取代的雜環(huán)化合物的制作方法

專利名稱：取代的雜環(huán)化合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及取代的雜環(huán)化合物、其制備以及其作為藥物的用途，尤其是用于治療炎性疾病，如哮喘或癌癥。
多催化性蛋白酶或蛋白酶體是一種高度保守的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，其負(fù)責(zé)大部分細(xì)胞蛋白質(zhì)的ATP依賴型蛋白水解。20S(700-kDa)蛋白酶體具有至少五種不同的蛋白水解活性，所述活性具有涉及活性位點(diǎn)的蘇氨酸殘基的新型作用機(jī)制。(Coux，O.，Tanaka，K.and Goldberg，A.1996Ann.Rev.Biochem.65801-47)
雖然20S蛋白酶包含蛋白水解核心，但是它除非在結(jié)構(gòu)地任一末端與一種19S頂蓋復(fù)合，而19S自身具有多重ATP酶活性，否則20S在體內(nèi)無法降解蛋白質(zhì)。這種較大的結(jié)構(gòu)被稱為26S蛋白酶體，其能快速降解已被通過加入多種分子的8.5-kDa多肽(泛素)靶向降解的蛋白質(zhì)。
現(xiàn)已充分確證，蛋白酶體是一種主要的外溶酶體蛋白水解系統(tǒng)，其參與降解途徑，引發(fā)眾多不同的細(xì)胞功能，如細(xì)胞分化、抗原加工以及短時(shí)調(diào)控蛋白的降解，如轉(zhuǎn)錄因子、致癌基因產(chǎn)物和細(xì)胞周期蛋白(綜述Ciechanover，A.1994 Cell 7913-21)。蛋白酶體的首要功能是催化蛋白水解為小肽。但是，也已證實(shí)泛素-蛋白酶體途徑可以催化大的無活性前體轉(zhuǎn)化為活性蛋白的受調(diào)控的蛋白水解過程。轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的活化即為最佳證明的一例(Palombella，V.J.，Rando，O.J.，Goldberg，A.L.，and Maniatis，T.1994 Cell 78773-785)。NF-κB的活性形式為一種由p65和p50亞基組成的異二聚體。p50存在于無活性的前體形式的細(xì)胞的細(xì)胞溶膠中，即p105，是p50的105-kDa的多肽前體。p105通過泛素-蛋白質(zhì)酶體水解途徑經(jīng)蛋白水解為p50。另外，水解過的p50和p65作為一種與抑制蛋白質(zhì)IκB的無活性復(fù)合體存在于細(xì)胞溶膠中。炎癥信號(hào)通過激發(fā)IκB的完全降解的信號(hào)途徑，激活NF-κB，同時(shí)激發(fā)p105轉(zhuǎn)化為p50。因此，NF-κB的信號(hào)誘發(fā)性活化需要兩個(gè)均由泛素-蛋白酶體途徑調(diào)控的蛋白水解的過程。
NF-κB一經(jīng)激活后，即定位于細(xì)胞核上，在該處其對一套明顯不同的基因的調(diào)控起著關(guān)鍵的作用，所述基因與免疫和炎性反應(yīng)相關(guān)(Grilli等，International Review of Cytology(1993)1431-62)。例如，炎性反應(yīng)相關(guān)的許多基因的表達(dá)需要NF-κB，如TNF-α基因和編碼細(xì)胞粘附分子E選擇蛋白、P選擇蛋白、ICAM和VCAM的基因(Collins，T.，Lab.Invest.(1993)68499)。大多數(shù)細(xì)胞因子基因的表達(dá)也需要NF-κB，如IL-2、IL-6、粒細(xì)胞集落刺激因子和IFN-β。誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶也受到NF-κB的調(diào)控。蛋白酶體抑制劑阻斷IκBα降解和NF-κB的活化(Palombella等，WO 95/25533，1995年9月28日公開；Traenckner等EMBO J.(1994)135433)。蛋白酶體抑制劑也阻斷TNF-α誘導(dǎo)的白細(xì)胞粘附分子E選擇蛋白、VCAM-1和ICAM-1的表達(dá)(Read等，Immunity(1995)2493)。
蛋白酶體在NF-κB的活化中起重要作用，這一點(diǎn)已得到直接作用于蛋白酶體水解的抑制劑的臨床應(yīng)用的證明。在某些疾病中，活化的NF-κB的正常功能可能對人體健康有害，如在炎性反應(yīng)中的觀察所見。因此，NF-κB活化的抑制劑因其能阻止許多炎癥分子(如細(xì)胞粘附分子或細(xì)胞因子)的分泌，將有可能用于治療炎性疾病如炎性紊亂，包括例如變應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)，COPD，呼吸道炎癥和哮喘，ARDS(急性呼吸窘迫綜合征)，AIDS，骨關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；炎性腸道疾病，包括潰瘍型結(jié)腸炎和節(jié)段性回腸炎；膿毒癥；移植排斥和缺血性或再灌注損傷，包括中風(fēng)和心肌梗塞。因NF-κB的活化對血管生成也具有重要作用，蛋白酶體抑制劑將有可能用于治療與異常新生血管化相關(guān)的疾病。
起初認(rèn)為p53為一種癌蛋白，但現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其與許多細(xì)胞過程相關(guān)(綜述Ko，L.J.和Proves，C.1996Genes Dev.10卷1054-1072)。已表明通過許多不同的刺激的作用，包括DNA損傷、病毒感染和生長因子的損失，p53可誘導(dǎo)若干造血細(xì)胞系的凋亡(Oren，M.，1994Semin.CancerBiol.5，221-227)。但是，明顯注意到的是，凋亡也可能以p53無依賴性關(guān)系，如通過糖皮質(zhì)激素的作用誘導(dǎo)。p53的誘導(dǎo)導(dǎo)致細(xì)胞周期的G1期的細(xì)胞生長停止以及因凋亡而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這兩種功能都使得p53控制DNA的損傷，從而減少當(dāng)細(xì)胞分化時(shí)DNA突變的繁殖。p53通過介導(dǎo)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑p21，p21接著引發(fā)成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤基因產(chǎn)物的亞磷酸化(hypophosphorylated)形式的聚集，而使細(xì)胞停滯于G1期?，F(xiàn)認(rèn)為，p53作為細(xì)胞中的一個(gè)關(guān)卡，DNA損傷后，它首先導(dǎo)致細(xì)胞分化停滯并凋亡?，F(xiàn)認(rèn)為p53的降解通過泛素-蛋白酶體途徑，擾亂p53的降解可能會(huì)引發(fā)凋亡。蛋白酶體抑制劑的另一潛在用途是用于治療異常細(xì)胞增殖引發(fā)的疾病。
現(xiàn)充分證明泛素-蛋白酶體途徑是調(diào)節(jié)性破壞細(xì)胞周期蛋白的關(guān)鍵，而細(xì)胞周期蛋白控制有絲分裂的終結(jié)并使細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)展至細(xì)胞周期的下一階段。由此通過使用蛋白酶體抑制劑抑制細(xì)胞周期蛋白的降解而導(dǎo)致生長停滯。因此蛋白酶體抑制劑的另一潛在用途是用于治療由加速細(xì)胞分化所引起的疾病。這些疾病包括癌癥、心血管疾病，如心肌炎、心管成形術(shù)后再狹窄、腎病如狼瘡、多囊性腎病、真菌感染、皮膚病如牛皮癬、異常傷口愈合、瘢痕瘤、免疫性疾病如自身免疫，急性和遲發(fā)性過敏癥、移植物抗宿主疾病、移植排斥和神經(jīng)免疫性疾病如多發(fā)型硬化癥和急性分散性腦脊髓炎。
已發(fā)現(xiàn)一些微生物代謝物可抑制蛋白酶體，例如，已報(bào)導(dǎo)從鏈霉菌如TMC-96系(Y.Koguchi等，J.Antibiot.，1999，52，63-65和J.Antibiot.，2000，531069-1076)和真菌如TMC-95系(J.Kohno等，J.Org.Chem.，2000，65990-995)中得到的一些肽類化合物，都作為此靶標(biāo)的強(qiáng)效抑制劑。含β-內(nèi)酯部分的非肽類放線菌代謝物或其相應(yīng)的化學(xué)類似物也已被認(rèn)為與此靶標(biāo)有密切相關(guān)。其中包括WO 02/47610和R.Feling等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2003，42355-357報(bào)道的海洋放
線菌Salinospora sp.中的Salinosporamides(Salinosporamide A)，以及WO 96/32105、WO 99/15183和WO 99/09006報(bào)道的乳胞素β-內(nèi)酯。
第十屆世界海洋天然產(chǎn)物論壇-沖繩2001報(bào)道了SalinosporamideE和Salinosporamide G，2002年9月8-12日第50屆藥用植物研究協(xié)會(huì)年會(huì)(巴塞羅那，西班牙)也報(bào)道了Salinosporamide-A。
Salinosporamide ESalinosporamide G Salinosporamide A ″Salinosporamide-A″
本發(fā)明涉及顯示對蛋白酶體具有空前強(qiáng)烈抑制活性的新的取代的雜環(huán)，以及這些化合物從具有SEQ ID NO1的鏈霉菌屬的新的放線菌JS360(DSM 15324)中分離的方法，如圖5以及所列的序列所公開的。
本發(fā)明涉及下式化合物，
其中
R1代表氫、羥基或甲基羰基氧基，
R2代表環(huán)己基或環(huán)己-2-烯基，
其中環(huán)己基可被0至2個(gè)羥基取代，以及
R3代表氫或羥基。
本發(fā)明化合物也可以以其鹽、溶劑合物或其鹽的溶劑合物的形式存在。
根據(jù)其結(jié)構(gòu)，本發(fā)明化合物可存在立體異構(gòu)形式(對映異構(gòu)體，非對映異構(gòu)體)。因此，本發(fā)明涉及所述化合物的對映異構(gòu)體和非對映異構(gòu)體及其相應(yīng)的混合物?？赏ㄟ^已知的手段，將這些對映異構(gòu)體和/或非對映異構(gòu)體的混合物分離為單一立體化學(xué)構(gòu)型。
根據(jù)其結(jié)構(gòu)，本發(fā)明還涉及所述化合物的互變異構(gòu)體。
本發(fā)明目標(biāo)化合物的鹽優(yōu)選為本發(fā)明化合物的生理學(xué)上可接受的鹽。
所述化合物(I)的生理上可接受的鹽包括礦物酸、羧酸和磺酸的酸加成鹽，如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽、甲磺酸鹽、乙磺酸鹽、甲苯磺酸鹽、苯磺酸鹽、萘二磺酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、蘋果酸鹽、檸檬酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽和苯甲酸鹽。
所述化合物(I)的生理上可接受的鹽包括與普通堿所成的鹽，例如并優(yōu)選堿金屬鹽(如鈉和鉀鹽)、堿土金屬鹽(如鈣和鎂鹽)和由氨或具有1-16個(gè)碳原子的有機(jī)胺衍生的銨鹽，例如并優(yōu)選乙胺、二乙胺、三乙胺、乙基二異丙基胺、單乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、二環(huán)己基胺、二甲胺基乙醇、普魯卡因、聯(lián)芐胺、N-甲基嗎啉、二氫松香胺、精氨酸、賴氨酸、乙二胺和甲基哌啶。
本發(fā)明目標(biāo)化合物的溶劑合物為所述化合物與溶劑分子組合形成固態(tài)或液態(tài)的復(fù)合物的那些溶劑合物。水合物是一種特殊形式的溶劑合物，其是與水復(fù)合而成。


圖130升規(guī)模JS360菌株的發(fā)酵時(shí)間曲線。
圖2從30升規(guī)模JS360菌株發(fā)酵的粗提取物中分離實(shí)施例1-7的流程。
圖3制備HPLC后實(shí)施例1的HPLC色譜圖、HPLC-UV和HPLC-ESILC-MS的光譜圖。
圖4實(shí)施例1的質(zhì)子譜圖。
圖5SEQ ID NO1部分16S r DNA，JS360/DSM 15324的部分序列。
圖6顯示Salinospora sp.和JS360之間關(guān)系的樹狀圖。
樹狀圖下方的標(biāo)尺表示序列間的距離。單位表示取代發(fā)生的數(shù)目。Salinospora sp.聚集于上分支，而JS360和相似序列聚集于下分支。
圖7帶有非氫原子編號(hào)的實(shí)施例1的Ortep-plot(50％)圖。
圖8沿顯示極性和非極性層面的a軸和c軸所觀察的實(shí)施例1的晶體堆積。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式(I)的化合物，其中
R1代表氫或羥基，
R2代表環(huán)己基或環(huán)己-2-烯基，
其中環(huán)己基可被0至2個(gè)羥基取代，以及
R3代表氫或羥基。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及下式的化合物，
其中
R1、R2和R3具有如上所述的意義。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式(I)的化合物，例如
(1R，4R，5S)-1-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-雙環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮
(1R，4R，5S)-1-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-4-[1-羥基-己基]-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜雙環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮
以及(1R，4R，5S)-1-[(1R)-2-環(huán)己烯-1-基甲基]-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-雙環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及下式的化合物，
其中
R4代表氫或羥基，
R5代表環(huán)己基或環(huán)己-2-烯基，
其中環(huán)己基可被0至2個(gè)羥基取代，
R6代表氫或羥基，以及
R7代表羥基或選自一組下式的取代基，
或
其中
R8代表氫或甲基，以及
*代表與所述分子的連接位置。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及下式的化合物，
其中
R4代表氫或羥基，
R5代表環(huán)己基或環(huán)己-2-烯基，
其中環(huán)己基可被0至2個(gè)羥基取代，
R6代表氫或羥基，以及
R7代表羥基或下式取代基，
其中
R8代表氫或甲基，以及
*代表與所述分子的連接位置。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及下式的化合物，
其中
R4、R5、R6和R7具有如上所述的意義。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及式(II)化合物，例如
(3S，4R)-2-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-3-羥基-4-[1-羥基-己基]-3-甲基-5-氧代-D-脯氨酸
N-乙?；?S-({(2R，3S，4R)-2-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-4-己基-3-羥基-3-甲基-5-氧代-2-吡咯烷基}羰基)半胱氨酸
和
N-乙酰基-S-({(2R，3S，4R)-2-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-4-己基-3-羥基-3-甲基-5-氧代-2-吡咯烷基}羰基)半胱氨酸甲酯。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及鏈霉菌屬的放線菌(具有SEQ IDNO1/圖5及所列的序列)。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種合成以下通式的化合物的方法，
其中
R1和R3具有如上所述的意義，
特征在于所述化合物通過從具有SEQ ID NO1的鏈霉菌屬的放線菌JS360(DSM 15324)中發(fā)酵并分離制備，
或者一種合成以下通式的化合物的方法，
其中
R1和R3具有如上所述的意義，
特征在于所述化合物通過氫化式(Ib)化合物中的雙鍵制備，
或一種合成以下通式的化合物的方法，
其中
R1和R3具有如上所述的意義，和
所述羥基連接在1或2位碳原子上，
特征在于所述化合物通過式(Ib)化合物的雙鍵的水合制備，
或一種合成以下通式的化合物的方法，
其中
R1和R3具有如上所述的意義，
特征在于所述化合物通過氧化式(Ib)化合物的雙鍵制備，
或一種合成以下通式的化合物的方法，
其中
R4、R5和R6具有如上所述的意義，并且
R7代表羥基或下式取代基，
其中
R8具有如上所述的意義，
特征在于所述化合物通過從具有SEQ ID NO1的鏈霉菌屬的放線菌中發(fā)酵并分離制備，
或一種合成以下通式的化合物的方法，
其中
R4、R5和R6具有如上所述的意義，并且
R7代表選自一組下式的取代基，
或
特征在于所述化合物通過使下式化合物與硫醇反應(yīng)制備，
其中
R4、R5和R6具有如上所述的意義。
式(I)包含式(Ib)、(Ic)、(Id)和(Ie)化合物。
式(II)包含式(IIb)、(IIc)和(IId)化合物。
方法[A]和[E]可按照實(shí)驗(yàn)部分所述進(jìn)行或者在深水有氧(submerged aerobic)條件下，在水性營養(yǎng)培養(yǎng)基中使鏈霉菌種(Streptomyces sp.)JS 360發(fā)酵。一般地，所述微生物在含有碳源和蛋白源物質(zhì)的營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)酵。優(yōu)選碳源包括葡萄糖、紅糖、蔗糖、甘油、淀粉、卡姆淀粉、乳糖、糊精、糖漿等。優(yōu)選的氮源包括棉子粉、玉米漿、酵母、帶有奶類的自溶性釀酒酵母、豆粉、棉子粒、玉米粉、奶類固體、酪蛋白胰酶解物、發(fā)酵固體(distillers’solids)、動(dòng)物肉胨、肉骨渣等。可優(yōu)選使用這些碳源和氮源的組合。由于使用自來水和未純化的成分作為培養(yǎng)機(jī)組分，因此不必向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加痕量的金屬，如鋅、鎂、錳、鈷、鐵等。
在約23-32℃之間，優(yōu)選在約28℃下，在傳導(dǎo)能滿足所述微生物生長的任何溫度下，均能誘導(dǎo)所述化合物生成。一般地，發(fā)酵約2至6日，優(yōu)選發(fā)酵約4至5天，可獲得化合物的最佳產(chǎn)出。發(fā)酵過程中，發(fā)酵液一般保持在弱至中度酸性，pH4-4.5下利于發(fā)酵終止。最終pH值部分依賴于使用的緩沖液(如果存在)以及部分依賴于所述培養(yǎng)基的起始pH值。滅菌前，將pH調(diào)節(jié)為約6.5-7.5較有利，優(yōu)選7.2。
化合物的制備不僅可在搖瓶中也可在固體培養(yǎng)基中以及攪拌的發(fā)酵器中進(jìn)行。當(dāng)在搖瓶或大容器和罐中進(jìn)行生長時(shí)，優(yōu)選使用所述微生物的無性繁殖(vegetative)而非芽孢形式接種，從而避免化合物產(chǎn)出的延遲，以及所伴隨的對設(shè)備使用的不充分。因此，優(yōu)選通過用等份的土壤或斜面培養(yǎng)物接種水性營養(yǎng)培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基中產(chǎn)生無性繁殖接種體。當(dāng)已如此獲得新鮮有活力的無性繁殖接種體時(shí)，即將其無菌轉(zhuǎn)移至其它搖瓶或其它適宜設(shè)備中進(jìn)行微生物發(fā)酵。用于產(chǎn)生無性繁殖接種體的培養(yǎng)基和用于產(chǎn)生化合物的培養(yǎng)基可相同或不同，只要其宜于微生物的充分生長即可。
通常采用在攪拌容器中，在深水有氧發(fā)酵的條件下，進(jìn)行鏈霉菌sp.JS 360的育種以及化合物的發(fā)酵和產(chǎn)生?；衔锏漠a(chǎn)出不依賴于所用的容器、發(fā)酵器及引酵物程序。通過搖瓶培養(yǎng)亦可獲得所述化合物。大量發(fā)酵時(shí)，優(yōu)選采用無性繁殖接種體。通過接種帶有芽孢形式、菌絲體片斷或生物的凍干小球的少量培養(yǎng)基制備所述無性繁殖接種體。然后將所述無性繁殖接種體轉(zhuǎn)移入發(fā)酵器中，經(jīng)過合適的孵育時(shí)間，得到最佳收率的化合物。
按照深水有氧培養(yǎng)過程的慣例，將無菌空氣分散通過培養(yǎng)基。為使生物充分生長，使用的空氣體積的范圍為每分鐘每培養(yǎng)基體積約0.25-0.5體積空氣(vvm)。在常規(guī)攪拌機(jī)以約240rpm旋轉(zhuǎn)時(shí)提供的攪拌下，10升容器的最適速率為約0.3vvm。如起泡嚴(yán)重時(shí)，必須向發(fā)酵介質(zhì)中加入少量(即1ml/l)消泡劑，如硅酮。優(yōu)選的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基在通用實(shí)驗(yàn)方法中給出。
所述化合物存在于發(fā)酵的鏈霉菌sp.JS 360的生物量中，也存在于發(fā)酵培養(yǎng)液的培養(yǎng)基濾液中?？赏ㄟ^在壓濾機(jī)上過濾分離培養(yǎng)液。
可采用各種方法從發(fā)酵培養(yǎng)液中分離和純化所述化合物，例如通過層析吸附方法，然后用適合的溶劑洗脫，柱層析法，分配色譜法和溶劑結(jié)晶法，及其各種方法的組合。
在優(yōu)選的回收方法中，從純啤酒發(fā)酵液(whole beer)、菌絲液或上清液的提取液中提取所述化合物。后者可通過使用吸附樹脂如XAD、HP20或Bayer Lewapol制備。采用柱色譜技術(shù)，優(yōu)選硅膠或改性硅膠，進(jìn)行初次純化。化合物的最終純化優(yōu)選通過制備高效液相色譜(HPLC)完成。
方法[B]的氫化反應(yīng)可在催化劑如鈀/碳和氫氣存在下，在適宜溶劑中，在溫度范圍0℃至+100℃內(nèi)，在常壓或最高可至3巴的高壓下進(jìn)行。
適宜的溶劑為例如醚類，如乙醚、甲基叔丁基醚、二氧六環(huán)或四氫呋喃，醇類，如甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正丁醇或叔丁醇，優(yōu)選甲醇、乙醇、異丙醇或四氫呋喃。
方法[C]的水合反應(yīng)可通過采用例如在四氫呋喃中的二硼烷(B2H6)處理，接著用過氧化氫處理的氧化后處理的硼氫化完成。另外，可發(fā)生環(huán)氧化，然后通過還原方法開環(huán)。所有過程均可在適宜的溶劑中，在溫度范圍-78℃至+25℃內(nèi)，在常壓或最高可至3巴的高壓下進(jìn)行。
適宜的溶劑為例如四氫呋喃、乙醚、叔丁基甲基醚和相關(guān)的溶劑。
方法[D]的氧化反應(yīng)可通過手性或非手性二羥基化的方法，采用高錳酸鉀(KMnO4)或四氧化鋨(OsO4)進(jìn)行。當(dāng)使用叔胺N-氧化物如N-甲基-嗎啉-N-氧化物或其它氧化劑如鐵氰化鉀(K3FeCN6)時(shí)，如使用四氧化鋨，催化量即可以是充分的。所有過程均在適宜的溶劑中，在溫度范圍0℃至+100℃內(nèi)，在常壓或最高可至3巴的高壓下進(jìn)行。
適宜的溶劑為加入適量水的醇類，例如，乙醇或叔丁醇。
方法[F]中與硫醇的反應(yīng)可在堿諸如三乙胺或二異丙基乙胺存在下，在適宜的溶劑中，在溫度范圍0℃至50℃內(nèi)，在常壓下進(jìn)行。
適宜的溶劑為例如四氫呋喃、二氯甲烷、二甲基甲酰胺和相關(guān)的溶劑。
本發(fā)明化合物顯示出一種不可預(yù)測的、有用的藥理學(xué)和藥動(dòng)學(xué)活性范圍。因此它們適用于作為治療和/或預(yù)防人和動(dòng)物疾病的藥物。
本發(fā)明化合物因其藥理學(xué)特性，可單獨(dú)使用或與其它活性成分聯(lián)合使用，以提供對下列疾病的有效治療急性和慢性炎癥過程，如中毒性休克綜合征、內(nèi)毒素休克、肺結(jié)核、變應(yīng)性變態(tài)反應(yīng)、動(dòng)脈粥樣硬化、牛皮癬性關(guān)節(jié)炎、瑞特氏綜合征、痛風(fēng)、外傷性關(guān)節(jié)炎、風(fēng)疹性關(guān)節(jié)炎和急性滑膜炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性脊椎炎、骨關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎和其它關(guān)節(jié)疾病、膿毒癥、敗毒性休克、革蘭氏陰性膿毒癥、腦型瘧疾、腦膜炎、缺血性和出血性中風(fēng)、神經(jīng)損傷、開放或閉合性腦外傷、矽肺、肺sarcososis、骨再吸收病、骨質(zhì)疏松癥、再狹窄、心、腦和腎再灌注損傷、血栓、腎小球性腎炎、慢性腎衰竭、糖尿病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、黃斑退化、移植物抗宿主疾病、自身移植排異、炎性腸道疾病、節(jié)段性回腸炎、潰瘍性結(jié)腸炎、神經(jīng)退化病、肌肉萎縮、血管增生病、濕疹、接觸性皮炎、牛皮癬、曬傷、結(jié)膜炎、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、慢性阻塞性肺病(COPD)、呼吸道炎癥、哮喘、發(fā)熱、牙周病、發(fā)燒、阿爾茨海默氏病和帕金森氏病以及疼痛，尤其是COPD和哮喘。
本發(fā)明化合物也可用于治療癌癥，如卵巢癌或結(jié)腸癌、腫瘤生長和轉(zhuǎn)移、自身免疫性疾病、心血管疾病，如心肌炎、血管成形術(shù)后的再狹窄、腎病，如狼瘡、多囊性腎病、真菌感染、病毒感染，如HIV、細(xì)菌感染、皮膚疾病，如牛皮癬、異常傷口愈合、瘢痕瘤、免疫性疾病、如自身免疫性疾病、急性和延遲性過敏癥、移植物抗宿主疾病、移植排異和神經(jīng)免疫性疾病，如多發(fā)性硬化癥和急性發(fā)散性腦脊髓炎。
在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包含至少一種通式(I)的化合物和藥學(xué)上可接受的稀釋劑的組合物，此組合物在治療急性和慢性炎癥過程或癌癥中的用途以及制備此類組合物的方法，所述方法特征在于將通式(I)化合物與常規(guī)輔助劑一起制成適合應(yīng)用的劑型。因此，通式(I)化合物適于制備藥物，尤其是治療急性和慢性炎癥過程(特別是COPD)或癌癥的藥物。
在用于治療上述疾病時(shí)，本發(fā)明化合物顯示出非全身性或全身性活性，其中優(yōu)選后者。為獲得全身性活性，可以口服或胃腸外給予所述活性化合物，其中優(yōu)選口服給藥方式。為獲得非全身性活性，可局部給予所述活性化合物。
對于胃腸外給藥，特別適于粘膜給藥(如口腔、舌、舌下、直腸、鼻內(nèi)、肺、結(jié)膜或陰道)或體內(nèi)給藥的方式。可以通過避免吸收(如心內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、靜脈內(nèi)、脊椎內(nèi)或腰椎內(nèi)給藥)或通過包括吸收(如皮內(nèi)、皮下、經(jīng)皮、腹腔或肌肉給藥)進(jìn)行給藥。
為了達(dá)到以上的目的，可將所述活性化合物以本身方式給藥或以劑型方式給藥。
口服給藥的適用劑型尤其為普通片劑和腸溶包衣片、膠囊、包衣片、丸劑、顆粒劑、小糖丸、散劑、固體和液體噴霧劑、糖漿劑、乳劑、混懸劑和溶液劑。胃腸外給藥的合適的給藥劑型為注射液和輸注液。
在給藥劑型中，所述活性化合物濃度可為0.001-100％重量；優(yōu)選活性化合物濃度為0.5-90％重量，即，足以允許特定劑量范圍的量。
以已知方式，采用惰性無毒的藥學(xué)上適宜的輔助劑，如賦形劑、溶劑、載體、乳化劑和/或分散劑，可將所述活性化合物轉(zhuǎn)化為上述給藥形式。
可以提及下列輔助劑，例如水、固體賦形劑，如天然或合成的礦物(如滑石粉或硅酸鹽(silicates))、糖(如乳糖)、無毒有機(jī)溶劑，如石蠟、植物油(如芝麻油)、醇類(如乙醇、甘油)、二醇類(如聚乙二醇)、乳化劑、分散劑(如聚乙烯吡咯烷酮)和潤滑劑(如硫酸鎂)。
口服給藥時(shí)，片劑當(dāng)然還可以含有諸如檸檬酸鈉的添加劑以及諸如淀粉、明膠等的添加劑。還可將增香劑或著色劑加入到口服液體制劑中。
為取得胃腸外給藥的良好療效，一般以約0.001-100mg/kg的給藥量為宜，優(yōu)選約0.01-1mg/kg體重?？诜r(shí)，該量為約0.01-100mg/kg，優(yōu)選約0.1-10mg/kg體重。
除此以外，在某些條件下，考慮到如體重、給藥途徑、對所述活性藥物的個(gè)體反應(yīng)差異、制備方法和給藥的時(shí)間或間隔問題，可能必須偏離所提及的量。在某些情況下，例如使用低于前述下限的量即足夠，而在其它情況下，必須使用超出前述上限的量。當(dāng)使用的量較大時(shí)，建議將其分割為每日內(nèi)的若干單劑量。
除另有說明，以下試驗(yàn)和實(shí)施例中的百分?jǐn)?shù)皆為重量百分比；分重量份百分比。液體/液體溶液所報(bào)告的溶劑比、稀釋比和濃度皆以體積計(jì)。
A.實(shí)施例
本說明書中使用以下縮寫
ACN 乙腈
aq. 水溶液
Bn 芐基
BOP 苯并三唑-1-基氧基三(二甲氨基)-六氟磷酸鹽
DCI 直接化學(xué)電離
DCM 二氯甲烷
DMF N，N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亞砜
EDTA 乙二胺四乙酸
ESI電噴霧電離
FCS牛胎血清
h 小時(shí)
HPLC 高效液相色譜
LC/MS 液相色譜/質(zhì)譜
min. 分鐘
mp 熔點(diǎn)
MS 質(zhì)譜
NMR核磁共振光譜
PBS磷酸鹽緩沖液
RP 反相(HPLC)
Rt保留時(shí)間(HPLC)
rt 室溫
SDS十二烷基硫酸鈉
TFA三氟乙酸
THF四氫呋喃
UV 紫外光
UV/Vis 紫外/可見光
％of th. 理論產(chǎn)率％
通用實(shí)驗(yàn)步驟
化學(xué)試劑為分析級，購自默克(Darmstadt，德國)或Sigma-Aldrich(Deisenhofen，德國)。NMR譜圖采用Bruker DRX 500核磁共振儀(在500.13MHz質(zhì)子頻率下操作)以DMSO-d6為溶劑報(bào)道。
HPLC-MS分析采用連接LCT質(zhì)譜儀(Micromass，Manchester，UK)的Agilent HP1100液相色譜進(jìn)行，正電子和負(fù)電子噴霧離子化(ESI)模式，對前述方法略有修改(M.Stadler等，Phytochemistry，2001，56，787-793)。固定相采用Waters symmetry色譜柱。流動(dòng)相A0.1％甲酸的水溶液，流動(dòng)相B0.1％甲酸的乙腈溶液；梯度0-1分鐘100％A，1-6分鐘，至90％B，6-8分鐘，至100％B，8-10分鐘，100％B。在分子量150-1600之間范圍內(nèi)記錄LC-MS譜。
HPLC-UV/Vis分析，根據(jù)M.Stadler等，Mycol.Res.，2001，105，1190-1205類似方法進(jìn)行，采用HP 1100系列分析HPLC系統(tǒng)(Agilent，Waldbronn，德國)，該系統(tǒng)包括G 1312A雙泵系統(tǒng)、G 1315A二極管陣列檢測器、G 1316A柱單元、G 1322A脫氣機(jī)和G 1313A自動(dòng)進(jìn)樣器。流動(dòng)相選擇0.01％磷酸/乙腈，靜止相采用Merck(Darmstadt，德國)Lichrospher RP 18柱(125×4mm，粒徑7μm)。等份樣品(代表2-10μg可溶于甲醇物質(zhì)，根據(jù)主代謝物的濃度而定)在40℃下分析，流速1ml/min，采用下列梯度10分鐘內(nèi)，0％乙腈-100％乙腈的線性梯度，隨后無梯度條件100％乙腈洗脫5分鐘，之后再生色譜柱5分鐘。HPLC-UV色譜圖在210nm，參考波長550nm以及帶寬80nm下記錄。在210-600nm范圍內(nèi)，使用二極管陣列檢測器(DAD)記錄HPLC-UV/Vis譜圖。用HP ChemStation軟件自動(dòng)搜索粗提取物中的校準(zhǔn)的內(nèi)標(biāo)化合物。
制備型HPLC采用制備型HPLC系統(tǒng)(Gilson Abimed，Ratingen，德國)在室溫下，應(yīng)用下述不同梯度和靜止相進(jìn)行，該系統(tǒng)包括GilsonUnipoint軟件、306雙泵系統(tǒng)、205流分收集器、119UV-Vis檢測器、806壓力模件和811C動(dòng)力混合器。
NMR光譜采用Bruker DMX 500在500.13MHz質(zhì)子頻率下操作記錄。所有光譜均在302K下在DMSO-d6溶液中測定。溶劑峰作為質(zhì)子和碳的化學(xué)位移內(nèi)部參考(δH2.50，δC39.5)。
鏈霉菌sp.JS360菌株的特征與維持
培養(yǎng)基
酵母-麥芽-葡萄糖(YMG)培養(yǎng)基D-葡萄糖0.4％，麥芽提取物1％，酵母提取物0.4％，pH7.2。
Q6培養(yǎng)基D-葡萄糖0.4％，甘油2％，棉子粉1％，自來水，pH7.2。
C培養(yǎng)基D-葡萄糖1％，酵母提取物1％，NZ胺(SheffieldChemicals，Sheffield，U.K.，LotONA20 2)0.5％，可溶性淀粉2％，無需調(diào)節(jié)pH。
GS培養(yǎng)基D-葡萄糖2％，脫脂豆粉(Soyamin 50T，Degussa，Düsseldorf，德國)2％，可溶性淀粉2％，碳酸鈣0.5％，氯化鈉0.25％，硫酸鎂0.05％，磷酸二氫鉀0.025％，pH調(diào)節(jié)至6.5-6.8。
MC培養(yǎng)基D-葡萄糖1％，酵母提取物0.5％，脫脂豆粉(Soyamin50T，Degussa，Düsseldorf，德國)1％，可溶性淀粉1％，氯化鈉0.5％，碳酸鈣0.3％，pH調(diào)節(jié)至7.2(0.1N氫氧化鈉溶液)。
MCPM培養(yǎng)基Diamalt Maltzin hell(Meistermarken GmbH，Bremen，德國)4.5％，NZ胺(Sheffield Chemicals，Sheffield，U.K.，LotONA 20 2)1％，氯化鈉0.3％，磷酸二氫鉀0.1％，硫酸鎂0.05％，硫酸亞鐵0.01％，pH6.8。
MS培養(yǎng)基甘露醇2％，脫脂豆粉(Soyamin 50T，Degussa，Düsseldorf，德國)2％，碳酸鈣0.3％，pH調(diào)節(jié)至7.5。
SP培養(yǎng)基甘露醇3％，酵母提取物0.75％，可溶性淀粉0.2％，豆蛋白胨(Merck，Darmstadt，德國#107212.0500)0.5％，pH調(diào)節(jié)至6.0(鹽酸調(diào)節(jié))。
JS360菌株從日本土壤樣品中采集得到。保存于Bayer AG培養(yǎng)物保藏中心(Wuppertal，德國)，在10％甘油中，液氮條件下保存。也保藏于DSMZ(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkultured，Mascheroder Weg 1b，d-38124Braunschweig，Germany)(戈特弗里德--威廉--萊布尼茨科學(xué)聯(lián)合會(huì)，德國微生物保藏和細(xì)胞培養(yǎng)中心1b，D-38124布倫瑞克，德國)，2002年11月27日，保藏號(hào)(designation number)DSM15324。
菌種鑒定
JS360菌株的形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)和生理學(xué)特征表明該菌株屬于鏈霉菌屬中未描述過的菌株。
形態(tài)學(xué)
在28℃培養(yǎng)12天后，在YMG培養(yǎng)基中JS360菌株的單一菌落直徑達(dá)到24mm。菌落長成白色絨毛狀產(chǎn)氣菌絲體，而底層菌絲體為奶油狀。培養(yǎng)基背面呈紅棕色，一種紅色色素釋放到培養(yǎng)基中。
16S rDNA(SEQ ID NO1)序列測定
為進(jìn)一步確定JS360菌株在其分類學(xué)中的位置，對16S rDNA(SEQ ID NO1)序列進(jìn)行比較。因此，應(yīng)用與Mincer TJ，Jensen PR，Kaufmann CA，F(xiàn)enical W.2002.Appl.Environ.Microbiology 60(10)5005-5011類似的方法，采用引物41f和1486r-P(未發(fā)表)，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)熱曲線，在退火溫度50℃下，對DNA提取物和16S rRNA基因的主要部分的序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用制造商提供的方案，用DNA結(jié)合順磁paramagnetic珠(Mag Prep PCR Clean Up Kit，Tecan Schweiz AG，Hornbrechtikon，瑞士)純化擴(kuò)增產(chǎn)物。
應(yīng)用Thermo Sequenase Cy5.5Dye Terminator Cycle Sequencing Kit(熱序列酶Cy5.5染料終止循環(huán)測序試劑盒)(Amersham Biosciences)、引物41f以及LI-COR 4200基因分析儀(LI-COR Inc.Lincoln，Nebraska，USA)，通過循環(huán)測序得到核苷酸序列。使用歐洲生物信息中心(EBI)在線(http//www.ebi.ac.uk/fasta33/)服務(wù)提供的FASTA軟件進(jìn)行對與已經(jīng)確定的序列相似的序列和最佳匹配的序列對比的搜尋。從用于輸入的LASERGENE軟件(DNASTAR Inc，Madison，Wisconsin，USA)的MegAlign模塊的數(shù)據(jù)庫中獲得顯示最佳匹配的序列。同時(shí)考慮了Mincer等.，Appl.Environm.Microbiol.，2002，68，5005-5011公開的Salinospora sp.的序列。
使用以下的核苷酸序列進(jìn)行比較
從JS360菌株中得到大約240個(gè)堿基的序列(圖5)。將此序列用于輸入FASTA中，尋找EMBL數(shù)據(jù)庫中的相似序列。發(fā)現(xiàn)該序列與鏈霉菌成員的16S rRNA序列高度相關(guān)。這三個(gè)最佳匹配中有兩個(gè)分別是從土壤和蚯蚓中分離得到的未命名的鏈霉菌株，而另一個(gè)為朱紅鏈霉菌(Streptomyces cinnabarinus)株。這三個(gè)序列與JS360中得到的序列之間的相似度為91％。在此數(shù)據(jù)庫中未找到相同序列。將JS360序列和這三個(gè)最相似的序列以及Salinospora菌株的6個(gè)序列進(jìn)行序列對比(聚類法(clustal method))。從該序列對比中，構(gòu)建一種表明種屬關(guān)系的樹狀圖。發(fā)現(xiàn)Salinospora sp.和包括JS360的組別之間的明顯區(qū)別(圖6)。結(jié)果表明JS360與Salinospora spp.明顯不同。從該菌株與部分16SrDNA序列的對比得出結(jié)論，該菌株屬于鏈霉菌屬。
JS360菌株的發(fā)酵和提取
1.菌種培養(yǎng)
用2ml 10％甘油培養(yǎng)物接種于含有150ml無菌YMG培養(yǎng)基的1升錐形瓶中，在28℃下，以240rpm速度，在旋轉(zhuǎn)震蕩器中培養(yǎng)72-96小時(shí)。
2.燒瓶規(guī)模的JS360菌株的發(fā)酵
將生長良好的YMG菌種培養(yǎng)物接種(2ml接種體/瓶)，然后將JS360菌株在10個(gè)含有150ml Q6培養(yǎng)基(見上文)的1升錐形瓶中培養(yǎng)，之后在28℃下，以240rpm速度，在旋轉(zhuǎn)震蕩器中培養(yǎng)118小時(shí)。發(fā)酵期間，每日提取樣本。測定pH值，采用Bayer DiastixHarnzuckerstreifen檢測游離葡萄糖。通過離心(10min，3000xg)，從該流體中分離濕菌絲體，用2升丙酮提取。將丙酮真空蒸發(fā)(40℃)。將殘余的水溶性殘液用水稀釋至500ml，然后用等量乙酸乙酯萃取3次。合并的有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥，真空蒸發(fā)(40℃)，得到830mg粗提取物，然后用于如下所述的制備型HPLC中(分離)。
將培養(yǎng)液加入到含有500ml Bayer Lewapol CA 9225樹脂的吸附柱上，用1升水漂洗。將該柱用1.5升丙酮∶甲醇4∶1洗脫。真空蒸發(fā)溶劑(40℃)。將殘余的水溶性殘液用水稀釋至500ml，然后用等量乙酸乙酯萃取3次。合并的有機(jī)相經(jīng)硫酸鈉干燥，真空蒸發(fā)(40℃)，得到650mg粗提取物，然后用于如下所述的制備型HPLC中(分離)。
3.30升規(guī)模的JS360菌株的發(fā)酵(攪拌發(fā)酵器)
將含有30升Q6培養(yǎng)基的40升Biostat P發(fā)酵器(BraunBioengeneering，Melsungen，德國)就地滅菌(在121℃及1.1巴下1小時(shí))，然后用2份已培養(yǎng)了76小時(shí)的生長良好的150ml YMG菌種培養(yǎng)物接種。在攪拌(240rpm)和通氣(0.3vvm)下，使該產(chǎn)物培養(yǎng)物生長。測定pH值，采用Bayer Diastix Harnzuckerstreifen檢測游離葡萄糖。另外，將此發(fā)酵器裝備一個(gè)Braun氧氣電極以測量培養(yǎng)液的氧飽和度。在無菌條件下，采集50ml樣本并用等量乙酸乙酯萃取，制備的粗提取物，用HPLC分析監(jiān)測實(shí)施例1。在發(fā)酵過程中，也通過HPLC-MS檢測實(shí)施例2-5和7，但在天然粗提取物中不能檢測到，原因是在產(chǎn)量太小，并且所用的HPLC系統(tǒng)中與具有類似保留時(shí)間的其它代謝物同時(shí)洗脫出來。該乙酸乙酯萃取液經(jīng)硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，再溶于甲醇中，采用通用實(shí)驗(yàn)步驟中所述的HPLC-UV系統(tǒng)進(jìn)行分析。圖1繪出在30升Q6培養(yǎng)基中JS360發(fā)酵的典型的時(shí)間曲線。當(dāng)隨氧飽和度值降低而培養(yǎng)基完全飽和時(shí)，pH值降至大約4.5。在培養(yǎng)基中的游離葡萄糖被消耗后，在發(fā)酵約60小時(shí)左右，應(yīng)用分析HPLC方法檢測實(shí)施例1的產(chǎn)物，114小時(shí)后達(dá)到峰值。此時(shí)收集培養(yǎng)物，原因是觀察到了隨后的實(shí)施例1降解現(xiàn)象。收集培養(yǎng)物后，通過離心(10min，3000xg)，從菌絲體中分離該流體，加入裝填Bayer Lewapol CA 9225吸附樹脂的柱上，用5升水漂洗。然后將該柱用6升丙酮∶甲醇4∶1洗脫。真空(40℃)蒸發(fā)洗脫液，得到一種水溶性殘留物，用水稀釋至1升，然后用1升乙酸乙酯萃取3次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，真空蒸發(fā)(40℃)。然后將得到的提取物(22.7g)用于如下所述的制備型HPLC中(分離)。
將菌絲體每次用5升丙酮萃取3次，真空(40℃)蒸發(fā)丙酮，得到一種水溶性殘留物，用水稀釋至1升，然后用1升乙酸乙酯萃取3次。將有機(jī)相合并，經(jīng)硫酸鈉干燥，真空蒸發(fā)(40℃)。然后將得到的提取物(13.4g)用于如下所述的制備型HPLC中(分離)。
4.在其它培養(yǎng)基中發(fā)酵(燒瓶規(guī)模)
為獲得實(shí)施例1和化學(xué)相關(guān)代謝物的最佳產(chǎn)量，可在各種其它培養(yǎng)基中培養(yǎng)JS 360菌株。為此，可用類似于在Q6培養(yǎng)基中發(fā)酵所述的類似方法(見上文2)，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。因此，在28℃下，以240rpm速度，在旋轉(zhuǎn)震蕩器上，將含有150ml所述培養(yǎng)基的1升錐形瓶培養(yǎng)至多至118小時(shí)。發(fā)酵期間，每日提取樣本。測定pH值，采用BayerDiastix Harnzuckerstreifen檢測游離葡萄糖。將等份的培養(yǎng)液(50ml)用乙酸乙酯萃取。這些乙酸乙酯萃取液經(jīng)硫酸鈉干燥，蒸發(fā)至干，再溶于甲醇中，采用通用實(shí)驗(yàn)步驟中所述的HPLC-UV和HPLC-MS系統(tǒng)進(jìn)行分析。發(fā)酵72-96小時(shí)后，比較保留時(shí)間和光譜圖，在以下的培養(yǎng)基中檢出了實(shí)施例1和相關(guān)化合物YM培養(yǎng)基、C培養(yǎng)基、GS培養(yǎng)基、MC培養(yǎng)基、MCPM培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基和SP培養(yǎng)基。但是，在Q6和GS培養(yǎng)基中觀察到最高產(chǎn)量的實(shí)施例1。
實(shí)施例1
(1R，4R，5S)-1-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮
制備如下。
實(shí)施例2
(1R，4R，5S)-1-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-4-[1-羥基-己基]-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮
制備如下。
實(shí)施例3
(1R，4R，5S)-1-[(1R)-2-環(huán)己烯-1-基甲基]-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮，
制備如下。
實(shí)施例4
(3S，4R)-2-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-3-羥基-4-[1-羥基-己基]-3-甲基-5-氧代-D-脯氨酸，
制備如下。
實(shí)施例5
N-乙?；?S-({(2R，3S，4R)-2-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-4-己基-3-羥基-3-甲基-5-氧代-2-吡咯烷基}羰基)半胱氨酸
制備如下。
實(shí)施例6
N-乙酰基-S-({(2R，3S，4R)-2-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-4-己基-3-羥基-3-甲基-5-氧代-2-吡咯烷基}羰基)半胱氨酸甲酯
制備如下。
實(shí)施例7
(3S，4R)-2-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-3-羥基-4-己基-3-甲基-5-氧代-D-脯氨酸
制備如下。
實(shí)施例2-7的立體化學(xué)以類似于實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)表示，通過X射線分析確證。
實(shí)施例1-7的分離
1.搖瓶發(fā)酵得到原料
將各粗提取物(由菌絲體得到620mg以及由培養(yǎng)液得到830mg)溶于5ml甲醇中，通過Bond Elut C18 500mg固相提取柱(Baker，Deventer，荷蘭)過濾，然后應(yīng)用于MZ Analysentechnik(Mainz，德國)Kromasil RP 18柱(粒徑，7μm；250×40mm)。采用流動(dòng)相0.01％TFA乙腈的梯度洗脫液，流速10ml/mint＝0min，20％乙腈；線性梯度，40分鐘由20％升至50％乙腈；此后20分鐘內(nèi)線性梯度，由50％升至100％乙腈；此后75％乙腈無梯度條件洗脫30分鐘，此后再生色譜柱。根據(jù)210nm的紫外吸收進(jìn)行合并洗脫部分。實(shí)施例1在保留時(shí)間(Rt)80-83min洗脫，由菌絲體提取物中得到14mg的量，由培養(yǎng)液提取物中得到1.5mg的量。實(shí)施例2-5和7含有極少量中間體，未從該提取物中分離純化，而實(shí)施例6完全未檢出。
2.30升規(guī)模發(fā)酵得到原料
將2.5-3g等份的按如上所述制備的粗提取物(由菌絲體得到13.4g，由培養(yǎng)液得到22.7g)溶于5ml甲醇中，通過Bond Elut C18500mg固相提取柱(Baker，Deventer，荷蘭)過濾，然后應(yīng)用于MZAnalysentechnik(Mainz，德國)Kromasil RP 18柱(粒徑，7μm；250×40mm；作為流動(dòng)相，采用0.01％TFA乙腈)。流動(dòng)相為0.01％TFA乙腈的梯度洗脫液，流速10ml/mint＝0min，20％乙腈；線性梯度，40分鐘由20％至50％乙腈；此后20分鐘內(nèi)線性梯度，由50％至100％乙腈；此后75％乙腈無梯度條件洗脫30分鐘，此后再生色譜柱。根據(jù)210nm的紫外吸收進(jìn)行合并洗脫部分。由此得到5個(gè)生物活性中間體產(chǎn)物。觀察到它們在此梯度系統(tǒng)中的保留時(shí)間(Rt)如下61-64min為中間體產(chǎn)物1(含實(shí)施例4和7)，65-71min為中間體產(chǎn)物2(含實(shí)施例5和6)，72-79min為中間體產(chǎn)物3(含實(shí)施例2)，79-85min為中間體產(chǎn)物4(含實(shí)施例1)以及86-93min為中間體產(chǎn)物5(含實(shí)施例3)。
中間體產(chǎn)物1-5中活性成分的最終純化通過制備型反相HPLC進(jìn)行，采用流速7ml/min，MZ Analysentechnik Inertsil C18柱(7μm；250×30mm)作為靜止相，經(jīng)下列梯度洗脫。無梯度條件，t＝0min→t＝30min；之后線性梯度，50分鐘由30％至100％乙腈；此后100％乙腈無梯度條件洗脫20分鐘，此后再生色譜柱。實(shí)施例1-6的產(chǎn)量和Rt列于表1中。圖2中說明分離的通用流程。
表1
實(shí)施例1至7的特征鑒定
采用通用實(shí)驗(yàn)步驟中所述的方法，通過HPLC-UV和HPLC-MS檢測實(shí)施例1-6。它們在分析HPLC系統(tǒng)中的特征鑒定參數(shù)列于表2中。圖3表示在所用的梯度系統(tǒng)中檢測實(shí)施例1。根據(jù)其相應(yīng)的分子峰，實(shí)施例1、2、4和7得出了結(jié)論性結(jié)果，而實(shí)施例3的LC-MS僅以正離子ESI方式顯示分子峰，原因是由于負(fù)離子ESI方式失去二氧化碳，觀察到較小的主要質(zhì)量峰(major mass fragment)。對于實(shí)施例5和6，在所用的HPLC-MS條件下易形成二聚體，因此LC-MS主信號(hào)與這些二聚體相關(guān)，而分子峰僅有較弱的信號(hào)。這些特征參數(shù)也用于鑒別發(fā)酵培養(yǎng)液中經(jīng)分析HPLC的實(shí)施例以及鑒別提取、下游處理和色譜層析過程中得到的中間體部分。
表2
通過低分辨率和高分辨率LC-MS光譜和一維和二維NMR(核磁共振)光譜，確定實(shí)施例1-7的結(jié)構(gòu)。儀器參數(shù)見通用實(shí)驗(yàn)步驟。
NMR數(shù)據(jù)顯示環(huán)己基環(huán)中存在順式雙鍵。仔細(xì)分析HSQC、HMBC和COSY/TOCSY數(shù)據(jù)，確定了雙環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與環(huán)己烯基甲醇部分一起與Salinosporamide A.中發(fā)現(xiàn)的一致。HSQC數(shù)據(jù)顯示各分子中存在至少2個(gè)甲基。結(jié)合TOCSY和HMBC，鑒定出一個(gè)無支鏈的己基部分。COSY光譜中清晰的交叉峰將此碳鏈定位于該雜環(huán)體系的2位。NMR和MS數(shù)據(jù)顯示實(shí)施例7(與實(shí)施例1比較)和實(shí)施例4(與實(shí)施例2比較)構(gòu)成相應(yīng)的β-內(nèi)酯分子的各自斷裂形式(seco-forms)。由于碳和質(zhì)子的化學(xué)位移的多重性和特征，使存在于12位(實(shí)施例2和4)的另外的羥基(與Salinosporamide A比較)更加明顯。
實(shí)施例5和6的NMR光譜顯示出一整套新的歸屬于N-乙酰基化半胱氨酸部分的信號(hào)。該N-乙?；?半胱氨酸分別通過前者的β-內(nèi)酯環(huán)的羰基或?qū)嵤├?的羧基與所述雜環(huán)結(jié)構(gòu)相連。通過其羰基化學(xué)位移(＞200ppm)和關(guān)聯(lián)該半胱氨酸的β-氫的HMBC，確定該硫代酯鍵。通過指認(rèn)HMBC和COSY光譜中相應(yīng)信號(hào)，確定半胱氨酸殘基內(nèi)的所有連接。由此可知，實(shí)施例5和6的結(jié)構(gòu)與乳胞素的結(jié)構(gòu)類似。
光譜數(shù)據(jù)
實(shí)施例1
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ＝0.87(t)，1.28(m)，1.29(m)，1.23(m)，1.40(m)，1.45(m)，1.47(m)，1.54(m)，1.58(m)，1.68(m)，1.74(s)，1.80(m)，1.90(m)，2.29(m)，2.41(t)，3.65(m)，5.47(m)，5.73(m)，5.81(m)，8.92(s).
13C-NMR(DMSO-d6)δ＝13.8，21.7，21.8，24.2，25.2，26.1，26.8，28.5，30.8，37.3，47.5，69.3，78.4，86.4，127.8，128.6，169.1，174.1.
實(shí)施例2
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ＝0.88(t)，1.27(m)，129(m)，1.35(s)，1.37(m)，1.49(m)，1.58(m)，1.59(m)，1.71(m)，1.75(m)，1.93(m)，2.35(d)，2.76(m)，3.49(m)，4.00(d)，4.68(m)，5.70(m)，5.91(m)，6.11(br)，8.52(s).
13C-NMR(DMSO-d6)δ＝13.4，21.0，21.4，23.7，24.2，29.6，30.1，31.5，36.1，54.6，69.4，75.0，76.0，76.5，127.9，170.9，172.3.
實(shí)施例3
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ＝0.88(t)，1.27(m)，1.30(m)，1.31(m)，1.33(m)，1.46(m)，1.48(m)，1.50(m)，1.61(s)，1.62(m)，1.63(m)，1.76(m)，1.92(m)，227(m)，2.55(t)，5.45(m)；5.68(m)，8.98(s).
13C-NMR(DMSO-d6)δ＝13.3，19.6，21.4，24.0，24.2，26.5，28.2，28.5，29.9，30.9，32.5，46.7，74.0，86.1，127.7，130.9，170.4，170.8.
實(shí)施例4
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ＝0.82(m)，1.17(m)，1.20(m)，1.24(m)，1.32(m)，1.47(m)，1.60(m)，1.62(m)，1.63(m)，1.84(m)，2.08(m)2.44(d)，3.68(m)，3.80(m)，5.60(m)，5.76(m).13C-NMR(DMSO-d6)δ＝13.1，20.1，20.6，21.0，23.5，23.6，30.5，33.5，37.7，52.7，67.1，73.6，75.2，80.1，126.3，128.6，171.2，176.5.
實(shí)施例5
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ＝0.87(m)，1.09(m)，1.24(m)，1.25(m)，1.27(m)，1.33(m)，1.35(m)，1.37(m)，1.44(m)，1.46(m)，1.50(m)，1.61(m)，1.64(m)，1.84(s)，1.87(m)，2.13(m)，2.47(t)，2.96(m)，3.30(m)，3.78(m)，4.36(m)，5.64(m)，5.79(m).
13C-NMR(DMSO-d6)δ＝13.9，20.8，21.7，22.0，22.1，22.2，23.4，24.3，26.8，27.7，28.7，29.2，31.1，38.1，50.3，51.0，75.3，79.7，80.6，127.0，129.3，169.3，178.9，201.2.
實(shí)施例6
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ＝0.87(m)，1.09(m)，1.24(m)，1.25(m)，1.27(m)，1.33(m)，1.35(m)，1.37(m)，1.44(m)，1.46(m)，1.50(m)，1.61(m)，1.64(m)，1.84(s)，1.87(m)，2.13(m)，2.47(t)，3.00(m)，3.24(m)，3.64(s)，3.78(m)，4.39(m)，5.64(m)，5.79(m).
13C-NMR(DMSO-d6)δ＝13.6，20.8，21.7，22.0，22.1，23.4，24.3，26.8，27.7，28.7，29.3，31.1，38.1，50.3，51.4，51.8，75.3，79.7，80.6，127.0，129.3，169.3，171.0，178.9，201.2.
實(shí)施例7
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ＝0.86(t)，1.25(m)，1.26(m)，1.33(m)，1.34(m)，1.36(m)，1.44(m)，1.46(s)，1.51(m)，1.66(m)，1.67(m)，1.88(m)，2.12(m)，2.45(t)，3.77(d)，5.64(m)，5.82(m)，7.66(s).
13C-NMR(DMSO-d6)δ＝13.8，20.3，21.5，21.7，23.3，24.4，26.5，27.9，28.9，31.0，38.5，50.5，74.6，75.5，80.4，127.4，129.7，177.5.
NMR-峰列表的解釋
實(shí)施例1R1＝H，R2＝OH，實(shí)施例2R1＝OH，R2＝OH，實(shí)施例3
R1＝H，R2＝H。
實(shí)施例4，實(shí)施例5R8＝H，實(shí)施例6R8＝CH3，實(shí)施例7(立體化學(xué)未經(jīng)NMR確認(rèn))。
實(shí)施例4 實(shí)施例5和6 實(shí)施例7
表3a
實(shí)施例1-3的化學(xué)位移，在500MHz、302K下，在DMSO-d6中測定。
++這些共振峰賦值(assignment)可互換。
表3b
實(shí)施例4-6的化學(xué)位移，在500MHz、302K下，在DMSO-d6中測定。
表3c
實(shí)施例7的化學(xué)位移，在500MHz、302K下，在DMSO-d6中測定。
表4a
實(shí)施例1-3的化學(xué)位移，在500MHz、302K下，在DMSO-d6中測定。
表4b
實(shí)施例4-6的化學(xué)位移，在500MHz、302K下，在DMSO-d6中測定。
表4c
實(shí)施例7的化學(xué)位移，在500MHz、302K下，在DMSO-d6中測定。
高分辨質(zhì)譜
實(shí)施例1ESI-；質(zhì)量實(shí)測值334.1977，計(jì)算值334.2014(對應(yīng)于分子式C19H28NO4的4.1mDa的偏差)
實(shí)施例2ESI-；質(zhì)量實(shí)測值350.1968，計(jì)算值350.1967(對應(yīng)于分子式C19H28NO5的0.1mDa的偏差)
實(shí)施例3ESI+；質(zhì)量實(shí)測值276.2388，計(jì)算值276.2327(對應(yīng)于分子式C18H30NO的6.1mDa的偏差)。在此，在ESI條件下，僅能觀察到片斷(M-CO2)。
實(shí)施例4ESI+；質(zhì)量實(shí)測值368.2107，計(jì)算值368.2073(對應(yīng)于分子式C19H31NO6的3.3mDa的偏差)
實(shí)施例5ESI-；質(zhì)量實(shí)測值497.2322，計(jì)算值497.2321(對應(yīng)于分子式C24H38N2O7S的0.0mDa的偏差)
實(shí)施例6ESI-；質(zhì)量實(shí)測值511.2594，計(jì)算值511.2478(對應(yīng)于分子式C25H40N2O7S的11.6mDa的偏差)
實(shí)施例7ESI+；質(zhì)量實(shí)測值354.2268，計(jì)算值354.2280(對應(yīng)于分子式C19H32NO5的1.3mDa的偏差)
實(shí)施例1的單晶X-射線結(jié)構(gòu)分析和絕對構(gòu)型的確認(rèn)
通過在46℃下，緩慢蒸發(fā)在丙醇/雙丙酮醇(97∶3)的飽和溶液來結(jié)晶幾種實(shí)施例1的晶體。采用Cukα-射線作為X射線源，在-183.5℃下，從一體積為0.30×0.20×0.03mm2的適宜晶體上，收集全套數(shù)據(jù)。用手性空間群P212121(見圖7)，在一個(gè)斜方晶胞中獲得結(jié)構(gòu)提議。該晶胞具有特別長軸，并且包含12個(gè)獨(dú)立的具有相同手性的實(shí)施例1的分子。所有分子表現(xiàn)不同的構(gòu)型。這些分子在極性和非極性層面堆積(見圖8)。極性的單層在二維平面上通過氫鍵聯(lián)接。因此，確定實(shí)施例1的絕對構(gòu)型為R(C2)；S(C4)；R(C5)；S(C6)；S(C7)，F(xiàn)lack參數(shù)為0.0，其標(biāo)準(zhǔn)差為0.2(H.-D.Flack，Acta Cryst，1983，A39，876-881)。正確的期望值是0(3個(gè)esd’s以內(nèi))，而相反絕對構(gòu)型的期望值是+1。
實(shí)施例1的X射線結(jié)構(gòu)中手性中心的數(shù)目
X射線分析的數(shù)據(jù)采集測量采用Bruker-Nonius衍射儀進(jìn)行，該衍射儀配備有Proteum CCD面積檢測器，F(xiàn)R591 Cukα射線旋轉(zhuǎn)陽極，Montel鏡作為單色器，以及Kryoflex低溫裝置(T＝90K)。測量的角度范圍從4.69-54.33°。采集205845個(gè)反射映像，其中26995個(gè)是獨(dú)立的(Rint＝0.1073)。全球面數(shù)據(jù)采集，進(jìn)行ω和掃描。采用的程序數(shù)據(jù)采集Proteum V.1.37(Bruker-Nonius 2002)，數(shù)據(jù)還原Saint Plus版本1.6(Bruker-Nonius 2002)和吸收值修正SADABS V 2.03(2002)。
結(jié)構(gòu)解析和精修SHELXTL版本6.10(Sheldrick 2000，University ofGoettingen，Germany)；21119Fo＞4sig(Fo)，2629個(gè)精修參數(shù)，R1＝0.0796，wR2＝0.1892，適合度F2＝1.083，F(xiàn)lack參數(shù)0.0(2)，最大殘留電子密度0.464(-3.14)e3。
晶體數(shù)據(jù)C19H29N1O4x 12，Mr＝335.26(4023.17)；斜方晶系；空間群P212121，a＝13.0624(2)，b＝29.0543(5)，c＝58.4559(11)，V＝22178.2(7)3，Z＝4，ρcal＝1.205Mg/m3，μ＝0.674mm-1。
化合物的制備方法
液相色譜-質(zhì)譜(LC-MS)Micromass platform LC，ShimadzuPhenomenex ODS色譜柱(4.6mmΦ×30mm)，流動(dòng)相乙腈-水(9∶1至1∶9)，流速1ml/min。質(zhì)譜采用電噴霧(ES)電離技術(shù)獲得。
質(zhì)量確定Finnigan MAT MAT95
熔點(diǎn)未校正。
1H NMR光譜采用Bruker DRX-300(300MHz對1H)光譜儀或Brucker 500 UltraShieledTM(500MHz對1H)紀(jì)錄?；瘜W(xué)位移以內(nèi)標(biāo)四甲基硅烷(TMS)為0位移(ppm)的百萬分之幾(ppm)報(bào)告。偶合常數(shù)(J)以赫茲表示，縮寫s、d、t、q、m和br，分別表示單峰、雙峰、三重峰、四重峰、多重峰和寬峰。
TLC采用預(yù)先包被的硅膠板(默克硅膠60F-254)進(jìn)行。所有柱層析分離均使用硅膠(WAKO-膠C-200(75-150μm)。所有化學(xué)試劑均為試劑級，購自Sigma-Aldrich、Wako pure chemical industries，Ltd.，英國、Tokyo kasei kogyo，Co.，Ltd.、Nacalai tesque，Inc.、Watanabe Chemical，Ind.Ltd.、Maybridge plc，Lancaster Synthesis Ltd.、Merck KgaA，德國或者Kanto Chemical Co.，Ltd。
所有起始原料均為可購商品或可采用文獻(xiàn)引用的方法制備。
實(shí)施例1
1-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮
室溫下，向2-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-己基-3-羥基-3-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-甲酸(實(shí)施例7)(130mg，0.37mmol)的二氯甲烷(10ml)溶液中，加入三乙胺(0.15ml，1.1mmol)和BOPCl(140mg，0.55mmol)。攪拌1小時(shí)后，向其中加入飽和碳酸氫鈉溶液(20ml)，然后將有機(jī)層用乙酸乙酯萃取，用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥。濃縮后，殘留物經(jīng)柱層析純化(己烷/乙酸乙酯＝3/1-1/1)，得到產(chǎn)物(98mg，79％)。
mp157℃；
LCMS(4分鐘方法)Rt＝2.56min，m/z＝336(M+H)+；
1H-NMR(500Mz，DMSO-d6)δ＝0.87(3H，t，J＝7.0Hz)，1.10-1.70(13H，m)，1.74(3H，s)，1.82(1H，m)，1.92(2H，m)，2.29(1H，m)，2.41(1H，d，J＝5.8Hz)，3.66(1H，t，J＝8.9Hz)，5.49(1H，d，J＝7.9Hz)，5.70(1H，m)，5.80(1H，d，J＝11.5Hz)，8.91(1H，s).
實(shí)施例2
1-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-(1-羥基-己基)-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮
室溫下，向2-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-3-羥基-4-(1-羥基-己基)-3-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-甲酸(實(shí)施例4)(239mg，0.65mmol)的二氯甲烷(14ml)溶液中，加入三乙胺(0.27ml，1.9mmol)和BOPCl(247mg，0.97mmol)。攪拌1小時(shí)后，向其中加入飽和碳酸氫鈉溶液(20ml)，然后將有機(jī)層用乙酸乙酯萃取，用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥。濃縮后，殘留物經(jīng)柱層析純化(己烷/乙酸乙酯＝3/1-1/1)，得到產(chǎn)物(92mg，40％)。
mp144℃；
LCMS(4分鐘方法)Rt＝2.55min，m/z＝352(M+H)+；
1H-NMR(500Mz，DMSO-d6)δ＝0.87(3H，t，J＝7.0Hz)，1.17-1.33(6H，m)，1.46-1.52(3H，m)，1.77(3H，s)，1.54-1.86(3H，m)，1.92(2H，m)，2.29(1H，m)，2.57(1H，d，J＝5.7Hz)，3.65(1H，t，J＝8.8Hz)，3.92(1H，m)，4.77(1H，d，J＝3.8Hz)，5.48(1H，d，J＝7.9Hz)，5.72(1H，m)，5.80(1H，d，J＝10.4Hz)，9.07(1H，s).
實(shí)施例8
1-(環(huán)己基-羥基-甲基)-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮
向1-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮(實(shí)施例1)(100mg，0.3mmol)和10％Pd-C(5mg)在二氯甲烷(2ml)中的混懸液中小心通入氫氣。室溫下攪拌3小時(shí)后，過濾除去催化劑。殘留物經(jīng)柱層析純化(己烷/乙酸乙酯＝4/1)，得到產(chǎn)物(50mg，50％)。
mp167℃；
LCMS(4分鐘方法)Rt＝2.73min，m/z＝338(M+H)+；
1H-NMR(500Mz，DMSO-d6)δ＝0.87(3H，t，J＝6.9Hz)，0.90-1.35(12H，m)，1.73(3H，s)，1.40-1.86(9H，m)，2.40(1H，t，J＝7.6Hz)，3.67(1H，t，J＝7.9Hz)，5.23(1H，d，J＝7.9Hz)，8.85(1H，s).
實(shí)施例9
乙酸(1S)-環(huán)己-2-烯-1-基[(1R，4R，5S)-4-己基-5-甲基-3，7-二氧代-6-氧雜-2-氮雜二環(huán)[3.2.0]庚-1-基]甲酯
室溫下，將(1R，4R，5S)-1-[(1S)-環(huán)己-2-烯-1-基(羥基)甲基]-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮(實(shí)施例1)(8.3mg，0.025mmol)和乙酸酐(2.78mg，0.027mmol)的吡啶(0.002ml)混合液攪拌18小時(shí)。然后，將混合物用甲苯稀釋，減壓濃縮，得到乙酸(1S)-環(huán)己-2-烯-1-基[(1R，4R，5S)-4-己基-5-甲基-3，7-二氧代-6-氧雜-2-氮雜二環(huán)[3.2.0]庚-1-基]甲酯(9.00mg，96％)。
MSm/z＝378(M+H)+；
1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ＝0.87(3H，t，J＝7.0Hz)，1.22-1.34(6H，m)，1.40-1.85(8H，m)，1.70(3H，s)，1.85-2.02(3H，m)，2.07(3H，s)，2.67(1H，dd，J＝8.0，5.5Hz)，5.19(1H，d，J＝8.5Hz)，5.41(1H，dd，J＝10.5，2.1Hz)，5.74(1H，m)，8.17(1H，s).
實(shí)施例10
2-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-己基-3-羥基-3-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-硫代羧酸S-芐酯
室溫下，向1-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮(實(shí)施例1)(30mg，0.09mmol)和三乙胺(37μl，0.27mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中加入氫硫化芐(0.1ml)。攪拌4小時(shí)后，混合液經(jīng)柱層析純化(己烷(單用)-己烷/乙酸乙酯＝3/1-1/1)，得到產(chǎn)物，用己烷洗滌，得到白色固體(25mg，61％)。
mp138℃；
LCMS(4分鐘方法)Rt＝2.92min，m/z＝460(M+H)+；
1H-NMR(500Mz，DMSO-d6)δ＝0.86(3H，t，J＝6.9Hz)，0.98(1H，m)，1.46(3H，s)，1.12-1.58(13H，m)，1.81(2H，m)，2.07(1H，m)，2.43(1H，m)，3.79(1H，t，J＝6.5Hz)，4.00(1H，d，J＝13.8Hz)，4.09(1H，d，J＝13.8Hz)，4.84(1H，s)，5.00(1H，d，J＝7.6Hz)，5.60(1H，m)，5.76(1H，d，J＝12.0Hz)，7.18-7.32(5H，m)，8.14(1H，s).
實(shí)施例11
2-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-己基-3-羥基-3-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-硫代羧酸S-(2-乙酰胺基-乙基)酯
室溫下，向1-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮(實(shí)施例1)(20mg，0.06mmmol)和三乙胺(25μl，0.27mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液中加入硫醇(0.05ml)。攪拌1小時(shí)后，混合液經(jīng)柱層析純化(己烷(單用)-己烷/乙酸乙酯＝3/1-1/1)，得到產(chǎn)物，用正己烷洗滌，得到白色固體(10mg，37％)。
mp82℃；
LCMS(4分鐘方法)Rt＝2.38min，m/z＝455(M+H)+；
1H-NMR(500Mz，DMSO-d6)δ＝0.86(3H，t，J＝6.8Hz)，1.09(1H，m)，1.44(3H，s)，1.19-1.55(11H，m)，1.62(2H，m)，1.79(3H，m)，1.85(2H，m)，2.13(1H，m)，2.44(1H，m)，2.82(2H，m)，3.13(2H，m)，3.79(1H，t，J＝7.0Hz)，4.76(1H，s)，5.02(1H，d，J＝7.6Hz)，5.63(1H，m)，5.79(1H，d，J＝10.1Hz)，7.93(1H，m)，8.18(1H，s).
實(shí)施例12
3-[2-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-己基-3-羥基-3-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-羰基硫烷基]-丙酸甲酯
室溫下，向1-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮(實(shí)施例1)(20mg，0.06mmol)和三乙胺(25μl，0.18mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液中加入硫醇(0.05ml)。攪拌4小時(shí)后，混合液經(jīng)柱層析純化(己烷(單用)-己烷/乙酸乙酯＝3/1-1/1)，得到產(chǎn)物，用己烷洗滌，得到白色固體(10mg，37％)。
mp64℃；
LCMS(4分鐘方法)Rt＝2.64min，m/z＝456(M+H)+；
1H-NMR(500Mz，DMSO-d6)δ＝0.86(3H，t，J＝6.9Hz)，1.09(1H，m)，1.43(3H，s)，1.15-1.54(11H，m)1.61(2H，m)，1.86(2H，m)，2.12(1H，m)，2.44(1H，t，J＝5.9Hz)，2.56(2H，t，J＝6.8Hz)，2.95(2H，t，J＝7.1Hz)，3.60(3H，s)，3.77(1H，t，J＝7.1Hz)，4.76(1H，s)，5.01(1H，d，J＝7.7Hz)，5.63(1H，m)，.5.78(1H，d，J＝11.9Hz)，8.18(1H，s).
實(shí)施例13
2-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-己基-3-羥基-3-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-硫代羧酸S-環(huán)己基酯
室溫下，向1-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮(實(shí)施例1)(20mg，0.06mmol)和三乙胺(83μl，0.6mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液中加入硫醇(0.1ml)。攪拌40小時(shí)后，混合液經(jīng)柱層析純化(己烷(單用)-己烷/乙酸乙酯＝3/1-1/1)，得到產(chǎn)物，用己烷洗滌，得到白色固體(16mg，59％)。
mp85℃；
LCMS(4分鐘方法)Rt＝3.04min，m/z＝452(M+H)+；
1H-NMR(500Mz，DMSO-d6)δ＝0.86(3H，t，J＝7.0Hz)，1.43(3H，s)，1.09-1.56(18H，m)，1.56-1.73(4H，m)，1.74-1.89(4H，m)，2.15(1H，m)，2.42(1H，m)，3.36(1H，m)，3.79(1H，t，J＝6.6Hz)，4.69(1H，s)，4.94(1H，d，J＝7.6Hz)，5.64(1H，m)，5.78(1H，d，J＝10.1Hz)，8.02(1H，s).
實(shí)施例14
2-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-3-羥基-4-(1-羥基-己基)-3-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-硫代羧酸S-芐基酯
室溫下，向1-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-(1-羥基-己基)-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮(實(shí)施例2)(30mg，0.09mmol)和三乙胺(36μl，0.26mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中加入氫硫化芐(0.05ml)。攪拌4小時(shí)后，混合液經(jīng)柱層析純化(己烷(單用)-己烷/乙酸乙酯＝3/1-1/1)，得到產(chǎn)物，用己烷洗滌，得到白色固體(17mg，41％)。
mp123℃；
LCMS(4分鐘方法)Rt＝2.84min，m/z＝476(M+H)+；
1H-NMR(500Mz，DMSO-d6)δ＝0.87(3H，t，J＝7.0Hz)，0.94(1H，m)，1.49(3H，s)，1.14-1.56(9H，m)，1.71(2H，m)，1.81(2H，m)，2.08(1H，m)，2.48(1H，m)，3.77(1H，t，J＝7.3Hz)，3.82(1H，m)，4.01(1H，d，J＝13.8Hz)，4.11(1H，d，J＝13.9Hz)，5.11(1H，d，J＝7.3Hz)，5.20(1H，d，J＝2.9Hz)，5.48(1H，s)，5.61(1H，m)，5.75(1H，d，J＝10.7Hz)，7.17-7.32(5H，m)，8.45(1H，s).
實(shí)施例15
2-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-3-羥基-4-(1-羥基-己基)-3-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-硫代羧酸S-(2-乙酰氨基-乙基)酯
室溫下，向1-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-4-(1-羥基-己基)-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮(實(shí)施例2)(30mg，0.09mmol)和三乙胺(36μl，0.26mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中加入硫醇(0.05ml)。攪拌1小時(shí)后，混合液經(jīng)柱層析純化(己烷(單用)-己烷/乙酸乙酯＝3/1-1/1)，得到產(chǎn)物，用己烷洗滌，得到白色固體(25mg，62％)。
mp80℃；
LCMS(4分鐘方法)Rt＝2.19min，m/z＝471(M+H)+；
1H-NMR(500Mz，DMSO-d6)δ＝0.87(3H，t，J＝6.3Hz)，1.48(3H，s)，1.01-1.75(12H，m)，1.79(3H，s)，1.87(2H，m)，2.14(1H，m)，2.48(1H，m)，2.84(2H，t，J＝7.0Hz)，3.13(2H，m)，3.77(1H，t，J＝7.0Hz)，3.82(1H，m)，5.11(1H，d，J＝7.3Hz)，5.19(1H，m)，5.41(1H，s)，5.64(1H，m)，5.77(1H，d，J＝10.1Hz)，7.93(1H，m)，8.49(1H，s).
實(shí)施例16-乙酸甲酯
室溫下，向2-(環(huán)己-2-烯基-羥基-甲基)-3-羥基-4-(1-羥基-己基)-3-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-甲酸(實(shí)施例2)(50mg，0.14mmol)的THF(3ml)溶液中，加入三乙胺(57μl，0.4mmol)、硫醇(0.05ml)和BOPCl(52mg，0.2mmol)。攪拌3小時(shí)后，向其中加入飽和碳酸氫鈉溶液(10ml)，然后將有機(jī)層用乙酸乙酯萃取，用鹽水洗滌，經(jīng)硫酸鎂干燥。殘留物經(jīng)柱層析純化(己烷/乙酸乙酯＝3/1-1/1)，得到產(chǎn)物(21mg，34％)。
mp75℃；
LCMS(4分鐘方法)Rt＝2.46min，m/z＝458(M+H)+；
1H-NMR(500Mz，DMSO-d6)δ＝0.86(3H，t，J＝6.9Hz)，1.02(1H，m)，1.19-1.39(7H，m)，1.46(3H，s)，1.56-1.76(4H，m)，1.86(2H，m)，2.17(1H，m)，2.48(1H，m)，3.61(3H，s)，3.68(2H，s)，3.74(1H，t，J＝7.2Hz)，3.80(1H，m)，5.13(1H，d，J＝7.3Hz)，5.17(1H，d，J＝2.8Hz)，5.45(1H，s)，5.64(1H，m)，5.78(1H，d，J＝10.4Hz)，8.57(1H，s).
實(shí)施例17
2-(環(huán)己基-羥基-甲基)-4-己基-3-羥基-3-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-硫代羧酸S-芐基酯
室溫下，向1-(環(huán)己基-羥基-甲基)-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮(實(shí)施例8)(20mg，0.06mmol)和三乙胺(25μl，0.18mmol)的二氯甲烷(2ml)溶液中加入氫硫化芐(0.05ml)。攪拌18小時(shí)后，混合液經(jīng)柱層析純化(己烷(單用)-己烷/乙酸乙酯＝3/1-1/1)，得到產(chǎn)物，用己烷洗滌，得到白色固體(15mg，55％)。
mp181℃；
LCMS(4分鐘方法)Rt＝2.89min，m/z＝462(M+H)+；
1H-NMR(500Mz，DMSO-d6)δ＝0.86(3H，t，J＝7.0Hz)，0.87-1.05(4H，m)，1.20-1.50(15H，m)，1.45(3H，s)，1.56(1H，m)，1.79(1H，m)，2.42(1H，t，J＝6.3Hz)，3.75(1H，dd，J＝5.4，7.0Hz)，4.00(1H，d，J＝13.9Hz)，4.10(1H，d，J＝13.9Hz)，4.79-7.83(2H，m)，7.20-7.30(5H，m)，7.85(1H，s).
實(shí)施例18
3-[2-(環(huán)己基-羥基-甲基)-4-己基-3-羥基-3-甲基-5-氧代-吡咯烷-2-羰基硫烷基]-丙酸甲酯
室溫下，向1-(環(huán)己基-羥基-甲基)-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜-二環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮(實(shí)施例8)(20mg，0.06mmol)和三乙胺(25μl，0.18mmol)的二氯甲烷(1ml)溶液中加入硫醇(0.05ml)。攪拌18小時(shí)后，混合液經(jīng)柱層析純化(己烷(單用)-己烷/乙酸乙酯＝3/1-1/1)，得到產(chǎn)物，用己烷洗滌，得到白色固體(14mg，52％)。
mp132℃；
LCMS(4分鐘方法)Rt＝2.66min，m/z＝458(M+H)+；
1H-NMR(500Mz，DMSO-d6)δ＝0.86(3H，t，J＝6.9Hz)，1.43(3H，s)，0.85-1.90(21H，m)，2.41(1H，m)，2.55(2H，m)，2.96(2H，m)，3.23(3H，s)，3.73(1H，t，J＝5.6Hz)，4.73(1H，s)，4.83(1H，d，J＝7.3Hz)，7.95(1H，s).
B.生理活性評價(jià)
本發(fā)明化合物的體外活性可在以下分析測定中證明
HTS測試
將試驗(yàn)化合物6倍系列稀釋，稀釋劑為包含150μM Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA的50mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5mM EDTA，0.005％TritonX-100和0.075％SDS。
向1536孔黑板的每孔中加入2μl稀釋的化合物溶液，隨后加入溶解于50mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5mM EDTA和0.005％TritonX-100中的3μl的0.5μg/ml升20S蛋白酶體(哺乳動(dòng)物，AFFINITI，Exeter，U.K.)。室溫下孵育1小時(shí)后，加入3μl的13μM Z-Leu-Leu-Leu-H結(jié)束反應(yīng)，在ARVO多標(biāo)檢測計(jì)數(shù)儀(Perkin Elmer，東京，日本)上，在λex 355nm和λem 460nm處測定熒光強(qiáng)度。
蛋白酶體抑制測試
在聚丙烯96孔板中，用2.5％的DMSO將試驗(yàn)化合物稀釋為若干濃度。作為內(nèi)部對照，采用所述試驗(yàn)化合物的相同步驟稀釋MG-132(Cat#3175-v；Peptide Institute，大阪，日本)。將稀釋的工作液(10μl/孔)轉(zhuǎn)移入聚丙烯96孔板中。測試緩沖液由50mM Tris-HCl(pH8.0)、0.5mM EDTA、0.005％TritonX-100和0.005％SDS組成，按10x濃度貯備液制備。肽底物(Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA；3120-v；PeptideInstitute，大阪，日本)以10mM儲(chǔ)備于100％DMSO中。將肽底物用1.25x濃度的測試緩沖液稀釋至125μM，然后向該化合物溶液中加入40μl底物溶液。室溫下，將所述化合物與底物預(yù)孵育10分鐘。然后將該化合物與底物的混合液(10μl/孔)轉(zhuǎn)移至黑色未包被的384孔測試板(Nunc)中，采用ARVO熒光板導(dǎo)桿(Perkin Elmer，Tokyo，Japan)，在460nm(λex，360nm)測定自發(fā)熒光發(fā)射強(qiáng)度。
人血紅細(xì)胞S20蛋白酶體購自Affinity research products Ltd(Cat#PW8720；Exeter，UK)，儲(chǔ)存于-80℃。將蛋白酶體以1x濃度的測試緩沖液稀釋至1000倍，然后將10μl加入到板內(nèi)的底物和抑制劑混合物中。室溫下進(jìn)行蛋白水解反應(yīng)。連續(xù)測量熒光發(fā)射90分鐘。在反應(yīng)的起始速度時(shí)，測定化合物的IC50值。表A給出選擇的數(shù)據(jù)。
表A
糜蛋白酶測試
在聚丙烯96孔板中，用2.5％的DMSO將試驗(yàn)化合物稀釋為若干濃度。作為內(nèi)部對照，采用所述試驗(yàn)化合物的相同步驟稀釋糜蛋白酶(Cat#4063；Peptide Institute，大阪，日本)。將稀釋的工作液(10μl/孔)轉(zhuǎn)移入聚丙烯96孔板中。測試緩沖液由50mM TES(pH8.0)、10mMCaCl2和0.1mg/ml BSA組成，按10x濃度貯備液制備。將肽底物(Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-MCA；3120v；Peptide Institute，大阪，日本)以10mM儲(chǔ)備于100％DMSO中。將肽底物用1.25x濃度的測試緩沖液稀釋至50μM，然后向該化合物溶液中加入40μl底物溶液。室溫下，將所述化合物與底物預(yù)孵育10分鐘。然后將該化合物與底物的混合液(10μl/孔)轉(zhuǎn)移至黑色未包被的384孔測試板(Nunc)中，采用ARVO熒光板導(dǎo)桿(Perkin Elmer，Tokyo，Japan)，在460nm(λex，360nm)測定自發(fā)熒光發(fā)射強(qiáng)度。
人糜蛋白酶購自Calbiochem(Cat#230900)，用50％甘油稀釋至0.5mg/ml，儲(chǔ)存于-20℃。將該糜蛋白酶儲(chǔ)備液用1x濃度的測試緩沖液稀釋至18ng/ml，然后將10μl加入到板內(nèi)的底物和抑制劑混合物中。室溫下進(jìn)行蛋白水解反應(yīng)。連續(xù)測定熒光發(fā)射60分鐘。在反應(yīng)的起始速度時(shí)，測定化合物的IC50值。
胰蛋白酶測試
在聚丙烯96孔板中，用2.5％的DMSO將試驗(yàn)化合物稀釋為若干濃度。作為內(nèi)部對照，采用所述試驗(yàn)化合物的相同步驟稀釋亮抑酶肽(Cat#4041-v；Peptide Institute，大阪，日本)。將稀釋的工作液(10μl/孔)轉(zhuǎn)移入聚丙烯96孔板中。測試緩沖液由50mM Tris-HCl(pH8.0)、150mM NaCl、1mM CaCl2和0.1mg/ml BSA 50mM組成，按10x濃度貯備液制備。將肽底物(Boc-Gln-Ala-Arg-MCA；3135-v；PeptideInstitute，大阪，日本)以1mM儲(chǔ)備于100％DMSO中。將肽底物用1.25x濃度的測試緩沖液稀釋至15μM，然后向該化合物溶液中加入40μl底物溶液。室溫下，將所述化合物與底物預(yù)孵育10分鐘。然后將該化合物與底物的混合液(10μl/孔)轉(zhuǎn)移至黑色未包被的384孔測試板(Nunc)中，采用ARVO熒光板導(dǎo)桿(Perkin Elmer，Tokyo，Japan)，在460nm(λex，360nm)測定自發(fā)熒光發(fā)射強(qiáng)度。
胰蛋白酶購自Calbiochem，用1mM HCl稀釋至1mg/ml，儲(chǔ)存于-20℃。將該胰蛋白酶儲(chǔ)備液用1x濃度的測試緩沖液稀釋至1ng/ml，然后將10μl加入到板內(nèi)的底物和抑制劑混合物中。室溫下進(jìn)行蛋白水解反應(yīng)。持續(xù)測定熒光發(fā)射60分鐘。在反應(yīng)的起始速度時(shí)，測定化合物的IC50值。
A549細(xì)胞中TNFα誘導(dǎo)的RANTES生成
將A549人肺上皮細(xì)胞系(ATCC #CCL-885)保存于添加了10％FCS(Gibco)、100U/ml青霉素、10μg/ml鏈霉素和2mM谷氨酰胺的Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(D-MEM，Nikken Biomedical Institute)中。在96孔平底組織培養(yǎng)板中，將A549細(xì)胞(4×104個(gè)細(xì)胞，80μl/孔)用介質(zhì)(0.1％DMSO)或試驗(yàn)化合物處理1小時(shí)。然后，將細(xì)胞用100ng/ml TNFα刺激24小時(shí)。按照制造商推薦(R&D Systems，Oxon，UK)，采用定量多層熒光免疫分析技術(shù)，測定24小時(shí)后收集的上清液中的RANTES的濃度。
A549細(xì)胞中TNFα誘導(dǎo)的IκBα的降解
37℃下，將生長在6孔板中的亞融合的A549細(xì)胞用各種濃度的抑制劑或介質(zhì)(0.1％DMSO)預(yù)處理30分鐘。然后，將細(xì)胞放置不處理或者用10ng/ml TNFα刺激指定的時(shí)間。將細(xì)胞用冷PBS洗滌2次，然后在冰上用100μl SDS-PAGE樣品緩沖液溶解。將該細(xì)胞溶解物短暫超聲，離心，將上清液用SDS-PAGE處理，按照制造商推薦，應(yīng)用抗IκBα(New England Biolabs #9242)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡分析。
MDA MB231和H460腫瘤細(xì)胞增殖的抑制
將細(xì)胞(3000)以3000細(xì)胞/孔接種于96孔板中的含有10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基內(nèi)，然后37℃培養(yǎng)24小時(shí)。接種24小時(shí)后，將終濃度范圍在10μM至系列稀釋至10nM之間的化合物加入，DMSO終濃度為0.1％。加入化合物后，在37℃下，在完全生長培養(yǎng)基中，將細(xì)胞培養(yǎng)72小時(shí)。采用Promega Cell TiterGlo ATP熒光檢測試劑盒(PromegaCorp)，通過測定以細(xì)胞ATP的量為基礎(chǔ)的熒光信號(hào)，確定每孔活的細(xì)胞數(shù)目，間接測定細(xì)胞數(shù)目。從0天的值中減去與試驗(yàn)化合物培養(yǎng)72小時(shí)后所讀數(shù)值。用Analyze 5程序確定IC50值。細(xì)胞種類間平均信嗓比＝3-5倍。
C.與藥用組合物相關(guān)的操作實(shí)施例
可用如下方法，將本發(fā)明化合物轉(zhuǎn)化為藥用制劑
片劑
組合物
100mg實(shí)施例1化合物、50mg乳糖(單水合物)、50mg玉米淀粉(天然)、10mg聚乙烯吡咯烷酮(PVP 25)(得自BASF，Ludwigshafen，德國)和2mg硬脂酸鎂。
片重212mg，直徑8mm，曲率半徑12mm。
制備
將活性組分、乳糖和淀粉的混合物與5％(m/m)PVP的水溶液制粒。干燥后，將顆粒與硬脂酸鎂混合5分鐘。采用常規(guī)壓片機(jī)(片型如上)將混合物壓制成形。沖模壓力一般為15kN。
口服混懸劑
組合物
1000mg實(shí)施例1化合物、1000mg乙醇(96％)、400mg Rhodigel(黃耆膠，產(chǎn)自FMC，賓西法尼亞州，美國)和99g水。
10ml口服混懸劑提供單劑量的100mg本發(fā)明化合物。
制備
將Rhodigel混懸于乙醇中，向該混懸液中加入活性組分。攪拌下加入水。持續(xù)攪拌約6小時(shí)直到Rhodigel完全溶脹。
序列表
<110>BayerAG
<120>取代的雜環(huán)
<130>LeA 36 545-DE01
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>243
<212>DNA
<213>鏈霉菌(Streptomyces sp)
<400>1
cacgtgggca atctgccctt cactctggga caagccctgg caaacgggct ctaataccgg 60
atatcactct cgcaggcatc tgtgagggtc gaaagctccg gcggtgaagg atgagcccgc120
ggcctatcag cttgttggtg aggtaacggc tcaccaacgg cgacgacggc tagccggcct180
gagaggcgac cgccacactg gcactcgaga cacggcccag actcctacgg aggcagcagt240
cgg 24權(quán)利要求
1.下式化合物及其鹽、溶劑合物或所述鹽的溶劑合物
其中
R1代表氫、羥基或甲基羰基氧基，
R2代表環(huán)己基或環(huán)己-2-烯基，
其中環(huán)己基可被0至2個(gè)羥基取代，以及
R3代表氫或羥基。
2.具有下式的權(quán)利要求1的式(I)化合物及其鹽、溶劑合物或所述鹽的溶劑合物
其中
R1、R2和R3具有權(quán)利要求1中所述的意義。
3.權(quán)利要求1的式(I)化合物，例如
(1R，4R，5S)-1-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜雙環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮
(1R，4R，5S)-1-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-4-[1-羥基-己基]-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜雙環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮
以及(1R，4R，5S)-1-[(1R)-2-環(huán)己烯-1-基甲基]-4-己基-5-甲基-6-氧雜-2-氮雜雙環(huán)[3.2.0]庚烷-3，7-二酮
4.下式化合物及其鹽、溶劑合物或所述鹽的溶劑合物
其中
R4代表氫或羥基，
R5代表環(huán)己基或環(huán)己-2-烯基，
其中環(huán)己基可被0至2個(gè)羥基取代，
R6代表氫或羥基，以及
R7代表羥基或選自下式的取代基
或
其中
R8代表氫或甲基，以及
*代表與所述分子的連接位置。
5.具有下式的權(quán)利要求4的式(II)化合物及其鹽、溶劑合物或所述鹽的溶劑合物，
其中
R4、R5、R6和R7具有權(quán)利要求4中所述的意義。
6.權(quán)利要求4的式(II)化合物，例如
(3S，4R)-2-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-3-羥基-4-[1-羥基己基]-3-甲基-5-氧代-D-脯氨酸
N-乙酰基-S-({(2R，3S，4R)-2-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-4-己基-3-羥基-3-甲基-5-氧代-2-吡咯烷基}羰基)半胱氨酸
和
N-乙?；?S-({(2R，3S，4R)-2-[(S)-(1S)-2-環(huán)己烯-1-基(羥基)甲基]-4-己基-3-羥基-3-甲基-5-氧代-2-吡咯烷基}羰基)半胱氨酸甲酯
7.一種合成權(quán)利要求1或2的通式(I)和(Ia)化合物的方法，其中式(I)包含式(Ib)、(Ic)、(Id)和(Ie)化合物，以及一種合成權(quán)利要求4或5的通式(II)和(IIa)化合物的方法，其中式(II)包含式(IIb)、(IIc)和(IId)化合物，所述方法的特征在于
[A]以下通式的化合物，
其中
R1和R3具有權(quán)利要求1中所述的意義，
通過從具有SEQ ID NO1的鏈霉菌屬的放線菌中發(fā)酵并分離制備，
或者
[B]以下通式的化合物，
其中
R1和R3具有權(quán)利要求1中所述的意義，
通過氫化式(Ib)化合物中的雙鍵制備，
或者
[C]以下通式的化合物，
其中
R1和R3具有權(quán)利要求1中所述的意義，和
所述羥基連接在1或2位碳原子上，
通過式(Ib)化合物中的雙鍵的水合制備，
或者
[D]以下通式的化合物，
其中
R1和R3具有權(quán)利要求1中所述的意義，
通過氧化式(Ib)化合物中的雙鍵制備，
或者
[E]以下通式的化合物，
其中
R4、R5和R6具有權(quán)利要求4中所述的意義，和
R7代表羥基或下式的取代基，
其中
R8具有權(quán)利要求4中所述的意義，
通過從具有SEQ ID NO1的鏈霉菌屬的放線菌中發(fā)酵并分離制備，
或者
[F]以下通式的化合物，
其中
R4、R5和R6具有權(quán)利要求4中所述的意義，和
R7代表選自下式的取代基，
或
通過使下式化合物與硫醇反應(yīng)制備，
其中
R4、R5和R6具有權(quán)利要求4中所述的意義。
8.包含至少一種權(quán)利要求1-6中的通式(I)、(Ia)、(II)或(IIa)的化合物以及藥學(xué)上可接受的稀釋劑的組合物。
9.一種權(quán)利要求8的組合物，它用于治療急性和慢性炎癥過程或癌癥。
10.權(quán)利要求8和9的組合物的制備方法，其特征在于權(quán)利要求1-6的通式(I)、(Ia)、(II)或(IIa)的化合物與常用輔助劑一起被制成適合應(yīng)用的劑型。
11.權(quán)利要求1-6的通式(I)、(Ia)、(II)或(IIa)的化合物在制備藥物中的用途。
12.權(quán)利要求11的用途，所述用途為制備用于治療急性和慢性炎癥過程或癌癥的藥物。
13.用于控制人和動(dòng)物的急性和慢性炎癥過程的方法，該方法包括給予抗炎有效量的至少一種權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的化合物。
14.用于控制人和動(dòng)物的癌癥過程的方法，該方法包括給予治療癌癥有效量的至少一種權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)的化合物。
15.具有保藏號(hào)DSM 15324和SEQ ID NO1的微生物。
16.具有保藏號(hào)DSM 15324和SEQ ID NO1的微生物，它用于制備式(I)、(Ia)、(II)和(IIa)的化合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及取代的雜環(huán)類化合物、其制備以及其作為藥物的用途，尤其是用于治療炎性疾病，如哮喘或癌癥。
文檔編號(hào)A61P35/00GK1845925SQ20048000937
公開日2006年10月11日 申請日期2004年2月6日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月14日
發(fā)明者M·施塔德勒, S·塞普, H·米勒, A·邁爾-巴特施米德, M·-A·布呂寧, J·貝內(nèi)特-布赫霍爾茨, 十龜弘子, 百百玲子, P·賴內(nèi)默, K·貝康, 渕上欣司, 松川聰子, K·烏爾巴恩斯 申請人:英特美德探索有限責(zé)任公司