是介導HLMP-1刺激蛋白聚糖合成的下游基因。
這些數據證明轉染AdhLMP-1能有效增加椎間盤細胞的蛋白聚糖合成。產生最高轉基因表達的病毒劑量(MOI 1000)也能對sGAG產生最大誘導，這提示HLMP-1表達和sGAG誘導之間存在相關性。這些數據說明HLMP-1基因治療是提高椎間盤細胞蛋白聚糖合成的一種方法，也說明HLMP-1是一種治療椎間盤疾病的藥物。
圖4A是顯示以不同MOI Ad-hLMP-1感染12小時后HLMP-1mRNA表達的圖表。在圖4A中，用不同劑量(MOI)的Ad-hLMP-1病毒誘導外源LMP-1表達，并用實時PCR定量。為了比較目的，將這些數據都標準化至Ad-LMP-1的MOI為5時的HLMP-1mRNA水平。陰性對照、未處理(NT)或Ad-LacZ處理(LacZ)組中沒有檢測到HLMP-1。當MOI為25和50時，HLMP-1mRNA水平以劑量依賴的方式達到大約8倍的平臺。
圖4B是顯示感染后3至6天，培養基中的sGAG產量的圖表。用DMMB試驗定量測定了感染后3-6天的總sGAG產量。將圖4B的數據標準化至對照(即未處理)組。從圖4B中可見，sGAG呈劑量依賴性增加，峰值達到對照的大約3倍(用MOI 25和50時)。陰性對照、以MOI 25的Ad-LacZ感染不增加sGAG。在圖4B中，每個結果都表示為三個樣品的平均值和標準差。
圖5是顯示sGAG的產量隨時間變化的圖表。從圖5可見，MOI為25和50時，第3天的sGAG產量明顯增加。在第六天，對AdLMP的反應中sGAG產量呈劑量依賴性增加。sGAG增加在MOI 25時達到平臺期。從圖5也可見，用AdLacZ(LacZ)處理不明顯改變sGAG的產量。每個結果都表示為6-9個樣品的平均值和標準差。圖5中，“**”表示該數據點與未處理對照相比時P值＜0.01。
圖6A和6B是分別顯示大鼠纖維環細胞中聚集蛋白聚糖和BMP-2基因對LMP-1過表達反應的圖表。以MOI 25Ad-LMP-1(LMP-1)感染后第3天進行了定量實時PCR。從圖6A和6B可見，與未處理對照(NT)相比，感染Ad-LMP-1后聚集蛋白聚糖和BMP-2基因表達明顯增加。還有，與未處理對照(NT)相比，以MOI 25的AdLacZ(LacZ)處理不明顯改變聚集蛋白聚糖和BMP-2基因的表達。在圖6A和6B中，每個結果都表示為六個樣品的平均值和SD。在圖6A和6B中，“**”表示該數據點的P值＜0.01。
圖7是顯示大鼠纖維環細胞經MOI 25AdLMP-1感染后，其中HLMP-1mRNA水平隨時間變化的圖。數據表示為，與MOI 5的AdLMP-1感染相比增加的倍數(用18S標準化后)和過度表達LMP-1引物的復制系數。從圖7可見，早在感染后12小時時，HLMP-1mRNA已明顯上調。另外，第1天和第3天之間表達水平也有顯著增加。圖7的每個結果表示為六個樣品的平均值和標準差。
圖8是顯示對HLMP-1過表達反應中BMPs和聚集蛋白聚糖mRNA水平變化的圖表。用實時PCR對用MOI 25Ad-hLMP-1感染后，不同時間點BMP-2、BMP-4、BMP-6、BP-7和聚集蛋白聚糖mRNA水平進行測定。從圖8可見，早在感染Ad-hLMP-1后12小時，BMP-2mRNA已明顯上調。另一方面，聚集蛋白聚糖mRNA直到感染3天后才上調。每個結果表示為六個樣品的平均值和SD。在圖8中，“**”表示感染AdLMP-1的數據點與未處理對照相比時P值＜0.01。
圖9是顯示對HLMP-1表達反應中sGAG產量增加的時間變化。圖9中的數據是大鼠環細胞用MOI 25Ad-HLMP-1感染所得。感染后每3天調換一次培養基，并用DMMB試驗測定一次sGAG。該數據顯示在第6天sGAG產量達到平臺，并基本上維持至第9天。
圖10顯示成頭蛋白(一種BMP拮抗劑)對LMP-1介導sGAG產量增加的影響。如圖10所示，大鼠環細胞用MOI 25Ad-LMP-1感染導致在第3-6天之間產生的sGAG增加三倍。這種增加因加入濃度3200納克/毫升和800納克/毫升的成頭蛋白而被阻斷。然而，如圖10所示，成頭蛋白不明顯改變未感染細胞中的sGAG產生。從圖10也可見，加入BMP-2后，用10納克/毫升的rhBMP-2刺激導致在第3-6天之間sGAG的產量增加三倍。800納克/毫升的成頭蛋白也可阻斷此種增加。
圖11是顯示在培養基中單層培養6天后，LMP-1對sGAG的影響。數據點表示與未處理細胞相比的增加倍數。如圖11所示，含CMV啟動子的LMP當通過AAV載體輸送時，仍能有效刺激單層培養的大鼠椎間盤細胞的葡糖胺多糖合成。
表2用于RT-PCR和SYBR綠實時PCR的引物序列

表2中的GAPDH指甘油醛磷酸脫氫酶表3用于TaqMan實時PCR的引物和探針序列

采用TaqMan核糖體RNA控制試劑(編號4308329，Applied Biosystems，美國加利福尼亞州福斯特城)作為18S核糖體RNA(rRNA)基因的正向引物、反向引物和探針。
骨形成機制-多種BMPs誘導的證據動物和體外研究已經證明，用較低劑量的腺病毒或質粒載體將LIM礦化蛋白-1(LMP-1)cDNA進行離體基因轉移，能夠產生明顯和-致的骨形成效果(Boden等，“基礎科學領域的沃爾沃獎用編碼全新成骨誘導蛋白(LMP-1)的cDNA進行局部基因治療引起腰椎融合”，Spine，23，2486-2492(1998))。然而關于LMP-1的作用機制，轉導的細胞能夠存活多久，或者哪種成骨誘導生長因子和細胞參與了新骨誘導和成骨細胞分化還知之甚少(參見Boden等，“LMP-1，一種LIM結構域蛋白，介導BMP-6對骨形成的作用”，Endocrinology，139，5125-5134(1998)和Boden等，Spine，2486-2492(1998))。而且，體內骨形成的機制(如軟骨與膜狀骨)仍未有定論。了解LMP-1的作用機制對于臨床上最優控制LMP-1誘導的骨形成和進一步了解成骨細胞分化相關細胞內信號傳導途徑是有幫助的。
LMP-1是異質性LIM結構域蛋白家族的一員，并且是與成骨細胞分化直接相關的第一成員(Kong等，“肌肉LIM蛋白可通過增強MyoD的活性促進肌生成”，Mol.Cell.Biol.，17，4750-4760(1997))。LIM-1在受糖皮質激素刺激的大鼠顱骨成骨細胞的信使核糖核酸(mRNA)中鑒定到，后來從骨肉瘤的互補脫氧核糖核酸(cDNA)文庫中分離得到(Boden等，Endocrinology，139，5125-5134(1998))。與通過細胞表面受體起作用的細胞外蛋白BMPs不同，認為LMP-1是細胞內信號傳遞分子，直接參與成骨細胞的分化(Boden等，Spine，20，2626-2632(1995)；Cook等，“重組人生骨蛋白-1在非人靈掌類中對節段性缺損愈合的影響”，J.Bone Joint Surg.，77-A，734-750(1995)；Schimandle等，“用重組人骨形態發生蛋白-2(rhBMP-1)產生的實驗性脊柱融合”，Spine，20，1326-1337(1995))。因此，LMP的治療性用途可包括其cDNA的基因轉移。根據它與骨發育的關系以及抑制和過度表達實驗的結果，認為LMP能夠誘導具有成骨誘導活性的可溶性因子的分泌，并且是體內體外成骨細胞分化和成熟的一種重要調節劑。
下面描述進行的幾方面研究1)鑒定LMP-1誘導的分泌型成骨誘導因子的候選物；2)描述LMP-1誘導的骨形成的組織學順序和類型；3)確定過度表達LMP-1的植入細胞在體內存活多長時間。
本研究中，利用人肺癌(A549)細胞確定LMP-1過度表達是否能體外誘導骨形態發生蛋白的表達。用含有LMP-1或LacZ cDNA的重組復制缺陷型人腺病毒5型感染培養的A549細胞。48小時后用免疫組化分析細胞。最后，16只無胸腺大鼠接受由載有感染了上述兩種病毒之一的人暗黃層細胞的膠原蛋白盤組成的皮下植入物。一定時間間隔后，無痛處死大鼠，取出植入物，用組織學和免疫組化分析。
材料和方法第1階段體外檢測LMP誘導的成骨誘導因子將帶有人巨細胞病毒啟動子的人LMP-1cDNA克隆入一個轉移載體中，然后轉移到上述重組復制缺陷型(E1、E3缺失)腺病毒中。
已知人肺癌細胞(A549)受人5型腺病毒的感染率很高。將這些細胞以50,000細胞/厘米2的密度接種于2孔室載玻片上(Nalge Nunc International，伊利諾斯州內珀維爾)，在含10％胎牛血清的F12Kaighn’s培養基(Gibco BRL)中增殖，37℃培養在潮濕的5％CO2培養箱中。
在孔室上，37℃感染A549細胞30分鐘，感染復數(MOI)為10pfu/孔。加入含10％FBS的培養基后37℃培養細胞48小時。細胞分別用人巨細胞病毒啟動子驅動的AdLMP-1(活性LMP)或AdLacZ(Ad βgal-腺病毒對照)感染(Boden等，Endocrinology，139，5125-5134(1998)和Boden等，Spine，23，2486-2492(1998))。作為另一陰性對照，一些細胞不感染腺病毒(未處理對照)。48小時后，將孔室載玻片上的細胞置于50％丙酮/50％甲醇中固定2分鐘，然后用免疫組化分析(見下述)，所用抗體是LMP-1、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-β1、MyoD和II型膠原蛋白的特異性抗體。
第2階段體內骨形成的組織學順序本實驗方案得到了實驗動物照料和使用委員會和人類研究委員會的審查和批準。靜脈穿刺獲得兔或人外周血(3毫升)，1200xg，10分鐘簡單離心分離得到暗黃層細胞。計數這些細胞，用腺病毒(AdLMP-1或AdLacZ)以MOI 4.0pfu/細胞37℃感染1×106細胞10分鐘。感染后，將細胞重懸，至最終體積80微升，施加至7毫米×7毫米×3毫米的膠原盤(牛I型膠原)上。
購得(Harlan，印第安納州印第安納波利斯)16只4-5周齡的無胸腺大鼠，飼養在無菌環境下。吸入1-2％異氟烷使大鼠麻醉。在無胸腺大鼠的胸部作4個10毫米的皮膚切口，通過鈍器解剖將其擴大成袋，然后將含有細胞的膠原盤植入各個袋中。植入物由載有感染了AdLMP-1(每只鼠2個)或AdLacZ(每只鼠2個)的暗黃層細胞的膠原盤組成。用可吸收縫線縫合皮膚。植入后1天、3天、5天、7天、14天、21天和28天分別處死動物，取出植入物，用組織學和免疫組化分析。
樣品在10％福爾馬林中性緩沖液中固定24小時。將樣品制備成非脫鈣和脫鈣切片。通過梯度乙醇液將非脫鈣切片樣品脫水，石蠟包埋。用10％乙二胺四乙酸(EDTA)溶液將植入后21天和28天的樣品脫鈣3至5天。脫鈣后，用梯度乙醇將樣品脫水石蠟包埋。將樣品在顯微切片機(Reichert Jung GmbH，德國海德爾堡)上切成5微米厚的薄片。用蘇木精和伊紅染色、Goldner’s三色染色薄片，并用BMP-4、BMP-7、CD-45和I型膠原蛋白的特異性抗體進行免疫組化研究。
制備第一抗體抗LMP-1抗體抗LMP-1抗體是親和純化的針對人LMP-1某內部區域的兔多克隆抗體，能與兔和人源的LMP-1反應。該抗體可用于鑒定LMP-1蛋白，稀釋度是1∶500或1∶1000。
抗BMP-2、抗BMP-4、抗BMP-6、抗BMP-7和抗TGF-β1抗體多克隆山羊抗BMP-2、抗BMP-4、抗BMP-6、抗BMP-7和抗TGF-β1抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，加利福尼亞州圣克魯斯)能與小鼠、大鼠和人BMPs交叉反應。抗BMP-2、抗BMP-4和抗BMP-6抗體針對人源BMP-2、BMP-4和BMP-6的氨基末端某表位。抗BMP-7抗體是親和純化的針對人BMP-7內部某區域免疫的山羊多克隆抗體。抗TGF-β1抗體是親和純化的針對人TGF-β1前體羧基末端的山羊多克隆抗體。這些抗體的應用稀釋度為1∶100和1∶500或1∶1000。
抗CD45抗體單克隆小鼠抗人白細胞共同抗原(LCA)CD45抗體(純化的IgG 1，κ；DAKO公司，加利福尼亞州Carpinteria)由兩個抗體組成，即針對不同表位的PD7/26和2B11抗體。PD7/26獲自T細胞生長因子維持的外周血白細胞。2B11由分離自T細胞淋巴瘤或白血病的腫瘤細胞獲得。免疫熒光測試時，這兩種抗體能結合94-96％的白細胞或單核細胞。本研究中，該抗體以1∶100稀釋度用于鑒定人白細胞。
抗I型膠原蛋白抗體單克隆抗I型膠原蛋白抗體(小鼠IgG 1同種型；Sigma化學品公司，密蘇里州圣路易斯)由I型膠原蛋白雜交瘤獲得，該雜交瘤是用牛皮膚I型膠原蛋白免疫的BALB/c小鼠的脾臟細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合產生的。該抗體能與人、牛、兔、鹿、豬和大鼠I型膠原蛋白反應，應用稀釋度為1∶100。
抗II型膠原蛋白抗體多克隆兔抗II型膠原蛋白抗體(Santa CruzBiotechnology，Inc.，加利福尼亞州圣克魯斯)針對人II型膠原蛋白α-1鏈氨基末端某相應表位。該抗體能與小鼠、大鼠和人源I型膠原蛋白α-1鏈反應，應用稀釋度為1∶100。
抗MyoD抗體多克隆兔抗MyoD抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，加利福尼亞州圣克魯斯)針對代表全長鼠源MyoD蛋白1-318號氨基酸相應的某表位。該抗體能與小鼠、大鼠和人源MyoD反應(不與肌細胞生成素、Myf-5或Myf-6反應)，應用稀釋度為1∶1000。
免疫組化染色用標記的鏈霉親和素-生物素方法(LSAB法)進行染色程序。用試劑盒(通用LSAB試劑盒，過氧化物酶；DAKO公司，加利福尼亞州Carpinteria)和抗LMP-1、BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-β1、CD-45、MyoD、I型膠原蛋白和II型膠原蛋白抗體進行免疫染色。根據產生第一抗體動物種類采用合適的生物素化第二抗體。用含0.3％過氧化氫的甲醇封閉內源性過氧化物酶。用含5％正常兔血清或5％正常山羊血清，和1％牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液(PBS)室溫孵育樣品15分鐘，以避免非特異性結合，然后用合適濃度的第一抗體，在4℃潮濕箱中孵育過夜。用PBS洗滌3次，每次5分鐘后，用生物素化第二抗體和鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物在潮濕箱中室溫孵育10分鐘，用3，3-四氯化二氨基聯苯胺(DAB；DAKO公司，加利福尼亞州Carpinteria)顯色。最后，用蘇木精復染切片。陰性對照在第一抗體與樣品孵育前，用相應的封閉肽(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，加利福尼州圣克魯斯)室溫孵育3小時。在一些實驗中，只用第一抗體或第二抗體作為附加陰性對照。
結果第1階段體外檢測LMP誘導的成骨誘導因子如圖12A-12D所示，轉染AdLMP-1的A549細胞，顯示細胞內LIM-1蛋白染色很強。圖12A-12D是A549細胞感染AdLMP-1(圖12A)、Adβgal(圖12C)48小時后或未處理細胞(圖12D)的LIM-1蛋白免疫組化染色顯微照片。從圖12A、12C和12D可見，感染AdLMP-1(圖12A)的細胞中出現特異性細胞內反應，而兩個對照(圖12C和12D)中無反應。由于第一抗體預先接觸封閉肽而去除了陽性細胞內染色(圖12B)，從而避免非特異性反應的可能。圖12A-12D的顯微照片是原始放大132倍拍攝的。
在AdLMP-1處理細胞，尤其在胞漿中中觀察到BMP-2、BMP-4和BMP-7的強染色，如圖13A-13F所示。圖13A-13F是A549細胞感染AdLMP-1(上排-圖13A、圖13B和圖13C)或Adβgal(下排-圖13D、圖13E和圖13F)48小時后，免疫組化染色的顯微照片。在AdLMP-1處理細胞中存在BMP-2(圖13A)、BMP-4(圖13B)和BMP-7(圖13C)的特異性細胞內染色，而Adβgal處理細胞(分別是圖13D、13E和13F)中沒有。圖13A-13F的顯微照片是原始放大132倍拍攝的。
圖3A-3D顯示采用抗BMP-6和抗TGF-β1抗體，AdLMP-1處理細胞也呈陽性染色。圖14A-14D是A549細胞感染AdLMP-1(上排-圖14A和圖14B)或Adβgal(下排-圖14C和圖14D)48小時后，免疫組化染色的顯微照片。AdLMP-1處理細胞中存在BMP-6(圖14A)和TGF-β1(圖14B)特異性細胞內染色，而Adβgal處理細胞(分別是圖14C和14D)中沒有。然而，這些反應比其他BMPs看到的反應稍弱。在Adβgal感染的和未處理對照中，細胞對LMP-1、任何BMPs或TGF-β1均無特異性反應。每種抗體的封閉肽確證了此反應的特異性。用抗II型膠原蛋白或抗MyoD抗體沒有發現特異性反應(數據未顯示)。圖14A-14D的顯微照片是原始放大132倍拍攝的。
第2階段體內骨形成的組織學順序組織學檢查-免疫組化白細胞的免疫學定位。植入后1天和3天，在AdLMP-1(活性)和Adβgal(對照)處理植入物中的暗黃層細胞制品中出現了大量抗CD-45抗體染色的細胞，見圖15A-15D所示。
圖15A-15D是膠原基質皮下植入無胸腺大鼠胸部3天(圖15A和C)或5天(圖15B和D)后切取的感染AdLMP-1(上排-圖15A和圖15B)或Adβgal(下排-圖15C和圖15D)的人暗黃層細胞中，白細胞表面標記CD45的免疫組化染色顯微照片。CD45抗原特異性染色細胞的數量在兩個處理組中均迅速降低。該發現提示植入的人細胞不能長期存活，骨形成可能依賴于宿主細胞的流入。特異性抗-人CD-45反應染色的細胞數量在第3天后減少，尤其是在植入物的中心。第5天在植入物外圍仍可見陽性染色，但是植入10天后，被抗CD-45染色的細胞就很少了。這種染色減少的模式在活性和對照植入物中是相同的。圖15A-15D的顯微照片是原始放大132倍拍攝的。
BMPs的免疫學定位。在AdLMP-1處理的植入物中，植入3和5天后，免疫組化揭示膠原纖維上細胞內呈BMP-4(圖16A-16D)和BMP-7(圖17A-17D)強染色。
圖16A-16D是膠原基質皮下植入無胸腺大鼠胸部3天(圖5A和C)或5天(圖5B和D)后切取的感染AdLMP-1(上排-圖16A和圖16B)或Adβgal(下排-圖16C和圖16D)的人暗黃層細胞，BMP-4的免疫組化染色顯微照片。AdLMP-1處理細胞的BMP-4特異性細胞內染色在Adβgal處理細胞中不存在。圖16A-16D的顯微照片是原始放大132倍拍攝的。
圖17A-17D是膠原基質皮下植入無胸腺大鼠胸部3天(圖17A和C)或5天(圖17B和D)后切取的感染AdLMP-1(上排-圖17A和圖17B)或Adβgal(下排-圖17C和圖17D)的人暗黃層細胞，BMP-7的免疫組化染色顯微照片。AdLMP-1處理細胞的BMP-7特異性細胞內染色在Adβgal處理細胞中不存在。圖17A-17D的顯微照片是原始放大132倍拍攝的。
從圖16A-16D和17A-17D可見，在Adβgal(對照)植入物的細胞中沒有發現BMP-4或BMP-7的特異性染色。而且，在植入超過10天的每個時間點，AdLMP-1植入物中也可見抗BMP-4和抗BMP-7強染色。在兩個時間階段都觀察到了BMP-4和BMP-7強染色第一階段是早期(即植入后3和5天)暗黃層細胞的數目已有限，第二階段是10天后見于基質包圍的成骨樣細胞中這類細胞很可能是反應性細胞而非移植的暗黃層細胞，如圖18所示。
圖18是膠原基質皮下植入無胸腺大鼠胸部14天后切取的感染AdLMP-1的人暗黃層細胞，BMP-7的免疫組化染色高倍顯微照片。與較早期時間點相比，BMP-7的染色更強，現已伴有大多數與新骨基質形成密切相關的細胞。圖18的顯微照片是原始放大132倍拍攝的。
I型膠原蛋白的免疫學定位在植入后7、10、14、21和28天的AdLMP-1植入物中觀察到抗I型膠原蛋白抗體產生的強染色。在早期時間點，特異性反應出現在成骨樣細胞毗鄰區域以及細胞本身的周圍。在用Adβgal處理的對照植入物中，I型膠原蛋白染色極少。
蘇木精和伊紅，以及Goldner’s三色染色無論用兔或人暗黃層細胞的結果都相同。為避免重復，下面的描述和相應的說明只針對人源細胞。在植入后1和3天，在Ad-LMP植入物邊緣的細胞數量增加，如圖19A-19D所示。
圖19A-19D是膠原基質皮下植入無胸腺大鼠胸部1天(圖19A和19C)或3天(圖19B和19D)后切取的感染AdLMP-1(上排-圖19A和圖19B)或Adβgal(下排-圖19C和圖19D)的人暗黃層細胞的顯微照片。在兩個時間點的AdLMP-1植入物中，植入物外圍細胞密度較高，提示了宿主細胞的遷移。圖19A-19D的顯微照片是用Goldner三色染色后，原始放大33倍拍攝的。
在Adβgal對照中，在相同時間點(即植入后1和3天)外圍幾乎看不到細胞。這些觀察結果提示表達LMP-1的宿主細胞遷移進入植入物中，如圖20A和20B所示。這些細胞是單核細胞和多形核白細胞的混合物。圖20A和20B是用膠原基質皮下植入無胸腺大鼠胸部1天后切取的感染AdLMP-1或Adβgal的人暗黃層細胞的高倍顯微照片。如圖20A所示，在含感染Adβgal細胞的膠原(C)植入物外圍細胞相當少(箭頭)。在植入物中心可見暗黃層細胞和紅細胞影。如圖20B所示，在AdLMP植入物中，膠原(C)植入物外圍的有核細胞密度較高，提示宿主細胞從周圍軟組織的遷入。這些細胞包括單核細胞、多形核細胞和組織細胞類似細胞。圖20A-20D的顯微照片是用蘇木精和伊紅染色后，原始放大100倍(圖20A)和160倍(圖20B)拍攝的。
圖21A-21J是膠原基質皮下植入無胸腺大鼠胸部后不同時間點切取的感染AdLMP-1(上排-圖21A-21E)或Adβgal(下排-圖21F-21J)的人暗黃層細胞的顯微照片。至第7天觀察到的礦化基質證明已進展到膜狀骨的形成(圖21C)。在包含感染Adβgal的細胞的植入物中，沒有看到骨形成(圖21F-21J)。圖21A-21J的顯微照片是用Goldner三色染色后，原始放大33倍拍攝的。
如圖21A-21E所示，隨時間推移，與膠原纖維結合的暗黃層細胞越來越少，至植入后5大Adβgal處理的植入物中心存活細胞數目減少。
圖22A-22C是膠原基質皮下植入無胸腺大鼠胸部后的不同時間點切取的感染AdLMP-1的人暗黃層細胞的高倍顯微照片。從圖22A可見，植入7天后的AdLMP-1植入物外圍，毗鄰成骨樣細胞(箭頭)的膠原纖維之間，可以看到新的礦化骨基質(B)。成骨樣細胞(箭頭)周圍的基質迅速礦化，但沒有典型類骨質接縫和特定取向。從圖22B可見，整個AdLMP-1移植物所處空間中已經形成成熟的新骨；至第28天，大多數膠原蛋白骨架已重吸收。當看到成骨細胞(OC)重建原代編織骨(B)時，可以看到成骨細胞(箭頭)覆蓋了類骨質和新形成骨的表面。最后，從圖22C可見，在骨(B)內部形成了造血骨髓組織，包括骨髓基質(S)和血管(V)。圖22A-22C的顯微照片是用Goldner三色染色后，原始放大160倍拍攝的。
從圖22A可見，植入7天后的AdLMP-1植入物外圍，與成骨樣細胞毗鄰的膠原纖維之間，可以看到新的骨基質。周圍基質迅速礦化，但沒有典型類骨質接縫和特定取向。缺乏有組織的骨生長取向并不令人驚訝，因為這些是沒有受到明顯負荷的皮下植入物。植入后10天，在AdLMP-1植入物中觀察到了更豐富的成骨樣細胞，它們正長入膠原纖維的空隙內。至植入后14天，成骨樣細胞已占據AdLMP-1植入物的中心區域。相反，在Adβgal處理的植入物中，成骨樣細胞充滿了膠原蛋白的空隙。植入后21天，在AdLMP-1植入物中心區域的大部分或全部，新的骨基質已礦化并形成。植入后28天，在AdLMP-1植入物最中心區域的空間中形成了成熟新骨。當看到成骨細胞重建初級編織骨的同時可以看到成骨細胞覆蓋了類骨質和新形成骨的表面(圖22B)。在骨內部也可見造血骨髓組織正在形成(圖22C)。在Adβgal處理的對照中，至28天，大部分植入的膠原已被吸收，為纖維組織所替代。
如上所述，體外用A549細胞進行的實驗顯示，AdLMP-1感染的細胞表達高水平的BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7和TGF-β1蛋白。當感染了AdLMP-1的人暗黃層細胞異位移植于無胸腺大鼠后72小時，顯示BMP-4和BMP-7蛋白水平升高，這確證了體外的假設。
根據上述研究的結果，因此證明LMP-1的成骨誘導性能涉及幾種BMPs的合成和分化并參與直接膜狀骨形成的宿主細胞的聚集。因此，用LMP-1cDNA進行的基因治療可能為大劑量植入單一BMPs以誘導新骨形成提供一種替代方法。
本發明提供一種在細胞中誘導一種或多種骨形態發生蛋白或轉化生長因子-β(TGF-βs)蛋白表達的方法。該方法包括用含有操作性連接于一啟動子的編碼LIM礦化蛋白的核酸序列的分離核酸轉染細胞。可根據本發明誘導選自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-β1及其組合的一種或多種蛋白的表達。所述分離核酸可以是能在標準條件下與序列表中第25號序列的全長互補核酸分子雜交的核酸；和/或能在高度嚴謹條件下與序列表中第26號序列的全長互補核酸分子雜交的核酸。所述細胞可以是暗黃層細胞、干細胞(如間充質干細胞或多能干細胞)或椎間盤細胞(如髓核細胞或纖維環細胞)。可以在離體或體內轉染該細胞。例如，可通過把核酸直接注射到哺乳動物的椎間盤內體內轉染細胞。
所述核苷酸序列編碼的LIM礦化蛋白可以是RLMP、HLMP-1、HLMP-1s、HLMP-2或HLMP-3。所述啟動子可以是巨細胞病毒啟動子。根據本發明的一個實施例，LIM礦化蛋白是一種LMP-1蛋白。所述核酸可包含在載體(例如表達載體，如質粒)中。此載體也可以是病毒，如腺病毒或逆轉錄病毒。本發明可用的一個腺病毒實例是AdLMP-1。
本發明的第二方面提供過表達一種或多種骨形態發生蛋白或轉化生長因子-β蛋白質的細胞。該細胞可以是能過表達選自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-β1及其組合的一種或多種蛋白質的細胞。該細胞可以是暗黃層細胞、椎間盤細胞、間充質干細胞或多能干細胞。也提供一種包含上述細胞和載體材料的植入物。本發明還提供一種在哺乳動物中誘導骨形成的方法，該方法包括將上述細胞或植入物引入哺乳動物中；還提供一種治療哺乳動物椎間盤疾病的方法，該方法包括將上述細胞引入哺乳動物的椎間盤中。
本

發明內容
中骨形態發生蛋白或轉化生長因子-β蛋白的過表達是指，細胞表達該蛋白質的水平高于該特定細胞中的正常表達水平(如所述蛋白表達水平高于未轉染含有操作性連接于一啟動子的編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列分離核酸的細胞的表達水平)。所述細胞可以是能正常表達一種或多種骨形態發生蛋白或轉化生長因子-β蛋白的細胞。所述細胞也可以是不能正常表達一種或多種骨形態發生蛋白或轉化生長因子-β蛋白的細胞。
雖然以上說明書提出了本發明的原理，為闡述也提供了實施例，但是本領域技術人員明白通過閱讀本發明可容易地進行各種形式和細節的改變，但這些改變仍屬于本發明的實際范圍。
PCT 057125


由國際局填寫

序列表<110>W.F.麥克凱(McKay，William F.)S.伯登(Boden M.D.，Scott D)S.永恩(Yoon，Sangwook T.)<120>在細胞中誘導骨形態發生蛋白(BMPs)和轉化生長因子-β蛋白(TGF-βs)表達的方法<130>3819-002-53<140>
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<150>US 60/331,321<151>2001-11-14<160>42<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>457<212>PRT<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<400>1Met Asp Ser Phe Lys Val Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Trp Gly Phe1 5 10 15Arg Leu Gln Gly Gly Lys Asp Phe Asn Val Pro Leu Ser Ile Ser Arg20 25 30Leu Thr Pro Gly Gly Lys Ala Ala Gln Ala Gly Val Ala Val Gly Asp35 40 45Trp Val Leu Ser Ile Asp Gly Glu Asn Ala Gly Ser Leu Thr His Ile50 55 60Glu Ala Gln Asn Lys Ile Arg Ala Cys Gly Glu Arg Leu Ser Leu Gly65 70 75 80Leu Ser Arg Ala Gln Pro Ala Gln Ser Lys Pro Gln Lys Ala Leu Thr85 90 95Pro Pro Ala Asp Pro Pro Arg Tyr Thr Phe Ala Pro Ser Ala Ser Leu100 105 110Asn Lys Thr Ala Arg Pro Phe Gly Ala Pro Pro Pro Thr Asp Ser Ala115 120 125Leu Ser Gln Asn Gly Gln Leu Leu Arg Gln Leu Val Pro Asp Ala Ser130 135 140Lys Gln Arg Leu Met Glu Asn Thr Glu Asp Trp Arg Pro Arg Pro Gly145 150 155 160Thr Gly Gln Ser Arg Ser Phe Arg Ile Leu Ala His Leu Thr Gly Thr165 170 175Glu Phe Met Gln Asp Pro Asp Glu Glu Phe Met Lys Lys Ser Ser Gln180 185 190Val Pro Arg Thr Glu Ala Pro Ala Pro Ala Ser Thr Ile Pro Gln Glu195 200 205Ser Trp Pro Gly Pro Thr Thr Pro Ser Pro Thr Ser Arg Pro Pro Trp210 215 220
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tatgcaccca gctgtgccaa atgcaagaag aagatcactg gagagatcat gcatgcgctg 1140aagatgacct ggcatgttcc ctgcttcacc tgtgcagcct gcaaaacccc tatccgcaac 1200agggctttct acatggagga gggggctccc tactgcgagc gagattacga gaagatgttt 1260ggcacaaagt gtcgcggctg tgacttcaag atcgatgccg gggaccgttt cctggaagcc 1320ctgggtttca gctggcatga tacgtgtttt gtttgcgcaa tatgtcaaat caacttggaa 1380ggaaagacct tctactccaa gaaggacaag cccctgtgca agagccatgc cttttcccac 1440gtatgagcac ctcctcacac tactgccacc ctactctgcc agaagggtga taaaatgaga 1500gagctctctc tccctcgacc tttctgggtg gggctggcag ccattgtcct agccttggct 1560cctggccaga tcctggggct ccctcctcac agtccccttt cccacacttc ctccaccacc 1620accaccgtca ctcacaggtg ctagcctcct agccccagtt cactctggtg tcacaataaa 1680cctgtatgta gctgtg 1696<210>3<211>260<212>DNA<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<400>3ttctacatgg aggagggggc tccctactgc gagcgagatt acgagaagat gtttggcaca 60aagtgtcgcg gctgtgactt caagatcgat gccggggacc gtttcctgga agccctgggt 120ttcagctggc atgatacgtg ttttgtttgc gcaatatgtc aaatcaactt ggaaggaaag 180accttctact ccaagaagga caagcccctg tgcaagagcc atgccttttc ccacgtatga 240gcacctcctc acactactgc 260<210>4<211>16<212>DNA<213>莫落尼鼠類白血病毒(MMLV)<400>4aagctttttt tttttg 16<210>5<211>13<212>DNA<213>莫落尼鼠類白血病毒(MMLV)<400>5aagcttggct atg 13<210>6<211>223<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>6atccttgctc acctcacggg caccgagttc atgcaagacc cggatgagga gcacctgaag 60aaatcaagcc aggtgcccag gacagaagcc ccagccccag cctcatctac accccaggag 120ccctggcctg gccctaccgc ccccagccct accagccgcc cgccctgggc tgtggaccct 180gcgtttgccg agcgctatgc cccagacaaa accagcacag tgc 223<210>7<211>717<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)
<400>7atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg 60ggcaaggact tcaatgtgcc cctctccatt tcccggctca ctcctggggg caaagcggcg 120caggccggag tggccgtggg tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc 180ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc 240ctcagcaggg cccagccggt tcagagcaaa ccgcagaagg cctccgcccc cgccgcggac 300cctccgcggt acacctttgc acccagcgtc tccctcaaca agacggcccg gccctttggg 360gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcaa cagaatggac agccgctccg accgctggtc 420ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg 480acaggccagt cgcgttcctt ccgcatcctt gcccacctca caggcaccga gttcatgcaa 540gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc 600ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc 660cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgccccgga caaaacg717<210>8<211>1488<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>8atcgatggcg agaatgcggg tagcctcaca cacatcgaag ctcagaacaa gatccgggcc 60tgcggggagc gcctcagcct gggcctcagc agggcccagc cggttcagag caaaccgcag 120aaggcctccg cccccgccgc ggaccctccg cggtacacct ttgcacccag cgtctccctc 180aacaagacgg cccggccctt tggggcgccc ccgcccgctg acagcgcccc gcaacagaat 240ggacagccgc tccgaccgct ggtcccagat gccagcaagc agcggctgat ggagaacaca 300gaggactggc ggccgcggcc ggggacaggc cagtcgcgtt ccttccgcat ccttgcccac 360ctcacaggca ccgagttcat gcaagacccg gatgaggagc acctgaagaa atcaagccag 420gtgcccagga cagaagcccc agccccagcc tcatctacac cccaggagcc ctggcctggc 480cctaccgccc ccagccctac cagccgcccg ccctgagctg tggaccctgc gtttgccgag 540cgctatgccc cggacaaaac gagcacagtg ctgacccggc acagccagcc ggccacgccc 600acgccgctgc agagccgcac ctccattgtg caggcagctg ccggaggggt gccaggaggg 660ggcagcaaca acggcaagac tcccgtgtgt caccagtgcc acaaggtcat ccggggccgc 720tacctggtgg cgttgggcca cgcgtaccac ccggaggagt ttgtgtgtag ccagtgtggg 780aaggtcctgg aagagggtgg cttctttgag gagaagggcg ccatcttctg cccaccatgc 840tatgacgtgc gctatgcacc cagctgtgcc aagtgcaaga agaagattac aggcgagatc 900atgcacgccc tgaagatgac ctggcacgtg cactgcttta cctgtgctgc ctgcaagacg 960cccatccgga acagggcctt ctacatggag gagggcgtgc cctattgcga gcgagactat 1020gagaagatgt ttggcacgaa atgccatggc tgtgacttca agatcgacgc tggggaccgc 1080ttcctggagg ccctgggctt cagctggcat gacacctgct tcgtctgtgc gatatgtcag 1140atcaacctgg aaggaaagac cttctactcc aagaaggaca ggcctctctg caagagccat 1200gccttctctc atgtgtgagc cccttctgcc cacagctgcc gcggtggccc ctagcctgag 1260gggcctggag tcgtggccct gcatttctgg gtagggctgg caatggttgc cttaaccctg 1320gctcctggcc cgagcctggg ctcccgggcc cctgcccacc caccttatcc tcccacccca 1380ctccctccac caccacagca caccggtgct ggccacacca gccccctttc acctccagtg 1440ccacaataaa cctgtaccca gctgaattcc aaaaaatcca aaaaaaaa 1488<210>9<211>1644<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>9atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg 60ggcaaggact tcaatgtgcc cctctccatt tcccggctca ctcctggggg caaagcggcg 120
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<223>人工序列的說明馬拉松賽跑反應的銜接子
<400>19ctaatacgac tcactatagg gctcgagcgg ccgcccgggc aggt 44<210>20<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說明馬拉松賽跑銜接頭的特異性的PCR引物<400>20ccatcctaat acgactcact atagggc 27<210>21<211>765<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>21ccgttgtttg taaaacgacg cagagcagcg ccctggccgg gccaagcagg agccggcatc 60atggattcct tcaaggtagt gctggagggg ccagcacctt ggggcttccg gctgcaaggg 120ggcaaggact tcaatgtgcc ctcctccatt tcccggctca cctctggggg caaggccgtg 180caggccggag tggccgtaag tgactgggtg ctgagcatcg atggcgagaa tgcgggtagc 240ctcacacaca tcgaagctca gaacaagatc cgggcctgcg gggagcgcct cagcctgggc 300ctcaacaggg cccagccggt tcagaacaaa ccgcaaaagg cctccgcccc cgccgcggac 360cctccgcggt acacctttgc accaagcgtc tccctcaaca agacggcccg gcccttgggg 420gcgcccccgc ccgctgacag cgccccgcag cagaatggac agccgctccg accgctggtc 480ccagatgcca gcaagcagcg gctgatggag aacacagagg actggcggcc gcggccgggg 540acaggccagt gccgttcctt tcgcatcctt gctcacctta caggcaccga gttcatgcaa 600gacccggatg aggagcacct gaagaaatca agccaggtgc ccaggacaga agccccagcc 660ccagcctcat ctacacccca ggagccctgg cctggcccta ccgcccccag ccctaccagc 720cgcccgccct gggctgtgga ccctgcgttt gccgagcgct atgcc 765<210>22<211>1689<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>22cgacgcagag cagcgccctg gccgggccaa gcaggagccg gcatcatgga ttccttcaag 60gtagtgctgg aggggccagc accttggggc ttccggctgc aagggggcaa ggacttcaat 120gtgcccctct ccatttcccg gctcactcct gggggcaaag cggcgcaggc cggagtggcc 180gtgggtgact gggtgctgag catcgatggc gagaatgcgg gtagcctcac acacatcgaa 240gctcagaaca agatccgggc ctgcggggag cgcctcagcc tgggcctcag cagggcccag 300ccggttcaga gcaaaccgca gaaggcctcc gcccccgccg cggaccctcc gcggtacacc 360tttgcaccca gcgtctccct caacaagacg gcccggccct ttggggcgcc cccgcccgct 420gacagcgccc cgcaacagaa tggacagccg ctccgaccgc tggtcccaga tgccagcaag 480cagcggctga tggagaacac agaggactgg cggccgcggc cggggacagg ccagtcgcgt 540tccttccgca tccttgccca cctcacaggc accgagttca tgcaagaccc ggatgaggag 600cacctgaaga aatcaagcca ggtgcccagg acagaagccc cagccccagc ctcatctaca 660ccccaggagc cctggcctgg ccctaccgcc cccagcccta ccagccgccc gccctgggct 720gtggaccctg cgtttgccga gcgctatgcc ccggacaaaa cgagcacagt gctgacccgg 780cacagccagc cggccacgcc cacgccgctg cagagccgca cctccattgt gcaggcagct 840gccggagggg tgccaggagg gggcagcaac aacggcaaga ctcccgtgtg tcaccagtgc 900
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1.一種在細胞中誘導一種或多種骨形態發生蛋白或轉化生長因子-β蛋白質表達的方法，該方法包括用包含操作性連接于一啟動子的編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列的分離核酸轉染細胞。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述LIM礦化蛋白誘導選自BMP-2、BMP-4、BMP-6、BMP-7、TGF-β1及其組合一種或多種蛋白質的表達。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述LIM礦化蛋白選自RLMP、HLMP-1、HLMP-1s、HLMP-2、HLMP-3或它們的組合。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述LIM礦化蛋白是HLMP-1。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述細胞選自干細胞、椎間盤細胞、髓核細胞、纖維環細胞和暗黃層細胞。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，用分離核酸轉染細胞，包括用含有分離核酸的重組腺病毒載體感染該細胞，該分離核酸編碼選自RLMP、HLMP-1、HLMP-1s、HLMP-2、HLMP-3或它們的組合的蛋白質。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述骨形態發生蛋白是BMP-4。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述骨形態發生蛋白是BMP-7。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述轉染細胞包括一種椎間植入物。
全文摘要
描述了一種在細胞中誘導一種或多種骨形態發生蛋白(BMPs)和/或轉化生長因子－β(TGF－βs)蛋白表達的方法。該方法包括用包含操作性連接于一啟動子的編碼LIM礦化蛋白的核苷酸序列的分離核酸轉染細胞。所述一種或多種骨形態發生蛋白可以是BMP－2、BMP－4、BMP－6、BMP－7或它們的組合。所述轉化生長因子－β蛋白可以是轉化生長因子－β1蛋白(TGF－β1)。轉染可通過直接注射病毒或裸DNA，或通過非病毒載體如質粒，離體或在體內完成。該方法可用來在骨細胞中誘導骨形成，或在能夠產生蛋白聚糖和/或膠原蛋白的細胞中，刺激蛋白聚糖和/或膠原蛋白的生成。
文檔編號A61K48/00GK1777680SQ200480010171
公開日2006年5月24日 申請日期2004年3月7日 優先權日2003年3月7日
發明者W·麥克凱, S·伯登, S·永恩 申請人:麥德托尼克索發摩爾丹耐克公司