突變型Bik的抗腫瘤效果的制作方法
                            
            
                            
            文檔序號：1091123閱讀：872來源：國知局
            
                            
                        
            
                        
            
                        
            
                            專利名稱：突變型Bik的抗腫瘤效果的制作方法
            
技術領域：
            本發(fā)明所屬的領域是細胞生物學、分子生物學、腫瘤生物學和醫(yī)學。本發(fā)明更具體地涉及不同形式的Bik，其包含對腫瘤治療有效的抗細胞增殖和/或促凋亡活性。
            
背景技術：
             Bik，也稱nbk，是促凋亡的僅含BH3(BH3-only)的蛋白質中的一種，它只具有一個Bcl-2同源區(qū)——BH3結構域，并在最近被認識到是凋亡所必需的起始因子(Han等，1996；Boyd等，1995)。在Bik基因所處的染色體22q上，信息等位基因的缺失可能與人類乳腺癌和結腸直腸癌的發(fā)展有關(Daniel等，1999)。該18-kDa的Bik蛋白與E1B 19K相互作用，并與不同的抗凋亡蛋白形成異二聚體，如Bcl-2和Bcl-XL，這一結合阻滯了抗凋亡蛋白的功能(Han等，1996)。Bik介導的凋亡需要BAX參與(Theodorakis等，2002)，而不依賴于p53(Han等，1996)。在應答生理性的由E1A引起的p53介導的死亡刺激時，Bik也是p53的下游凋亡效應因子(Bartke等，2001)。上調的Bcl-2在p53和Bik誘導的下游發(fā)揮功能，從而抑制E1A死亡途徑，而E1A表達細胞的死亡或生存則由該細胞中抗凋亡Bcl-2和促凋亡Bik的比例決定(Mathai等，2002)。此外，Bik能使腫瘤細胞對某些化療藥物敏化(Daniel等，1999)，且誘導凋亡的化療藥物中的一種--阿霉素(doxorubicin)是由Bik基因介導的(Panaretakis等，2002)。所有這些研究表明Bik是一種以人類癌癥為靶向的有效治療基因。
            
僅含BH3的蛋白質在它們的表達模式和活化模式上有所區(qū)別，許多僅含BH3的蛋白質的活化需要翻譯后修飾(Puthalakath和Strasse，2002)。Bik是活性可被磷酸化作用調控的僅含BH3的蛋白質中的一種(Verma等，2000)。Verma等證實Bik是以磷蛋白的形式存在，并在蘇氨酸33和絲氨酸35殘基處被磷酸化，它們所決定的是全部實現(xiàn)Bik的凋亡活性所需的，這一活性可能是通過酪蛋白激酶II相關酶實現(xiàn)的。即，Verma等將蘇氨酸和絲氨酸殘基磷酸化位點突變成為丙氨酸殘基，結果導致了Bik凋亡活性的下降。他們由此斷定Bik的促凋亡能力需要磷酸化過程，而該磷酸化是通過并不顯著影響其與Bcl-2的親和的目前尚未知的機制進行。
            
發(fā)明概況本發(fā)明提供新穎的治療性的Bik突變體組合物和方法，具體而言是治療癌癥，且熟練的技術人員公認在對抗癌癥的方法庫中添加任何一種方法都是有益于公眾健康的。
            
本發(fā)明涉及與Bik突變體相關的系統(tǒng)和方法，且具體涉及其抗腫瘤效果。Bik是Bcl-2蛋白質家族中的一個促凋亡成員。在本發(fā)明中，發(fā)明人證實其新發(fā)現(xiàn)非野生型形式的Bik，例如突變型，無論在體內或體外都顯示出強大的抗腫瘤活性。與Verma等的解釋相比(2000)，去除了Bik上磷酸化位點的本文所述的模擬Bik突變體的多肽，仍然具有有效的抗腫瘤、抗細胞增殖和/或促凋亡活性，且在某些實施方案中，比野生型Bik更有效。也即，本發(fā)明所列的實施例顯示通過編碼突變bik多肽的多聚核苷酸的轉染，可在不同人類癌癥中誘導凋亡。這就提供了同樣使用本發(fā)明的組合物(如治療用)和方法，如將突變型Bik多聚核苷酸用于癌癥的基因治療，如卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌。
            
因此，本發(fā)明總體上涉及抑制癌癥細胞和/或腫瘤細胞增殖的方法，該方法包括將所述細胞與有效量的抑制增殖的突變型Bik多肽相接觸。本文所指的突變型Bik多肽為一種具有抗細胞增殖、促凋亡和/或抗腫瘤活性的突變形式。增殖的抑制在代表性的實施方式中可以以下指標顯示，如對某一細胞的凋亡誘導，如舉例來說在細胞培養(yǎng)中對癌癥細胞株的生長抑制、對腫瘤體積的減小和/或存活能力的提高。更佳的是，在某些實施方案中要抑制其增殖的細胞是有生命的生物體(例如人類)的細胞。這種轉化的抑制在預防和/或治療此類轉化驅動的現(xiàn)象如癌癥、腫瘤發(fā)生和/或轉移中，具有很大的實用性。
            
突變型Bik多肽可通過許多為熟練技術人員所知的方式中的任何一種方式與細胞接觸或導入細胞。突變型Bik多肽可通過直接導入突變型Bik多肽方式導入細胞。在這種情況下，該突變型Bik多肽可通過本領域所知的任何方法獲得，雖然如所期望的，在體外將突變型Bik多肽導入細胞(例如在細胞培養(yǎng)體系中)可為獲得突變Bik的較佳方法。
            
突變型Bik也同樣可通過在細胞中導入編碼突變型Bik多肽的多聚核苷酸的方式導入細胞。例如，RNA或DNA編碼的Bik可通過本領域所知的任何方式導入細胞。在某些較佳實施方式中，突變型Bik通過導入編碼突變Bik的DNA片斷的方式導入細胞。在某些這樣的實施方式中，設想在該DNA片斷中進一步將突變型Bik基因(或突變型Bik多聚核苷酸)與其相關的調控序列有效連接。例如，該Bik基因可與合適的啟動子和合適的終止子序列有效連接。該基因/調控序列DNA構造的構建在本領域中眾所周知。在具體實施方式
            
中，啟動子選自下組CMV、端粒酶、TCF-4或VEGF。然而，在具體實施方式
            
中，其構造所包含的啟動子是組織特異性的，如舉例而言，對癌癥的組織特異性，包括典型的乳腺癌、前列腺癌或胰腺癌。
            
在進行導入的某些實施方式中，該DNA片斷可位于載體上，例如質粒載體或病毒載體。所述病毒載體可以是，例如，選自下組逆轉錄病毒、腺病毒、皰疹病毒、痘病毒和腺相關病毒。如此的DNA片斷可用于本發(fā)明相關的不同方法。在本發(fā)明的一個基因治療實施方式中，該載體可用于將突變型Bik基因傳遞到細胞中。同樣，該載體也可用于轉化培養(yǎng)的細胞，而此類培養(yǎng)的細胞可用于，特別是，突變型Bik在體外的表達。
            
本發(fā)明對各種類型的癌癥均有效，這是由于如本文的代表性實施方式中，突變型Bik能不受癌細胞存活策略的影響而殺死它們，這些存活策略為許多癌細胞所采用，如生長因子受體和AKT途徑。在某一具體實施方式
            
中，突變型Bik對實體瘤有效，如舉例來說，肉瘤、肺、腦、前列腺、乳腺、卵巢、胰腺、肝、膀胱、腸胃的癌癥，以及惡性的血液腫瘤，如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。在代表性實施方式中，本發(fā)明對具以下特征的癌癥有效雌激素受體陽性、EGF受體過表達、Her2/neu過表達、Her-2/neu非過表達、Akt過表達、雄性激素依賴或非雄性激素依賴。即，突變型Bik對癌細胞有效，且不受癌細胞的癌基因過表達狀態(tài)的影響，如Her-2/neu、EGFR、AKT，或不受癌細胞的生長是否激素依賴的影響(例如，MCF-7依賴或非PC3依賴)。
            
例如，在本文中包含顯示突變型Bik抗細胞株試驗結果的具體數(shù)據(jù)，該試驗至少由六種代表類型的癌細胞或血管生成(angiogenic)細胞，包括1)乳腺癌，如MCF-7(雌激素受體陽性)、MDA-MB-468(EGF受體過表達)和MDA-MB-231；2)內皮細胞，如人臍帶血管內皮細胞(Human Umbilical Vascular Endothelials，HUVEC)，其顯示突變型Bik的抗血管生成效果；3)頭頸癌，如TU138和TU167；4)黑色素瘤，如B16F10；5)卵巢癌，如SKOV-ipl(Her-2/neu過表達)、SKOV(非Her-2/neu過表達)和2774(Akt過表達)；以及6)前列腺癌，如PC3(非雄性激素依賴性生長)。
            
在
            
具體實施例方式
            
中，突變型Bik所導入的細胞為人類細胞。在許多實施方式中所述的細胞為腫瘤細胞。在某些目前較佳的實施方式中，所述的腫瘤細胞為乳腺腫瘤細胞、前列腺腫瘤細胞、卵巢腫瘤細胞或胰腺腫瘤細胞。然而，突變型Bik可導入其它細胞，包括但不限于膀胱癌細胞、睪丸癌細胞、結腸癌細胞、皮膚癌細胞、肺癌細胞、胃癌細胞、食道癌細胞、腦癌細胞、白血病細胞、肝癌細胞、子宮內膜癌細胞、或頭頸癌細胞。在某些實施方式中，所述突變型Bik組合物通過注射導入。在具體實施方式
            
中，所述突變型Bik組合物包含于脂質體中。
            
在本發(fā)明的某些實施方式中，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)能抑制增殖的Bik突變體，可與其它抗轉化/抗癌治療聯(lián)合使用。這些治療可為在進行本申請時就已知的方法，或可為在本申請之后形成的方法。Bik突變體可與如下的其它治療聯(lián)合使用如治療用多肽、編碼其它治療用多肽的多聚核苷酸、化療藥物、手術方法或放療。例如，突變型Bik可與其它已知的多肽聯(lián)合使用，如TNFα或p53。其它多肽凋亡誘導物也可與Bik聯(lián)合使用，包括但不限于，p53、Bax、Bak、Bcl-x、Bad、Bim、Bok、Bid、Harakiri、Ad E1B、Bad和ICE-CED3蛋白酶。
            
突變型Bik可與任何適合的化療藥物聯(lián)合使用。在某一代表性的實施方式中，所述化療藥物為紫杉酚(taxol)。突變型Bik也可與放療相結合。構成化療的電離輻射的類型可選自下組x-射線、γ-射線和微波。在某些實施方式中，所述電離輻射可通過外束輻射或給予放射性核素進行遞送。突變型Bik同樣也可與其它基因治療方式相結合。在具體實施方式
            
中，所述的突變型Bik被導入腫瘤中。所述腫瘤可以是在動物中的，具體的是在人體中。
            
本發(fā)明的Bik突變體基因產品和多聚核苷酸可同樣以合適的方法導入。導入的“合適方法”指將突變型Bik基因產品置于一定部位以降低腫瘤細胞增殖的方法。例如，可用注射、口服和噴霧方法，由在給定條件下能夠確定適宜導入方法的熟練技術人員實施。在某些采用注射方法的實施方式中，所述的注射可以為靜脈內、腹腔內、肌內、皮下、腫瘤內、胸膜內注射，或其它任何適宜的形式。
            
在本發(fā)明的某些其它方面中，提供了具有合適容器的治療藥盒，其包括突變型Bik基因產品或編碼突變型Bik基因產品的多聚核苷酸的藥學制劑。該藥盒還可包括治療用多肽、編碼治療用多肽的多聚核苷酸和/或化療藥物的藥學制劑。
            
本文中所用的術語“突變型Bik”指來源于任何生物體的Bik多聚核苷酸或多肽，包括諸多的突變型Bik，其具有抗腫瘤活性、抗細胞增殖活性和/或促凋亡活性，其中的突變型Bik與天然Bik相比，至少含有一個改變了的氨基酸或的編碼這些氨基酸的相應多聚核苷酸。該替代可包含經修飾的氨基酸，如含有附加的乙?；陌被?，例如，或該改變可在至少一個具體的氨基酸位點上包含至少一個替代氨基酸。在具體實施方式
            
中，所述突變型Bik在至少一個氨基酸上包含至少一個替代，但仍保留抗細胞增殖活性、抗腫瘤活性、促凋亡活性和/或上述活性的結合效果，從而有效達到本文所述的目的。在某些情況下，突變型Bik較天然Bik顯示出更佳的抗細胞增殖活性、抗腫瘤活性、促凋亡活性和/或上述活性的結合效果。在其它條件下，突變型Bik可具有與天然Bik類似的抗細胞增殖活性、抗腫瘤活性、促凋亡活性和/或上述活性的結合效果。在其它情況下，突變型Bik較天然Bik具有降低的抗細胞增殖活性、抗腫瘤活性、促凋亡活性和/或上述活性的結合效果。當然，一個或多個相關活性大大低于天然Bik或其它突變型Biks相應的相關活性的大部分突變體，在本發(fā)明的所有實施方式中將不被采用。然而，本領域中的熟練技術人員，由于其學習了本領域的技術條件和專業(yè)知識，能夠選擇出對于本發(fā)明的某些具體實施方式
            
具實用性的突變體。
            
所述抗腫瘤活性、抗細胞增殖活性和/或促凋亡活性可對除獲得該突變型Bik的生物體以外的其它生物體有效。例如，在本文中的代表性實施方式中使用了人Bik，而鼠的Bik也可在人類治療中替代使用或補充使用。從任何生物體中獲得的突變型Bik可在任何氨基酸位點替代。此外，人Bik可在具體殘基處發(fā)生突變并被發(fā)現(xiàn)治療有效，而具有相似殘基替代的鼠突變型Bik也可有效。在某一具體實施方式
            
中，鼠Bik多肽包含至少一個磷酸化位點的變化，而基于本文提供的對人Bik的相關說明，本領域的熟練技術人員可知曉如何在鼠Bik中引起類似的變化。在另一具體的實施方式中，突變型鼠Bik在其絲氨酸27、蘇氨酸29、絲氨酸31和/或這些位點的組合位點上發(fā)生替代。
            
當然，Bik可由于其它任何原因發(fā)生突變，而本領域的熟練技術人員也都知道到在Bik多肽或編碼Bik多肽的多聚核苷酸中，除了以改變磷酸化位點為目的和/或影響或保持抗腫瘤活性、抗細胞增殖活性和/或促凋亡活性為目的所需產生突變之外，還可出于的其它目的產生突變。例如，可為使得Bik多聚核苷酸和/或多肽更適合于治療目的而進行突變。例如，可進行如下目的的修飾降低多肽的抗原性、去除部分多肽區(qū)域、增強多肽的核定位性、延長多肽的半衰期等。
            
本文至少在實施例中描述了至少一種用以比較具體突變體和野生型效果的測定試驗，也可采用其它本領域的試驗。在具體實施方式
            
中，至少有一種活性大大低于天然Bik的突變體不是所需要的，并不包含在本發(fā)明的范圍中。
            
具體地說，本發(fā)明涉及與Bik具體突變形式相關的方法和組合物，該Bik具體突變形式與細胞生長、存活或增殖的調控相關。在具體的實施方式中，細胞生長的調控有助于癌癥或再狹窄的治療。具體而言，本發(fā)明教導熟練的技術人員由于突變型Bik多肽含有一或多個氨基酸替代，致使其多肽鏈不能被磷酸化或以低水平被磷酸化，此類突變型Bik多肽在抗腫瘤應用中有效。在具體實施方式
            
中，發(fā)明人已表明突變型Bik能降低或廢除磷酸化，從而導致用該突變型Bik處理過的轉化細胞的生長受到抑制。在具體實施方式
            
中，例如，以Asp或Glu替代，致使該多肽在那些位點不能磷酸化，并導致用該突變型Bik處理過的轉化細胞的生長受到抑制。當然，本發(fā)明不局限于替代氨基酸為Asp或Glu的實施方式。而是，可以抑制Bik磷酸化的以任意氨基酸替代任一氨基酸的替代都在本發(fā)明的考慮范圍內。在某一實施方式中，用于替代Thr33和/或Ser35的氨基酸不為丙氨酸。在另一實施方式中，至少一個替代氨基酸具有至少一個酸性性質，例如，該氨基酸為天冬氨酸或谷氨酸。因此，本發(fā)明的一個目的涉及Bik多肽上的至少一種修飾，該修飾使得該多肽不能被磷酸化，并且優(yōu)選地是所得的Bik突變體具有抗細胞增殖能力、抗腫瘤能力、促凋亡能力或這些能力的組合。
            
本領域的技術人員可認識到在類似的氨基酸或非類似氨基酸上的突變，可以發(fā)生在Bik的其它位點上，且這些突變體中的某一些將具有如本文提供的代表性實施方式中所述的相同活性。例如，Bik中任何位點上的蘇氨酸、絲氨酸或其他適當?shù)陌被峋杀惶娲?，如用代表性的天冬氨酸或谷氨酸加以替代。熟練的技術人員知道公眾可獲得的提供Bik序列(用以改造使其不同于天然Bik)的數(shù)據(jù)庫，如國家生物技術信息中心(National Center for BiotechnologyInformation)的GenBank數(shù)據(jù)庫或商業(yè)數(shù)據(jù)庫如Celera Genomics公司(Rockville，MD)的數(shù)據(jù)庫。代表性的多肽Bik序列包括(以其GenBank編號表示)SEQ ID NO3(AAC50413、NP~001188、AAF01156、AAC79124、CAA62013和S58214)以及SEQ ID NO4(AAC40079和Nu031572)。代表性的多聚核苷酸Bik序列包括(以其GenBank編號表示)SEQ ID NO5(AY245248)和SEQ ID NO6(NM~001197)。
            
因此，本發(fā)明提供了有關在Bik中形成不同突變的指導，因此，本發(fā)明涉及一種關于細胞生長調控整個領域的新進展，該領域包括細胞增殖的抑制和/或細胞死亡的易化。在某一實施方式中，所述細胞增殖的抑制包括其增殖率的延遲、增殖總細胞數(shù)的延遲或包括上述兩者。
            
熟練的技術人員可認識到Bik多肽內的任何位點都可被修飾，從而產生如本文所述的這些組合物，且更進一步的是可進行多位點修飾。熟練的技術人員可認識到在約160個氨基酸的Bik多肽(取決于組織)上，只存在有限數(shù)量的可修飾位點。此外，熟練的技術人員可認識到僅可對其中的20種標準氨基酸進行修飾，而本文所提供的指導即涉及實現(xiàn)這些修飾的方法。進一步而言，基于本文所提供的指導和本領域的其他方法，受本發(fā)明指導的熟練的技術人員可以知道如何測試抗腫瘤、抗細胞生長和/或促凋亡效果，并從而使本領域的熟練技術人員不會采用不恰當?shù)脑囼灧椒y試某一具體的修飾。
            
因此，基于本文所提供的指導，本發(fā)明涉及引起細胞增殖抑制或細胞存活提高抑制的Bik突變多肽。在具體實施方式
            
中，本發(fā)明涉及的突變體包括，例如，Bik T33D、S35D和T33DS35D雙突變。
            
依照本發(fā)明的目標，本發(fā)明包含一種含突變型Bik多肽的組合物。例如，含有一個氨基酸替代的組合物。在某一實施方式中，在本應造成未替代Bik多肽磷酸化的條件下，該替代阻礙Bik多肽的磷酸化。在其它具體實施方式
            
中，該替代為Thr33置換為Asp33或Ser35置換為Asp35，或兩者皆是。在其它具體實施方式
            
中，該組合物進一步被定義為含有分散于藥學可接受的賦形劑中的Bik多肽的組合物。在附加的具體實施方式
            
中，該組合物被置于藥盒的合適包裝中。
            
在本發(fā)明的另一目的中，本發(fā)明包含一種防止個體中細胞生長的方法，該方法包括給該個體施用突變型Bik多肽這一步驟。在另一具體實施方式
            
中，該多肽的給藥是通過脂質體進行的。在某一附加的具體實施方式
            
中，該多肽進一步含有蛋白質轉導域，如HIV Tat或穿透因子(penetratin)。
            
在本發(fā)明的另一目的中，本發(fā)明包含一種防止個體中細胞生長的方法，該方法包含給該個體施用編碼突變型Bik多肽的核酸這一步驟。在另一具體實施方式
            
中，該核酸的給藥是通過選自下組的載體進行的質粒、反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、脂質體以及它們的組合。
            
在本發(fā)明的其它目的中，本發(fā)明包含一種使用突變型Bik多肽組合物的方法，其中該Bik多肽組合物分散于藥學上可接受的賦形劑中，且其中該組合物施用給患有增殖細胞失調的動物。
            
在本發(fā)明的另一目的中，本發(fā)明包含一種治療增殖細胞失調個體的方法，其中包括給該個體施用突變型Bik多肽這一步驟。在另一具體實施方式
            
中，所述的增殖細胞失調指癌癥。在更具體的實施方式中，所述增殖細胞失調指再狹窄。在更具體的實施方式中，所述癌癥指乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或胰腺癌。
            
在本發(fā)明的其它目的中，本發(fā)明包含一種處理細胞的方法，其中包含將該細胞與突變型Bik多肽接觸。在某一具體實施方式
            
中，所述細胞是人類細胞。在另一具體實施方式
            
中，所述細胞包含于某種動物體內。在更具體的實施方式中，所述動物為人類。在更具體的實施方式中，所述人類具有增殖細胞失調。在一附加的具體實施方式
            
中，所述增殖細胞失調指癌癥。在進一步具體的實施方式中，所述癌癥為乳腺癌、卵巢癌或前列腺癌。在另一具體實施方式
            
中，所述增殖細胞失調指再狹窄。
            
在本發(fā)明進一步的目的中，編碼突變型Bik多肽的多聚核苷酸是由組織特異性啟動子調控的，如靶向癌組織的啟動子。雖然任何啟動子對癌組織的靶向性均優(yōu)于非癌組織，在某一具體實施方式
            
中所述的癌特異性啟動子是，例如，乳腺癌特異性的啟動子、前列腺癌特異性啟動子、或胰腺特異性啟動子。
            
在某一
            
具體實施例方式
            
中，乳腺癌特異性啟動子包含乳腺癌特異性序列，而在進一步的實施方式中，包含一段能提高該組織特異性序列表達(如表達水平)的增強子序列。在某一具體實施方式
            
中，將CMV啟動子增強子序列與乳腺癌特異性片段相連，該片段來自于代表性的拓撲異構酶IIα(topoisomerase IIα，topoIIα)啟動子或代表性的轉鐵蛋白受體啟動子。它們對基因靶向有效，能夠靶向并治療原發(fā)性和轉移性的乳腺癌，而對正常組織的毒性較低。
            
在另一實施方式中，編碼突變型Bik多肽的多聚核苷酸的表達由胰腺癌特異性啟動子調控。在某一具體實施方式
            
中，采用了一種新穎的胰腺癌特異性啟動子，如本文中的一個稱為CTP的啟動子，其至少含有最小的胰酶分泌素A受體(Cholecystokinin A receptor，CCKAR，-726至+1核苷酸)、兩步轉錄系統(tǒng)序列和土撥鼠肝炎病毒(woodchuck hepatitis virus，WPRE)的翻譯后調控元件。這一工程化的構建體具有強啟動子活性，并在體內、外顯示對胰腺癌細胞表達突變型Bik的特異性。
            
在本發(fā)明的另一具體實施方式
            
中，前列腺癌特異性啟動子調控編碼突變型Bik多肽的多聚核苷酸的表達。在具體實施方式
            
中，本發(fā)明采用了一種新穎的前列腺癌特異性啟動子，如本文稱為ATTP的啟動子，其至少含有最小的人端粒酶反轉錄酶啟動子(hTert)、土撥鼠肝炎病毒(WPRE)的翻譯后調控元件和ARR2控制序列，其可響應雄性激素的刺激。這一工程化的構建體具有強啟動子活性，并在體外對雄性激素依賴和非雄性激素依賴的前列腺癌細胞顯示出特異性。這一啟動子能用于特異性地驅動體內前列腺癌細胞中突變型Bik的基因表達。
            
上文已列出了十分廣泛的本發(fā)明的特征和技術優(yōu)勢，以使下述本發(fā)明的詳細說明能被更好地理解。本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將在下文中闡述，其構成了本發(fā)明權利要求的主題。本領域的熟練技術人員應當理解，本文所揭示的概念和具體實施方式
            
，可方便地用作修飾或設計其它結構的基礎，而與本發(fā)明達到相同的目的。本領域的技術人員還應意識到這些等價的構建體并不脫離如所附權利要求列出的本發(fā)明的精神和范圍。認為是本發(fā)明特性的新穎性特征(有關其組成和實施方法)與進一步的目的和優(yōu)點將從下面的闡述并結合附圖，得到更好的理解。然而，應該清楚地理解到各附圖是僅出于闡明和說明的目的給出，而并不試圖定義本發(fā)明的限制范圍。
            
附圖簡要說明為了更全面地理解本發(fā)明，在下文結合附圖進行參考說明。
            

            

            
圖1A到1F表明Bik突變體的表達在不同的人類癌細胞系中顯示出更強的生長抑制效果。
            
圖2表明Bik突變體在不同的人類癌細胞系中顯示出更強的細胞殺傷效果。
            
圖3表明Bik突變體在不同的人類癌細胞系中顯示出很強的細胞殺傷。
            
圖4A到4B表明了Bik突變體在離體試驗中表現(xiàn)出更強的腫瘤抑制效果。
            
圖5A到5B證明SN遞送的突變型Bik基因顯著抑制人類腫瘤在小鼠體內的生長。
            
圖6A和6B顯示代表性的Bik突變體(BikDD)多聚核苷酸出對腫瘤生長顯示出明顯的抑制作用并在乳腺癌原位模型中提高存活率。在圖6A中，每周測量并記錄腫瘤體積。圖6B顯示BikDD提高了MDA-MB-231原位腫瘤的荷瘤小鼠的存活率。
            
圖7A和7B表明Bik突變體(BikDD)基因對腫瘤生長表現(xiàn)出明顯的抑制作用，并可提高乳腺癌原位模型的存活率。圖7A顯示每周測量并記錄腫瘤體積。圖7B表明BikDD可以提高MDA-MB-231原位腫瘤荷瘤小鼠的存活率。
            
圖8表明用Bik突變體(BikDD)進行基因治療可以提高卵巢癌原位模型中小鼠的存活率。
            
圖9說明用Bik突變體(BikDD)進行基因治療可以提高胰腺癌原位模型中小鼠的存活率。
            
圖10顯示CT90BikDD和CMV-BikDD在不同細胞系中的體外殺傷實驗。Y軸數(shù)值表示處理后有活力細胞的百分比。
            
圖11顯示CT90-BikDD基因治療的體內抗腫瘤效果。每只小鼠接種2.5×106個乳腺癌細胞系MDA-MB-231，并每周用脂質體復合的CTO-BikDD、CMV-BikDD、空白載體pGL3處理一次，右旋糖緩沖液D5W作為未處理對照。處理期間每周2次測量腫瘤大小(Y軸數(shù)值)，列于圖中。X軸表示處理日期。
            
圖12A-12E顯示CT90-BikDD乳腺癌靶向性基因治療在代表性原位小鼠模型中的治療效果。圖12A表明脂質體復合的CT90-BikDD在原位小鼠模型中靶向到乳腺癌細胞系中。圖12B和12D中顯示了基因治療處理過程中的腫瘤大小記錄，其中小鼠每周接受一次治療(QW，圖12B)或每周接受兩次治療(BIW，圖12D)。
            
圖13說明Bik-DD在MDA-MB-468異種移植小鼠中的基因治療。
            
發(fā)明詳述如本說明書中所用，“一(a)”或“一個(an)”可意為一個或者多個。如本發(fā)明的權利要求中所用，當與“包含(comprising)”連用時，“一”或“一個”可意為一個或者多于一個。如本文所用，“另一(another)”可意為至少第二個或者更多。
            
本發(fā)明涉及突變型Bik多肽及其編碼核酸，并涉及突變型Bik的使用方法。因此，在代表性的實施方式中，本發(fā)明者將蘇氨酸33和絲氨酸35殘基改變?yōu)樘於彼?，構成潛在的組成型活性形式，這些Bik突變體作為治療藥物用于癌癥的基因治療中。盡管先前的發(fā)明者們已論證了系統(tǒng)化給藥的非病毒基因遞送系統(tǒng)(SN)-Bik顯著地抑制了移植到裸鼠體內的人乳腺癌細胞的生長和擴散，并延長了受試動物的壽限(Zou等，2002)，如本文所述，與野生型Bik相比，Bik突變體同樣可在體外和體內模型中增強Bik基因產物的抗腫瘤功能。
            
本發(fā)明涉及促凋亡Bik多聚核苷酸的變異形式，其作為腫瘤抑制基因用于治療人類卵巢癌、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌及其它癌癥。在某些實施方式中，采用了如病毒或者非病毒的遞送系統(tǒng)將其導入合適的受體動物以抑制腫瘤生長和發(fā)展。在本發(fā)明的一個代表性實施方式中，遞送的Bik突變體通過凋亡機制抑制腫瘤生長和發(fā)展。由此，本文中發(fā)明者闡明了Bik變異體發(fā)揮很強的抗腫瘤活性，且作用方式類似于典型的腫瘤抑制物。
            
Bik最初被鑒定為是一種與EiB 19K和Bcl-2相互作用的、僅有BH-3域的蛋白質。在人乳腺癌的裸鼠模型中，系統(tǒng)化地施用Bik可顯著抑制腫瘤生長和擴散。近來，報道了翻譯后磷酸化可調節(jié)Bik的促凋亡能力。在此，本發(fā)明者闡明在多種人類癌癥細胞中，Bik突變體較野生型(wt)Bik具有更強的抑制細胞增殖和增強凋亡誘導的效果。本發(fā)明者也闡明了在小鼠體外模型中，Bik突變體能抑制腫瘤生成和降低腫瘤形成速率。最后，發(fā)明者闡明了在小鼠體內模型中，Bik突變體-SN脂質體能抑制小鼠體內的腫瘤生長并延長其壽限。由此，本發(fā)明提供了突變型Bik基因產物以及編碼其的多聚核苷酸，它們較野生型Bik對誘導細胞死亡更有效。
            
生成了代表性的Bik突變體，Bik-T33D(蘇氨酸33替代為天冬氨酸)、Bik-S35D(絲氨酸35替代為天冬氨酸)和Bik-T33DS35D(蘇氨酸33和絲氨酸35均替代為天冬氨酸)。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中，這些突變體選擇性地抑制癌細胞生長，且同時較佳地為比野生型Bik具有更好的抗癌效果的制劑。在其它實施方式中，突變型Bik抑制其它細胞增殖，并對治療再狹窄或抑制血管生成有作用。本領域的熟練技術人員在本說明書的指導下，可生成其它代表性的Bik多肽突變體。
            
熟練的技術人員認識到許多Bik核酸和多肽序列可用于本發(fā)明。熟練的技術人員明白現(xiàn)有公開的數(shù)據(jù)庫可以提供這些序列，如國家生物技術信息中心的GenBank數(shù)據(jù)庫，或現(xiàn)有商業(yè)數(shù)據(jù)庫如來自Celera基因組公司。(Rockville，MD)。代表性的多肽序列包括(以其GenBank編號表示)SEQ ID NO3(AAC50413、NP_001188、AAF01156、AAC79124、CAA62013和S58214)和SEQ IDNO4(AAC40079)。代表性的多聚核苷酸序列包括(以其GenBank編號表示)SEQID NO5(AY245248)和SEQ ID NO6(NM_001197)。
            
在
            
具體實施例方式
            
中，Bik多肽包含至少下列域之一BH3域(例如，ALRLACIGDEMD；SEQ ID NO10)、至少一個E1B 19K作用域(例如，LRLACIGDEMDV；SEQ ID NO11)、至少一個Bcl-2作用域(例如，ALALRLACIGDEMPVSLR；SEQ ID NO12)和/或至少一個異二聚化域(例如，LALRLACIGDEMDVSLRA；SEQ ID NO13)，如與不同抗凋亡蛋白質例如Bcl-2和Bcl-XL形成異二聚、和/或一個跨膜域(例如，EQVLLALLLLLALLLPLLSGGLHLLLK；SEQID NO14)，且至少某些域可以重疊。盡管在選擇性實施方式中Bik可包含一個或者多個功能磷酸化位點，在具體實施方式
            
中，Bik多肽包含在特定氨基酸上不含有實質功能的的磷酸化位點。如本文所用的術語“不含有實質功能的磷酸化位點”意為多數(shù)Bik分子在一個或多個可被磷酸化的特定氨基酸上失去磷酸化能力。在具體實施方式
            
中，所討論的磷酸化位點包括Thr33和Ser35。熟練的技術人員知道如何測定磷酸化能力，如提供針對所討論的磷酸化或者非磷酸化形式的Bik的特異性抗體。在一些實施方式中，熟練的技術人員也可以用雙向凝膠電泳或者質譜來確定這些殘基的磷酸化。
            
熟練的技術人員應當知道Bik的突變體，如代表性的BikT33D(蘇氨酸33改變?yōu)樘於彼?(SEQ ID NO7)、BikS35D(絲氨酸35改變?yōu)樘於彼?(SEQ IDNO8)和Bik T33DS35D(蘇氨酸33和絲氨酸35均改變?yōu)樘於彼?(SEQ IDNO9)，可以通過多種方式生成。在具體的實施方式中，對一段如上所述的核酸序列例如，SEQ ID NO5或者SEQ ID NO6，至少在其編碼需要改變的特定氨基酸的密碼子處產生突變，如編碼第33個殘基蘇氨酸突變成編碼天冬氨酸等等。表1列舉了所有標準氨基酸的密碼子，熟練的技術人員應當很清楚如何對初始核酸進行操作以生成所需要的突變體，例如采用標準的定點誘變技術。
            
在本發(fā)明的實施方式中，Bik野生型基因產物在自然條件下被磷酸化。發(fā)明者特別在本文中顯示，突變型Bik例如一個或者多個包含編碼T33殘基和/或S35殘基的突變，盡管失去了磷酸化能力，該突變型Bik基因產物同樣具有抑制細胞生長和/或促凋亡活性。熟練的技術人員知道可以改變T33和/或S35殘基以阻止磷酸化。例如可以通過改變編碼它的核酸密碼子來改變T33氨基酸殘基，如采用定點突變。或者，T33和/或S35氨基酸也可用至少一種阻止磷酸化的化合物進行封閉，例如采用封閉劑諸如甲二酰胺(carbodiamide)和/或在三氟乙酸中用乙酰氯對殘基進行乙?；?br>
熟練的技術人員知道Thr33和/或Ser35的替代可阻止Bik多肽在非取代Bik多肽發(fā)生磷酸化的條件下被磷酸化，此外也知道本領域中確定這些條件的標準方法。
            
在本發(fā)明的一個方面，至少含有一個缺陷的磷酸化位點的突變型Bik多肽以組織特異性調控的多聚核苷酸方式給藥。具體地，突變型Bik可以特異性地靶向到，例如，乳腺癌、胰腺癌或前列腺癌中表達。在本發(fā)明的某些方面，乳腺癌特異性啟動子控制突變型Bik的表達。盡管發(fā)明者考慮到任何乳腺癌特異性控制序列，但在具體的實施方式中，突變型Bik的表達受到復合(嵌合)啟動子的控制?？梢允褂玫娜橄侔┨禺愋詥幼雍蠧MV啟動子增強子序列，該序列與在拓撲異構酶IIα啟動子(命名為CT90)或者轉鐵蛋白啟動子(命名為CTR116)中的乳腺癌特異性片段相連。這兩個嵌合啟動子在乳腺癌細胞中選擇性地驅動基因表達并且具有與CMV啟動子相當?shù)幕钚运?。在基因轉移中使用CT90或CTR116嵌合啟動子構建的突變型Bik來靶向并治療原發(fā)和轉移的乳腺癌，而對正常組織毒性較低，較好地選擇性殺死乳腺癌細胞和/或顯著降低乳腺腫瘤的生長和/或生長率。
            
在本發(fā)明的其它方面，前列腺癌特異性或胰腺癌特異性啟動子控制突變型Bik的表達。雖然發(fā)明人考慮了任何相應的前列腺癌特異性或胰腺癌特異性啟動子，在某一具體實施方式
            
中，分別采用了復合的前列腺前列腺癌特異性或胰腺癌特異性啟動子。例如，該前列腺癌特異性啟動子可包含一個ARR2調控序列，而胰腺癌特異性啟動子可包含一個CCKAR調控序列。
            
用于調控編碼突變型Bik多肽的多聚核苷酸表達的任何啟動子或調控序列可用作如增強表達和/或轉錄后加工的特定調控序列。特定的但具有代表性的序列包括增強子、兩步轉錄放大系統(tǒng)、調控RNA聚腺苷酸化、半衰期以及諸如此類的調控元件，如WPRE，以及本領域中的其它序列。
            
在本發(fā)明的其它實施方式中有防止個體中細胞生長的方法，其包含給個體施用突變型Bik多肽。在具體實施方式
            
中，該多肽在脂質體中施用和/或該多肽進一步含有蛋白質轉導域(Schwarze等，1999)，如HIV Tat或穿透因子(penetratin)。在另一實施方式中，突變型Bik以多聚核苷酸的形式給藥，其中該多聚核苷酸含有在氨基酸水平產生修飾的改變，如通過定點誘變產生的改變。該修飾的Bik多聚核苷酸通過載體給藥，如質粒、反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺相關病毒載體、脂質體或它們的組合。
            
在本發(fā)明的實施方式中也有處理細胞的方法，該方法包括將細胞與突變型Bik多肽接觸。在具體實施方式
            
中，該細胞為人類細胞，該細胞包含于動物中和/或所述動物為人類。
            
本文考慮到本發(fā)明的組合物較佳地具有與細胞中的天然Bik多肽相似的活性，而該組合物可與天然Bik具有大致相同或比其更有效的抗癌癥細胞效果。即，在某些實施方式中，本發(fā)明的范圍涉及改變天然Bik多肽，并以與野生型Bik多肽相似的形式使用。在另一實施方式中，突變型Bik的形式(如區(qū)別于野生型序列)包含與天然Bik多肽的活性差異。
            
I.影響B(tài)ik基因產物和基因的定義和技術A.Bik基因產物和基因本文中使用的術語“突變Bik基因產物”和“突變型Bik”指氨基酸序列不同于天然Bik，但具有生物活性的蛋白質，即其能履行與天然Bik類似的活性。例如，它們較佳地具有促凋亡活性、抗細胞增殖活性、抗腫瘤活性和/或因抗Bik而起的與抗Bik抗體的交叉反應性抗體活性。術語“Bik基因產物”包括Bik分子的類似物，其顯示出與天然Bik至少一些相同的生物活性。此外，誘變領域的技術人員可了解到其它還未揭示或發(fā)明的類似物也可用于構建Bik類似物。
            
術語“Bik的突變形式”指與編碼上述定義的Bik基因產物的DNA序列基本相同的任何DNA序列。該術語也指與該DNA序列一致的RNA或反義序列。“Bik基因”也可包括任何帶有結合的控制序列的組合物。
            
在用于定義Bik氨基酸序列或Bik核酸序列時，術語“基本相同”表示具體的對象序列，例如，突變序列，其通過如以下的方式不同于天然Bik序列一或多個取代、缺失、增加及其組合，其網絡效應是保留Bik蛋白的至少某些生物活性?；蛘?，如果(a)該DNA相似序列來源于天然Bik基因的編碼區(qū)；或(b)該DNA相似序列能在適度嚴格的條件下與(a)DNA序列雜交，且其編碼具有生物活性的Bik；或(c)由于(a)或(b)所定義的DNA相似序列的遺傳密碼的簡并而產生的DNA序列；那么，這樣的DNA相似序列與本文所揭示的特定DNA序列“基本相同”。基本相同的相似蛋白質會與天然蛋白質對應序列的相似性超過80％。具有較低相似性但具有相當生物活性的序列，也被認為是等價物。為確定核酸序列，所有可編碼基本相似的氨基酸序列的對象核酸序列均被認為是與參照核酸序列基本相似的，而不去考慮密碼子序列的差異。
            
B.相似性百分比相似性百分比可通過例如下述的方式測定用GAP計算機程序比對序列信息(由威斯康星大學遺傳學家計算機組，University of Wisconsin GeneticistComputer Group提供)。GAP程序采用了1970年由Needleman等提出，1981由Smith等改良的比對方法。概括地說，GAP程序將相似性定義為相似的比對符號(即核苷酸或氨基酸)數(shù)除以兩段序列中較短序列的總符號數(shù)。GAP程序的優(yōu)選默認參數(shù)包括(1)核苷酸的統(tǒng)一比較矩陣(包括相同值為1，不相同值為0)，和Gribskov等，1986的加權比較矩陣，描述于Schwartz等，1979；(2)每個空格罰分3.0，和每個符號和每個空格額外罰分0.01；以及(3)未端空格不罰分。
            
II.核酸序列在某些實施方式中，本發(fā)明涉及到突變型Bik核酸、基因和基因產物的用途，如包含不同于已知Bik基因的序列的突變型Bik或與之相應的蛋白質。術語“基本上相同于Bik的序列”指該序列基本上對應于Bik基因的一部分，但有相對較少的堿基或氨基酸(不論是DNA或蛋白質)與Bik(或當所指為蛋白質時，其生物功能等價物)的有所不同。術語“生物功能等價物”是本領域熟知的，本文進一步有詳細定義。因此，“基本上相同的”序列指具有約70％--80％、或更優(yōu)地約81％--約90％、或甚至更優(yōu)地約91％--約99％之間的氨基酸與Bik的氨基酸相同或功能上等價的序列。
            
本發(fā)明覆蓋含功能上相等的密碼子的突變型bik核酸。術語“功能上相等的密碼子”在本文用于指編碼相同氨基酸的密碼子，如編碼精氨酸或絲氨酸的6個密碼子，也指編碼生物學上相等的氨基酸的密碼子(表1)。
            
也可理解到氨基酸和核酸序列可包含額外的殘基，如額外的N-或C-末端氨基酸或5’或3’序列，只要該序列符合上述的標準(包括考慮到蛋白質表達時，其保留了該蛋白質的生物活性)，其仍然基本上是如本文所揭示的所述的一種序列。特別加到核酸序列上的末端序列，可以例如，包含編碼區(qū)5’或3’部分兩側的各種非編碼序列，或包含已知存在于基因內部的各種內部序列，即內含子。
            
本發(fā)明還包括與本說明書所述序列互補或基本互補的DNA片段的用途。“互補的”核酸序列是按照標準的Watson-Crick互補法則進行堿基配對的那些序列。在本文中，術語“互補序列”指，基本上互補的核酸序列，其可通過與上文所述相同的核酸比較進行評估，或可定義為如上所述的相對嚴格條件下能與所述核酸片段進行雜交的核酸序列。
            
C.生物功能等價物如上所述，可對Bik結構進行修飾或變化，且仍可獲得具有相似或所需特性的分子。例如，蛋白質結構中的某些氨基酸可被其它氨基酸所替代，而該替代并不造成與其它結構互作結合能力的明顯喪失，例如與EIB 19K或Bcl-2的互作結合。由于在許多實施方式中，相互作用能力和蛋白質的性質決定了蛋白質的生物功能活性，可在蛋白質序列中進行某些氨基酸序列的替代(或者當然，編碼其的表1 功能上相等的密碼子  
            
     
            
DNA序列的改變)，而獲得了具有相似或甚至相反性質的蛋白質(如，拮抗相對于促進)。因此，發(fā)明人考慮可在突變型Bik蛋白質或多肽(或編碼其的DNA)序列中進行各種改變，而不會導致它們的所需生物用途或活性的明顯喪失。
            
本領域技術人員同樣熟知的是，生物功能等價蛋白質或肽定義的本質是如下的概念即在該分子限定部分可進行有限數(shù)目的變化，而使所得的分子仍能具有可接受水平的等價生物活性。因此，本文中將生物功能等價的肽定義為那些其中某些氨基酸被替代而非大多數(shù)或所有氨基酸被替代的肽。根據(jù)本發(fā)明，可以十分簡便地制備和使用多種含有不同替代的不同蛋白質/肽。
            
同樣眾所周知的是，某些殘基對蛋白質或肽的生物或結構性能顯得特別重要，如活性位點的殘基，這類殘基通常是不能互換的。
            
氨基酸替代，例如那些可用于修飾Bik的替代，通常是基于氨基酸側鏈取代基的相對相似性進行的，例如它們的疏水性、親水性、所帶電荷、大小等。氨基酸側鏈取代基的大小、形狀和類型分析顯示，精氨酸、賴氨酸和組氨酸都是帶正電荷的殘基；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸大小相似；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有大致相似的形狀。因此，基于這些考慮，精氨酸、賴氨酸和組氨酸；丙氨酸、甘氨酸和絲氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸，在本文中定義為生物功能等價物。
            
在制造這類變化時，可以考慮氨基酸的親水性指數(shù)。根據(jù)各氨基酸的疏水性和電荷性質，對每種氨基酸均指定其親水指數(shù)，分別為異亮氨酸(+4.5)、纈氨酸(+4.2)、亮氨酸(+3.8)、苯丙氨酸(+2.8)、半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)、甲硫氨酸(+1.9)、丙氨酸(+1.8)、甘氨酸(-0.4)、蘇氨酸(-0.7)、絲氨酸(-0.8)、色氨酸(-0.9)、酪氨酸(-1.3)、脯氨酸(-1.6)、組氨酸(-3.2)、谷氨酸(-3.5)、谷氨酰胺(-3.5)、天冬氨酸(-3.5)、天冬酰胺(-3.5)、賴氨酸(-3.9)、和精氨酸(-4.5)。
            
氨基酸親水指數(shù)在賦予蛋白質相互反應生物功能中的重要性，在本領域中是普遍理解的(Kyte和Doolittle，1982，納入本文作參考)。已知某些氨基酸可替代具有相似親水指數(shù)或分值的其它氨基酸，并仍能保留相似的生物活性。根據(jù)親水性指數(shù)進行改變時，優(yōu)選親水指數(shù)在±2內的氨基酸進行替代，尤為優(yōu)選那些在±1內的氨基酸進行替代，更尤為優(yōu)選的是那些在±0.5內的氨基酸進行替代。
            
本領域中同樣已知，可根據(jù)親水性有效進行相似氨基酸的取代。納入本文為參考的美國專利第4,554,101號闡明了，蛋白質的最大局部平均親水性(受其毗鄰氨基酸親水性的支配)，與其免疫原性和抗原性相關，即蛋白質的生物性能。已知，一個氨基酸可取代另一個具有相似親水值的氨基酸，且仍能獲得生物學上等價的蛋白質。
            
如美國專利第4,554,101號中所詳述，為氨基酸殘基指定如下親水性值精氨酸(+3.0)、賴氨酸(+3.0)、天冬氨酸(+3.0.+-0.1)、谷氨酸(+3.0±0.1)、絲氨酸(+0.3)、天冬酰胺(+0.2)、谷氨酰胺(+0.2)、甘氨酸(0)、蘇氨酸(-0.4)、脯氨酸(-0.5±0.1)、丙氨酸(-0.5)、組氨酸(-0.5)、半胱氨酸(-1.0)、甲硫氨酸(-1.3)、纈氨酸(-1.5)、亮氨酸(-1.8)、異亮氨酸(-1.8)、酪氨酸(-2.3)、苯丙氨酸(-2.5)、色氨酸(-3.4)。
            
根據(jù)相似親水性值進行改變時，優(yōu)選親水性值在±2內的氨基酸進行替代，尤為優(yōu)選那些在±1內的氨基酸進行替代，更尤為優(yōu)選的是那些在±0.5內的氨基酸進行替代。
            
雖然討論集中在因氨基酸變化而產生的功能上等價的多肽，可理解這些變化可以通過編碼DNA的變化而實現(xiàn)；還要考慮到遺傳密碼子的簡并性，及二個或多個密碼子可編碼同一個氨基酸。
            
III.基于核酸的表達系統(tǒng)本發(fā)明在某些實施方式中，采用了表達包含突變型Bik多聚核苷酸的系統(tǒng)。本文闡述了這些多聚核苷酸的具體代表性方面。
            
A.載體術語“載體”指用于運載的核酸分子，可將核酸序列插入該運載分子中，而將該核酸序列導入細胞，且該運載分子能在細胞中復制。核酸序列可以是“外源性的”，意味著它相對于載體所導入的細胞是異物，或者此核酸序列與細胞中某序列同源但其在宿主細胞核酸中的某一位置上是通常是沒有的。載體包括質粒、粘粒、病毒(噬菌體、動物病毒和植物病毒)和人造染色體(如YAC)。本領域技術人員能通過標準的重組技術(見Maniatis等，1988和Ausubel等，1994，兩者均作為參考納入本文)熟練地構建載體。
            
術語“表達載體”指含有編碼能被轉錄的基因產物至少一部分的核酸序列的載體。在某些情況下，RNA分子隨后被翻譯成蛋白質、多肽或肽。而在其它情況下，這些序列不被翻譯，例如在產生反義分子或核酶的情況下。表達載體可含有各種“調控序列”，指在特定宿主生物體中，對與之操作性連接的編碼序列的轉錄和可能的翻譯所必需的核酸序列。除了控制轉錄和翻譯的調控序列外，載體和表達載體可包含還具有其它功能的核酸序列，描述如下。
            
1.啟動子和增強子“啟動子”是一種調控序列，它是一種控制轉錄啟動和轉錄速度的核酸序列區(qū)域。在某一具體實施例中，調控序列(如啟動子)，調控表達該核酸序列的組織的組織特異性。啟動子或調控序列可含有可以與調控蛋白和分子相結合的遺傳元件，如結合RNA聚合酶和其它轉錄因子。短語“操作性位于(operativelypositioned)”、“操作性連接于(operatively linked)”、“在控制下(undercontrol)”和“在轉錄控制下(under transcriptional control)”指處在相對于核酸序列的正確功能位置和/或方向，以控制該核酸序列轉錄的啟動和/或表達的啟動子或其它調控序列。啟動子可與或可不與“增強子”連接，增強子指參與核酸序列轉錄活化的順式作用調控序列。
            
啟動子可以天然地與某基因或序列相連，如可以通過分離位于編碼片段和/或外顯子上游的5’非編碼序列而得到。這種啟動子可稱為“內源性的”。相似地，增強子可以天然地與某核酸序列相連，位于該序列下游或上游?；蛘?，可通過將編碼核酸片段置于重組或異源性啟動子的控制下而獲益，重組或異源啟動子指在天然情況下通常不與該核酸序列相連的啟動子。重組或異源增強子也指在其天然情況下通常不與該核酸序列相連的增強子。這類啟動子或增強子可包括其它基因的啟動子或增強子，和從其它原核細胞、病毒或真核細胞分離得到的啟動子或增強子；以及“天然不產生的”啟動子或增強子，即含有不同轉錄調控區(qū)的不同元件和/或含有改變表達的突變。除了用合成方法產生啟動子和增強子的核酸序列外，也可采用重組克隆技術和/或核酸擴增技術，包括PCRTM，與本文所述組合物結合(見美國專利4,683,202、5,928,906，分別納入本文作參考)。另外，考慮也可采用能指導序列在核外細胞器，如線粒體、葉綠體等中轉錄和/或表達的調控序列。
            
當然，重要的是采用能有效指導DNA片段在被選擇用于表達的細胞類型、細胞器和生物體中表達的啟動子和/或增強子。分子生物學領域的技術人員通常知道蛋白質表達所用的啟動子、增強子和細胞類型組合，例如，參見Sambrook等(1989)，納入本文參考文獻。所用的啟動子可以是組成型的、組織特異性的、可誘導的、和/或能在適當條件下用于指導導入DNA片段高水平表達的，這樣，在大規(guī)模生產重組蛋白和/或肽時具有優(yōu)越性。該啟動子可以是異源的或內源的。
            
表2列出了在本發(fā)明的背景中可以采用的幾種元件/啟動子，可用于調控基因表達。這一列表并不意味著涵蓋了參與表達啟動的所有可能元件，而僅是列出其中代表性的部分。表3提供了可誘導元件的例子，即是可響應特定刺激而活化的核酸序列區(qū)域。
            
表2 啟動子和/或增強子  
            
     
            
     
            
     
            
表3 可誘導元件  
            
     
            
     
            
組織特異性啟動子或元件的鑒定及其活性特征的表征試驗，為本領域技術人員所熟知。此類區(qū)域的例子包括如人LIMK2基因(Nomoto等1999)、促生長素抑制素受體2基因(Kraus等，1998)、小鼠附睪視黃酸結合基因(Lareyre等，1999)、人CD4(Zhao-Emonet等，1998)、小鼠α2(XI)膠原(Tsumaki等，1998)、DIA多巴胺受體基因(Lee等，1997)、胰島素樣生長因子II(Wu等，1997)、或人血小板內皮細胞粘附分子-1(Almendro等，1996)。
            
用于調控突變型Bik表達的靶向和/或水平的組織特異性啟動子可為內源性的野生型啟動子、突變的啟動子或合成的啟動子，只要突變型Bik的表達能優(yōu)選地保留在一或多個目的組織中(相對不是所需靶組織而言)。合成啟動子可進一步定義為復合啟動子，在本文中指至少由兩個來源于不同內源和/或合成啟動子的獨立區(qū)域所組成的啟動子，這兩個獨立區(qū)域操作性連接以調控突變型Bik的表達。在某一具體實施方式
            
中，該組織特異性指針對癌組織的特異性，而與之相反的是非癌組織。本文中的術語“癌組織”指至少含有一個癌細胞的組織。
            
a.乳腺癌癥組織特異性啟動子目前，在癌癥基因治療中所用的大部分啟動子具有很強但對正常和腫瘤細胞無選擇性的活性(如CMV和β-肌動蛋白啟動子)。因此，在本發(fā)明的某些方面，將乳腺組織特異性啟動子用于本發(fā)明，如用于調控Bik突變形式的表達，包括代表性的BikT33D、BikS35D和Bik T33DS35D突變體。在一具體的方面中，該乳腺組織特異性啟動子為乳腺癌組織特異性啟動子。這樣，這一實施方式中所需的啟動子特異性地在乳腺癌組織中靶向表達。
            
任何乳腺癌組織特異性啟動子均可用于本發(fā)明，只要其優(yōu)選地指導突變型Bik在乳腺癌組織中表達。能夠指導突變型Bik在乳腺癌組織中表達的乳腺癌組織特異性啟動子實例至少包括hALA、GLG、HK-II和HER2啟動子(Anderson等，2000；Katabi等，1999；Lu等，2002；Maeda等，2001)。
            
在本發(fā)明的某一具體實施方式
            
中，使用了復合啟動子，該復合啟動子采用了拓樸異構酶IIα(topoIIα)或轉鐵蛋白受體(TfR)乳腺癌特異性調控序列。用例如SAGE分析和cDNA微陣列法確定該拓樸異構酶IIα(topoIIα)和轉鐵蛋白受體(TfR)的水平在乳腺癌中有所提高。本發(fā)明的發(fā)明人鑒別出了分別位于topollα和TfR啟動子5’端的90堿基對的片段(SEQ ID NO26)和116堿基對的片段(SEQID NO27)，作為最小的乳腺癌特異性調控所需的序列。在具體實施方式
            
中，通過將這兩段短啟動子與一個增強子序列操作性連接，增強了啟動子的活性，增強子為如巨細胞病毒(CMV)啟動子增強子序列(SEQ ID NO25)；這些嵌合的啟動子在本文中分別稱為CT90和CTR116。全長的CT90啟動子包含于SEQ ID NO37中，而全長CTR116啟動子包含于SEQ ID NO38中。這些啟動子在本文中有所闡述，而在題為《癌癥特異性啟動子》的美國臨時專利申請第60/_＿＿＿號中有詳細的特征描述(“Cancer-Specific Promoters”，其作者為Mien-ChieHung，Yan Li，Yong Wen，Chi-Ping Day，Kun-Ming Rau，Xiaoming Xie，ZhengLi等)，與本發(fā)明同時提交并全文引入本文作為參考。為了證明其在癌癥基因治療中的用途，本發(fā)明的發(fā)明人用CT90構建了DNA構建體，以驅動突變型Bik的表達。將這一構建體轉染入細胞系后，其可選擇性地殺死乳腺癌細胞。此外，本發(fā)明的發(fā)明人證明用代表性的非病毒遞送系統(tǒng)通過靜脈注射的方式給小鼠施用該構建體，其對小鼠內的乳腺癌腫瘤異種移植物具有抗腫瘤效果。這就表明CT90和CTR116可驅動治療基因(如突變型Bik)在乳腺癌細胞中的選擇性表達。
            
因此，本發(fā)明包含出于治療目的，將乳腺癌特異性啟動子用于調控突變型Bik靶向乳腺癌細胞的表達，其對正常細胞具有低毒性或無毒性。
            
b.胰腺癌組織特異性啟動子胰腺特異性啟動子可用于靶向突變型Bik的表達，包括代表性的BikT33D、BikS35D和Bik T33DS35D突變體。任何乳腺癌組織特異性啟動子均可用于本發(fā)明，只要其優(yōu)選地指導突變型Bik在胰腺癌組織中表達。指導突變型Bik在胰腺癌組織中表達的胰腺癌組織特異性啟動子的例子包括胰島素啟動子，如大鼠胰島素啟動子(Wang等，2004)、中期因子(midkine)和環(huán)加氧酶-2啟動子(Wesseling等，2001)以及癌胚抗原(CEA)啟動子(Takeuchi等，2000)。
            
本發(fā)明的發(fā)明人開發(fā)了一種胰腺癌特異性啟動子，在本文中對其有所闡述，而在題為《癌癥特異性啟動子》的美國臨時專利申請第60/＿＿＿＿號中有詳細的特征描述(“Cancer-Specific Promoters”，其作者為Mien-Chie Hung，YanLi，Yong Wen，Chi-Ping Day，Kun-Ming Rau，Xiaoming Xie，Zheng Li等)，與本發(fā)明同時提交并全文引入本文作為參考。該啟動子含有胰酶分泌素A受體(CCKAR)啟動子序列，具體地是將CCKAR啟動子的nt-726到+1(SEQ ID NO28)區(qū)域與一個增強子(如CMV增強子)操作性地連接。然后將該CCKAR-CMV復合物用特定的兩步轉錄放大(TSTA)系統(tǒng)改造(Iyer等，2001；Zhang等，2002；Sato等，2003以及其中所應用的文獻)，如用代表性的GAL4-VP16或GAL4-VP2融合蛋白，以增強轉錄活性，且它也可與土撥鼠肝炎病毒后轉錄調控元件(WPRE)(SEQIDNO29)操作性地連接，以改變RNA多聚腺苷化信號、RNA出核和/或RNA翻譯。熟練的技術人員可認識到術語“兩步轉錄放大(TSTA)系統(tǒng)”也同樣可稱作“兩步轉錄活化(TSTA)系統(tǒng)”或“重組轉錄活化途徑”(Nettelbeck等，2000)。該CCAKAR-TSTA-WPRE(CTP)啟動子被應用于某一具體的方面，而這種復合啟動子的一個例子包含于SEQ ID NO34中。因此，該分子工程化的CTP啟動子應用于用突變型Bik進行胰腺癌的基因治療有效的治療藥征中。
            
c.前列腺癌組織特異性啟動子前列腺癌組織特異性啟動子可用于調控編碼突變型Bik多聚核苷酸的表達。例如最近已開發(fā)出如PSA、probasin和hK2等前列腺特異性啟動子。這些啟動子的活化是雄性激素依賴性的。在多種疾病階段中，患者是雄性激素依賴性(ADPC)的，這樣就能采用雄性激素響應載體來指導治療基因在前列腺組織中的表達。雖然本發(fā)明的發(fā)明者(Xie等，Cancer Res 2001)和其它組(Zhang等，MolEndocrinol 2000)已經開發(fā)出了響應雄性激素受體的強前列腺特異性啟動子，然而在經過前列腺癌進行性治療的主要藥征——閹割治療或雄性激素切除治療后，這些雄性激素依賴性啟動子的活性會降低。用含有這些啟動子的組合物進行治療的這些患者會對這種治療不產生反應并死于復發(fā)的非雄性激素依賴性前列腺癌(AIPC)。
            
本發(fā)明人已開發(fā)了一類前列腺癌特異性啟動子，預計其對ADPC和非雄性激素依賴性前列腺癌(AIPC)均有效，用以治療轉移性的和復發(fā)的激素不應性前列腺癌，具體地是調控突變型Bik的表達。該啟動子在本文中有所闡述，而在題為《癌癥特異性啟動子》的美國臨時專利申請第60/__＿＿＿號中有詳細的特征描述(“Cancer-Specific Promoters”，其作者為，Mien-Chie Hung，Yan Li，Yong Wen，Chi-Ping Day，Kun-Ming Rau，Xiaoming Xie，Zheng Li等)，與本發(fā)明同時提交并全文引入本文作為參考。該啟動子，在本文中稱為ATTP，至少含有人端粒酶反轉錄酶(hTERT)(SEQ ID NO32)的最小啟動子片段(hTERTp)以及與其操作性連接的兩步轉錄放大(TSTA)系統(tǒng)，如代表性的GAL4-VP16或GAL4-VP2(GAL4-VP2的兩個例子為SEQ ID NO30或SEQ ID NO33)融合蛋白編碼序列，且其同樣操作性地連接于土撥鼠肝炎病毒轉錄后調控元件(WPRE)上，以改變RNA多聚腺苷化信號、RNA輸出和/或RNA翻譯。這些調控序列在ADPC和AIPC細胞系中均有效。已知在大多數(shù)情況下，復發(fā)的前列腺癌的AR基因發(fā)生擴增和/或AR過表達，該特定啟動子大大提高了實施方式中的效果指數(shù)，其中該系統(tǒng)的活性是由雄性激素激發(fā)的。在優(yōu)選的實施方式中，組織特異性區(qū)域至少含有，例如，來源于ARR2基因的ARR2調控元件(SEQ ID NO31)。在本發(fā)明的一個具體方面中，TSTA-hTERT-ARR2和WPRE元件用作前列腺癌特異性調控元件，其在具體實施方式
            
中包含于SEQ ID NO35中。因此，本發(fā)明的發(fā)明人已開發(fā)了新穎的前列腺癌特異性調控系統(tǒng)，其不僅能使突變型Bik靶向ADPC，還能使其靶向AIPC。
            
2.啟動信號和內部核糖體結合位點編碼序列的有效翻譯還可能需要特異性啟動信號。這些信號包括ATG啟動密碼子或毗連序列?？赡苄枰峁┩庠葱苑g調控信號包括ATG啟動密碼子。本領域普通技術人員不難確定這一點并提供必須的信號。已充分查明啟動密碼子必須是“框內”，即與所需編碼序列同處讀框內以保證整個插入物的翻譯。外源性翻譯控制信號和啟動密碼子可以是天然的或合成的。加入合適的轉錄增強子元件可提高表達率。
            
在本發(fā)明某些實施方式中，采用內部核糖體進入位點(IRES)元件來產生多個基因或多順反子信使。IRES元件能繞過5’甲基化加帽(Cap)依賴性翻譯的核糖體掃描模式，在內部位點開始翻譯(Pelletier和Sonenberg，1988)。已報道了小RNA病毒家族二成員(脊髓灰質炎和腦脊髓炎)的IRES元件(Pelletier和Sonenberg，1988)，及哺乳動物信使的IRES(Macejak和Sarnow，1991)?？蓪RES元件連接到異源性開放讀框內?？梢黄疝D錄各自被IRES分開的多個開放讀框，產生多順反子信使。借助IRES元件各開放讀框能進入核糖體得到有效翻譯。采用一個啟動子/增強子轉錄一個信使，能有效表達多個基因(見美國專利5,925,565和5,935,819，納入本文作參考)。
            
3.多克隆位點載體可含有多個克隆位點(MCS)，該位點是含有多個限制性酶切位點的核酸區(qū)域，可采用任一區(qū)域與標準重組技術結合來消化該載體(見Carbonelli等，1999；Levenson等，1998；Cocea，1997，納入本文作參考)。“限制性酶消化”指采用只在核酸分子特定位置起作用的酶催化切割核酸分子?？蓮氖袌錾腺徺I到許多這些限制性酶。這類酶的用途廣為本領域技術人員所知。通常，采用能在MCS內切割的限制性酶使載體線性化或片段化，以保證外源序列連接入該載體。“連接”指在兩個核酸片段之間形成磷酸二酯鍵，二片段彼此可毗連或不毗連。涉及限制性酶和連接反應的技術是重組技術領域技術人員所熟知的。
            
4.剪接位點大多數(shù)轉錄的真核RNA分子將經歷RNA剪接以去除原初轉錄物中的內含子。含基因組真核序列的載體可能需要供體和/或受體剪接位點，以確保轉錄物的正確加工而表達蛋白質(見Chandler等，1997納入本文作參考)。
            
5.聚腺苷酸信號表達時，通常要有一聚腺苷酸信號來行使轉錄物的正確聚腺苷酸化。不認為聚腺苷酸信號的性質對成功實施本發(fā)明是關鍵性的，和/或可采用任何這類序列。優(yōu)選例包括SV40聚腺苷酸信號和/或牛生長激素聚腺苷酸信號，能方便地和/或已知能在各種靶細胞中很好發(fā)揮功能的聚腺苷酸信號。還考慮可采用轉錄終止位點作為表達盒中的元件。這些元件的作用是提高信使水平和/或盡量減少從盒中通讀到其它序列中。
            
6.復制起始位點為了在宿主細胞中擴增載體，其可含有一個或多個復制起始位點(常稱為“ori”)，此位點是一種能啟動復制的特定核酸序列。此外，如果宿主細胞是酵母菌，可采用自主復制序列(ARS)。
            
7.可選擇性和可篩選性標記本發(fā)明某些實施方式中，可通過在表達載體中含有一標記，而在體外或體內鑒定含有本發(fā)明核酸結構的細胞。這種標記可賦予細胞一種可鑒定的變化，有易于鑒定含有該表達載體的細胞。通常，可選擇標記是可使其被選擇出來的標記。陽性選擇標記是存在此標記時而得以選出的標記，而陰性可選擇標記是該標記存在時阻止其選擇的標記。陽性可選擇標記的一個例子是抗藥性標記。
            
通常包含藥物選擇性標記有助于轉化子的克隆和鑒定，例如，能賦予對新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、零霉素和組氨醇抗性的基因可用作可選擇標記。除了能賦予表型而得以區(qū)分實施本發(fā)明而建立的轉化子的標記外，也考慮其它類型的標記，包括諸如基于比色分析的GFP等可篩選標記。或者，可采用可篩選酶，如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉移酶(CAT)。本領域技術人員也知道可能在FACS分析時如何利用免疫標記。不認為所用標記很重要，只要其能與編碼基因產物的核酸同時被表達?？蛇x擇和可篩選標記的其它例子是該領域技術人員熟知的。
            
B.宿主細胞術語“細胞”、“細胞系”和“細胞培養(yǎng)物”本文中可互換使用。所有這些術語也包括其子代，即任何和所有的后代?？衫斫馑凶哟捎诠室饣蚍枪室獾耐蛔兌豢赡芟嗤Ｔ诒磉_異源性核酸序列的段落中，“宿主細胞”指原核或真核細胞，包括能復制載體，和/或表達載體編碼的異源基因的任何可轉化生物體。宿主細胞可以和已經被用作載體的受體。宿主細胞可被“轉染”或“轉化”，指外源性核酸轉移到或導入到宿主細胞中的過程。轉化細胞包括原代目標細胞及其子代。
            
宿主細胞可衍生自原核或真核細胞，取決于所需結果是該載體的復制，還是部分或全部表達載體編碼的核酸序列?？少彽迷S多細胞系和培養(yǎng)物用作宿主細胞，可從美國典型培養(yǎng)物收藏中心(ATCC)獲得它們，ATCC是活培養(yǎng)物和基因材料檔案保管服務機構(www.atcc.org)。本領域技術人員能根據(jù)載體的骨架和需要的結果確定合適的宿主。例如，可將質粒或粘粒導入原核宿主細胞復制出許多載體?？捎米魉拗骷毎M行載體復制和/或表達的細菌細胞包括DH5α，JM109和KC8，以及許多可從市場購買到的細菌宿主，如SURE感受態(tài)細胞和SolopackTMGold細胞(Stratagene，La Jolla)。另外，細菌細胞如大腸桿菌LE392可用作噬菌體病毒的宿主細胞。
            
用于載體復制和/或表達的真核宿主細胞包括HeLa、NIH3T3、Jurkat、293、Cos、CHO、Saos和PC12。本領域技術人員可購得和知道各種細胞類型的許多宿主細胞。相似地，病毒載體可用于真核或原核宿主細胞，特別是允許載體復制或表達的那些細胞。
            
某些載體可采用使其能在原核和真核二種細胞中均能復制和/或表達的調控序列。本領域技術人員還知道培養(yǎng)上述宿主細胞維持它們并使載體復制的條件。也了解和知道大規(guī)模生產載體及生產載體編碼的核酸和它們的同源多肽、蛋白質或肽的技術和條件。
            
C.表達系統(tǒng)已存在含有上述至少部分或所有組成的許多表達系統(tǒng)。原核和/或真核系統(tǒng)可用于本發(fā)明來產生核酸序列，或它們的同源多肽、蛋白質和肽。許多這類系統(tǒng)可從市場和廣泛來源購得。
            
昆蟲細胞/桿狀病毒系統(tǒng)可產生高水平異源核酸區(qū)段的蛋白質表達，見美國專利No.5,871,986；4,879,236所述，二者納入本文參考，可從Invitrogen和BacPackTMBaculovirus Expression System From Clontech，以MaxBac2.0名稱買到。
            
表達系統(tǒng)的其它例子包括Stratagene’s complete ControlTM的可誘導哺乳動物表達系統(tǒng)，其包括合成的蛻皮激素-可誘導受體，或其pET表達系統(tǒng)，一種大腸桿菌表達系統(tǒng)?？烧T導表達系統(tǒng)的另一個例子可從Invitrogen購買到，它攜帶有T-RexTM(四環(huán)素調節(jié)的表達)系統(tǒng)，一種采用全長CMV啟動子的可誘導哺乳動物表達系統(tǒng)。Invitrogen也提供酵母菌表達系統(tǒng)，稱為畢赤嗜甲醇表達系統(tǒng)，設計用于在嗜甲醇畢赤酵母菌中高水平生產重組蛋白質。本領域技術人員知道怎樣表達載體，如表達構建物來生產核酸序列或其同源的多肽、蛋白質或肽。
            
IV.核酸遞送本發(fā)明諸方面的總體方法涉及上述組合物和/或治療劑，其提供含有編碼特定的和/或所需突變型Bik蛋白、多肽和肽的基因構建物，從而允許這些蛋白質、多肽或肽發(fā)揮所需要的活性。雖然認為該基因構建物和/或蛋白質可被直接輸送，但優(yōu)選實施方式包括向細胞提供特定和所需蛋白質、多肽和肽的編碼核酸。這樣提供后，細胞的轉錄和翻譯機制能合成蛋白性組合物，及該表達構建物可提供的任何組分。提供反義物、核酶和其它抑制劑時，優(yōu)選的方式也是向細胞提供編碼該構建物的核酸。
            
在本發(fā)明某些實施方式中，可將編碼該基因的核酸穩(wěn)定整合入細胞的基因組中。其它實施方式中，此核酸可作為DNA的分離的游離體區(qū)段穩(wěn)定維持在細胞中。這類核酸區(qū)段和“游離體”編碼的序列在宿主細胞周期同步過程中，能充分保留和獨立復制。表達構建物如何被輸送給細胞，和/或在細胞中核酸如何保留取決于所用的表達構建物的類型。
            
A.利用病毒載體輸送DNA某些病毒能感染細胞并通過受體介導的內吞機制進入細胞整合到宿主細胞基因組中，和/或穩(wěn)定和/或有效地表達病毒基因，從而使它們成為外源基因轉移到哺乳動物的有吸引力的候選者。本發(fā)明優(yōu)選的基因治療載體通常是病毒載體。
            
雖然某些病毒能接受異種遺傳物質，但受到它們可容納的核苷酸數(shù)量的限制，和/或它們可感染的細胞范圍限制，已證明這些病毒成功地進行了基因表達。然而，腺病毒不能將其遺傳物質整合入宿主基因組中，和/或因而基因表達不需要宿主復制機制，使其非常適合快速有效的異源基因表達。制備復制缺陷性感染病毒的技術是本領域熟知的。
            
當然，采用病毒輸送系統(tǒng)，需要充分純化病毒粒子，使其基本上沒有不良污染物，如缺陷性干擾性病毒顆粒、內毒素和其它熱原質，從而不會在接受該載體構建物的細胞、動物和個體中引起任何不良反應。純化載體的優(yōu)選方法包括采用浮力密度梯度離心，如氯化銫梯度離心。
            
1.腺病毒載體輸送表達構建物的具體方法包括利用腺病毒表達載體。雖然已知腺病毒載體整合入基因組DNA的能力低，但這些載體賦予的高效基因轉移抵消了此缺點。“腺病毒表達載體”意味著包括含有腺病毒序列的那些構建物，能(a)支持該構建物的包裝和/或(b)能最終克隆到其中的組織和/或細胞特異性結構中表達。
            
該表達載體含有經基因工程改造形式的腺病毒。已知腺病毒的基因組成是36kb的線性雙鏈DNA病毒，允許用長達7kb的外源序列置換腺病毒DNA的大片段(Grunhaus和Horwitz，1992)。與逆轉錄病毒相反，腺病毒感染宿主細胞不會導致染色體整合，因為腺病毒DNA能以游離體方式復制而無潛在的基因毒性。還有，腺病毒結構上穩(wěn)定，和/或大量擴增后未測到基因組重排。
            
腺病毒特別適合用作基因轉運載體，因為其基因組大小適中，易操作，效價高，靶細胞范圍廣泛和/或感染力高。該病毒基因組二端含有100-200個堿基對的反向重復序列(ITR)，它們是病毒DNA復制和/或包裝所必須的順式元件。其基因組的早期(E)和/或晚期(L)區(qū)域含有受病毒DNA復制驅動的不同轉錄單位。其E1區(qū)(E1A和/或E1B)編碼負責調節(jié)病毒基因組和/或幾種細胞基因轉錄的蛋白質。E2區(qū)(E2A和E2B)表達導致合成病毒DNA復制的蛋白質。這些蛋白質參與DNA復制、后期基因表達和/或宿主細胞關閉(Renan，1990)。后期基因的產物包括大多數(shù)病毒衣殼蛋白，只是在主要后期啟動子(MLP)產生的一個原代轉錄物經過有效加工后才表達。在感染后期此MLP(位于16.8m.u.)特別有效，和/或此啟動子產生的所有mRNA含有5’-三聯(lián)前導(TPL)序列，使它們能優(yōu)先翻譯mRNA。
            
在此系統(tǒng)中，通過穿梭載體和前病毒載體之間的同源重組產生重組腺病毒。由于二個前病毒載體之間有可能重組，因此可產生野生型腺病毒。故從單一空斑分離單克隆病毒和/或檢測其基因組結構很是重要。
            
產生和/或增殖復制缺陷性的此種腺病毒載體依賴于獨特的輔助細胞系，稱為293細胞系，產生自身Ad5 DNA片段轉化的人胚腎細胞，能組成性表達E1蛋白質(E1A和/或E1B；Graham等，1977)。由于E3區(qū)不一定來自腺病毒基因組(Jones和Shenk，1978)，此腺病毒載體在293細胞幫助下能在E1區(qū)、D3區(qū)和二區(qū)中攜帶外源DNA(Graham和Prevec，1991)。最近已報道了在E4區(qū)中含有缺失的腺病毒載體(美國專利5,670,488，納入本文作參考)。
            
實際上腺病毒可包裝大約105％的野生型基因組(Ghosh-Choudhury等，1987)提供額外的大約2kbDNA容量。加上E1和/或E3區(qū)中可替代的大約5.5kbDNA，此腺病毒載體的最大容量在7.5kb，和/或該載體總長的大約15％。該載體骨架中保留了80％以上的腺病毒基因組。
            
輔助細胞系可衍生自人細胞，如人胚腎細胞、肌細胞、造血細胞和其它人胚胎間充質和上皮細胞?；蛘撸o助細胞可衍生自其它種類哺乳動物的允許人腺病毒(生長)的細胞。這類細胞包括，如Vero細胞和其它猴胚胎間充質和/或上皮細胞。如上所述，優(yōu)選的輔助細胞系是293。
            
最近，Racher等，(1995)公開了培養(yǎng)293細胞和/或增殖腺病毒3的改進方法。一種方式中，通過在含100-200ml培養(yǎng)液的1升硅化旋轉瓶(Techne，Cambridge，UK)中接種單個細胞培養(yǎng)成天然細胞集落。以40rpm攪拌后用臺酚蘭估計細胞活力。另一方式中，如下采用Fibra-Cel微載體(Bibby Sterlin，Stone，UK)(5g/l)。細胞接種重懸于5ml培養(yǎng)液中，加入到250ml Erlenmeyer瓶的載體(50ml)中，和/或靜置1-4小時，偶而攪動。用50ml新鮮培養(yǎng)液替換原培養(yǎng)液和/或搖動。為產生病毒，讓細胞生長至80％匯合，然后更換培養(yǎng)液(至25％最終體積)和/或加入0.05 MOI的腺病毒。培養(yǎng)物靜置過夜，然后體積增加到100％和/或再開始搖動72小時。
            
除了要求腺病毒載體是復制缺陷型和至少是條件缺陷型的之外，不認為腺病毒載體的性質對成功實施本發(fā)明是關鍵性的。腺病毒可以是已知的42種不同血清型和A-F亞組中的任何一種。優(yōu)選亞組C的5型腺病毒作為起始材料，以獲得用于本發(fā)明的條件性復制缺陷型腺病毒載體。這是因為5型腺病毒是人腺病毒，已知道其大量的生化和遺傳信息，并且歷史上已被用于采用腺病毒作載體的大多數(shù)構建物中。
            
如上所述，本發(fā)明典型的載體是復制缺陷型的、不含有腺病毒的E1區(qū)。因此最方便的是在E1編碼序列已被去除的部位導入轉化結構。然而，該結構插入腺病毒序列中的部位對本發(fā)明不是關鍵的?？扇鏚arlsson等，(1986)所述，將編碼感興趣基因的聚核苷酸插入E3取代載體中E3缺失區(qū)位置，輔助細胞系和輔助病毒則互補了E4缺失的E4區(qū)。
            
腺病毒的培養(yǎng)和/或操作是該領域技術人員知道的，其顯示體外和體內有著廣泛的宿主范圍。使病毒可獲得高效價，如每毫升109-1011空斑形成單位，它們具有高感染力。腺病毒的生命周期不需要整合入宿主細胞基因組中。腺病毒輸送的外源基因是游離體，因此對宿主細胞基因毒性低。接種野生型腺病毒的研究未見副作用報道(Couch等，1963；Top等，1971)，證明作為體內基因轉運載體它們是安全的和/或有治療潛力。
            
腺病毒載體已用于真核基因表達(Levrero等，1991；Gomez-Foix等，1992)和疫苗開發(fā)(Grunhaus和Horwitz，1992；Graham和Prevec，1992)。最近，動物研究提示，重組腺病毒可用于基因治療(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991a；(Stratford-Perricaudet等，1991b；Rich等，1993)。將重組腺病毒給予不同組織，包括氣管灌注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周靜脈注射(Herz和Gerard，1993)和/或腦內定位接種(Le Gal La Salle等，1993)。重組腺病毒和腺病毒相關病毒(見下)能感染和轉導非分裂性人原代細胞。
            
2.AAV載體腺病毒相關病毒(AAV)是用于本發(fā)明細胞轉導的一種有吸引力的載體系統(tǒng)，因為它整合頻率高，可感染非分裂細胞，使其可將基因輸送到哺乳動物細胞中，例如組織培養(yǎng)物中(Muzyczka，1992)和體內。AAV感染性具有廣泛宿主范圍(Tratschin等，1984；Laughlin等，1986；Lebkowski等，1988；McLaughlin等，1988)。關于rAAV載體產生和用途的詳述見美國專利No.5,139,941和/或4,797,368，各自納入本文作參考。
            
證明AAV可用于基因輸送的研究包括LaFace等，(1988)；Zhou等(1993)；Flotte等(1993)；Walsh等(1994)。重組AAV載體已成功用于體外和/或體內轉導標記基因(Kaplitt等，1994；Lebkowski等，1988；Samulski等，1989；Yoder等，1994；Zhou等1994；Hermonat和Muzyczka，1984；Tratschin等，1985；McLaughlin等，1988)和涉及人類疾病的基因(Flotte等，1992；Luo等，1994；Ohi等，1990；Walsh等，1994；Wei等，1994)。最近AAV載體已批準用于治療膀胱纖維變性的I期人體試驗。
            
AAV是一種依賴性細小病毒，需要另一種病毒(或是腺病毒或皰疹病毒家族某成員)共感染才能在培養(yǎng)細胞中經歷產毒性感染(Muzyczka，1992)。缺少輔助病毒共感染時，野生型AAV基因組通過其兩末端整合入人染色體19中，在那兒以潛伏狀態(tài)作為前病毒居留(Kotin等，1990；Samulski等，1991)。然而，rAAV整合不限于染色體19，除非AAV的Rep蛋白也表達(Shelling和Smith，1994)。當攜帶AAV前病毒的細胞加上輔助病毒感染時，可從該染色體和從重組質粒中“拯救”AAV基因組，和/或建立正常的產毒性感染(Samulski等，1989；McLaughlin等，1988；Kotin等，1990；Muzyczka，1992)。
            
通常，通過共轉染含有側接二個AAV末端重復序列的感興趣基因的質粒(McLaughlin等，1988；Samulski等，1989；各自納入本文作參考)和/或含有野生型AAV編碼序列而無末端重復序列的表達質粒，如pIM45(McCarty等，1991；納入本文作參考)。也用腺病毒和攜帶AAV輔助功能所需腺病毒基因的質粒感染和轉染細胞。以此種方式制備的rAAV病毒貯藏液有腺病毒污染，必須用物理方法將其與rAAV顆粒分離(例如氯化銫密度離心)?；蛘?，可采用含AAV編碼區(qū)的腺病毒載體和含AAV編碼區(qū)及某些和所有腺病毒輔助基因的細胞系(Yang等，1994；Clark等，1995)。也可采用攜帶rAAV DNA作為整合前病毒的細胞系(Flotte等，1995)。
            
3.逆轉錄病毒載體逆轉錄病毒作為基因輸送載體具有應用前景，因為它們能將其基因整合入宿主基因組中，而轉運大量的外源性遺傳物質，能感染廣譜的物種和細胞類型，并被包裝在特定的細胞系中(Miller，1992)。
            
逆轉錄病毒是一組單鏈RNA病毒，特征是能通過逆轉錄過程在感染細胞中將其RNA轉變成雙鏈DNA(Coffin，1990)。產生的DNA然后穩(wěn)定整合入細胞染色體中成為前病毒，和/或指導病毒蛋白質的合成。整合導致在受體細胞和/或其后代中保留該病毒的基因序列。逆轉錄病毒基因組含有分別編碼衣殼蛋白質、聚合酶和包膜組分的三個基因gag，pol和/或env。Gag基因上游的序列含有將其基因組包裝到病毒粒子中的信號。在病毒基因組的5’和3’末端有兩個長末端重復(LTR)序列。這些病毒含有的強啟動子和增強子序列也是整合入宿主細胞基因組所需要的(Coffin，1990)。
            
為了構建逆轉錄病毒載體，將編碼感興趣基因的核酸插入病毒基因組某些病毒序列處產生復制缺陷型病毒。為了產生病毒粒子，需構建含gag，pol和env基因但無LTR的包裝細胞系和包裝組分(Mann等，1983)。當將含cDNA的重組質粒，與逆轉錄病毒LTR和包裝序列一起導入(例如通過磷酸鈣沉淀)此細胞系中時，包裝序列能使重組質粒進行RNA轉錄并被包裝成為病毒顆粒，然后分泌到培養(yǎng)液中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin，1986；Mann等，1983)。收集含重組逆轉錄病毒的培養(yǎng)液，任選地濃縮，用于基因轉運。逆轉錄病毒載體能感染廣泛的各種細胞類型。然而，其整合和/或穩(wěn)定表達需要宿主細胞分裂(Paskind等，1975)。
            
與采用缺陷性逆轉錄病毒載體有關的是可能在包裝細胞中出現(xiàn)野生型復制活性病毒。這可能是由于gag，pol env序列上游重組病毒插入物的完整序列整合入宿主細胞基因組中所致。然而，現(xiàn)已有新的包裝細胞系可大大減少重組的可能性(Markowitz等，1988；Hersdorffer等，1990)。
            
已報道了采用第二代逆轉錄病毒載體輸送基因。Kasahara等(1994)制備了莫洛尼小鼠白血病病毒的工程改造變體，通常只能感染小鼠細胞，其包膜蛋白經過修飾，使該病毒能特異性結合和感染攜帶有紅細胞生成素(EPO)受體的人細胞。這一點是通過將EPO序列的一部分插入包膜蛋白中而產生具有新結合特性的嵌合蛋白而實現(xiàn)的。
            
4.其它病毒載體可采用其它病毒載體作為本發(fā)明中的表達構建物。可采用衍生自病毒，如牛痘病毒(Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988)、新德比斯病毒、巨細胞病毒和單純皰疹病毒的載體。對于各種哺乳動物細胞它們可賦予幾種有吸引力的特征(Friedmann，1989；Ridgeway，1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。
            
隨著最近發(fā)現(xiàn)的缺陷型乙肝病毒，對于不同病毒序列的結構-功能關系有了新的理解。體外研究顯示，該病毒盡管其基因組缺失了80％以上，仍可保留輔助-依賴性包裝和逆轉錄能力(Horwich等，1990)。這提示，其基因組的大部分可用外源遺傳物質替代。Chang等最近將氯霉素乙酰轉移酶(CAT)基因導入鴨乙肝病毒基因組的聚合酶、表面和/或pre-表面抗原編碼序列位置。將其與野生型病毒共轉染入禽肝細胞瘤細胞系中。用含有高效價重組病毒的培養(yǎng)液感染了原代鴨肝細胞。轉染后至少24天中測到CAT基因的穩(wěn)定表達。
            
某些其它實施方式中，基因療法的載體是HSV。使HSV成為有吸引力的載體的因素是其基因組的大小和組成。因為HSV大，與其它較小病毒系統(tǒng)相比，加入多個基因和表達盒不成問題。此外，可得到具有不同性能(溫度、強度等)的不同病毒控制序列，使其比其它系統(tǒng)能在更大程度上控制表達。還有一個優(yōu)點是該病毒具有較少剪接的信使，易于遺傳操作。HSV也較易操縱和/或可高效價生長。因此就獲得足夠MOI所需體積和重復劑量需要較少而言，輸送問題不大。
            
5.修飾的病毒本發(fā)明其它實施方式中，待輸送的核酸包含在經基因工程改造能表達特異性結合配體的感染性病毒中。因而該病毒顆粒能特異性結合靶細胞的同源受體，將其組分輸送給細胞。依靠在病毒包膜上化學加入乳糖殘基化學修飾逆轉錄病毒，最近設計開發(fā)了特異性靶向逆轉錄病毒載體的新方法。此種修飾可使該病毒通過唾液酸糖蛋白受體而特異性感染肝細胞。
            
設計了使重組逆轉錄病毒靶向的另一種方法，是采用抗逆轉錄病毒包膜蛋白和/或抗特異性細胞受體的生物素化抗體。該抗體用鏈霉親和素經生物素組分偶聯(lián)(Roux等，1989)。采用抗主要組織相容性復合體I類和II類抗原的抗體，他們證明可體外用親嗜性病毒感染各種帶有這些表面抗原的人細胞(Roux等，1989)。
            
B.DNA輸送的其它方法本發(fā)明的不同實施方式中，將DNA作為表達構建物輸送給細胞。為了有效表達基因構建物，必須將該表達構建物輸送給細胞。如上所述，優(yōu)選的輸送方法是通過病毒感染，將表達構建物在感染性病毒顆粒中殼體化。然而，本發(fā)明也考慮用幾種非病毒方法轉運表達構建物到細胞中。本發(fā)明一實施方式中，表達構建物只由裸露重組DNA和/或質粒組成。該構建物的轉運可采用物理和/或化學方法透過細胞膜進行。如下所述是一些可成功用于體內和/或活體外的方法。
            
C.脂質體介導的轉染本發(fā)明另一實施方式中，可將表達構建物包裹在脂質體中。脂質體是以磷脂雙層膜和/或內部水性介質為特征的囊泡性結構。多層脂質體具有被水性介質分隔的多層脂質層。當將磷脂懸浮在過量水溶液中時可自發(fā)性形成脂質體。在形成封閉結構和/或包裹水份和/或將溶質溶解在脂質雙層間之前，脂成分經歷了自身重排(Ghosh和Bachhawat，1991)。也考慮表達構建物與脂轉染胺(Lipofectamine，Gibco BRL)的復合物。
            
脂質體介導的核酸輸送和外源DNA的體外表達已非常成功(Nicolau和Sene，1982；Fraley等，1979；Nicolau等，1987)。Wong等(1980)證明了在培養(yǎng)的雞胚、HeLa和肝細胞瘤細胞中脂質體介導的外源DNA輸送和/或表達的可行性。
            
本發(fā)明某些實施方式中，可將脂質體與血凝性病毒(HVJ)組成復合物，顯示促進了與細胞膜的融合和/或促進了脂質體包裹DNA進入細胞(Kaneda等，1989)。本發(fā)明其它實施方式中，將脂質體與核內非組蛋白性染色體蛋白質(HMG-1)復合和/或結合運用(Kato等，1991)。其它實施方式中，將脂質體與HVJ和HMG-1二者復合和/或結合運用。其它實施方式中，輸送載體可包含配體和脂質體。當在DNA構建物中采用細菌啟動子時，最好還將合適的細菌聚合酶包含在脂質體中。
            
本發(fā)明人考慮可將neu-抑制性基因產物用脂質體介導的基因轉移導入細胞。Nabel等(1990)提出，可將這類構建物與脂質體偶聯(lián)，通過導管直接導入。采用這些方法，neu-抑制性基因產物可在體內特定部位有效表達，不只是在靜脈注射可抵達的肝、脾細胞中表達。因此，本發(fā)明還包含neu-抑制基因產物編碼DNA構建物的組合物(配制成DNA/脂質體復合物)，和使用這種構建物的方法。
            
如美國專利No.5,641,484所述，脂質體特別適合治療HER2/neu介導的癌癥。
            
a.脂質體的制備可用Gao等(1991)的方法制備動物細胞Bik的有效轉染試劑陽離子脂質體。Gao等描述了一步合成的新的陽離子膽固醇衍生物。據(jù)報道此種脂質制備的脂質體用于轉染更有效，對處理細胞的毒性比用Lipofectin試劑制備的低。這些脂質是DC-Chol(“3’(N-(N’N’-二甲基胺乙烷)-氨甲酰膽固醇”)和DOPE(“二油酰磷脂酰乙醇胺”)。生產這些脂質體的步驟如下。
            
通過膽甾烯基氯甲酸酯和N，N-二甲基乙二胺簡單的反應合成DC-Chol。將膽甾烯基氯甲酸酯溶液(2.25g，5mmol，用無水氯仿配)0℃逐滴加入到過量N，N-二甲基乙二胺的溶液(2ml，18.2mmol，溶于3ml無水氯仿)中。蒸發(fā)除去溶劑后，4℃在無水乙醇中重結晶純化殘留物，真空干燥。產品是白色DC-Chol粉末。
            
在氯仿中混合1.2□mol DC-Chol和8.0□mol DOPE制備陽離子脂質體。干燥該混合物，真空干燥，在試管中重懸于1ml stero 20mM Hepes緩沖液(pH7.8)中。4℃水合24小時后，將分散物超聲波儀超聲處理5-10分鐘，形成平均直徑150-200nm的脂質體。
            
制備脂質體/DNA復合物，發(fā)明人采用如下步驟。將待轉染的DNA放在DMEM/F12培養(yǎng)液中，比例為15μg DNA比50μl DMEM/F12。用DMEM/F12稀釋DC-Chol/DOPE脂質體混合物至50μl DMEM/F12比100μl脂質體。然后輕輕混合DNA稀釋液和脂質體稀釋液，37℃培育10分鐘。培育后DNA/脂質體復合物備用注射。
            
可通過含有，例如磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰絲氨酸(PS)、膽固醇(Chol)、氯化N-[1-(2，3-二油?；?丙基]-N，N-三甲胺(DOTMA)、二油酰磷酯酰乙醇胺(DOPE)和/或者3.β-[N-(N’N’-二甲基胺乙烷)氨甲?；懝檀?DC-Chol)，及該技術人員所知的其它脂類組成的脂質體進行脂質體轉染。該領域技術員知道有各種脂質體轉染技術可用于本發(fā)明。其中有Nicolau等，1987；Nabel等，1990和Gao等，1991所述的那些技術。在一具體實施方式
            
中，脂質體含有DC-Chol。更具體說，在優(yōu)選實施方式章節(jié)中發(fā)明人的脂質體含有按照Gao等(1991)所說制備的DC-Chol和DOPE。發(fā)明人還預備使用含DOTMA的脂質體，可從San Diego，Calif.的Vical，Inc.，以商標名LipofectinTM購買到。
            
可用各種方法將脂質體導入與細胞接觸進行轉染。細胞培養(yǎng)時，可簡單地將脂質體-DNA復合物分散加入在細胞培養(yǎng)液中。體內應用時，通常注射脂質體-DNA復合物。靜脈注射可使脂質體介導DNA復合物轉運到例如肝和脾。為了讓DNA轉染進入通過靜脈注射不能進入的細胞，可將脂質體-DNA復合物直接注射到動物機體中的特定部位。例如，Nabel等通過導管注射入動脈壁。其它例子中，發(fā)明人采用腹膜內注射使基因轉運到小鼠中。
            
本發(fā)明還設想含有脂質體復合物的組合物。該脂質體復合物將含有脂質成分和編碼核酸的DNA片段，該核酸編碼Bik突變形式。脂質體復合物中采用的編碼Bik突變形式的核酸可以是，例如，編碼Bik-T145A或Bik-T145D的核酸。
            
制備脂質體復合物所用的脂質可以是任何上述脂質。具體說，DOTMA、DOPE和/或DC-Chol可構成脂質體復合物的全部或一部分。發(fā)明人特別成功的是用含有DC-Chol的復合物。在優(yōu)選實施方式中，脂質將含有DC-Chol和DOPE。雖然預計任何比例的DC-Chol與DOPE都可用，但預計所含DC-Chol與DOPE的比例在1∶20和20∶1的脂質特別優(yōu)異。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)約1∶10-1∶5比例的DC-Chol∶DOPE制備的脂質體有用。
            
在一
            
具體實施例方式
            
中，采用能提高Bik在細胞核中保留所需的最小區(qū)域，這樣不會在接受Bik基因構建物的細胞中導入不需要的DNA。該領域技術人員熟知的技術，如限制性酶切，將能產生Bik的小區(qū)域。這些區(qū)域抑制neu的能力不難通過實施方式中所述試驗測定。
            
本發(fā)明某些實施方式中，將脂質體與血凝性病毒(HVJ)組成復合物，顯示能促進與細胞膜的融合和促進脂質體包裹的DNA進入細胞(Kaneda等，1989)。其它實施方式中，將脂質體與細胞核內非組蛋白性染色體蛋白質(HMG-1)復合和/或結合運用(Kato等，1991)。還有其它實施方式中，將脂質體與HVJ和HMG-1二者復合和/或結合運用。這類表達構建物已成功用于在體外和體內轉運和表達核酸，它們也適合于本發(fā)明。當在DNA構建物中采用細菌啟動子時，最好還將合適的細菌聚合酶包含在脂質體中。
            
b.通過含Bik突變體的脂質體體內治療癌癥根據(jù)以上提供的技術，本領域技術人員知道，可用至少一種Bik突變體處理任何細胞，在具體實施方式
            
中，任何癌細胞都可這樣處理。例如，在某些實施方式中，被處理的細胞是HER2/neu-陽性或HER2/neu-陰性。然而，在一個具體實施方式
            
中，被處理的細胞是HER2/neu-陽性。
            
其內容納入本文作參考的美國專利No.5,641,484說，可采用脂質體介導的直接基因轉運技術來獲得對活的宿主中HER2/neu-過度表達的人癌細胞的抑制。其所述實施方案如下。給雌性裸小鼠(5-6周齡)腹腔內注射SK-OV-3細胞(2×106/100μl)。SK-OV-3細胞已證明是能在裸鼠腹腔中生長的人卵巢癌細胞。5天后，給小鼠腹腔注射各種化合物。某些小鼠只注射治療性DNA，某些注射按上述方法制備的脂質體/治療性DNA復合物，還有一些注射脂質體/突變型治療性DNA復合物。所述小鼠注射200μl所述化合物。首次注射后，在小鼠活著期間每7天重復注射。
            
上述結果表明脂質體介導的基因轉運可抑制HER2/neu-過度表達的人卵巢癌細胞生長。因此，預計脂質體介導的靶向融合物基因療法通過將靶向融合物直接靶向HER2/neu-癌基因，可作為HER2/neu-過度表達的人卵巢癌的強力治療制劑。
            
c.用突變型Bik脂質體轉染治療人的疾病根據(jù)美國專利No.5,641,484所述的動物體內研究結果，本領域技術人員會理解和預計有極大的可能采用Bik T33D，S35D，和/或T33DS35D DNA與脂質體的復合物，來治療HER2/neu-介導的癌癥。認為臨床研究可證明這些效果。本領域技術人員將會知道可直接確定采用Bik T33D，S35D，和/或T33DS35D來抑制HER2/neu-介導的癌癥的最好治療方案。這在醫(yī)學領域中不是常規(guī)實施的實驗問題而是優(yōu)化問題。裸鼠的體內研究提供了開始優(yōu)化劑量和輸送方案的起始點。注射次數(shù)開始是一周一次，如美國專利No.5,641,484所述小鼠研究那樣做。然而，注射次數(shù)可調整優(yōu)化，從一天到每隔二周，每月一次，取決于初步臨床試驗的結果和具體患者的需要。人的劑量最初可從小鼠所用Bik T33D，S35D，和/或T33DS35D的劑量推測確定，約每50克體重15μg質粒DNA。據(jù)此，50kg的婦女每劑需要用15mgDNA治療。當然，此劑量可上調或下調，如這類治療方案常規(guī)那樣，取決于初步臨床試驗的結果和具體患者的需要。預計這些臨床試驗將證明用Bik T33D，S35D，和/或T33DS35D以及其它抑制neu的基因產物來治療人HER2/neu-過度表達癌癥的用途。劑量和頻率方案最初可根據(jù)動物體內研究的數(shù)據(jù)，如該領域經常做的那樣。
            
D.電穿孔本發(fā)明某些實施方式中，通過電穿孔將表達構建物導入細胞中。電穿孔包括將細胞和/或DNA懸液暴露于高壓放電。
            
采用電穿孔轉染真核細胞已相當成功。以此方式已采用人κ免疫球蛋白基因轉染了小鼠前B淋巴細胞(Potter等，1984)和/或用氯霉素乙酰轉移轉移酶基因轉染了大鼠肝細胞(Tur-Kaspa等，1986)。
            
E.磷酸鈣和/或DEAE-葡聚糖本發(fā)明其它實施方式中，采用磷酸鈣沉淀將表達構建物導入細胞。已用此技術以腺病毒5型DNA轉染了人KB細胞(Graham和Van Der Eb，1973)。還以此方式用新霉素標記基因轉染了小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NTH3T3和/或HeLa細胞(Chen和Okayama，1987)，和/或用各種標記基因轉染了大鼠肝細胞(Rippe等，1990)。
            
另一實施方式中，采用DEAE-葡聚糖然后用聚乙二醇將表達構建物輸送給細胞。以此方式將報告質粒導入小鼠骨髓瘤和/或紅白血病細胞(Gopal，1985)。
            
F.粒子轟擊技術本發(fā)明另一實施方式將裸DNA表達構建物轉運入細胞涉及顆子轟擊技術。此方法依靠加速包被DNA的微粒到高速使微粒穿過細胞膜和/或進入細胞而不殺傷它們(Klein等，1987)。已開發(fā)了加速小粒子的幾種裝置。一種裝置依靠高壓放電產生的電流來提供驅動力(Yang等，1990)。所用微粒由生物學惰性物質如鎢和金珠組成。
            
G.直接顯微注射和/或超聲加載本發(fā)明其它實施方式包括用直接微量注射和/或超聲加載導入表達構建物。已采用直接微量注射將核酸構建物導入蟾蜍卵母細胞(Harland和Weintraub，1985)，和/或通過超聲加載用胸苷激酶基因轉染了LTK-成纖維細胞(Fechheimer等，1987)。
            
H.腺病毒輔助轉染本發(fā)明某些實施方式中，采用腺病毒輔助的轉染將表達構建物導入細胞。據(jù)報道采用腺病毒偶聯(lián)系統(tǒng)在細胞系統(tǒng)中提高了轉染效率(Kelleher和Vos，1994；Cotton等，1992；Curiel，1994)。
            
V.聯(lián)合治療為了提高Bik突變形式，或編碼Bik突變形式的表達構建物的效率，可能需要將這些組合物與能有效治療過度增生性疾病的其它制劑，如抗癌癥制劑聯(lián)用?！翱拱┌Y制劑”能負面影響對象的癌，例如通過殺傷癌細胞、誘導癌細胞凋亡、降低癌細胞生長速度、減少轉移發(fā)生或數(shù)量、減少腫瘤體積、抑制腫瘤生長、減少腫瘤或癌細胞的血供、促進針對癌細胞或腫瘤的免疫應答反應、防止或抑制癌癥進展或提高癌癥受試者壽限而負面影響受試者的癌瘤。更一般說，這些其它組合物以有效殺傷或抑制細胞增殖的聯(lián)合劑量提供。此方法可能包括使細胞同時與表達構建物和制劑或多種因素相接觸。這可通過使細胞與單一組合物或包含兩種制劑的藥物相接觸，或使細胞同時與不同的組合物或藥物接觸而實現(xiàn)，其中，一種組合物含有表達構建物，另一種含有第二種制劑。
            
腫瘤細胞對化療和放療制劑的耐受性提出了臨床腫瘤學的一個重大問題。當前癌癥研究的一個目標是通過聯(lián)合化療和放療與基因治療，找到提高化療和放療療效的方法。例如，通過逆轉錄病毒載體系統(tǒng)將單純皰疹病毒胸苷激酶(HS-tK)基因輸送到腦腫瘤中時，成功地誘導了對抗病毒劑更昔洛韋的易感性(Culver等，1992)。在本發(fā)明正文中，考慮除其它促凋亡或細胞周期調節(jié)劑外，可將Bik基因治療，相似地與化療、放療或免疫治療干預結合起來應用。
            
或者，此種基因療法可先于或后于其它藥物治療間隔幾分鐘至幾星期。在其它藥物和表達構建物分別施加于細胞的實施方式中，通常要保證在各次輸藥時間之間不會有顯著的失效期，這樣所述制劑和表達構建物仍能發(fā)揮對細胞的有益聯(lián)合作用。在此類例子中，考慮可使細胞在約12-24小時內，更優(yōu)選在約6-12小時內，與二種藥征相互接觸。某些情況下，可能需要明顯延長治療時間，然而各次給藥之間的失效時間是幾天(2，3，4，5，6或7)至幾周(1，2，3，4，5，6，7，或8)。
            
可采用各種組合，基因療法是“A”，而另一種制劑，如放療或化療是“B”A/B/A   B/A/B  B/B/A  A/A/B   A/B/BB/A/A A/B/B/BB/A/B/BB/B/B/AB/B/A/B   A/A/B/B  A/B/A/BA/B/B/AB/B/A/AB/A/B/AB/A/A/BA/A/A/BB/A/A/AA/B/A/AA/A/B/A給予患者本發(fā)明的治療性表達構建物，將按照給予化療藥物的通用方案，并考慮到載體的毒性，(如果有的話)。預計可按需要重復治療周期。也考慮各種標準療法及手術干預可與上述細胞過度增殖療法聯(lián)合應用。
            
A.化療本領域技術人員可以理解，除本文所述的用于抑制細胞生長目的的Bik突變形式以外，其它化療制劑在腫瘤病的治療中也是有用的。這些化療制劑的例子描述于下表4。
            
癌癥治療包括基于化學和放射性治療的各種聯(lián)合。代表性的具體方式包括，例如，順鉑(CDDP)，碳鉑，甲基芐肼，二氯甲基二乙胺，環(huán)磷酰胺，喜樹堿，異環(huán)磷酰銨，美法侖，苯丁酸氮芥，白消安，亞硝基脲，更生霉素，道諾霉素，阿霉素，博來霉素，普卡霉素，絲裂霉素，依托泊苷(VP16)，它莫西芬，雷洛昔芬，雌激素受體結合劑，紫杉酚，吉西他濱，諾維本，法呢基-蛋白轉移酶抑制劑，反鉑(transplatinum)，5-氟尿嘧啶，長春花新堿，長春滅瘟堿和氨甲喋呤，或以上物質的任何類似物或衍生變體。
            
表4-在腫瘤病中有用的化療制劑  
            
     
            
     
            
     
            
     
            
     
            
     
            
b.放療其它引起DNA損傷并被廣泛應用的因素包括大家所熟知的□-射線、X-射線和/或向腫瘤細胞直接輸送放射性同位素。其他形式的DNA損傷因素如微波和紫外輻射也可以考慮。所有這些因素最可能引起對DNA、DNA前體、DNA的復制和修復以及染色體的組裝和維持的大范圍損傷。X射線的劑量范圍從每天50-200倫琴，持續(xù)一段時間(3到4周)，到2000-6000倫琴的單次劑量。放射性同位素的劑量范圍很寬，可根據(jù)同位素的半衰期、所發(fā)出射線的強度和類型以及腫瘤細胞攝取的量而定。
            
本文所用的術語“使接觸”或“暴露于”用于細胞時指將治療性構建物和化療或放療藥物輸送給靶細胞、或直接與靶細胞一起放置的過程。為了達到殺死細胞或細胞抑制的目的，兩種藥物應以能聯(lián)合有效殺死細胞或阻止細胞分裂的劑量給予細胞。
            
C.免疫治療免疫治療一般依賴于利用免疫效應細胞和分子來靶向和摧毀癌細胞。免疫效應器可以是，例如，腫瘤細胞表面上一些標記的特異性抗體?？贵w可單獨作為治療的效應分子或可征集其它細胞來實施細胞殺傷。也可將抗體與藥物或毒素(化療藥物，放射性核素，蓖麻毒素A鏈，霍亂毒素，百日咳毒素等)偶聯(lián)，抗體只作為靶向試劑?；蛘撸肿涌梢允菙y帶有可與腫瘤細胞靶子直接或間接相互作用表面分子的淋巴細胞。各種效應細胞包括細胞毒T細胞和NK細胞。
            
因此，免疫治療也可用作聯(lián)合治療的一部分，與Ad-Bik基因治療聯(lián)用。下面討論聯(lián)合治療的一般方法。通常，腫瘤細胞必須帶有可供靶向的標記，即大多數(shù)其它細胞不存在的標記。存在很多腫瘤標記，它們中的任何標記都可能適于本文所述的靶向。常用腫瘤標記包括癌胚抗原，前列腺特異性抗原，泌尿腫瘤相關抗原，胚胎性抗原，酪氨酸酶，(p97)，gp68，TAG-72，HMFG，Sialyl Lewis抗原，MucA，MucB，PLAP，雌激素受體，層連蛋白受體，erb B和p155。
            
D.基因在其它實施方式中，第二種治療包括第二種基因治療，其中，在給予編碼全部或部分突變形式的Bik的第一種治療性多聚核苷酸之前、之后或同時給予第二種治療性多聚核苷酸。編碼全長或截短的突變形式Bik的載體與編碼一種下列基因產物的載體一起輸遞對靶組織有聯(lián)合的抗過度增殖效果?；蛘?，可采用編碼兩種基因的單一載體。本發(fā)明包括多種蛋白，下面描述了其中的一些。
            
1.細胞增殖誘導因子誘導細胞增殖的蛋白質根據(jù)功能可分成各種類型。所有這些蛋白質的共性是它們可調控細胞增殖。例如，PDGF的一種形式，sis癌基因，是分泌型生長因子。癌基因很少產生于編碼生長因子的基因，目前，sis是唯一已知自然發(fā)生的致癌生長因子。在本發(fā)明的一個實施方式中，考慮利用細胞增殖特定誘導因子相關的反義mRNA來阻止該細胞增殖誘導因子的表達。
            
蛋白FMS、ErbA、ErbB和neu是生長因子受體。這些受體的突變導致調控功能的喪失。例如，影響Neu受體蛋白質跨膜區(qū)域的點突變產生neu癌基因。erbA癌基因產生自甲狀腺激素的細胞內受體。認為經修飾的致癌ErbA受體可與內源甲狀腺激素受體相互競爭，引起生長失控。
            
癌基因最大的一類包括信號轉導蛋白質(例如，Src，Abl和Ras)。蛋白質Src是細胞質蛋白質-酪氨酸激酶，某些情況下通過酪氨酸殘基527位突變使它從原癌基因轉化為癌基因。與之相比較，在一個實施例中，GTP酶蛋白質ras從原癌基因轉化為癌基因是因為其序列中氨基酸12位的纈氨酸突變?yōu)楦拾彼峤档土藃as的GTP酶活性。
            
蛋白Jun，F(xiàn)os和Myc是作為轉錄因子在細胞核功能上直接發(fā)揮作用的蛋白。
            
2.細胞增殖抑制因子腫瘤抑制性癌基因的功能是抑制過量的細胞增殖。這些基因的失活破壞它們的抑制活性，導致增殖失控。下面描述了腫瘤抑制因子p53，p16和C-CAM。
            
在以化學致癌劑、紫外線輻射和幾種病毒轉化的很多細胞中已發(fā)現(xiàn)了高水平的突變p53。在多種人腫瘤中，p53基因是突變失活的高頻靶點，并在已有的記錄中是在普通的人癌癥中突變頻率最高的基因。在超過50％的人NSCLC以及多種其它腫瘤中p53是突變的(Hollstein等，1991)。
            
P53基因編碼393個氨基酸的磷酸化蛋白，該蛋白可與宿主蛋白例如大T抗原和E1B形成復合物。在正常組織和細胞中可發(fā)現(xiàn)該蛋白，但與轉化的細胞或腫瘤組織相比，其濃度很低。
            
野生型p53被認為在很多細胞型中是重要的生長調節(jié)子。錯義突變對于p53基因是很常見的，并且其對于癌基因的轉化能力是很關鍵的。點突變造成的單遺傳改變可產生致癌p53。然而與其它癌基因不同，已知p53點突變發(fā)生在至少30個不同密碼子中，經常產生改變細胞型但不減低純合性的顯性等位基因。此外，很多這些負顯性等位基因似乎在生物體中是可以耐受的并在種系中傳遞。各種突變等位基因的范圍似乎是從輕度的功能異常到強烈外顯性，負顯性等位基因(Weinberg，1991)。
            
另一個細胞增殖抑制因子是p16。真核細胞周期的主要轉換是由細胞周期蛋白依賴性激酶或CDK’s來啟動的。一種CDK，細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)調控G1進程。該酶的活性可能是在G1晚期磷酸化Rb。CDK4的活性由活化亞基、D-型細胞周期蛋白和抑制亞基控制，生化鑒定已確認p16INK4為特異性結合和抑制CDK4的蛋白質，并因此可能調控Rb的磷酸化(Serrano等，1993；Serrano等，1995)。既然p16INK4蛋白質是CDK4抑制因子(Serrano，1993)，那么該基因的缺失將提高CDK4的活性，導致Rb蛋白質的過度磷酸化。還已知p16可調控CDK6的功能。
            
p16INK4屬于新描述的CDK-抑制蛋白類別，該類蛋白還包括p16B，p19，p21Waf1/Cip1，和p27KIP1。p16INK4基因圖譜定位于9Bik，這是在很多腫瘤類型中常常缺失的染色體區(qū)。p16INK4基因的純合性缺失和突變在人腫瘤細胞系中時常發(fā)生。該證據(jù)提示p16INK4基因是腫瘤抑制基因。然而，因觀察到p16INK4基因改變的頻率在原代未培養(yǎng)的腫瘤中比培養(yǎng)細胞系中低得多(Caldas等，1994；Cheng等，1994；Hussussian等，1994；Kamb等，1994；Kamb等，1994；Mori等，1994；Okamoto等，1994；Nobori等，1995；Orlow等，1994；Arap等，1995)，上面的解釋已受到質疑。以質粒表達載體轉染來恢復野生型p16INK4功能降低了某些人癌細胞系的集落形成(Okamoto，1994；Arap，1995)。
            
本發(fā)明可利用的其它基因包括Rb，APC，DCC，NF-1，NF-2，WT-1，MEN-I，MEN-II，zacl，p73，VHL，MMAC1/PTEN，DBCCR-1，F(xiàn)CC，rsk-3，p27，p27/p16融合物，Bik/p27融合物，抗-血栓形成基因(例如，COX-1，TFPI)，PGS，Dp，E2F，ras，myc，neu，raf，erb，fms，trk，ret，gsp，hst，abl，E1A，p300，參與新生血管形成的基因(例如，VEGF，F(xiàn)GF，血小板反應素，BAI-1，GDAIF，或它們的受體)和MCC。
            
3.細胞程序性死亡的調節(jié)因子凋亡或細胞程序性死亡是正常胚胎發(fā)育、成年組織內環(huán)境穩(wěn)定的維持以及癌變抑制中的一種基本過程(Kerr等，1972)。已證明，Bcl-2蛋白家族和ICE樣蛋白酶家族是其他系統(tǒng)中凋亡的重要調節(jié)因子和效應因子。發(fā)現(xiàn)Bcl-2蛋白與濾泡性淋巴瘤有關，在由各種凋亡刺激因子引起的凋亡的控制以及提高細胞的存活中起著重要作用(Bakhshi等，1985；Cleary和Sklar，1985；Cleary等，1986；Tsujimoto等，1985；Tsujimoto和Croce，1986)?，F(xiàn)認為進化保守的Bcl-2蛋白是相關蛋白家族的一個成員，可以歸類為死亡激動劑或死亡拮抗劑。
            
Bcl-2被發(fā)現(xiàn)以后，證明它可以抑制由各種刺激因素引起的細胞死亡。而且現(xiàn)已知道存在一個Bcl-2細胞死亡調節(jié)蛋白家族，它們具有相同的結構，其序列同源。已證實這個家族內的不同成員或者具有與Bcl-2相似的功能(如BclXL、BclW、BclS、Mcl-1、A1、Bfl-1)，或者具有與Bcl-2相反的功能，并可促進細胞死亡(如Bax、Bak、Bik、Bim、Bid、Bad、Harakiri)。
            
E.手術約60％患有癌癥的人將進行一些類型的手術，包括預防性、診斷性或階段性、治療性和姑息性手術。治療性手術是可與其它治療例如本發(fā)明的治療、化療、放療、激素治療、基因治療、免疫治療和/或其它治療聯(lián)合使用的癌癥治療。
            
治療性手術包括切除術，其中將全部或部分癌組織從身體移除、切除和/或摧毀。腫瘤切除指將腫瘤的至少一部分從身體移除。除腫瘤切除術之外，手術治療包括激光手術、冷凍手術、電外科手術和顯微鏡控制的手術(Mohs’手術)。還考慮將本發(fā)明與表面癌、初癌或偶然量正常組織的切除聯(lián)合使用。
            
移除所有癌性細胞、組織或腫瘤的一部分之后，身體內可能形成了腔隙?？赏ㄟ^灌注、直接注射或在該區(qū)域局部應用其它抗癌治療的方法來達到治療目的。這種治療可以重復，例如每1，2，3，4，5，6，或7天，或每1，2，3，4，和5周或每1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，或12個月。這些治療的劑量也可不同。
            
F.其它制劑可與本發(fā)明聯(lián)合使用以提高治療效果的其他藥物也可以考慮。這樣的其它制劑包括免疫調節(jié)劑、可上調細胞表面受體和GAP連接的制劑、細胞抑制劑和分化制劑、細胞粘附抑制劑以及能提高過度增殖細胞對凋亡誘導因子敏感性的藥物。免疫調節(jié)劑包括腫瘤壞死因子；干擾素α、β、γ；IL-2和其他細胞因子；F42K和其他細胞因子類似物；或MIP-1、MIP-1β、MCP-1、RANTES和其他趨化因子。本發(fā)明還考慮上調細胞表面受體或其配基如Fas/Fas配基、DR4或DR5/TRAIL的表達，能夠通過提高過度增殖細胞的自分泌或旁分泌作用來加強本發(fā)明的凋亡誘導能力。通過增加GAP連接的數(shù)量來提高細胞間的信號傳遞也可以增強對鄰近的過度增殖細胞的抗過度增殖效應。在其它的實施方式中，細胞抑制劑或分化制劑可與本發(fā)明聯(lián)合使用以提高治療的抗過度增殖效應?？紤]使用細胞粘附的抑制劑以提高本發(fā)明的效果。細胞粘附抑制劑的例子有病灶粘連激酶(FAKs)抑制劑和洛伐他丁。能增加過度增殖細胞對凋亡的敏感性的其它藥物，如抗體c225，也可與本發(fā)明組合物聯(lián)用以提高治療效果。
            
也可將激素治療與本發(fā)明或上述任何其它癌癥治療方法聯(lián)合使用。可在某些癌癥例如乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌或宮頸癌的治療中使用激素以降低某些激素例如睪酮素或雌激素的水平或阻抑其作用。這種治療經常作為一種治療選擇或用于減少轉移危險與至少一種其它癌癥治療聯(lián)合使用。
            
VI.藥物制備本發(fā)明的藥物組合物含有有效量的一種或多種形式的溶于或分散于藥學上可接受的運載體或賦形劑中的突變型Bik或其它制劑。短語“藥學上或藥理學上可接受的”是指當動物時，例如人(適當時)，不會產生副作用、過敏或其它不良反應的分子實體和組合物。通過本文所公開的內容，本領域技術人員將會知道含有至少一種Bik突變形式或其它活性成分的藥學組合物的制備方法，例如見Remington的Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，納入本文參考文獻。另外，對動物(如人)給藥，可以理解的是制品應符合FDA公署生物標準要求的無菌、無致熱原，總體安全和純度標準。
            
本文使用的“藥學上可接受的運載體”包括任何和所有的溶劑、分散介質、包衣劑、表面活性劑、抗氧化劑、防腐劑(如抗菌劑，抗真菌劑)、等滲劑、吸收延緩劑、鹽類、防腐劑、藥物、藥物穩(wěn)定劑、粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、增甜劑、調味劑、染料等物質和它們的組合，這是本領域普通技術人員知道的(見例如，Remington的Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack PrintingCompany，1990，1289-1329頁，納入本文參考文獻)。除了與活性成分不相容的常規(guī)運載體外，認為均可用于治療或藥物組合物中。在具體實施方式
            
中，突變型Bik組合物在脂質體中給藥。
            
所述Bik突變形式可含不同類型的運載體，對于注射這種給藥途徑，運載體的形式取決于是否要以固體、液體或氣溶膠形式給藥，以及是否需要除菌。本發(fā)明組合物可通過靜脈內、皮內、動脈內、腹膜內、病灶內、顱內、關節(jié)內、前列腺內、胸膜內、氣管內、鼻內、玻璃體內、陰道內、直腸內、局部、腫瘤內、肌肉內、腹膜內、皮下、膀胱內、粘膜、心包內、口服、局部、采用氣溶膠、注射、輸液、持續(xù)輸液、局部灌注直接浸浴靶細胞、通過導管、通過灌洗、配制在霜膏中、在脂質組合物(如脂質體)中或通過該領域普通技術人員知道的其它方法或上述方法的任何組合給藥(見例如，Remington的Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company，1990，納入本文參考文獻)。
            
給予患病動物本發(fā)明組合物的實際劑量由物理和生理因素，如體重、疾病嚴重性、待治療疾病的類型、原有和共同的治療措施、受試者的特發(fā)病和給藥途徑所決定。負責給藥的醫(yī)生將決定組合物中活性成分的濃度和受試者個體的合適劑量。
            
某些實施方式中，藥物組合物可含有，例如至少約0.1％的活性成分。其它實施方式中，該活性成分含有的重量單位約在2％-75％之間，或約在25％-60％之間，例如，可從其中推斷出的任何范圍。其它非限制性例子中，每次給藥的一個劑量也可含約1μg/kg/體重，約5μg/kg/體重，約10μg/kg/體重，約50μg/kg/體重，約100μg/kg/體重，約200μg/kg/體重，約350μg/kg/體重，約500μg/kg/體重，約1mg/kg/體重，約5mg/kg/體重，約10mg/kg/體重，約50mg/kg/體重，約100mg/kg/體重，約200mg/kg/體重，約350mg/kg/體重，約500mg/kg/體重，約1000mg/kg/體重，或每次施用更多，和可從其中推斷出的任何范圍。在從上列數(shù)字推斷出的范圍的非限制性例子中，可根據(jù)上述數(shù)字給予約5mg/kg/體重-100mg/kg/體重，約5μg/kg/體重-約500mg/kg/體重等。
            
無論如何，該組合物可含有各種抗氧化劑以防止一種或多種組分的氧化。此外可用防腐劑來預防微生物的作用，如各種抗菌和抗真菌劑，包括但不僅限于對羥基苯丙酸酯(如甲基對羥基苯丙酸酯、丙基對羥基苯丙酸酯)、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞或其組合。
            
Bik突變形式可配制成游離堿、中性或鹽形式的組合物。藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽，如與蛋白質組分的游離氨基形成的鹽，或與無機酸，如鹽酸或磷酸，或有機酸如乙酸、草酸、酒石酸或扁桃酸形成的鹽。與游離羧基形成的鹽也可衍生自無機堿，如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣或鐵；或有機堿如異丙胺、三甲基胺、組胺或普魯卡因。
            
在該組合物是液體形式的實施方式中，運載體可以是溶劑或分散介質，包括但不限于水、多元醇(如甘油、丙烯二醇、液態(tài)聚乙二醇等)、脂質(如甘油三酯、植物油、脂質體)和它們的組合。例如，可通過采用包衣如卵磷酯；通過用運載體如液體多元醇或脂分散維持所需顆粒大?。挥帽砻婊钚詣┤缌u丙基纖維素；或這些方法的組合來維持適當?shù)牧鲃有浴ＴS多情況下，優(yōu)選包含等滲劑如糖、氯化鈉或其組合。
            
其它實施方式中，本發(fā)明可采用滴眼劑、滴鼻液或噴霧、氣溶膠或吸入劑。通常將這類組合物設計成與靶組織類型相容。一非限制性例子中，滴鼻液常設計成以液滴或噴霧形式給予鼻通道的水溶液。制備的滴鼻液在許多工作方面類似于鼻分泌液，從而可維持正常的纖毛運動。因此，在優(yōu)選實施方式中，滴鼻水溶液通常等滲或輕度緩沖，將pH維持在約5.5-6.5。此外，類似于眼科制品中使用的抗微生物防腐劑、藥物或適合的藥物穩(wěn)定劑，如需要可包含于配方中。例如，已知的各種商品化滴鼻制品，其中包括抗菌素或抗組胺藥。
            
某些實施方式中，制備通過諸如口服消化途徑給藥的Bik突變形式。這些實施方式中，固體組合物可含有，例如溶液、懸浮液、乳液、片劑、藥丸、膠囊(如硬或軟衣殼明膠膠囊)、緩釋制劑、口頰吸收組合物、栓劑、酏劑、懸浮劑、糖漿、糯米紙囊劑或它們的組合?？诜M合物可直接加到飲食中。口服給藥的優(yōu)選運載體包括惰性稀釋劑、可同化食用運載體或它們的組合。在本發(fā)明其它方面，可將口服組合物制成糖漿或酏劑。糖漿或酏劑可含有，例如至少一種活性制劑、增甜劑、防腐劑、矯味劑、染色劑、防腐劑功它們的組合。
            
在某些優(yōu)選實施例中，口服組合物可含有一種或多種粘合劑、賦形劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑和它們的組合。某些實施例中，此組合物可含有以下一種或多種物質粘合劑如西黃嗜膠、阿拉伯膠、谷物淀粉、明膠或其組合；賦形劑如磷酸二鈣、甘露糖醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂或其組合；崩解劑如谷物淀粉、土豆淀粉、海藻酸或其組合；潤滑劑如硬脂酸鎂；增甜劑如蔗糖、乳糖、糖精或其組合；矯味劑如薄荷、冬青油、櫻桃香精、橙子香精等；或上述物質的組合。當劑量單位形式是膠囊時，除上述類型物質外可含有運載體如液體運載體。可存在多種其它物質，如以包衣劑的形式存在，或用以修飾劑量單位的物理形式。例如可用蟲膠、糖或二者包裹藥片、藥丸，或膠囊。
            
適合于其它給藥方式的其它制劑包括栓劑。栓劑是重量和形狀不同的固體劑量形式，醫(yī)學上常用于插入直腸、陰道或尿道給藥。插入后，栓劑變軟，融化或溶于體腔液體中。通常對于栓劑，傳統(tǒng)的運載體包括，例如，聚亞烷基二醇、甘油三脂或其組合。某些實施方式中，栓劑可由含有約0.5％--10％，優(yōu)選約1％--2％范圍活性成分的混合物形成。
            
通過在適當溶劑中加入所需量的活性組分與根據(jù)所需加入上述各種其它成分，然后按需要過濾除菌配制而成滅菌可注射溶液。通常在含有基礎分散介質和/或其它組分的無菌運載體中，加入不同的除菌活性成分配成分散劑。配制滅菌注射液、懸浮液或乳液用的滅菌粉劑時，優(yōu)選的配制方法是真空干燥或冷凍干燥技術，這樣的技術可從事先過濾除菌的液體介質產生活性成分加上其它所需成分的粉末。如需要液體介質應適當緩沖，注射前該液體稀釋液先用足夠的鹽或葡萄糖做成等滲。也考慮制備供直接注射的高濃度組合物制品，考慮用DMSO作為溶劑可導致極快的滲透，輸送高濃度的活性制劑到小區(qū)域中。
            
該組合物在制備和貯存條件下必須穩(wěn)定，防止微生物如細菌和真菌的污染。需知應將內毒素的污染控制到最低，處在安全水平內，例如低于0.5ng/mg蛋白質。
            
在
            
具體實施例方式
            
中，可在該組合物中采用延遲吸收的制劑如單硬脂酸鋁、明膠或其組合來延緩可注射組合物的吸收。
            
VII.定點突變結構導向的位點特異性突變是對蛋白質一配體相互作用進行解剖分析和工程操作的一種有力的工具(Wells，1996，Braised等，1996)。該技術通過向所選DNA引入一個或多個核苷酸序列變化來提供序列變體的制備和測試。
            
位點特異性突變采用編碼所需突變的DNA序列的特異性寡聚核苷酸序列，以及足夠數(shù)目的毗連的未修飾的核苷酸。以這種方式提供具有足夠大小和復雜性的引物序列，而在其橫跨的缺失接頭兩端形成穩(wěn)定的雙鏈。優(yōu)選長度約為17-25個核苷酸的引物，其中在序列接頭的兩端約5-10個殘基被改變。
            
該技術通常使用以單鏈和雙鏈形式存在的細菌噬菌體載體。用于定點突變的載體包括載體例如M13噬菌體。這些噬菌體載體可商業(yè)購得，它們的使用一般是本領域技術人員所熟知的。雙鏈質粒也常規(guī)性地用于定點突變中，這可以免去將感興趣的基因從噬菌體轉移到質粒的步驟。
            
一般，首先獲得單鏈載體，或將雙鏈載體的兩條鏈熔化，該單鏈載體或雙鏈載體的序列中包含編碼所需蛋白或遺傳元件的DNA序列。通過合成制備攜帶所需突變序列的寡聚核苷酸引物，然后將其與單鏈DNA制品退火，在選擇雜交條件時需考慮錯配的程度。將雜交產物用DNA多聚酶例如大腸桿菌聚合酶I(Klenow片段)處理以完成攜帶有突變的鏈的合成。這樣，形成了異源雙鏈，其中一條鏈編碼原始的非突變的序列，第二條鏈攜帶所需的突變。然后用此異源雙鏈載體轉化合適的宿主細胞，例如大腸桿菌細胞，選擇包括帶有突變序列排列的重組載體的克隆。
            
最佳地，可通過飽和(saturation)突變，其中檢查所有19個氨基酸替代，來獲得有關蛋白某殘基功能重要性和信息含量的全面信息。該方法的缺點是多殘基飽和突變的邏輯學是另人生畏的(Warren等1996，Brown等1996；Zeng等1996；Burton和Barbas，1994；Yelton等1995；Jackson等，1995；Short等19959 Wong等，1996；Hilton等1996)。必須研究上百甚至可能上千種的位點特異性突變。然而，改進的技術使突變的產生和快速篩選更為直接。也可參見美國專利5,798,208和5,830,650，描述了“走過式”(“walk-through”)突變。
            
定點突變的其它方法揭示于美國專利5,220,007；5,284,760；5,354,670；5,366,878；5,389,514；5,635,377；和5,789,166。
            
實施例本文包括以下實施例以顯示本發(fā)明的優(yōu)選實施方式。本領域技術人員應懂得，實施例中按照本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的代表性技術所公開的技術，在實施本發(fā)明時能很好地發(fā)揮作用，可認為構成了實施本發(fā)明的優(yōu)選方式。然而，閱讀了此公開內容后，本領域技術人員應理解可在所公開的具體實施方式
            
中作出許多修改而仍能獲得相似或類似的結果，但這未脫離本發(fā)明的思路和范圍。
            
實施例1代表性材料和方法細胞系人乳腺癌細胞系MCF-7，MDA-MB-231，MDA-MB-435，卵巢癌細胞系SKOV-ipl和人前列腺癌細胞系PC-3購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville，MD)，根據(jù)賣方說明培養(yǎng)。
            
質粒構建和定點突變通過將Bik，Luc，和GFP9的cDNA分別插入含有巨細胞病毒啟動子的pcDNA3載體來構建表達Bik，Luc，和GFP9的質粒。根據(jù)廠商的方法(ClontechInc.)進行定點突變。用下列引物，對于T33D為5’-GGCATGACTGACGATGAAGAGGACCTG-3’(SEQ ID NO1)，對于S35D為5’-GTTCTTGGCATGGATGACTCTGAACAGG-3’(SEQ ID NO2)，將Bik殘基蘇氨酸33和絲氨酸35天冬氨酸化。用自動測序驗證3個Bik突變構建物的序列。
            
配方非病毒基因輸遞系統(tǒng)，稱為SN，實質上是陽離子脂質體，如前所述(Zou等，2002)來配制。
            
轉染細胞在含1毫升/孔DMEM/F12培養(yǎng)基的6孔板中培養(yǎng)24小時直到60％-70％匯合，DMEM/F12培養(yǎng)基含有10％FBS(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)。將脂質體DNA(SN-DNA)以2μg/106細胞的比例直接加到培養(yǎng)板中。24小時后，通過在熒光顯微鏡下計數(shù)GFP-陽性細胞來確定轉染效率，結果表示為總細胞的百分比的形式表示結果。對每個樣品的6個＞200細胞/區(qū)域的隨機區(qū)域加以計數(shù)。所有試驗獨立地重復3次。
            
Western印跡分析以RIPA-B細胞裂解緩沖液制備蛋白裂解物，該緩沖液含有20mM Na2PO4(pH7.4)，150mM NaCI，1％ 吐溫X-100，100mM NaF，2mM Na3VO4，5mM苯甲磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)，1％抑蛋白酶肽，和10μg/ml亮抑肽酶。山羊抗Bik多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，California)。驢(Donkey)抗-山羊IgG過氧化物酶(Jackson)用作二抗。Western印跡用增強型化學發(fā)光(ECL；Amersham)來顯影。
            
熒光素酶試驗為了確定Bik對細胞增殖的劑量效應，用50ng CMV-luc和遞增數(shù)量(0，0.5，或2ug)的CMV-Bik共轉染不同的癌細胞。通過加入合適量的pcDNA3載體使各劑量轉染的DNA總量保持恒定(2.05μg)。轉染后48小時，收獲細胞，根據(jù)廠商提供的方法用luc試驗系統(tǒng)(Promega)測量luc活性。通過將得自無CMV-Bik(0μg)轉染的luc活性設定為100％來計量相對活性。數(shù)據(jù)代表3次獨立試驗的平均±SD。
            
凋亡試驗對于體外試驗，用標準熒光激活細胞分選分析來確定細胞的凋亡。簡言之，用SN-bik或其它物質轉染細胞。轉染后12或24小時，碘化丙錠染色后用流式細胞儀測定sub-G1 DNA含量來評估凋亡細胞。隨機選擇每個樣品中＞2000細胞/區(qū)域的區(qū)域，計數(shù)凋亡細胞和未凋亡細胞的比率。
            
離體腫瘤抑制用SN-bik或SN-luc轉染人乳腺癌細胞系MCF-7和前列腺細胞系PC-3細胞。轉染后24小時，小心地將細胞進行胰蛋白酶消化，收獲，接種到裸鼠的MFPs中(2×106細胞/腫瘤)。每周測量所得的腫瘤體積。
            
抗腫瘤活性測驗為了研究腫瘤生長抑制，以2×106的乳腺癌細胞/腫瘤接種雌裸鼠MFPs。2周后，當大多數(shù)腫瘤超過4×4mm時，將荷瘤小鼠隨機分成3組，每組5只。所有處理組中的小鼠都接受SN-bik的i.v.注射3周，每周3次，劑量為15ugDNA/小鼠。用相同劑量的SN-luc或相同體積的PBS注射對照組小鼠。每周測量腫瘤體積。為了評估動物存活和壽限的增加，采用了相同的腫瘤模型和相同的治療處理。腫瘤接種后200天結束實驗。
            
統(tǒng)計學分析本研究中所有統(tǒng)計學測驗均為雙側log秩統(tǒng)計學測驗。
            
實施例2代表性BIK突變體的構建用定點突變(Clontech；La Jolla，CA)構建Bik單突變體T33D，S35D和雙突變體T33DS35D，其中殘基33(蘇氨酸)和35(絲氨酸)分別或共同改變成天冬氨酸殘基。通過DNA測序驗證突變型Bik構建物之后，以Bik抗體進行的Western印跡證明，瞬時轉染后HBK293細胞中產生不同的Bik突變體的表達。陽離子脂質(SN)的配方用于將促凋亡突變型Bik基因遞送到體外和體內不同的人癌細胞中(Zou等，2002)。
            
實施例3代表性BIK突變體的體外檢測為了檢測Bik突變體在體外對人癌細胞系生長的抑制是否好于野生型Bik，進行了瞬時轉染試驗以評價突變型Bik對細胞生長抑制的效果，其中用數(shù)量遞增(0，0.5，和2μg)的CMV-Bik野生型和不同人癌細胞中的突變體和固定量(50ng)的CMV-luc共轉染，人癌細胞包括人乳腺癌細胞系MDA-MB-231，MDA-MB-468，MCF-7，前列腺癌細胞系PC-3和卵巢癌細胞系SKOV-ipl。因為明顯的luc活性是活細胞的一種量度，所以相對熒光素酶活性可用作細胞生長和增殖的指標(圖1)。
            
圖1A中顯示了瞬時轉染后293T細胞中Bik和突變型蛋白表達的western印跡分析。肌動蛋白用作等量上樣對照。圖1B-1F中，用50ng的CMV-luc和數(shù)量遞增(0，0.5，或2ug)的CMV-Bik野生型或突變體共轉染人乳腺癌細胞系MDA-MB-468(圖1B)，MCF-7(圖1C)，MDA-MB-231(圖1D)，卵巢癌細胞系skov-ipl(圖1E)和前列腺癌細胞系PC-3(圖IF)。通過將得自無CMV-Bik(0μg)轉染的熒光素酶活性設定為100％來計量相對活性。數(shù)據(jù)代表3次獨立試驗的平均值；豎條，SD；星號(*)表示相比于野生型具有顯著差異(P＜0.05)。
            
雖然野生型和突變型Bik的表達都以劑量依賴方式引起全面的生長抑制，但Bik突變體，尤其是T33DS35D突變體，表現(xiàn)出對不同癌細胞更強的生長抑制作用，并且表達水平與生長抑制活性成比例。因此，突變型Bik在體外和體內對多種癌細胞型都非常有效。其作用不依賴于Her-2/neu癌基因的表達水平。
            
用相似的方法，表示于圖2，Bik突變體T33DS35D也表現(xiàn)出對頭頸癌細胞(TU138和TU167)，黑素瘤(B16F10)，卵巢癌(2774和SKOV。SKOV不是Her-2/neu過表達細胞，與SKOV-ipl相反)和內皮細胞(人臍帶血管內皮細胞，HUVEC)有效的抗癌作用。因此，除Her-2/neu過表達的癌細胞SKOV-ipl之外，Bik突變體也對無Her-2/neu過表達的細胞表現(xiàn)出有效的抑制作用。
            
實施例4BIK突變體活性的FACS分析已知促凋亡基因Bik在很多惡性細胞中增強凋亡。為了檢測突變型Bik是否在不同的癌細胞上引起細胞殺傷作用或凋亡的增強，用標準熒光激活細胞分選分析(FACS)來檢測癌細胞的凋亡。簡言之，用SN-Bik或其它物質轉染細胞。
            
具體說，用100ng CMV-GFP和2μg CMV-Bik野生型或突變體共轉染人乳腺癌細胞系MCF-7和前列腺癌細胞系PC-3。pcDNA3轉染的細胞用作對照。轉染后12或24小時，收獲凋亡的細胞，以碘化丙錠染色后通過流式細胞儀檢測sub-G1DNA含量來評估凋亡的細胞。數(shù)據(jù)代表3次獨立試驗的平均值；豎條，SD；星號(*)表示相比于野生型具有顯著差異(P＜0.05)。
            
轉染后12或24小時，以碘化丙錠染色后通過流式細胞儀檢測sub-G1 DNA含量來評估凋亡的細胞。在MCF-7細胞中，不同的Bik突變體誘導多于野生型Bik 40％-80％的凋亡(圖3)。凋亡的啟動也比野生型早，早在轉染后8小時就開始凋亡。在PC-3細胞系中觀察到類似的現(xiàn)象。結果表明突變型Bik可誘導顯著的癌細胞凋亡，比野生型Bik更強和更早。
            
實施例5  
            
代表性Bik突變體的活體外試驗腫瘤抑制基因的最重要生物學特性之一就是其能夠在體內降低腫瘤生成的能力。為了測定不同的Bik突變體中哪些可能具有更好的抗腫瘤活性，在裸鼠癌癥模型中進行了活體外腫瘤生成試驗。在組織培養(yǎng)板中，通過SN脂質體用CMV-Bik野生型或突變體轉染人乳腺癌細胞系MCF-7和前列腺癌細胞系PC-3。pcDNA3轉染的細胞作為對照。24小時后，小心地收獲處理過的細胞，并將其接種到裸鼠的乳房脂肪墊(mfp)(對于MCF-7)或皮下結締組織(對于PC-3)中。對于MCF-7接種400萬個細胞，對于PC-3接種100萬個細胞。用空白載體pcDNA3轉染的細胞作為對照。每周測量接種的腫瘤的體積。
            
具體地，在組織培養(yǎng)板中，人乳腺癌細胞系MCF-7(4×106細胞，接種前2周在每只小鼠的皮下植入0.72mg的17β-雌二醇片劑)和前列腺癌細胞系PC-3(1×106細胞)通過SN脂質體用CMV-Bik野生型或突變體進行轉染。pcDNA3轉染的細胞用作對照。24小時后，收獲處理的細胞，并將其接種到裸鼠的乳房脂肪墊(mfp)(對于MCF-7)或皮下結締組織(對于PC-3)中，每組8只小鼠。每周測量腫瘤的體積，如圖4A所示。7周后，處死小鼠，并測量腫瘤的重量，如圖4B所示。每組中都有腫瘤形成速率。豎條，標準差；星號(*)表示與野生型相比具有顯著差異(P＜0.05)；星號(**)表示與pcDNA3對照相比具有顯著差異(P＜0.05)。
            
該“活體外試驗”繞過了體內基因遞送問題，并且表明在最佳的基因遞送條件下，具有突變型Bik的腫瘤細胞在體內比野生型Bik表現(xiàn)出更低的腫瘤生長能力(圖4A)。與pcDNA3對照相比，SN-Bik延遲小鼠中的腫瘤生長至少3周。對于MCF-7細胞，7周內野生型Bik和3個Bik突變體處理組的腫瘤體積比在2.1至3.7的范圍內，對于PC-3細胞，該比值在2.2至4.1之間，表明突變型Bik的處理在體內具有強烈的腫瘤抑制活性。圖4的數(shù)據(jù)代表每組8只小鼠腫瘤體積的平均值±標準偏差。此外，野生型Bik的平均腫瘤體積(以重量測定)是不同的Bik突變體組的約2至4倍(圖4B)。在MCF-7組中，突變型Bik也具有較低的腫瘤形成速率。
            
實施例6代表性Bik突變體的體內試驗以上研究表明，在體外和活體外條件下，3個突變型Bik形式比野生型Bik更好地誘導凋亡和抑制腫瘤細胞生長，并且進一步在原位乳腺癌模型和皮下前列腺癌模型中將SN遞送的Bik突變體的抗腫瘤活性與野生型Bik加以比較。
            
因為在體外凋亡試驗和腫瘤生長活體外試驗中，雙突變T33DS35D Bik在三個Bik突變體中是最強的突變，因此將Bik T33DS35D(Bik DD)用作三個Bik突變體的代表，在以下的體內研究中以其和野生型Bik加以比較。然后，用SN-wtBik、SN-Bik T33DS35D或SN-pcDNA3處理已經形成腫瘤的小鼠。與SN-Bik和SN-pcDNA處理的小鼠相比，注射SN-Bik T33DS35D顯著地抑制小鼠的腫瘤生長。
            
具體地，圖5A中使用的是小鼠體內的原位人乳腺癌MCF-7細胞(乳房脂肪墊，4×106細胞/小鼠，在接種前2周給每只小鼠皮下植入0.72mg的17β-雌二醇片劑)和異位人前列腺癌PC3細胞(皮下，1×106細胞/小鼠)模型。一周后，將荷瘤小鼠隨機地分至三個組，每組5只小鼠。一組接受多次SN-DNA注射，15μg DNA/小鼠，每周三次，總共處理12次，原位乳腺癌用靜脈內注射，而異位前列腺癌則用腫瘤內注射，另一組接受相同劑量的SN-pcDNA3。每周測量腫瘤的體積。圖5B中，用SN遞送的突變型Bik基因顯著地延長了具有原位或異位人類癌癥的小鼠的壽限。該圖中的數(shù)據(jù)代表來自5只獨立的小鼠的平均值±標準偏差。豎條，SD。)到3至5周，在兩個模型中SN-Bik處理的小鼠的平均腫瘤體積均大于SN-Bik T33S35D處理的小鼠。可以在第8周和第9周觀察到最顯著的腫瘤抑制效果，野生型和突變型處理組的腫瘤體積之間大約有2-3倍的差異(P＜0.05；圖5A)。與用SN-野生型Bik處理的對照組相比，SN-Bik T33S35D處理顯著地增加了被處理小鼠的存活率(P＜0.05；圖5B)。在MCF-7細胞中，對于Bik T33S35D處理組，中位存活時間為175天，與此相比，Bik處理組中位存活時間為112天，在PC3細胞中，分別為140天和105天。該結果表明SN-Bik T33S35D在這些人癌癥模型中抑制了約50％的腫瘤生長，并顯著地提高了存活率。
            
已經建立了乳腺癌系統(tǒng)性基因治療方法，該方法包括一個非病毒基因遞送系統(tǒng)(SN)和一個促凋亡基因bik。SN-Bik基因復合物體外在4種乳腺癌細胞系中顯著地誘導凋亡，該復合物也在裸鼠的原位腫瘤組織中顯著地誘導凋亡(Zou等，2002)。系統(tǒng)性地施用SN-Bik顯著地抑制植入裸鼠中的人乳腺癌細胞的生長和轉移，并且延長被治療動物的壽限。Bik基因是一個有效的凋亡誘導基因，不依賴于p53。像Bad(Wang等，1999)和Bid(Desagher等，2001)一樣，Bik是由磷酸化(蘇氨酸33和絲氨酸35殘基)加以調控的。不同于Bad，磷酸化能夠增強Bik的促凋亡能力。該作用機制目前還不知道，可能是由酪蛋白激酶II相關酶引起的(Verma等，2000)。磷酸酶PP2A可能負調控其功能(Klumpp和Krieglstein，2002)。在具體實施方式
            
中，Bik的翻譯后磷酸化引起構象的改變，從而使其從非活性的復合物中釋放出來，并增強其與抗凋亡Bcl-2同源物的親和度或易接近度。
            
結果表明Bik突變體(T33D，S35D和T33DS35D)轉染比野生型(wt)Bik轉染更有效地抑制多種人類癌細胞的增殖和增強凋亡誘導，也能更有效地在活體外和體內模型中抑制小鼠的腫瘤生長。因此，這就表明突變型Bik基因比野生型Bik基因更有效地誘導細胞死亡，SN-Bik可以用作癌癥治療制劑。
            
顯然，本文揭示的方法是在本發(fā)明的背景下對于具體的Bik突變體證實有效。根據(jù)本文提供的指導，本領域的技術人員可以制備并檢測任意數(shù)量的具有抗細胞增殖活性、抗腫瘤活性、促凋亡活性或其組合的突變體。
            
實施例7代表性的Bik突變體用作治療制劑的試驗在動物研究中檢測了與抗腫瘤活性相關的Bik突變體，這些動物研究諸如細胞系、細胞培養(yǎng)、和/或除了先前實施例中已述模型之外的其它模型。在本發(fā)明的通用實施方式中，用載體將突變體遞送到裸鼠模型中檢測其抗腫瘤活性，所用的載體如脂質體、腺病毒載體、或其組合。一旦證明了抗腫瘤活性，則進一步用免疫活性的小鼠檢測其潛在的毒性，隨后即是臨床試驗。
            
在
            
具體實施例方式
            
中，在動物中檢測了Bik突變體的優(yōu)先生長抑制活性。簡言之，將癌細胞系給予裸鼠的乳房脂肪墊而產生乳房異種移植模型。盡管如本文所述，任何癌細胞都在本發(fā)明的范圍之內，無論其基因型或表達水平，(例如，不管是HER-2/neu-陽性或是HER-2/neu-陰性)，在具體實施方式
            
中，使用的是HER-2/neu過表達的乳腺癌細胞系(例如，SKBR3和/或MDA-MB361)，如用于試驗。在腫瘤達到特定體積之后，將Bik突變體和/或野生型Bik對照給予小鼠，例如，與可接受的載體，如脂質體，以混合物的形式實施靜脈注射。對比這些處理組的腫瘤體積和存活曲線，并進行統(tǒng)計分析。在優(yōu)選實施方式中，突變型Bik在抑制腫瘤生長方面基本上與野生型Bik相當，或者效果更好。
            
實施例8制備其它Bik突變體根據(jù)前述實施例的數(shù)據(jù)和說明書其它的內容，以及本領域的現(xiàn)有知識，技術人員會有動力并且也能夠產生其它的Bik突變體，而且，也能夠使用本文揭示的方法確定本發(fā)明背景下的突變體的功效。
            
實施例9測試其它Bik突變體一旦產生了除了本文揭示的代表性突變體之外的Bik突變體，就如本文所述的方法在相關的細胞系中用細胞培養(yǎng)進行測試。此外，也如本文所述使用FACS分析來檢測Bik突變體。也可以在具體的實施方式中應用本文所述的使用活體外系統(tǒng)或體內系統(tǒng)的檢測其它Bik突變體的方法。
            
實施例10突變型Bik在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌模型中的抗癌效果代表性Bik突變體(BikDD)多聚核苷酸表現(xiàn)出顯著的腫瘤生長抑制效果以及在乳腺癌原位模型中提高存活率的功效。將人乳腺癌細胞MDA-MB-231(2×106細胞)接種到裸鼠的乳房脂肪墊(MFP)中。一周后，將荷瘤小鼠隨機分成5組，每組5或8只小鼠。所有治療組中的小鼠每周接受靜脈內注射，注射載體(pUK21)或者BikDD(pUK/BikDD)(15μg DNA/小鼠)，使用NIH脂質體進行遞送，治療持續(xù)10周。對照組的小鼠接受5％的右旋糖(D5W)注射。圖6A中，每周測量并記錄腫瘤體積。圖6B表明BikDD提高了具有MDA-MB-231原位腫瘤的小鼠的存活率。圖6A和6B中所示數(shù)據(jù)表示的是5或8只獨立的小鼠的平均值和標準偏差。
            
Bik突變(BiIcDD)基因也顯示出顯著的腫瘤生長抑制，以及能在乳腺癌原位模型中提高存活率。將人乳腺癌細胞MDA-MB-468(3×106細胞)接種到裸鼠的乳房脂肪墊中(MFP)。1周后，將荷瘤小鼠隨機地分至5個組中，每組9或10只小鼠。所有治療組的小鼠每周接受靜脈注射，注射載體(pUK21)或者BikDD(pUK/BikDD)(45μg DNA/小鼠)，使用NIH脂質體進行遞送，持續(xù)治療10周。對照組的小鼠注射5％的右旋糖(D5W)。圖7A中，每周測量并記錄腫瘤體積。圖2B中，BikDD提高了荷有MDA-MB-231原位腫瘤的小鼠的存活率。圖7A和7B所示數(shù)據(jù)代表了來自9或10只獨立的小鼠的平均值和標準偏差。
            
圖8中，用Bik突變(BikDD)基因進行治療提高了卵巢癌原位模型中小鼠的存活率。將人卵巢癌細胞2774(2×106細胞)以腹膜內注射(i.p.)接種到裸鼠體內。將小鼠隨機地分成3組，每組10只。所有治療組的小鼠每周接受i.p.注射，注射載體(pUK21)或者BikDD(pUK/BikDD)(15μg DNA/小鼠)，使用NIH脂質體進行遞送，持續(xù)治療12周。對照組的小鼠注射5％的右旋糖(D5W)。圖中所示數(shù)據(jù)代表了來自10只獨立小鼠的平均值和標準偏差。
            
圖9中，用Bik突變(BikDD)基因進行治療提高了胰腺癌原位模型中小鼠的存活率。將胰腺癌細胞Pan02(5×104細胞)接種到裸鼠體內。將小鼠隨機地分成3組，每組10只。所有治療組的小鼠每周接受i.p.注射，注射載體(pUK21)或者BikDD(pUK/BikDD)(15μg DNA/小鼠)，使用NIH脂質體進行遞送，持續(xù)治療11周。對照組的小鼠注射PBS。
            
實施例11突變型Bik的癌組織特異性表達目前的癌癥治療，如化療(CT)和放療，對于腫瘤細胞的選擇性較低，對正常組織具有副作用。為了將副作用降至最小，這些治療方法通常以間斷的方式加以施用，使正常細胞在治療周期之間得到恢復。然而，在恢復期，一些存活的癌細胞因為基因突變而對治療產生更大抗性。于是就會發(fā)生癌癥復發(fā)或惡化。靶向腫瘤的基因治療通過作用于腫瘤特異性的信號通路可以將治療所帶來的副作用和產生抗性的危險降至最低。本發(fā)明中使用組織特異性啟動子來進行突變型Bik的靶向基因治療，諸如靶向乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌。
            
突變型Bik的乳腺癌特異性表達突變型Bik的乳腺癌特異性表達采用兩個本文所述的代表性啟動子，這兩個啟動子在名為“癌癥特異性啟動子”的美國臨時專利申請60/__＿中有更具體的描述，該專利申請屬于Mien-Chie Hung、Yan Li、Yong Wen、Chi-Ping Day、Kun-Ming Rau、Xiaoming Xie、Zheng Li，本文中同時列出并全文引入本文作為參考。
            
拓撲異構酶IIα的乳腺癌特異性表達構建了一個治療性構建物，該構建物包括操作性連接于CMV增強子(SEQ IDNO25)的拓撲異構酶IIα控制序列，如CT90區(qū)(SEQ ID NO26)，同時包括這兩個序列的組合的構建物(SEQ ID NO37)操作性連接于編碼突變型Bik的多聚核苷酸以調控其表達。本文中詳述了該構建物，而在名為“癌癥特異性啟動子”的美國臨時專利申請60/＿＿中有更詳細的描述，該專利申請屬于Mien-Chie Hung、Yan Li、Yong Wen、Chi-Ping Day、Kun-Ming Rau、Xiaoming Xie、Zheng Li，本文中同時列出并全文引入本文作為參考。在下文中將一個具體的含有編碼BikDD突變體序列的突變型Bik構建物稱為CT90-BikDD。該構建物與一個熒光素酶報告載體共轉染入乳腺癌細胞系MDA-MB-231和468，以及正常的乳腺上皮細胞系184A1中，然后用熒光素酶活力試驗來確定細胞殺傷效果。CMV啟動子控制的BikDD載體(CMV-BikDD)和空白載體分別用作陽性和陰性對照。CMV-BikDD對所有三個細胞系的殺傷程度幾乎相同，而CT90-BikDD優(yōu)先地殺傷乳腺癌細胞(圖10)，表明CT90-BikDD的殺傷效果對乳腺癌細胞具有選擇性。因此，CT90可以用于靶向乳腺癌的基因治療。
            
接著，對該靶向乳腺癌基因治療的抗腫瘤效果進行了體內評估。將乳腺癌MDA-MB-231細胞接種至乳房脂肪墊后一周，每周一次用脂質體復合的CT90-BikDD對裸鼠進行治療(治療組)，用CMV-BikDD治療(陽性對照)，以及用CMV-PGL3進行處理(模擬處理)，或用右旋糖緩沖液D5W進行治療作為未處理對照。每只小鼠靜脈內注射15□g脂質體復合的DNA構建物，每周一次，并定期測量腫瘤體積。與CMV-BikDD或CMV-PGL3組相比，CT90-BikDD治療組表現(xiàn)出更顯著的腫瘤抑制效果(圖11)。
            
在原位小鼠模型中也表現(xiàn)出了CT90-BikDD乳腺癌構建物的治療效果，其中脂質體復合的CT90-BikDD靶向乳腺癌細胞(圖12A)。將脂質體復合的CT90-BikDD或CMV-BikDD構建物施用至攜帶MDA-MB-468乳腺癌異種移植物的小鼠體內。注射后72小時處死小鼠，并將腫瘤和主要的器官取出并固定。在組織切片上進行原位雜交以檢測BikDD mRNA的表達。顯示了腫瘤和心臟的檢測結果。箭頭表示陽性細胞。圖12B和12D中顯示了基因治療期間的腫瘤大小記錄結果。攜帶MDA-MB-231乳腺癌異種移植物的小鼠接受15-μg脂質體復合的CT90-BikDD、CMV-BikDD、空白載體pGL3、或5％右旋糖水溶液的治療，施用方法為靜脈注射。每個治療組包括10只小鼠。小鼠每周接受一次治療(QW，圖12B)或每周接受兩次治療(BIW，圖12D)，治療持續(xù)8周，每周2次測量并記錄腫瘤大小。圖中顯示了T-測驗得到的CT90比pGL3的p值(P(CT90pGL3))以及CMV比pGL3(P(CMVpGL3))的p值。圖12C和12E顯示了QW組(圖12C)或BIW組(圖12E)小鼠的存活記錄。第八周開始停止治療，而小鼠則繼續(xù)飼養(yǎng)直至它們出現(xiàn)研究機構規(guī)則所定義的病態(tài)。每周記錄存活的小鼠數(shù)量。
            
用Bik-DD在MDA-MB-468異種移植小鼠中進行的基因治療結果顯示于圖13中。攜帶MDA-MB-468乳腺癌異種移植物的小鼠接受15μg脂質體復合的CT90-BikDD、CMV-BikDD、空白載體UK21、或5％右旋糖水溶液的治療，施用方法為，例如，靜脈注射。每個治療組包括10只小鼠。小鼠每周接受一次治療，持續(xù)8周，每周2次測量并記錄腫瘤大小。
            
轉鐵蛋白受體的乳腺癌特異性表達本發(fā)明人還在名為“癌癥特異性啟動子”的美國臨時專利申請60/＿＿(屬于Mien-Chie Hung、Yan Li、Yong Wen、Chi-Ping Day、Kun-Ming Rau、Xiaoming Xie、Zheng Li，本文中同時列出并全文引入本文作為參考)中表明，至少有部分的轉鐵蛋白受體(TR)啟動子，如含有SEQ ID NO27(CTR116)的序列，具有乳腺癌特異性，而且在與，例如，CMV啟動子增強子(SEQ ID NO25)聯(lián)合應用時，它能夠調控突變型Bik的表達，使其具有有效的乳腺癌特異性表達。全長CTR116對照序列(SEQ ID NO38)含有操作性連接于SEQ ID NO27的SEQ IDNO25。
            
在本發(fā)明的其它實施方式中，還進一步分別縮短CT90和CTR116元件來確認其中能夠保持乳腺癌特異性表達活性的更小片段。例如，可以對這些區(qū)域分別構建缺失構建物，并檢測它們的組織特異性，以確認仍然保持能夠指導在乳腺癌組織中表達的更小片段。
            
突變型Bik的胰腺癌特異性表達本發(fā)明人可以利用胰腺癌特異性啟動子序列來調控編碼突變型Bik多肽的多聚核苷酸的表達。本文已述一個特殊又典型的胰腺癌特異性啟動子，該啟動子在名為“癌癥特異性啟動子”的美國臨時專利申請60/＿＿中有更詳細的描述，該專利申請屬于Mien-Chie Hung、Yan Li、Yong Wen、Chi-Ping Day、Kun-MingRau、Xiaoming Xie、Zheng Li，本文中同時列出并全文引入本文作為參考。
            
通常，可操作性連接的最小CCKAR啟動子和可操作性連接于WPRE的TSTA構建物(其中，TSTA序列可以是，例如，Gal4VP2)調控突變型Bik多肽的表達。這種兩步轉錄放大(活化)(TSTA)序列優(yōu)先地提高細胞啟動子如CCIKAR的轉錄活性(Iyer，Wu等2001；Zhang，Adams等2002)。在該系統(tǒng)中，第一步包括融合蛋白，例如GAL4-VP16或GAL4-VP2的組織特異性表達。第二步，GAL4-VP16或GAL4-VP2反過來驅動在最小啟動子中GAL4應答元件調控下的目標基因的表達。TSTA序列也可以包含G5E4T序列(SEQ ID NO36)，舉例說，它可以包括5個17-bp的GAL4結合區(qū)，該結合區(qū)位于距離腺病毒E4基因TAT盒23個堿基的位置(Carey等，1990)。也可以在胰腺癌中應用突變型Bik的轉錄后調控，該方法使用一個調控元件，如WPRE。因此，胰腺癌特異性表達的組合構建物包含在SEQ IDNO34中，其至少包括CCKAR(SEQ ID NO28)，GAL4-VP2(SEQ ID NO30或SEQ IDNO33)，G5E4T(SEQ ID NO36)，以及WPRE(SEQ ID NO29)。
            
在本發(fā)明的具體實施方式
            
中，以類似的方法產生構建物，這些構建物包含這些或類似的胰腺特異性啟動子，這些啟動子連接于編碼突變型Bik的多聚核苷酸，接著將構建物導入需要接受胰腺癌治療的哺乳動物體內，所用的方法與本文所述的相似。本領域技術人員很容易優(yōu)化實驗參數(shù)，如遞送模式、組合物濃度等。
            
本發(fā)明的其它實施方式中，進一步縮小胰腺癌特異性元件以確定一個或多個仍能保持胰腺癌特異性表達活性的更小片段。例如，可以對這些區(qū)域分別構建缺失構建物，并對它們的組織特異性加以評估，以確認仍能保持能夠指導在胰腺癌組織中表達的更小片段。
            
突變型Bik的前列腺癌特異性表達采用前列腺癌特異性啟動子序列來調控編碼突變型Bik多肽的多聚核苷酸的表達。本文已述一個特殊又典型的胰腺癌特異性啟動子，該啟動子在名為“癌癥特異性啟動子”的美國臨時專利申請60/＿＿中有更詳細的描述，該專利申請屬于Mien-Chie Hung、Yan Li、Yong Wen、Chi-Ping Day、Kun-Ming Rau、Xiaoming Xie、Zheng Li，本文中同時列出并全文引入本文作為參考。在具體實施方式
            
中，使用前列腺癌特異性啟動子，該啟動子能夠以獨立于雄性激素的方式和依賴雄性激素的方式調控突變型Bik的表達。
            
通常，hTERT啟動子操作性連接于兩步轉錄放大(活化)(TSTA)序列，該序列優(yōu)先地提高細胞啟動子的轉錄活性(Iyer，Wu等2001；Zhang，Adams等2002)。可以使用GAL4-VP16融合蛋白或GAL4-VP2融合蛋白。在該系統(tǒng)中，第一步包括GAL4-VP16(或GAL4-VP2，例如)融合蛋白的組織特異性表達。第二步，GAL4-VP16反過來驅動在最小啟動子中GAL4應答元件調控下的目標基因的表達。使用TSTA優(yōu)先放大轉基因的表達水平。啟動子還含有ARR2前列腺癌特異性元件(SEQ ID NO31)。將土撥鼠肝炎病毒(WPRE)的轉錄后調控元件操作性連接于pARR2-hTERT-TSTA以產生pARR2.hTERTp-TSTA-突變型Bik-WPRE，WPRE的轉錄后調控包括RNA多聚腺苷酸化、RNA輸出、和/或RNA翻譯(Donello，Loeb等，1998)。本發(fā)明的一個具體方面中，啟動子在雄性激素依賴性和非雄性激素依賴性的前列腺癌中均發(fā)揮功效。因此，用于前列腺癌特異性表達的組合構建物包含在SEQ ID NO35中，其至少包括ARR2(SEQ ID NO31)、hTERT(SEQ ID NO32)、GAL4-VP2(SEQ ID NO30或SEQ ID NO33)、G5E4T(SEQ ID NO36)、和WPRE(SEQ ID NO29)。
            
在本發(fā)明的其它實施方式中，進一步分別縮小前列腺癌特異性元件以確定一個或多個仍能保持前列腺癌特異性表達活性的更小片段。例如，可以對這些區(qū)域分別構建缺失構建物，并檢測它們的組織特異性，以確認仍能保持能夠指導在前列腺癌組織中表達的更小片段。
            
實施例12臨床試驗本實施例涉及單獨使用Bik突變蛋白、肽、或多肽或編碼Bik突變蛋白、肽、或多肽的核酸，或與其它抗癌藥物聯(lián)用來開發(fā)應用于人體治療的方案。Bik突變蛋白、肽、或多肽或編碼Bik突變蛋白、肽、或多肽的核酸，以及抗癌藥物治療可能在多種癌癥的臨床治療中發(fā)揮作用，包括，例如，轉化的或癌變的細胞參與的Akt活化。這種治療將會成為抗腫瘤治療中極其有效的工具，例如，在治療對傳統(tǒng)的化療方法具有抗性的卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、腦癌、結腸癌和肺癌的患者時。
            
根據(jù)本發(fā)明公開的內容，本領域技術人員可以了解實施臨床試驗的各種要素，包括患者的治療和監(jiān)控。所提供的以下信息作為通用方針使用于臨床試驗中構建所使用的Bik突變蛋白、肽、或多肽或編碼Bik突變蛋白、肽、或多肽的核酸。
            
選作臨床研究對象的罹患晚期、轉移性乳腺癌、上皮卵巢癌、胰腺癌、結腸癌或其它癌癥的患者應當是典型的具有癌癥發(fā)生高風險的患者，他們應當先前接受過對于現(xiàn)在復發(fā)的癌癥的治療，或者至少對一種傳統(tǒng)療法沒有應答。在一個代表性的臨床方案中，患者可在胸膜或腹膜腔內安裝Tenckhoff導尿管或其它合適的裝置，并進行一系列的胸膜/腹膜瀉流。通常希望確定沒有形成已知的胸膜或腹膜腔的小室，肌苷水平低于2mg/dl，以及膽紅素水平低于2mg/dl?；颊邞敱憩F(xiàn)出正常的血凝分布圖。
            
關于Bik突變蛋白、肽、或多肽或編碼Bik突變蛋白、肽、或多肽的核酸，以及其它的抗癌藥物的給藥，可以在胸膜腔或腹膜腔內安置一個Tenckhoff導尿管或其它裝置，除非在先前的手術中已經安放了這樣的裝置。可以獲得胸膜或腹膜液的樣品，這樣就能評估并記錄細胞結構(cellularity)、細胞學、LDH和合適的體液標記(CEA，CA15-3，CA 125，PSA，p38(磷酸化的和未磷酸化的形式)，Akt(磷酸化的和未磷酸化的形式))以及細胞內標記(Bik突變蛋白、肽或多肽或編碼這些的核酸)的基線水平。
            
在相同的方法中，Bik突變蛋白、肽、或多肽或編碼Bik突變蛋白、肽、或多肽的核酸，可以單獨給藥或與其它抗癌藥物聯(lián)用?？梢允窃谛啬?腹膜腔內給藥，直接給予至腫瘤中，也可以系統(tǒng)性給藥。起始劑量可以是0.5mg/kg體重。在沒有＞3級的毒性作用下，可以以每劑量水平治療三個患者。可以以100％的遞增增加劑量(0.5mg，1mg，2mg，4mg)，直至檢測到藥物相關的2級毒性作用。此后，可以以25％的遞增增加劑量。如果對于任何患者所確定的Bik突變蛋白、肽、或多肽或編碼Bik突變蛋白、肽、或多肽的核酸部分以及抗癌藥物部分的聯(lián)合內毒素水平超過5EU/kg，則可以將給藥劑量等分成2份灌注液，兩次給藥間隔為6小時。
            
Bik突變蛋白、肽、或多肽或編碼Bik突變蛋白、肽、或多肽的核酸，和/或其它抗癌藥物的聯(lián)合治療，可以在短時間內灌注給藥，或者以恒定的速率在7至21天的時間內灌注給藥。對于Bik突變蛋白、肽、或多肽或編碼Bik突變蛋白、肽、或多肽的核酸，可以單獨灌注，或者與抗癌藥物和/或像大黃素之類的酪氨酸激酶抑制劑聯(lián)用。任何劑量水平的灌注都依賴于各水平下達到的毒性級別。因此，如果在任一次灌注后或在穩(wěn)定速率灌注的特定時間達到II級毒性水平，則應當停止給予以后的劑量或者停止恒定速率灌注，除非毒性水平有所改善。對患者組持續(xù)給予劑量遞增的Bik突變蛋白、肽、或多肽或編碼Bik突變蛋白、肽、或多肽的核酸(與抗癌藥物聯(lián)用)，直至大約60％的患者表現(xiàn)出任何類型的不能接受的III級或IV級毒性水平。該劑量值的2/3則定義為安全劑量。
            
當然，應當在治療開始前和大約3-4周后的一定時間間隔，對患者進行身體檢查、腫瘤測量、和實驗室檢測。實驗室研究應當包括CBC、分化和血小板計數(shù)、尿液分析、SMA-12-100(肝和腎功能測試)、血凝分布圖、和其它任何合適的化學研究，以此確定疾病程度，或確定現(xiàn)有癥狀產生的原因。同樣也應當監(jiān)測合適的血清生物學標記，例如，CEA，CA 15-3，p38(磷酸化和未磷酸化的形式)和Akt(磷酸化和未磷酸化的形式)，p185等。
            
為了監(jiān)測疾病的進程以及評估抗腫瘤反應，考慮應當每4周檢測患者合適的腫瘤標記，如果開始時標記水平是異常的，則每周2次檢測CBC，分化和血小板計數(shù)持續(xù)4周；然后，如果沒有觀察到骨髓抑制現(xiàn)象，則進行每周檢測。如果任何患者出現(xiàn)長期的骨髓抑制現(xiàn)象，則建議實施骨髓檢查以排除腫瘤侵入骨髓造成全血細胞減少癥的可能性。應當每4周獲得一個血凝分布圖。應當每周進行SMA-12-100。第一次給藥后的72小時，可以對胸膜/腹膜導出液進行取樣，并在此后的第一、二個周期中每周取樣檢測，然后每4周檢測，直至疾病惡化或研究結束?？梢栽u估細胞結構、細胞學、LDH和合適的體液標記(CEA，CA15-3，CA125，ki67和Tunel試驗來檢測凋亡，Akt)以及合適的細胞內標記(Akt)。當出現(xiàn)可測量的疾病時，每4周記錄腫瘤的測量。每8周應當重復進行合適的放射研究以評估腫瘤的反應。治療開始后的每4周和8周以及研究結束時都重復進行肺活量測定和DLCO。每4周可以進行尿液分析。
            
可以用可接受的計量方法來定義臨床反應。例如，完全反應可以定義為所有可測量的疾病消失至少1個月。而部分反應則可以定義為所有可評估的腫瘤節(jié)結的垂直直徑乘積(product)之和減少50％或者更多，或者至少1個月內沒有腫瘤位點顯示出體積擴大。類似地，混合反應則可以定義為所有可測量病灶的垂直直徑的乘積減少50％或者更多，與此同時在一個或多個位點出現(xiàn)惡化。
            
參考文獻本說明書所提到的所有專利和出版物表明了本發(fā)明涉及領域技術人員的水平。所有納入本文作參考的專利和出版物以同樣程度納入，就象各出版物特定和單獨納入作參考那樣。
            
專利美國專利No.4,683,202美國專利No.4,797,368  
            
美國專利No.4,879,236美國專利No.5,139,941美國專利No.5,220,007美國專利No.5,284,760美國專利No.5,354,670美國專利No.5,366,878美國專利No.5,389,514美國專利No.5,635,377美國專利No.5,641,484美國專利No.5,670,488美國專利No.5,789,166美國專利No.5,798,208美國專利No.5,830,650美國專利No.5,871,986美國專利No.5,925,565美國專利No.5,928,906美國專利No.5,935,819出版物Anderson，L.M.，Krotz，S.，Weitzman，S.A.，和Thimmapaya，B.(2000).用轉錄靶向方法進行的白色念珠菌胞嘧啶脫氨酶基因的乳腺癌特異性表達，Cancer Gene Ther 7，845-852.  
            
Bartke，T.，Siegmund，D.，Peters，N.，Reichwein，M.，Henkler，F(xiàn).，Scheurich，P.，和Wajant，H.在DLD-1細胞中，p53上調cFLIP，抑制NF-kappaB-調控的基因的轉錄，以及誘導胱冬酶-8依賴性細胞死亡，Oncogene.20571-80.，2001.  
            
Boyd，J.M.，Gallo，G.J.，Elangovan，B.，Houghton，A.B.，Malstrom，S.，Avery，B.J.，Ebb，R.G.，Subramanian，T.，Chittenden，T.，Lutz，R.J.，等Bik，一種新型的死亡誘導蛋白，與Bcl-2家族蛋白共有獨特的序列結構域，并與病毒和細胞促存活蛋白相互作用，Oncogene.111921-8.，1995.  
            
Carey，M.，Leatherwood，J.，和Ptashne，M.一種強效GAL4衍生物在體外遠距離激活轉錄，Science 247710-712，1990.  
            
Daniel，P.T.，Pun，K.T.，Ritschel，S.，Sturm，I.，Holler，J.，Dorken，B.，和Brown，R.死亡基因Bik/Nbk的表達促進皮質類固醇抗性T-細胞淋巴瘤對藥物誘導的凋亡的敏感性，并在嚴重組合型免疫缺陷小鼠中阻止腫瘤生長，Blood.941100-7.，1999.  
            
Desagher，S.，Osen-Sand，A.，Montessuit，S.，Magnenat，E.，Vilbois，F(xiàn).，Hochmann，A.，Journot，L.，Antonsson，B.，和Martinou，J.C.酪蛋白激酶I和II對bid的磷酸化調控胱冬酶8對bid的切割，Mol Cell.8601-11，2001.  
            
Emami，K.H.和Carey，M.(1992)多聚VP16轉錄激活結構域功效的協(xié)同增長，EMBO J.115005-5012.  
            
Han，J.，Sabbatini，P.，和White，E.Nbk/Bik，一種含有BH3并與E1B 19K互作的蛋白，對凋亡的誘導，Mol Cell Biol.165857-64.，1996.  
            
lyer，M.，Wu，L.，Carey，M.，Wang，Y.，Smallwood，A.，和Gambhir，S.S.(2001).兩步轉錄擴增作為采用弱啟動子時顯現(xiàn)報告基因表達的方法，Proc.Natl.Acad.Sci.9814595-14600.  
            
Katabi，M.M.，Chan，H.L.，Karp，S.E.，和Batist，G.(1999).己糖激酶II型一種在人癌細胞中差異性表達和調控的新型腫瘤特異性啟動子，Hum Gene Ther 10，155-164.  
            
Klumpp，S.和Krieglstein，J.凋亡中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，CurrOpin Pharmacol.2458-62.，2002.  
            
Lu，H.，Zhang，Y.，Roberts，D.D.，Osborne，C.K.，和Templeton，N.S.(2002).在體外乳腺癌細胞中和體內腫瘤中增強的基因表達，Mol Ther6，783-792.  
            
Maeda，T.，J，O.W.，Matsubara，H.，Asano，T.，Ochiai，T.，Sakiyama，S.，和Tagawa，M.(2001).最小c-erbB-2啟動子介導的單純皰疹病毒胸苷激酶基因的表達使更昔洛維具有人乳腺癌細胞的選擇性細胞毒性，CancerGene Ther 8，890-896.  
            
Mathai，J.P.，Germain，M.，Marcel lus，R.C.，和Shore，G.C.響應E1A和p53引起的凋亡信號轉導的BIK/NBK的誘導和內質網定位，Oncogene.212534-44.，2002.  
            
Nettelbeck，D.M.，Jerome，V.和Muller，R.(2000)基因治療用于腫瘤靶向的設計者(designer)啟動子，Trends Genet.16174-181.  
            
Panaretakis，T.，Pokrovskaja，K.，Shoshan，M.C.，和Grander，D.對阿霉素的凋亡響應中，Bak，Bax，和僅含BH3的蛋白質的激活，J Biol Chem.27744317-26.，2002.  
            
Puthalakath，H.和Strasser，A.緊緊約束殺傷者僅含BH3的蛋白質促調亡活性的轉錄和翻譯后控制，Cell Death Differ.9505-12，2002.  
            
Qiao，J.，Doubrovin，M.，Sauter，B.V.，Huang，Y.，Guo，Z.S.，Balatoni，J.，Akhurst，T.，Blasberg，R.G.，Tjuvajev，J.G.，Chen，S.H.，和Woo，S.L.(2002).自殺型基因治療的腫瘤特異性轉錄靶向.Gene Ther9，168-175.  
            
Sadowski I，Ma J，Triezenberg S，Ptashne M.GAL4-VP16是一種異常有力的轉錄激活子.Nature.1988年10月6；335(6190)563-4.  
            
Sato，M.，Johnson，M.，Zhang，L.，Zhang，B.，Le，K.，Gambhir，S.S.，Carey，M.，Wu，L.(2003)最優(yōu)化腺病毒載體以指導高度擴增的前列腺特異性表達，用于成像和基因治療.Mol.Ther.8(5)726-737.  
            
Takeuchi M，Shichinohe T，Senmaru N，Miyamoto M，F(xiàn)ujita H，Takimoto M，Kondo S，Katoh H，Kuzumaki N.負顯性H-ras突變體，N116Y，在裸鼠肝中抑制轉移性人前列腺癌細胞的生長.Gene Ther.2000年3月；7(6)518-26.  
            
Theodorakis，P.，Lomonosova，E.，和Chinnadurai，G.對于人上皮癌細胞中多次刺激誘導產生的凋亡，BAX是其顯現(xiàn)的關鍵必要因素，Cancer Res.623373-6.，2002.  
            
Verma，S.，Zhao，L.，和Chinnadurai，G.促調亡蛋白BIK的磷酸化磷酸化位點的圖譜以及對凋亡的作用，J Biol Chem.1717，2000.  
            
Wang，H.G.，Pathan，N.，Ethell，1.M.，Krajewski，S.，Yamaguchi，Y.，Shibasaki，F(xiàn).，McKeon，F(xiàn).，Bobo，T.，F(xiàn)ranke，T.F.，和Reed，J.C.通過鈣調神經磷酸酶對BAD的去磷酸化產生Ca2+-誘導的凋亡，Science.284339-43.，1999.  
            
Wang XP，Yazawa K，Yang J，Kohn D，F(xiàn)isher WE，Brunicardi FC.由大鼠胰島素啟動子指導的使用胞嘧啶脫氨酶基因進行的對胰腺癌特異性的基因表達和治療.J Gastrointest Surg.2004 Jan；8(1)98-108.  
            
Wesseling JG，Yamamoto M，Adachi Y，Bosma PJ，van Wijland M，BlackwellJL，Li H，Reynolds PN，Dmitriev I，Vickers SM，Huibregtse K，CurielDT.Midkine和環(huán)化加氧酶-2啟動子有望用于對胰腺癌進行腺病毒載體基因遞送.Cancer Gene Ther.2001年12月；8(12)990-6.  
            
Zhang，L.，Adams，J.Y.，Billick，E.，Ilagan，R.，Iyer，M.，Le，K.，Smallwood，A.，Gambhir，S.S.，Carey，M.，Wu，L.(2002)用于前列腺癌中轉基因遞送的兩步法轉錄擴增(TSTA)系統(tǒng)的分子工程.Mol.Ther.5(3)223-232.  
            
Zou，Y.，Peng，H.，Zhou，B.，Wen，Y.，Wang，S.C.，Tsai，E.M.，和Hung，M.C.促調亡基因bik的系統(tǒng)性腫瘤抑制，Cancer Res.628-12.，2002.  
            
雖然已對本發(fā)明的內容和優(yōu)點作了詳細描述，但應理解可在不脫離本文所附權利要求所確定的思路和范圍的前提下，對本發(fā)明作出各種變化、替代和改變。而且，并不希望本申請的范圍受到此說明書所述的過程、機制、制造方法、材料組成、工具、方法和步驟的具體實施方式
            
的限制。本領域的普通技術人員根據(jù)本發(fā)明公開的內容不難理解，可以根據(jù)本發(fā)明，利用現(xiàn)有的或將來發(fā)展形成的、其功能或獲得的結果與本文所述的相應實施方式基本相同的過程、機制、制造方法、材料組成、工具、方法和步驟。因此所附的權利希望要求將這類過程、機制、制造方法、材料組成、工具、方法和步驟包括在其范圍內。
            
序列表<110>M.-C.洪(HUNG，MIEN-CHIE)Y.李(LI，YAN)Y.聞(WEN，YONG)<120>突變型Bik的抗腫瘤效果<130>UTFC791WO<140>未知<141>2004-04-02<150>60/459,901<151>2003-04-02<160>38<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>1ggcatgactg acgatgaaga ggacctg   27<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>2gttcttggca tggatgactc tgaacagg 28  
            
<210>3<211>160<212>PRT<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的肽<400>3Met Ser Glu Val Arg Pro Leu Ser Arg Asp Ile Leu Met Glu Thr Leu1   5  10  15Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Glu Pro Pro Thr Met Glu Val Leu Gly Met20  25  30Thr Asp Ser Glu Glu Asp Leu Asp Pro Met Glu Asp Phe Asp Ser Leu35  40  45Glu Cys Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile50  55  60Gly Asp Glu Met Asp Val Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu Ala Gln Leu65  70  75  80Ser Glu Val Ala Met His Ser Leu Gly Leu Ala Phe Ile Tyr Asp Gln85  90  95Thr Glu Asp Ile Arg Asp Val Leu Arg Ser Phe Met Asp Gly Phe Thr100 105 110Thr Leu Lys Glu Asn Ile Met Arg Phe Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly115 120 125Ser Trp Val Ser Cys Glu Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu130 135 140Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys145 150 155 160<210>4<211>150<212>PRT<213>人工序列  
            
<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的肽<400>4Met Ser Glu Ala Arg Leu Met Ala Arg Asp Val Ile Lys Thr Val Pro1   5  10  15His Asp Gln Val Pro Gln Pro Pro Val Ala Ser Glu Thr Pro Ser Met20  25  30Lys Glu Pro Val Arg Asp Val Asp Leu Met Glu Cys Val Glu Gly Arg35  40  45Asn Gln Val Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Leu50  55  60Cys Leu Arg Ser Pro Arg Leu Val Gln Leu Pro Gly Ile Ala Ile His65  70  75  80Arg Leu Ala Val Thr Tyr Ser Arg Thr Gly Val Arg Gly Ile Phe Arg85  90  95Ser Leu Ile Arg Ser Leu Thr Asn Leu Arg Glu Asn Ile Trp Ser Trp100 105 110Arg Val Leu Thr Pro Gly Ala Trp Val Ser Pro Asp Gln Asp Pro Gly115 120 125Gln Leu Phe Pro Met Val Leu Leu Val Phe Leu Leu Leu Gly Gly Ala130 135 140Trp Tyr Leu Gln Leu Gln145 150<210>5<211>21560<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物  
            
<400>5tgatcagcat attgtcttgg gattttgcaa agtaaataag tactgtattt gcacccactc 60tgcccttgaa tcatccagtg tccccaaacg gtccttcttt ctccatcttt tctgctaatg 120tttactgaac atctcctaca tacctggcac tgtgcctcca gccttaagac ccctctgcaa 180gcatctcaca tatatcaggt ctttcggacc catgagaccc cgtgtcattg ctttacctcc 240ctgagtctca attttttcat ctgcaaaatg cattcagagg gaagccccca ttatgaaggg 300ttccctactc ctgactgtaa ggcactctgt ggctgttagc cacagtcagg gcgagctgct 360ttgtaggggt tgatgtagtt tggaggccct agaagaaaag actacagggc cgggagtggt 420ggctcacgcc tgtaatccca gcactttggg agcccgaggc cggtggatca cctggtgtca 480ggagttcaag accagcctgg ccaatatggc aaaaccccgt ctctactaaa aatacaaaaa 540ctagccgggc atggtggcac acgcctgtaa tccagctact aggggggctg aggcgggagg 600attgcttcaa cctgggagac agacgttgca gtgagccaag attgtgccac tgcactccag 660cctgggcaac agggctagac tctgtctcaa aaaaacaaaa acaaaaacaa acaaaaaaac 720cccacaaaag caaagaaggt ccagagcccg gaaggcggga ggggctctga agactttatc 780acactttacc tcctctgttc ctcccaacag cccagctctt ggtaggtgct gttgtccatt 840tcacagatga gaacattgaa ggggaagtaa ttaccctaga ggtgggaaga acagagtgag 900ggtacccaac aggtagcaaa cgacagagct gggggagggg aacccctgtc cctgcccctc 960ccctaatctc tgaggggatc aagacagaag taaacaagct ttgccgtgcc caggacaatt 1020gttactttgt tattccagga gcgctctgcc ttctcccacc cccaatatac cccagggctg 1080gagttaggtc ctacccatcc ccgcgtagca ggctgcccac ccgcccaccc cgcctggaag 1140ctttctgatt tctctgttcg ccccgccagg cgctgtgggg tccgtctcac caggtctgca 1200cgtgagcccc ctgcccccaa tccctcccag tcccgcccgc ctctcgcgga cccggagccc 1260cgacgggagg gggaaggcag tgggtgtgtc atgcagctgg aaggctgcgg acgggcggca 1320gtggaggggc agccccctgg cttcgggtat ggatcactgg atgctgctgc taaccaaatg 1380tgaacctcgg ttttcatatt tgtgaaatag gcttaaaaac acctaaatcc caaagctgcc 1440agcctaagga gcacacgtct ttgaacgctg gcttcacgct gtcatttaag tcatttcgtc 1500ctcttggagc ctcggtttcc acgtgggtaa aatgatcgtg aaaaaaagca ccgaggagta 1560ctttgagctc gaacggaggc catccgtgta aagggccaga ttctgtcaat ggatcgatcc 1620ccccgatatt gatggaaacc cctgagtgca cgcccgtgct gggcgcaggg gaaacagcga 1680cgcacgggac aaaacaagct tgcagaacag cagggggcag agaggctgta aacaagccaa 1740cgggctgcac ttgtagcggt tctgttgcca atgccattca gaccccagtc cgggattccg 1800cgctcggggt gcgagaggcc gctcccgggg aggggcggga cccgggcggg gcgggagggg 1860cggggcgccc gggcctatta ggtcccgcgc cggcagccgg gccgcagaca cgaagcctcc 1920cgggtggctt acagacgctg ccagcatcgc cgccgccagg tgagtgcccc cgaccctgct 1980gccgcccgct gctccgccca gctcgagccc ggcggttagc gcccaggccg cggcccgggt 2040gccgagcggc tggaagtgtg gggagccgtg cccaggtttt accgctccag caagtcgctg 2100gcggggcgac gtctcgggac tccggctccg aaacgtaccc tctctgtccg gggctccagg 2160tccccgacgg gcgatcgtgc caggcgcggc ccctgcgggc ctcagtctcc gcgcctgtgc 2220aatggggtgg tccctctgcg tctcgccgcg acggctggac gccccatcgc cgccgcacag 2280tcctccagtg cggcttccgg gcacccggct ccgaactctg gggtcgtgcg gacccggcca 2340gaccgtagcg cggcaacgcc agcccacggc cgcggccgca cagccccggt gcccttaaaa 2400gagggaagat ggcgtcgtgc ccggtgccgc cgggaccggc tcccggaggc gctgcgcacc 2460tgaggaaggg ccgaggaaag gcttcgtaac gggacgccca gaaagtccgg aacaggaacg 2520tgcacacgga gcggcgcgca gccgcccgcc ctcgcttgcc cacgcgccct gcacaggtgc 2580  
            
gccccagact gggcggggac tagagcccgg ctggggcatg cgaccttgtt tggtaaattg 2640gaggtgcgcc cctgcgggtg acccgcgagg gggccccccg cctgcggggc gcggtcacga 2700caaggcttgt ggggttcgga gctggtcgtc gtctgggctc tggcctccta aatgcgatcg 2760ctttcaagcc cttcattgtc aattttgcta gaatgagcca ctcgtggggt aggacgtggt 2820tgttgatgtt actgttgtag ctcttactat tgtaacattt ttgttgctgt tttaacgcag 2880tgtttactgt ggtctgggag cccgagcttc ccagggagca ttggtgtcag cctcatgtcc 2940ccgcattagg aggagcgcag tctggtgggc actagcgccg ggaagttctt aacatctgtc 3000tgcccctggg agcaggaggc ctcatcttcc aggtggagaa acagagattt cagtcccagg 3060aggcacagaa atgccagggt tgtctagcta gaagccaagg gccctttatg gaacccaagc 3120caaaacctct ttccactctc cagccctgtg gcctcggaag ggccactcca tctctctgaa 3180cctcagtttg ttctgttcac tctgcaaaat gtatccctga ggtttctggc caggtgaaag 3240cccctctcaa gttagtagcc tccctggagt taagactcac cccgatttct acttaatttg 3300ggcacgcctt tggaataagt tctcaggaat ggcacagttt gggtgttttt tgtttctttt 3360tgtttttttt tgaaacagag cttcgctctt gttgcccagg ctggagtgca atggcgccgt 3420ctcggctaac tgcaacctcg gcctcctggg ttcaaacggt tctcctgcct cagcctccta 3480gtagctggga ttacaggcgc ctaccacgag gcccagctaa ttttttgtat ttttagtaga 3540gatggggttt caccatgttg gccaagctag tctcgaactc ctgacctcag gcgatccacc 3600cgcctcagcc tcccaaagtg ctgggattac aggtgtgacc caccccgccc ggcttgagtg 3660tttaaatact cctgcctcag cctcccaagg tgctgggatt acagacgtga gcccctatgc 3720ctggcccttt tttttttttt aattgtctta aggatgttaa gactaagatt ctcacacatt 3780tgactcgtgc ctgtaatcct agcactttgg gaggctgagg caggaggatt gcttgagctc 3840aggagactag actgggctag accagactgg gtaacatggt aaaaccctgt ctctaccaaa 3900aatacaaaaa attaaccggg catggtggca tgtgcctctg gtcctagcta cgcaggaggc 3960tgagttcaga ggcctacctg agcttggagg ggttgaggct gcagtgaacc ctgatcatgc 4020cactgcactc tagcctggga gacagagtga gaccctgtct caaaaaaagg agcattaggc 4080tgggcatggt ggctcacatt tgtaatccta gcactttggg aggccgaggg agatggatca 4140cctgaggtca ggagttgtga gacgagcctg gccaacatgg caaaaccagt ctcttttaaa 4200aatgcaaaaa ttagccggtc gtggtggcgt gtgtctgtaa tcccagctac ttgggaggct 4260gaggcaggag aactgcttga atctgggagg cagaggttgc actgagcgga gatcacacca 4320tggcactcca gcctgggcca catagggaga ctctctgtca aaagaaaatt taaaaaagca 4380tcaaatggta gatccccagt gtctgttaca gcttgggtac tctatggctg gatagagagg 4440ctgcatacat gttagttatt gtaagtttgt ttgttttttt gagacggagt ttcgctcttg 4500ttgcccaggc tggagtgcaa tggctgggaa tacaggcgtg agccacctca cccggctcaa 4560gattcttaca catttgactt gcctgtaatc ccagcacttt gggaggctaa ggcgggagaa 4620ttgcttgaac ccaggaggcg gagattgcag tgagcagaga tggtgccact gcactcagcc 4680tgggctaacg tgagactcca tctcaaaaaa aaaaaaatta cgtcttgtgt cacagagctg 4740cagataaacc agagactact cataaccgtg tacttttttt ttcccccatt tctgatcccg 4800tctcaacgga aggatgtaat tgaggaaggg cttgattggc cagtgagtct tgaagctgac 4860accactgctg gtggtatttt cccctctccc tggaaagcat cctgttttta gtgaacctat 4920taaatgtgta gacaattaat ggctttttgc ttcccctgct gcagacttag cggatcccat 4980gagattttga ctaccgtctg tgctcagaac agtttgagcc gtatggagga agtctccgca 5040ccagtcttac tgttggtggt caccaggaag ccagcagtgt gtctgaactg gacacatgtg 5100gccacttcct agcctccctt tgtcctgcca ctggttggtt ggggctgggc cctgggagaa 5160acatagaatg tgagcaaatc agtccgtggc ccctaagttc cttgttggcc ccgaggcagg 5220  
            
caggagaggg gcgggcacac agggcagctg attttcctag tgtcaatatt aggatgtgac 5280aatacaaaac accactgggc ctcgccaggc actgcatggt aaacctgttt ttctgggggt 5340gggacagaac ttggcaccca gttagccaaa ctgaaaagcc atgcagcaaa gagagaaaag 5400ctcacttgtt tatttgagtg agggtccctg tcattttgga tatttaagat caagtattct 5460tgaccgcccc ctccccgaga tggagtcttg ctctgttgcc caggctggag tgcagtggtg 5520tgatctcagc tcactgcaac ctctgcctcc cgggttcagg tgattctcct gcctcagcct 5580cccgagtagc tgagattaca ggcgcgtgcc accacaccag gctaattttt gtatttttaa 5640tagagatggg gtttcaccac gttggccagg ttggtcttga actcctgacc ttgtgatccg 5700cccgcctcag cctcccaaag tgctgggatt acaggtgcga gccaccgtgc ctggccaaga 5760gatgacattt attgtgtgtg acagtatctt cgagattaga ggctcccttt catgtgaggg 5820caaagagagc tacctgattc caggaggagc tgaaattccc tgtgcagaca atggcgcatc 5880atgaagataa atccgagctc ggaccgtgag gtggtcagca cgggtgtgcg cctcgcagag 5940caacaggctc acagaatgag agctgcctct tagtgggcac ttactgcata ccatgcatgc 6000agcatttcac ctccttctca gggctacatc tgcccatggg gctttccctc ctgcccttta 6060acagaaggtg atactgtcca gtccagggtc tcccagccag gaacagcctg ccatcgtgag 6120cccagcacca gagtaacccc ttccctcatt ctcaggattt tgcagtgaac tctcaggctg 6180tctgcatcct ctcaccggct ttcactgggt ccctgctctg ttctggggcc atgcaggttc 6240ccgactggct ggggcagaca cacaggtaaa catttaacga gaccttgatg ggctgagtgc 6300ccaatccagg tctgtttacc caaggtgctg ggacaacaca gatgaggagc atttaattct 6360gtcctgggga gggtggggag gaagtgactt gtgcctgagc cccaaggaag cagtgagtcc 6420cccgtgcctg cctgggggat gttggtaaca gagggaggat gtaaaggagg agctggggtg 6480tgaaagggct gggtgcaagt tcatagggga gacccaaaca ctgaagtgga gcccaggggc 6540cgtacctgcc tctcaagcct cagggtcggg gccagggtga gcagtcttca tattcttcag 6600cctcagcatt tcagaacttg ttttattttt tttttgagat ggagccttac tcctgtcgcg 6660ggggctggag tgcagtggcg cgatctcggc tcactgcaac ctccacctcc tgggttcaag 6720tgattctcct tcctcagcct ccctagtagc tgggattaca ggcgtgcgcc accacgcctg 6780gctagttttt gtatttttag tagagatgag gtttcgccat gttggccagg atggttgtga 6840actcctgacc tcagttgatc cacctgcctc aacctcccaa agtgctagga ttataggtgt 6900gagccaccgc gtctggccta ttttttattt ttgattgagt cttgctctgt tgcccaggtt 6960agagtgcggt ggcacgatct tggctcactg caacctctgc ctctcaggtt taagtgattc 7020tcctgcctta gtctcccgag tagcttggac tacaggtgcc cgccaccacg cccggctaac 7080tttggtattt ttagtagaga cactgtttca ccatgttgac cggggggtct tgaactcctg 7140accttagttg atccatctgc cttgacctcc caaagtgctg ggattacagg agggagccac 7200cgcgccccgg cccagaactt gttttaaata tgaacttttg aaacttaaca actgtaggcc 7260caggtggtgg cttggcattc tctgcttcct tcatggtgat aaaaaggcac aggcttcccc 7320tttttggggt catttcaaaa tcagtcaaga gaattattag tctgttagac ttcctctacg 7380gttaggatta tttttatagg tgttcgaaca ggaaaggaca tagaataaaa tctcctcccc 7440taacttattg atacagggtc tcactctgtc gcccaggctg gagtgcagtg gcgcagtcac 7500agctcactgc agcctcaacc tcctgggctc aagtgatcct ttcgccttgt gctcttaaag 7560tgctgggagc ctccaaaagg ctaagctgtg acgttgggta ggttacatgt attaaatgca 7620tttttttttt tttgagacag ttttgttctt gtcacccagg ctggagtgta atggcataat 7680ctcggctcac tacaacctct gcctcccagg ttcaagtgat tctcctgcct cagcctcccg 7740agtagctggg attacaggcg cccaccccca cgcccggcta atttttgtat ttttagtaga 7800gacagagttt caccgtgtta gccagaatgg tttcgatctc ctgacctcgt gatccgcccg 7860  
            
cctcggcctc ccaaagtgct gggattacag gcgtaagcca ccgtgcccgg cctggtgaaa 7920ccccgtcttt actaaaaata caaaattagc caggtgtggt ggcgtgcacc tgtagtccca 7980ggtacttggg aagttgaggt ggaaagatca cctgagccca gggaggtgga gactacagtg 8040agccatgttc atgccactgc actccagcct gggtgacaga gagaccctgt ctcaaaatag 8100taatactcca tattgggcct ctcacagggg aatcttgggg ggagctgcag ctcagggtga 8160ctcccatctt gtcactagcc aggtgacccc ttcattctgg agccttagct ctgaaagccg 8220caggtggggg tgccgtttca gatgcccctt ttccatttca aaggctctga ttctagatct 8280tgaagccgga tgcggcactg gcacttggct tcagtttcca ctgtgacgga cggaggtctc 8340ccaggcccag cccaggcagc caagcccatc ctggaatcag aacacgctga gcacattttg 8400tagggtggca cctttttatc caagttacta gctacacatc agtgtttaaa gagaaaaaag 8460tgagctgtct tttttttttc ttgaaacttg aggaaacaag gtacatacta cggatttttt 8520tttttctttt tctttttttt ttttgagaca gtctcactct gtcgcccaga ccggagtgtg 8580gtggcatgat ctcggcttac tgaaagctct gcctccaggg ttcaagccat tctcctgcct 8640cagcctcccg agtagctggg actacaggcg cccgccacca cgcccagcta attttttttg 8700tatttttagt agagacaggg tttcactgtg ttagccagga tgctctccat ctcctgacct 8760tgtgatctgc acgcctcaac ctcccaaagt gctgggatta caggcgtgag ccaccgcgcc 8820cggcccatat tttttttttt tgagatggag tttttcgctc ttgtcgccca ggttggagtg 8880taatggtgtg atctcggctc actgcaaact cctcctccca ggttcaagcg attctcctgc 8940ctcagccacc cgagtagctg gattacaggc gcgcaccacc acacctggct aatttttttt 9000gaaacggggt agagacggag ttttattacc atgttagtca ggctggtctt gaactcctga 9060cctcatgatc tgcccacctt ggcctcccaa agtgctggga ttacaggtgt aagccaccgc 9120ggctggccca tttcatatat ttttaaaatt ttttattgtt aatttatttt tagagagggg 9180gtctcgttgt attgcccagg ctggtcttga actgggctcg tgcgacgtgc ccgcctcggc 9240ctcccgaagg gctgtgatga cagcacagcg gtgcctgtga tctatggctt caatttttca 9300aggctgccag gtccatgcag gggtgtgtgt gggatgcatc cctagaaatc aaaggtcatg 9360tgcgtgtgtg actggtggat gctgatggtc acactaccct ccagaaaggc agcaacatgt 9420tcagtccacc gtggcgtcct gagctgtgag tggcctctgg tctcctctct tctaaggctg 9480ttgattgtgt taaccagctt ttatggagcc cctgctaggt ggtggaaaat gggcagtagt 9540gtatgttttc atcctctcag cagccctgga ggcccggctg tttctgcaag gctcagaggt 9600gagctggttg ttctgcctca cacagcaggg gccgagcagg gggtggaact gaggtccagc 9660ctggctgcag gctcagggcg tttcctgctg ggttacactg gagttgtgtg cgctccaagg 9720gctttgtgcc accccaccct catggtccag ggccaggctg tgactgggag ggtggcacgt 9780ggaagactgg accagggttt tctagctggg cccactcagc tggccctccc tgtgacccca 9840gcgtggcccc tgaccctctc ggtttgcctg cctgtgaaac aggaagtgtc agatcccgcc 9900tgcttggctt tgacaggact gggcgaggtc atgagagtct gagggtccct accaggagtt 9960cgacctcatc ctcaggtcca gccccatcca cctctgcccc caaccccgct ctgacactcc 10020tgcagcctcg gccctcgaac acctgctgag ggctgagcag aacacatctc tacttgcttg 10080tgcttctggg caacctggga ggggcttggg aggtagatgg cgtttcccca tcttccagat 10140gagccatagg cgagctgtcg agtgcagagc tgttcaccaa atgtaggctg ctctgtccag 10200aacctgccct ccctcccact cggagccctg caggtgccct caaggccgtg ggtgtggtac 10260tcttttctgc acatactaga tttgcatcct aacctcttag ggtaaaatag ggcttctgac 10320tggcgcctgg tgtttccact ggtgagtgtg taggaggcta agtgcgggct gtagcctggg 10380tggggacaca tggctaggtg tgtcttcctt caccaaagaa gggtttcaac tactcatttg 10440caagtttgct ggaaaaaaaa agataataaa aaccagtcca gtttcctgta tctgcagctg 10500  
            
cagtgacctc acagtgggtc ctctgggaat aggttgcctt catgtcttca gtcaacaaac 10560atatgtctgc tctatgccag gccttgggct gacaaccaga aactgataag agcagcagcc 10620cctctcttag cggtttactc tgtgccggat catttcatcc ccacaacagt cctgtgcaat 10680aggtgttact agtatctcca ttctaatttt ttttttttct gatatggagt cttgccctgt 10740agcccagcct ggagtgcagt ggtcagctgg agccagaggg gagcagagac aggggctgca 10800ggacccccag gaggccccca agcagactct gagggtccaa gaaggtgatg cccgaatagg 10860ccagcctcat acccatcctc tcagtacttt gggaggccca ggcgggagtt gaagccagga 10920gttccgagac aagcctgggc aacaaagcaa gaccctatct ctacagcaat tctataaaaa 10980tgagccaagt gcagtggtac atacctgtcg agttaccctg gaggctgagg tgggatgatt 11040acctgagccc aggagtttga ggctgtagtg agcatgatca ggccactgca ctccagcctg 11100ggcaaacggg tgagaccctg tctgtgaaaa aaataataat aaaatttaat ttttaaaaaa 11160ggaccaatag gcgtaggcat gggccggtct gaggttggct ggtgagctct gcacatttga 11220agactttgga ggcatggcag gaccaggcac catccatgga aagcatactt gagtgtggtt 11280agcgcgggaa ccaagattgg ggtggcaggg ccacaggggg agggcctgtt agtggatgtg 11340gcacaacccc ccacttgttt ttgagacaag tcttgctctg tcacccaggt tggagtgcaa 11400tggcgcggtc tcggctcact gcatattctg cctcctggat tcaagtgatt ctcctgcctc 11460agcctcccaa gtagctggga ttataggcga gcgccaccac acctggttaa tttttgtatt 11520tttagtggag atggcgtttc accatgttag ccaggctagt ctcaaactcc taagctcagg 11580tgatccacct gcctccacct ctcaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc gcactgcacc 11640aggccaggtc tagggagccg aacagagcag tgacagggtc agggttgagg ctgctacctt 11700gagattaggt tggagagagc tccactgaag gctggagacc agtaaggcat tcagagctgg 11760tgccaggtag gagctgacag gactgggcct cccttgggct ggtggggtgg ccaggagaga 11820ccagagcagg aggtcgctgc tgcaaggacc ctcctgggca ggctccccac cttccgctcc 11880ctggctccac acttttccca tgcagatctg ggccctaagg ccagcctagg cccagttggt 11940gatgggatct ttgccattca tatcaagtca atctgagggc ctgggcccag aggccagatg 12000gttaaaggtt cagattaggt cccttctttg tggtagaggg taatgggtat ttaataaatt 12060aatccaaagt gctgtaatcc cagtactttg ggaggctgag gcgggtggat cacttgagat 12120caggagttga gaccagcctg gccaacatgg taaaaccccg actctactaa aaatacaaaa 12180attagccggg tgtggtggca tgtgcctgta atcccagcta cctgggagtc tgaggcagga 12240gaatcacttg aacctgggag gcggaggttg cacctgagct gagatcacac cactgcactc 12300cagcctgggc aatagagtga gactgtctca aaaacaaaca aacaaacaaa caaaaaaaca 12360ctaccaccaa caaaaacaca atagatgggg aaactgaggc tggtgcagga agggttgggc 12420tagggtatca acctaaggtg agatgtggtc ctgggtctac tcagatgggg aggttggcag 12480ggtggggagc ttgaaagggt cttgcaggca gagcgtgggt gactgactcc tcaggtaggc 12540ctgacctgca ctctgctgca gaccctcggc agcgcagccc actctggtgg ctggggcctt 12600cttcctatct ggcgcctaag gattctcgga atgcctgctg ggtaaggggg ctgtgggcac 12660agtgggtcaa ggcgaggctc ggtgcagctc acagctcagc tcacagtgag gtgaggttcc 12720actgttgctc tggctttgcg gggcgtggag gtactggggt ctccaggagc acaaagcagg 12780agactgcctt ttcgagggga agggaaaggg gggaaaagca aacaagggct ggagctgctt 12840tcctagggaa atgccatttg catagacacc caaggcagct ggaagttctg gacacagttc 12900ttctaatgcc agcttaacac gcacactgct ggccgtctat acaatgtaaa acatctcatc 12960tgtgaaacct tattttttct ttttgagtca gaatctagct ctgcctccca ggttcaagct 13020gggattacag gcgtatgtca ccacgcctgg ctaattttgt atttttatta gaggcggggt 13080tttaccatgt tggccaggct ggtctcaaac tcctgacctc aggtgatccg cctgtctcag 13140  
            
cctcccaaag tgctgggatt acaggcgtga gccaccgcac ccggcccatc catctccctt 13200gaatgctgaa agcaagtcgt gagcacacac ttgtgcctag gcctgtggga gggcggccct 13260gtgggtcctg cctgccgtca gttttctctc tcctgggggt cagggagact tggagctctg 13320tcccttcttg gcttagtcat gaacctctct aagcctcagt gtcctgtgtg aacaaacagc 13380tcagtgagat ggtgggaggg cggagtgtcc tgtcagcagg catggggaat taaaaattaa 13440gaacacccag ggcattatgg taagaaaata atgagttgaa gcataaaggt aatggttagt 13500gccaacttcc tcccagcgtg ccaggccctg ttcaaagtac atgaaggagt tccttatttc 13560gtcttcccaa tagcccaggg cggggctctc agaccatgaa acccatttca cagatgaaga 13620aattgacaca ctgctgctaa ctgccagagc cgggctttga actaggccat tagatttccg 13680tgccacagtc atcgtcatta tcgtcatcta catctaaggc tgtttggtac cctgtagggt 13740aaatgtgggg tacatgatgg tgaatcaggt cgcagaaccc ttctctgcca tcatgatgaa 13800acatgtactg gcatgggatt cgcaatgatc atagttagga aggcctttgg tggcaaagaa 13860gaggaaactc agtgaatggt gatgaggaca catttgggtt catttttctt acacacagtt 13920ggaggagaca gctcagtgac accctcaggc ctggccgctc tctgcctccc cgctctgctc 13980ttcttggtca gccactgcag ctccatcttt gaaggagctg ccctggctgt gtctactccc 14040tggcatccaa cccctgcctc cagcctctga gccctcattg accagaactg ggttacatgg 14100ttgtcaccag ctgcaaggga tgctgggaag ctgagggaga ggagggccat ggttggctta 14160gatgaatgag gatgcagggc caccccgaag aaaattgggg ttctatcagc aaggagccag 14220gtggaatgga tatcggagag gtaaatagca tctgccagta aagaaggctg taagacactg 14280tatggggtga tcccatttgt gaagaaggat gtgtgatgcg cacaagtgtt taggaaaaac 14340actagaagaa ttagcgatgg tctctctggg aatggggatt gtgatacgtt tttctcatgc 14400tgcctctctg cctttcttct caagagaaac agcagacacc aaagaacagg tgtagccttc 14460tgttaagtgg tacagaggaa tcgccctgca gcctggcctc tgtcccctgt gctgacagca 14520ggtgcctggg ttttctgctt tgacaggttc ttgagggctg gtgtccgagg agaacttcta 14580atatttattt atactctgat tttgtttcac aaagaagaaa aaggctgggc gtggtggctc 14640atgtctgtcg tcccagcact ttgggaggcc gaggtggggt ggatcacttt gaggtcagga 14700gttcaagacc agcctggcca acatgatgaa acccccgtct ttactaaaaa tacaaaataa 14760ttagccaggc atagctcatg cctgtagtcc cagctactcg ggaggctgag gcaggagaat 14820tgcttgaacc caggaggcag aggttgcagt gagccaagat tgtgccactg ccctccagcc 14880tccagcaaga ctcagtatcc aaaaacaaag aaagaaagaa agggccctta tgaatcatct 14940tcaagttcct cccttccaag aacagagatg ctaggcgact tgcccagagg cacacagcca 15000gcatgtagca ggattcatgc ctgtgggagc tggggttggg ggatattgac ggctttagcg 15060gatcaaaaga gctggtgagt agggctatac aatctggggg tcatcctgtg agagagcccc 15120cagactgctc agttcttagg ggtccagtca tatgctgtct ttttgcccca gaggagaaat 15180gtctgaagta agacccctct ccagagacat cttgatggag accctcctgt atgagcagct 15240cctggaaccc ccgaccatgg aggttcttgg catgactgac tctgaagagg acctggaccc 15300tatggaggac ttcgattctt tggaatgcat ggagggcagg taggtcccca tggcctgccc 15360taccccctgc ctgatagtga cttcaggggt gggctggatg agcagacctt ctgtgagcgg 15420gggagcgcct gcagatgcct cccaggcagg gcctccgaga ggaagatttc ccggatgtgg 15480gcatggaggc ttctgccctg ggagcggctt cactttgctg ccccaccctc ccctgatacc 15540agctcacaga cccctggaca gccagcatgt tcacagtctc aagatggacc tggggcccct 15600ggctgtcaaa atggcacagt gtttgggcct cagggagcta gacaggccct tagcgacctg 15660ctgaggacat cagggcctct tgaaggaggt gactctgttg ccagaaaggg gacccgatcc 15720agatcccaag agagggttct tagatctcaa gcaagaaaga atttgggcca cacgcagtgg 15780  
            
ctcgcgcctg taatcccagc acttagggag gctgaggcag gcggatcact tgaggtcagg 15840agctcgagac cagcctggcc aacatggcaa aaccctgtct ctactaaaaa tacaaaaagt 15900agctgggcct ggtggcacat gtctgtagtc ccagctagtc gggaggctga ggcaaggaga 15960atctcttgaa cccaggaggc agaggttgca gtgacccaag gttgcaaaaa tgcactccag 16020cctgggcaac agagcgagac tccatctcaa aaaaagaaaa cctactctat aggcagagca 16080gcggcatggg ctgctcaact gaatatactt atagttattt cctgattaca tgctaaacaa 16140ggggtggatt attcatgagt ttccgggtaa ggggtgggca gttcccggaa ccgagaattc 16200ctcctccttt tagacaatat agggcaactt cctgacgttg ccgtggcatt tgtaaactgt 16260cgtggcactg gtgagtgact ccaacatgct aatatagttg gtgcacaatg aatagtgagg 16320atgactggag gtcacttttg tgcccatctt ggctttggtg ggctttggct ggcgtctttg 16380ccgaatcctg ttttatcagc agggtctttg taacctgtat cttatgctga tgtcctatct 16440catcctgtga cttagaattc ctagcctcct gggaatgcaa cccagtaggt ctcagccttt 16500tgttacccag cccctaatca agatggagtc gctctggttc aactgcctct gacggctctc 16560attttagaaa accagaaccg ggccgggcgc cgtggctcat gcctgtaatc ccagcacttt 16620gggaggctga ggtgggcgga tcacctgagg ttgggagttc gagactagcc tggccaacat 16680ggtgaaaccc aacctctact aaaaatacaa atgttaccca ggtatggggc cgggggtggg 16740gggatgggcg ctggtagtcc cagctactca ggaggctgag gcaggaaaat cacttgaacc 16800cgggacgtgg aggttgcagt gagccctgag attgcaccac tgcactccag cctgggtaac 16860agagtaagac tccgtttcac aaaaaaagag aaagagaaaa gaaagaaaga aaaaagaaag 16920aaaaccagaa cctatggaag agcctgagga ggccatgcag ttcctggtcc cggcttcaaa 16980gaatcactga ggcatgaaga agggatcttc cttggactga caaggaccct ggaggcagca 17040ggatttgcct ggggtttcag gggccaaggt ccagtaggac ctgacccttg cactctgcca 17100actgctccca gctatgtcca gcacacggca gcatacccag atgtccaggc acacccggcc 17160atcccagcgg caggaaggac ctgcactttt tttttttttt tttgagacag agtctctgtc 17220acccaggctg gagtgcagtg gcatgatctt ggctcactgc aacctccacc tcccgggttc 17280aagtgatttt cctgcctcag cctcctgagt agctgggagt gcaggcgtgc accagcatgc 17340ccggcttttt tttttttttt gagacggagt ctcgctgtgt cgcccaggct ggagtacagt 17400ggcatgatct ctgctcacca caagctccac ctccctggtt tacgccattc tcctgcctca 17460gcctcctgag tagctgggac tacaggcgcc tgccaccaca cctggctaat tttttgtatt 17520ttcagtagag acagggtttc atcatgttag ccaggatggt ctcgatctcc tgacctcgtg 17580atctgcctgc ctcggcctcc caaaaagtgc tgggattaca ggcgtgagcc accacacccg 17640gccaggactg gcactttcat tcttcccctg gtacagatga ggaacgtgaa ggcccaggag 17700cagctgacct cagtagtttc taccctgagc ctggaagaga atggtcaggc ctgacctggg 17760ctgttgcttt ctgctgggga atcctgtctc tgatgtggca cctcccacag gccagggacc 17820agctccatgt tccacaggat tcttttctgc tcaggatttt ttttttcagc ctcaggattt 17880ttagtcatta aggattttag aactggaggc acctgtccat taatggacaa ggttggagga 17940catgaagcct ggggcagtat tttcctgagg tttcccaggg taacagaagg taggaccaca 18000gcccccaacc ctgattgcca gcccacacct gtacccctcc cacccgcatc ccctccaagt 18060agggagtgta ggcccagggc attggcaggt caggtgggtg gggccagggc ccagggccgg 18120cctcagctca gggcccctag gagtcccact tccctgggag ttcccccggt gtagtcactg 18180ggatggaatg cacacaggtc cctggtagag gcccagacca gcaagctggg agggtgggga 18240gtgtcttagt ctttgtgtgg gagtgaatgc gggtggggtg taggatcaag gatgtggttt 18300agtggggggc ctactagggg cttcttagtc cccccattcg gagaggggtg gtgccagcag 18360ggctggtttc aggattggga ccaggacaca ggtcttagag ccccctcacc tcccacaaag 18420  
            
gaaggtaagc tgcaacccct gtgggaaggg ggctcaaggg ggctcagcca tccgggggac 18480tcagcaccac cagacctgtc cattcccctt ggtcagcctc agccatccgg gggctcagca 18540cccccagacc tgcctgttcc ccttgtccac catttccacc aaagcccaca ggtgggcctg 18600ccccaggatt ctttttgaaa tagcttgcac ctctggggcc acccacggat gggacctcat 18660gggtatctct gaatccaagt gggagccgga ggagggatac agggaggccc actcactgcc 18720tgccccaaat ctgacaccat ctcttatcct ctgggccact cccagctgca cacaatccgt 18780tggctgggtg ggtccaggtg catgtggcct ccacggcaca gccacacccg actcctgtgt 18840gtgctccctg cagtgacgca ttggccctgc ggctggcctg catcggggac gagatggacg 18900tgagcctcag ggccccgcgc ctggcccagc tctccgaggt ggccatgcac aggtagccgg 18960cctatgccct atgcctctac acctggggag gggccctggg cggtgggtgg aggccctgaa 19020cacagcacag ggctgggccc tgaggaagct ctgtggggga tgtgccttga cactctgggg 19080ctatactgaa acccttggct gcttcccgca cctctcctgg gagcccccag ctcctggcac 19140tcgccccctg ccacctgtcc ctggcattcc tgggcaacaa agcagagccc agggcccttt 19200tctctctcgc cgtcctcatt gagcccagat ggtacatttc caccgtggtc ttaagagggg 19260gtgctacgtg agctcggatc ctagatcctg ggggctgggc ctctcagcga gtctccggtg 19320ggggaataga gtgggcagtg gcttgtgagg gccctgtaga atgggggttt attttccacg 19380tggccagctc tggaagacag ggccaaacac ccggtgggct ggcgggcggc tggctggcgg 19440aggaagcagg aagttggaat gaatttgacc acaaacagtc cataccacgc ggcccctgca 19500ggtggaggcg cccacggaaa gggccccggg tggctgtggg gtgggagggc acaggcccct 19560gctccccaca gctgtgatgg tgtcatctaa gtacaggctg cccctacctg ctcctgcagt 19620aatggctttg tccccccatc ctctttgtct atagcctggg tctggctttc atctacgacc 19680agactgagga catcagggat gttcttagaa gtttcatgga cggtttcacc acacttaagg 19740agaacataat gaggttctgg agatccccga accccgggtc ctgggtaaga gccttgagat 19800ccctgaccct gacttgcgct gcggccagtg ggggctgtca gagccgctcc ttggggcgcc 19860acagtcccca ccactccgta tcatcatctg tgtcacctgt gtccacatct gcctgatccc 19920atgggctttt gggtttgaga tgcctggttc tgagtgcaca aaccagtgca tggtcctggg 19980tctccctctg gtccgagagc cttcacctgg caggcaggac tcccgtctcc tggccagggc 20040aggggcctcc ctgagcagcc ttcctggtag cctggtccca tggtgtccac tcggcaccgc 20100ccaccacaag ggcagctgac tgccctcacc tgtgcccacc gggtgtcttt gcctgtgtcc 20160cgcagactgg caggcccagg ccacgctggc ctctctggcc acgtcctcag ggccactttc 20220cccctctcct gaactccttc cttctctggt cccctcgagc tccttcccag tccccaccct 20280cctgggcttc cccttggcac tccgctgtca cccgtctggc cccattgctg gggcctgccc 20340cgagcctgac tcctctgctt tgctcccaca ggtgtcctgc gaacaggtgc tgctggcgct 20400gctgctgctg ctggcgctgc tgctgccgct gctcagcggg ggcctgcacc tgctgctcaa 20460gtgaggcccc ggcggctcag ggcggggctg gccccacccc catgaccact gccctggagg 20520tggcggcctg ctgctgttat ctttttaact gttttctcat gatgcctttt tatatttaaa 20580ccccgagata gtgctggaac actgctgagg ttttatactc aggttttttg tttttttttt 20640attccagttt tcgttttttc taaaagatga attcctatgg ctctgcaatt gtcaccggtt 20700aactgtggcc tgtgcccagg aagagccatt cactcctgcc cctgcccaca cggcaggtag 20760cagggggagt gctggtcaca cccctgtgtg atatgtgatg ccctcggcaa agaatctact 20820ggaatagatt ccgaggagca ggagtgctca ataaaatgtt ggtttccagc agtctctggt 20880cctctctggg gggttggcag caccagcacg ggcttcctct cgccccaggg aggcacactg 20940tgttggtggg gagggcaggg cctgtgtgct cctaatcaga tccttccctg caaaagggga 21000ccgcaaatgc tgccttggtt tggcccgacg gtttgccttc tcccttgtcc cggtctgtgg 21060  
            
cctaaaatcc actgttgggg gttatttcct ttgggctttc agttcctctt taggggatgc 21120ctgcctctcc ctgcacagac tcctcaccac agggatgcag ccgtggctcc gctcacaggg 21180agaggtgtgg tggggattgg ggagcaggac aaggggcacc aggggcagga gggccaggac 21240cctgctttgt acctttgtag gcttggtacc tgccctgggc cttggcctcg tgccatttgt 21300agaccccacc aggcctccct cccaggacat cggctctgtg tctgccctcc accccaaatg 21360tcaaagctgg gctgggccgg ccaccattct ccagccccca acccccctca tccccagagc 21420tgggagatgc agctgttcat acctcccagg ctggctgggc agaccctgca tcctgctcac 21480tcctccctcc atcctggcct ccaaaccaaa ggggacctcc aataggcttt cctgcctcct 21540tatgtcttct ctccggtctg 21560<210>6<211>963<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>6gacacgaagc ctcccgggtg gcttacagac gctgccagca tcgccgccgc cagaggagaa 60atgtctgaag taagacccct ctccagagac atcttgatgg agaccctcct gtatgagcag 120ctcctggaac ccccgaccat ggaggttctt ggcatgactg actctgaaga ggacctggac 180cctatggagg acttcgattc tttggaatgc atggagggca gtgacgcatt ggccctgcgg 240ctggcctgca tcggggacga gatggacgtg agcctcaggg ccccgcgcct ggcccagctc 300tccgaggtgg ccatgcacag cctgggtctg gctttcatct acgaccagac tgaggacatc 360agggatgttc ttagaagttt catggacggt ttcaccacac ttaaggagaa cataatgagg 420ttctggagat ccccgaaccc cgggtcctgg gtgtcctgcg aacaggtgct gctggcgctg 480ctgctgctgc tggcgctgct gctgccgctg ctcagcgggg gcctgcacct gctgctcaag 540tgaggccccg gcggctcagg gcggggctgg ccccaccccc atgaccactg ccctggaggt 600ggcggcctgc tgctgttatc tttttaactg ttttctcatg atgccttttt atatttaaac 660cccgagatag tgctggaaca ctgctgaggt tttatactca ggttttttgt ttttttttta 720ttccagtttt cgttttttct aaaagatgaa ttcctatggc tctgcaattg tcaccggtta 780actgtggcct gtgcccagga agagccattc actcctgccc ctgcccacac ggcaggtagc 840agggggagtg ctggtcacac ccctgtgtga tatgtgatgc cctcggcaaa gaatctactg 900gaatagattc cgaggagcag gagtgctcaa taaaatgttg gtttccagca aaaaaaaaaa 960aaa   963<210>7<211>160<212>PRT<213>人工序列  
            
<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的肽<400>7Met Ser Glu Val Arg Pro Leu Ser Arg Asp Ile Leu Met Glu Thr Leu1   5  10  15Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Glu Pro Pro Thr Met Glu Val Leu Gly Met20  25  30Asp Asp Ser Glu Glu Asp Leu Asp Pro Met Glu Asp Phe Asp Ser Leu35  40  45Glu Cys Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile50  55  60Gly Asp Glu Met Asp Val Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu Ala Gln Leu65  70  75  80Ser Glu Val Ala Met His Ser Leu Gly Leu Ala Phe Ile Tyr Asp Gln85  90  95Thr Glu Asp Ile Arg Asp Val Leu Arg Ser Phe Met Asp Gly Phe Thr100 105 110Thr Leu Lys Glu Asn Ile Met Arg Phe Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly115 120 125Ser Trp Val Ser Cys Glu Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu130 135 140Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys145 150 155 160<210>8<211>160<212>PRT<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的肽<400>8Met Ser Glu Val Arg Pro Leu Ser Arg Asp Ile Leu Met Glu Thr Leu1   5  10  15Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Glu Pro Pro Thr Met Glu Val Leu Gly Met20  25  30Thr Asp Asp Glu Glu Asp Leu Asp Pro Met Glu Asp Phe Asp Ser Leu35  40  45Glu Cys Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile50  55  60Gly Asp Glu Met Asp Val Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu Ala Gln Leu65  70  75  80Ser Glu Val Ala Met His Ser Leu Gly Leu Ala Phe Ile Tyr Asp Gln85  90  95Thr Glu Asp Ile Arg Asp Val Leu Arg Ser Phe Met Asp Gly Phe Thr100 105 110Thr Leu Lys Glu Asn Ile Met Arg Phe Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly115 120 125Ser Trp Val Ser Cys Glu Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu130 135 140Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys145 150 155 160<210>9<211>160<212>PRT<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的肽  
            
<400>9Met Ser Glu Val Arg Pro Leu Ser Arg Asp Ile Leu Met Glu Thr Leu1   5  10  15Leu Tyr Glu Gln Leu Leu Glu Pro Pro Thr Met Glu Val Leu Gly Met20  25  30Asp Asp Asp Glu Glu Asp Leu Asp Pro Met Glu Asp Phe Asp Ser Leu35  40  45Glu Cys Met Glu Gly Ser Asp Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile50  55  60Gly Asp Glu Met Asp Val Ser Leu Arg Ala Pro Arg Leu Ala Gln Leu65  70  75  80Ser Glu Val Ala Met His Ser Leu Gly Leu Ala Phe Ile Tyr Asp Gln85  90  95Thr Glu Asp Ile Arg Asp Val Leu Arg Ser Phe Met Asp Gly Phe Thr100 105 110Thr Leu Lys Glu Asn Ile Met Arg Phe Trp Arg Ser Pro Asn Pro Gly115 120 125Ser Trp Val Ser Cys Glu Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu130 135 140Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys145 150 155 160<210>10<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的肽  
            
<400>10Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp1   5  10<210>11<211>12<212>PRT<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>11Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val1   5 10<210>12<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的肽<400>12Ala Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val Ser1   5  10  15Leu Arg<210>13<211>18<212>PRT<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的肽<400>13Leu Ala Leu Arg Leu Ala Cys Ile Gly Asp Glu Met Asp Val Ser Leu  
            
15 10  15Arg Ala<210>14<211>27<212>PRT<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>14Glu Gln Val Leu Leu Ala Leu Leu Leu Leu Leu Ala Leu Leu Leu Pro1   5  10  15Leu Leu Ser Gly Gly Leu His Leu Leu Leu Lys20  25<210>15<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>15aggacccagg tacctatgtt caaaagtgcc tc32<210>16<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>16ccttgcctgc tgctttccac caagtgct 28  
            
<210>17<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>17caggttggga aaatggtcag ccctcctgaa a 31<210>18<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>18cgttctgagg cgggcaatca aatgacctat   30<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>19cccgctagcc taattttatt ttatttttaa ttc   33<210>20<211>36<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>20cccctcgagg tattttggaa aaatgtcctt atctag  36<210>21<211>31<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>21cgcacgcgta ggcatcagct ctctacaatt c31<210>22<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>22agcctcgagc aggatctgag ataagaacca cg   32<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>23acggcgctcg agtccatcag ttctcatc28<210>24<211>28  
            
<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>24ttacttaagc ttgtgtagga cgcctgtc28<210>25<211>452<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>25tacgggccag atatacgcgt tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta 60cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg 120gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc 180ccatagtaac gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa 240ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca 300atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta 360cttggcagta catctacgta ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt 420acatcaatgg gcgtggatag cggtttgact ca   452<210>26<211>180<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>26agacggtgag agcgagtcag ggattggctg gtctgcttcg ggcgggctaa aggaaggttc 60aagtggagct ctcctaaccg acgcgcgtct gtggagaagc ggcttggtcg ggggtggtct 120cgtggggtcc tgcctgttta gtcgctttca gggttcttga gccccttcac gaccgtcacc 180<210>27  
            
<211>231<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>27cggccgccag tgtgatggat atctgcagaa ttcgcccttg cgatctgtca gagcacctcg 60cgagcgtacg tgcctcagga agtgacgcac agcccccctg ggggccgggg gcggggccag 120gctataaacc gccggttagg ggccgccatc ccctcagagc gtcgggatat cgggtgaagg 180gcgaattcca gcacactggc ggccgttact agtggatccg agctcggtac c  231<210>28<211>1757<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>28ccttgcctgc tgctttccac caagtgctgg agagctggtg aattgctcac tcccggctca 60ttcctctaat gaccgaagcg tctcgcagat gcaacctgcc gtggaggagc agggagggag 120tgatttccag gtgtgggctt tttcagccat tcctaaaggc gacttgagtt cacctcactc 180actccagcat ttgtactcct gttgtggaaa aggcagtgag cacaagccaa gcccgctcca 240ccttcacccc gccccacctc ccccggccct ttcctgggcc agtcttaggg ccctgagtac 300agacagcctg gctacccgtt aaccattctc agcgtgtggc tgctttttac acacatgtgt 360acatatgcac ggacacacac acacacacag aggcttcccc agtactcctc tatataggaa 420cccgtcacca tcccagacat atgcagaaga aagcccaaac cggctgtgtg agacaggaac 480aattaacacg gtaacagatc cgataatgca gaccatcagg cctaaagaac acggagggac 540tgtgttctac ctccttatag aaaagcaatt agtgcctttt tagctttgga accatgcccg 600gtggtgtgtg tgtggacaga actgctggct ggttgttaag ttgctactaa acacagtgtt 660gtttctcgtg gtctctgccc ttgttaacta ggattgaggc acttttgaac ataggtacct 720gggtcctaag ggcgaattcc agcacactgg cggccgttac tagtggatcc gagctcggta 780ccaagctcca gctgggaata gagataggag gggacccagc tggatgcagt gggcagtggg 840ggtcatagag tcaagagggt acagaataca atggggtcct agtatcatgg tggaggtcag 900aaagagccct aaaagagagg gtcaaggtag gaggttagtg aaggtccacc tccaccctct 960ccaggacagg gacatcaggc cacaattaat ttctctgcag ttggtgagtg gtcatggtct 1020ctggagtccc cagcatccag agtgtccctg gtctagtggt cccccctttc tgagccacag 1080ccactttctc catcaaatga ggccagtaat acccatccca tagtgatgct gtgaggatga 1140gatgagcatc tgtaagtgct gaagataatc cctgacacat cccaagcatt cagcagtgca 1200agcatacact tacacggcac tccccagagc caggcatgtg ctggtgcctc atacacgtga 1260  
            
ccacatttga tcgtcacaat gaccctgtga gggagactgt gcaacagagg actgaccttg 1320ctcaaagacc tcaggcgttt cccctcagag cctgagaggt catctctttt tttttttttt 1380tttcctttct ttctttttct tttccatttc tttttctttg caagaggtca tctctaatgc 1440tttggaatat cctgccagat tagagtccct ttgttcacct gaaggtttgg gccacaccag 1500atagtctaac ggtgtgattt gtgctgaagg ttttgagcca cactatatca gctagatttc 1560tagagcggcc ggccgcaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt 1620gtgtgaatcg atagtactaa catacgctct ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact 1680agcaaaatag gctgtcccca gtgcaagtgc aggtgccaga acatttctct atcgataggt 1740accgagctca tttaggt1757<210>29<211>646<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>29aatcaacctc tggattacaa aatttgtgaa agattgactg gtattcttaa ctatgttgct 60ccttttacgc tatgtggata cgctgcttta atgcctttgt atcatgctat tgcttcccgt 120atggctttca ttttctcctc cttgtataaa tcctggttgc tgtctcttta tgaggagttg 180tggcccgttg tcaggcaacg tggcgtggtg tgcactgtgt ttgctgacgc aacccccact 240ggttggggca ttgccaccac ctgtcagctc ctttccggga ctttcgcttt ccccctccct 300attgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg 360ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc 420gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc 480aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt 540cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc ctttgggccg cctccccgcc tggaattcga 600gctcggtacg ggctcgacta gagtcggggc ggccggccgc ttcgag646<210>30<211>819<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>30ttatgtcaca ccacagaagt aaggttcctt cacaaagatc ccaagctgtc gatcgacatt 60tctagaggat ctcggacccg gggaatcccc gtcccccaac atgtccagat cgaaatcgtc 120  
            
tagcgcgtcg gcatgcgcca tcgccacgtc ctcgccgtct aagtggagct cgtcccccag 180gctgacatcg gtcggggggg cggatctcgg acccggggaa tccccgtccc ccaacatgtc 240cagatcgaaa tcgtctagcg cgtcggcatg cgccatcgcc acgtcctcgc cgtctaagtg 300gagctcgtcc cccaggctga catcggtcgg gggggcggat cccccgggct gcaggaattc 360cggcgataca gtcaactgtc tttgaccttt gttactactc tcttccgatg atgatgtcgc 420acttattcta tgctgtctca atgttagagg catatcagtc tccactgaag ccaatctatc 480tgtgacggca tctttattca cattatcttg tacaaataat cctgttaaca atgcttttat 540atcctgtaaa gaatccattt tcaaaatcat gtcaaggtct tctcgaggaa aaatcagtag 600aaatagctgt tccagtcttt ctagccttga ttccacttct gtcagatgtg ccctagtcag 660cggagacctt ttggttttgg gagagtagcg acactcccag ttgttcttca gacacttggc 720gcacttcggt ttttctttgg agcacttgag ctttttaagt cggcaaatat cgcatgcttg 780ttcgatagaa gacagtagct tcatctttca ggaggctag819<210>31<211>1352<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>31acagacattg acattgtgtc atctagtata caaataggtt cttggagtac tttactaggc 60atggacaatg cccaatgcct gtcccattct tcaggcatat ttttatttgt gggctttatg 120tccctattaa gaaaaagact aagaacaaga tgctatcata ttttcttaac tggaatggta 180gatgtttaaa catgatgact accaagcttg gctagaacat tgtgtcatct agtatacaaa 240taggttcttg gagtacttta ctaggcatgg acaatgccca atgcctgtcc cattcttcag 300gcatattttt atttgtgggc tttatgtccc tattaagaaa aagactaaga acaagatgct 360atcataagct ccaagcttat cgccagctgg gaatagagat aggaggggac ccagctggat 420gcagtgggca gtgggggtca tagagtcaag agggtacaga atacaatggg gtcctagtat 480catggtggag gtcagaaaga gccctaaaag agagggtcaa ggtaggaggt tagtgaaggt 540ccacctccac cctctccagg acagggacat caggccacaa ttaatttctc tgcagttggt 600gagtggtcat ggtctctgga gtccccagca tccagagtgt ccctggtcta gtggtccccc 660ctttctgagc cacagccact ttctccatca aatgaggcca gtaataccca tcccatagtg 720atgctgtgag gatgagatga gcatctgtaa gtgctgaaga taatccctga cacatcccaa 780gcattcagca gtgcaagcat acacttacac ggcactcccc agagccaggc atgtgctggt 840gcctcataca cgtgaccaca tttgatcgtc acaatgaccc tgtgagggag actgtgcaac 900agaggactga ccttgctcaa agacctcagg cgtttcccct cagagcctga gaggtcatct 960cttttttttt ttttttttcc tttctttctt tttcttttcc atttcttttt ctttgcaaga 1020ggtcatctct aatgctttgg aatatcctgc cagattagag tccctttgtt cacctgaagg 1080tttgggccac accagatagt ctaacggtgt gatttgtgct gaaggttttg agccacacta 1140tatcagctag atttctagag cggccggccg caataaaata tctttatttt cattacatct 1200gtgtgttggt tttttgtgtg aatcgatagt actaacatac gctctccatc aaaacaaaac 1260  
            
gaaacaaaac aaactagcaa aataggctgt ccccagtgca agtgcaggtg ccagaacatt 1320tctctatcga taggtaccga gctcatttag gt   1352<210>32<211>496<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>32ggccgcccca cgtgcgcagc aggacgcagc gctgcctgaa actcgcgccg cgaggagagg 60gcggggccgc ggaaaggaaa ggggggggct gggaggcccg gagggggctg ggccggggac 120ccgggagggg tcgggacggg gcggggtccg cgcggaggag gcggagctgg aaggtgaagg 180ggcaggacgg gtgcccgggt ccccagtccc tccgccacgt ggggagcgcg gtcctgggcg 240tctgtgcccg cgaatccact gggagcccgg cctggccccg acagcgcagc tgctccgggc 300ggacccgggg gtctgggccg cgcttccccg cccgcgcgcc gctcgcgctc ccagggtgca 360gggacgccag cgagggcccc agcggagaga ggtcgaatcg gcctaggctg tggggtaacc 420cgagggaggg gcctctagat ataagggcga attccagcac actggcggcc gttactagtg 480gatccgagct cggtac 496<210>33<211>857<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>33ttatgtcaca ccacagaagt aaggttcctt cacaaagatc ccaagctgtc gatcgacatt 60tctagaggat ctcggacccg gggaatcccc gtcccccaac atgtccagat cgaaatcgtc 120tagcgcgtcg gcatgcgcca tcgccacgtc ctcgccgtct aagtggagct cgtcccccag 180gctgacatcg gtcggggggg cggatctcgg acccggggaa tccccgtccc ccaacatgtc 240cagatcgaaa tcgtctagcg cgtcggcatg cgccatcgcc acgtcctcgc cgtctaagtg 300gagctcgtcc cccaggctga catcggtcgg gggggcggat cccccgggct gcaggaattc 360cggcgataca gtcaactgtc tttgaccttt gttactactc tcttccgatg atgatgtcgc 420acttattcta tgctgtctca atgttagagg catatcagtc tccactgaag ccaatctatc 480tgtgacggca tctttattca cattatcttg tacaaataat cctgttaaca atgcttttat 540atcctgtaaa gaatccattt tcaaaatcat gtcaaggtct tctcgaggaa aaatcagtag 600aaatagctgt tccagtcttt ctagccttga ttccacttct gtcagatgtg ccctagtcag 660  
            
cggagacctt ttggttttgg gagagtagcg acactcccag ttgttcttca gacacttggc 720gcacttcggt ttttctttgg agcacttgag ctttttaagt cggcaaatat cgcatgcttg 780ttcgatagaa gacagtagct tcatctttca ggaggctagg gccgccagtg tgatggatat 840ctgcagaatt cgccctt857<210>34<211>8512<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>34ggtacgggag gtacttggag cggccgcgat ccagacatga taagatacat tgatgagttt 60ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct 120attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt 180cattttatgt ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc 240tacaaatgtg gtatggctga ttatgatcat gaacagactg tgaggactga ggggcctgaa 300atgagccttg ggactgtgaa tttaaaatac acaaacaatt agaatcagta gtttaacaca 360ttatacactt aaaaatttta tatttacctt agagctttaa atctctgtag gtagtttgtc 420caattatgtc acaccacaga agtaaggttc cttcacaaag atcccaagct gtcgatcgac 480atttctagag gatctcggac ccggggaatc cccgtccccc aacatgtcca gatcgaaatc 540gtctagcgcg tcggcatgcg ccatcgccac gtcctcgccg tctaagtgga gctcgtcccc 600caggctgaca tcggtcgggg gggcggatct cggacccggg gaatccccgt cccccaacat 660gtccagatcg aaatcgtcta gcgcgtcggc atgcgccatc gccacgtcct cgccgtctaa 720gtggagctcg tcccccaggc tgacatcggt cgggggggcg gatcccccgg gctgcaggaa 780ttccggcgat acagtcaact gtctttgacc tttgttacta ctctcttccg atgatgatgt 840cgcacttatt ctatgctgtc tcaatgttag aggcatatca gtctccactg aagccaatct 900atctgtgacg gcatctttat tcacattatc ttgtacaaat aatcctgtta acaatgcttt 960tatatcctgt aaagaatcca ttttcaaaat catgtcaagg tcttctcgag gaaaaatcag 1020tagaaatagc tgttccagtc tttctagcct tgattccact tctgtcagat gtgccctagt 1080cagcggagac cttttggttt tgggagagta gcgacactcc cagttgttct tcagacactt 1140ggcgcacttc ggtttttctt tggagcactt gagcttttta agtcggcaaa tatcgcatgc 1200ttgttcgata gaagacagta gcttcatctt tcaggaggct agggccgcca gtgtgatgga 1260tatctgcaga attcgccctt ccttgcctgc tgctttccac caagtgctgg agagctggtg 1320aattgctcac tcccggctca ttcctctaat gaccgaagcg tctcgcagat gcaacctgcc 1380gtggaggagc agggagggag tgatttccag gtgtgggctt tttcagccat tcctaaaggc 1440gacttgagtt cacctcactc actccagcat ttgtactcct gttgtggaaa aggcagtgag 1500cacaagccaa gcccgctcca ccttcacccc gccccacctc ccccggccct ttcctgggcc 1560agtcttaggg ccctgagtac agacagcctg gctacccgtt aaccattctc agcgtgtggc 1620tgctttttac acacatgtgt acatatgcac ggacacacac acacacacag aggcttcccc 1680agtactcctc tatataggaa cccgtcacca tcccagacat atgcagaaga aagcccaaac 1740  
            
cggctgtgtg agacaggaac aattaacacg gtaacagatc cgataatgca gaccatcagg 1800cctaaagaac acggagggac tgtgttctac ctccttatag aaaagcaatt agtgcctttt 1860tagctttgga accatgcccg gtggtgtgtg tgtggacaga actgctggct ggttgttaag 1920ttgctactaa acacagtgtt gtttctcgtg gtctctgccc ttgttaacta ggattgaggc 1980acttttgaac ataggtacct gggtcctaag ggcgaattcc agcacactgg cggccgttac 2040tagtggatcc gagctcggta ccaagctcca gctgggaata gagataggag gggacccagc 2100tggatgcagt gggcagtggg ggtcatagag tcaagagggt acagaataca atggggtcct 2160agtatcatgg tggaggtcag aaagagccct aaaagagagg gtcaaggtag gaggttagtg 2220aaggtccacc tccaccctct ccaggacagg gacatcaggc cacaattaat ttctctgcag 2280ttggtgagtg gtcatggtct ctggagtccc cagcatccag agtgtccctg gtctagtggt 2340cccccctttc tgagccacag ccactttctc catcaaatga ggccagtaat acccatccca 2400tagtgatgct gtgaggatga gatgagcatc tgtaagtgct gaagataatc cctgacacat 2460cccaagcatt cagcagtgca agcatacact tacacggcac tccccagagc caggcatgtg 2520ctggtgcctc atacacgtga ccacatttga tcgtcacaat gaccctgtga gggagactgt 2580gcaacagagg actgaccttg ctcaaagacct caggcgttt cccctcagag cctgagaggt 2640catctctttt tttttttttt tttcctttct ttctttttct tttccatttc tttttctttg 2700caagaggtca tctctaatgc tttggaatat cctgccagat tagagtccct ttgttcacct 2760gaaggtttgg gccacaccag atagtctaac ggtgtgattt gtgctgaagg ttttgagcca 2820cactatatca gctagatttc tagagcggcc ggccgcaata aaatatcttt attttcatta 2880catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg atagtactaa catacgctct ccatcaaaac 2940aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag gctgtcccca gtgcaagtgc aggtgccaga 3000acatttctct atcgataggt accgagctca tttaggtgac actatagaat acaagcttgc 3060atgcctgcag gtccggagga cagtactccg ctcggaggac agtactccgc tcggaggaca 3120gtactccgct cggaggacag tactccgctc ggaggacagt actccgactc tagaggatcc 3180ccagtcctat atatactcgc tctgcacttg gccctttttt acactgtgac tgattgagct 3240ggtgccgtgt cgagtggtgt ctcgagatct gcgatctaag taagcttggc attccggtac 3300tgttggtaaa gccaccatgg aagacgccaa aaacataaag aaaggcccgg cgccattcta 3360tccgctggaa gatggaaccg ctggagagca actgcataag gctatgaaga gatacgccct 3420ggttcctgga acaattgctt ttacagatgc acatatcgag gtggacatca cttacgctga 3480gtacttcgaa atgtccgttc ggttggcaga agctatgaaa cgatatgggc tgaatacaaa 3540tcacagaatc gtcgtatgca gtgaaaactc tcttcaattc tttatgccgg tgttgggcgc 3600gttatttatc ggagttgcag ttgcgcccgc gaacgacatt tataatgaac gtgaattgct 3660caacagtatg ggcatttcgc agcctaccgt ggtgttcgtt tccaaaaagg ggttgcaaaa 3720aattttgaac gtgcaaaaaa agctcccaat catccaaaaa attattatca tggattctaa 3780aacggattac cagggatttc agtcgatgta cacgttcgtc acatctcatc tacctcccgg 3840ttttaatgaa tacgattttg tgccagagtc cttcgatagg gacaagacaa ttgcactgat 3900catgaactcc tctggatcta ctggtctgcc taaaggtgtc gctctgcctc atagaactgc 3960ctgcgtgaga ttctcgcatg ccagagatcc tatttttggc aatcaaatca ttccggatac 4020tgcgatttta agtgttgttc cattccatca cggttttgga atgtttacta cactcggata 4080tttgatatgt ggatttcgag tcgtcttaat gtatagattt gaagaagagc tgtttctgag 4140gagccttcag gattacaaga ttcaaagtgc gctgctggtg ccaaccctat tctccttctt 4200cgccaaaagc actctgattg acaaatacga tttatctaat ttacacgaaa ttgcttctgg 4260tggcgctccc ctctctaagg aagtcgggga agcggttgcc aagaggttcc atctgccagg 4320tatcaggcaa ggatatgggc tcactgagac tacatcagct attctgatta cacccgaggg 4380  
            
ggatgataaa ccgggcgcgg tcggtaaagt tgttccattt tttgaagcga aggttgtgga 4440tctggatacc gggaaaacgc tgggcgttaa tcaaagaggc gaactgtgtg tgagaggtcc 4500tatgattatg tccggttatg taaacaatcc ggaagcgacc aacgccttga ttgacaagga 4560tggatggcta cattctggag acatagctta ctgggacgaa gacgaacact tcttcatcgt 4620tgaccgcctg aagtctctga ttaagtacaa aggctatcag gtggctcccg ctgaattgga 4680atccatcttg ctccaacacc ccaacatctt cgacgcaggt gtcgcaggtc ttcccgacga 4740tgacgccggt gaacttcccg ccgccgttgt tgttttggag cacggaaaga cgatgacgga 4800aaaagagatc gtggattacg tcgccagtca agtaacaacc gcgaaaaagt tgcgcggagg 4860agttgtgttt gtggacgaag taccgaaagg tcttaccgga aaactcgacg caagaaaaat 4920cagagagatc ctcataaagg ccaagaaggg cggaaagatc gccgtgtaat tctaggtacc 4980gagctcttac gcgtgctagc cctcgacaat caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga 5040ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg 5100cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc 5160tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc 5220actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt 5280tccgggactt tcgctttccc cctccctatt gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt 5340gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg 5400aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg 5460tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg 5520ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt 5580tgggccgcct ccccgcctgg aattcgagct cggtacgggc tcgactagag tcggggcggc 5640cggccgcttc gagcagacat gataagatac attgatgagt ttggacaaac cacaactaga 5700atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc 5760attataagct gcaataaaca agttaacaac aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt 5820cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc aagtaaaacc tctacaaatg tggtaaaatc 5880gataaggatc cgtcgaccga tgcccttgag agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg 5940ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt 6000aggacaggtg ccggcagcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 6060ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta tccacagaat 6120caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 6180aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 6240atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 6300cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 6360ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca 6420gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 6480accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 6540cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 6600cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct 6660gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 6720aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 6780aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 6840actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 6900taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 6960gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 7020  
            
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 7080ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcgataa 7140accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 7200agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 7260acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 7320tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 7380cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 7440tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 7500ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 7560gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 7620tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 7680ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 7740gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 7800cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 7860gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 7920ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg 7980cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg 8040ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc 8100taaatcgggg gctcccttta gggttccgat ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa 8160aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc 8220ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata gtggactctt gttccaaact ggaacaacac 8280tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt tataagggat tttgccgatt tcggcctatt 8340ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt 8400ttacaatttc ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg 8460cctcttcgct attacgccag cccaagctac catgataagt aagtaatatt aa 8512<210>35<211>8565<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>35cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 60gccagcccaa gctaccatga taagtaagta atattaaggt acgggaggta cttggagcgg 120ccgcgatcca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca 180gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat 240aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg 300ggaggtgtgg gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta tggctgatta 360tgatcatgaa cagactgtga ggactgaggg gcctgaaatg agccttggga ctgtgaattt 420aaaatacaca aacaattaga atcagtagtt taacacatta tacacttaaa aattttatat 480  
            
ttaccttaga gctttaaatc tctgtaggta gtttgtccaa ttatgtcaca ccacagaagt 540aaggttcctt cacaaagatc ccaagctgtc gatcgacatt tctagaggat ctcggacccg 600gggaatcccc gtcccccaac atgtccagat cgaaatcgtc tagcgcgtcg gcatgcgcca 660tcgccacgtc ctcgccgtct aagtggagct cgtcccccag gctgacatcg gtcggggggg 720cggatctcgg acccggggaa tccccgtccc ccaacatgtc cagatcgaaa tcgtctagcg 780cgtcggcatg cgccatcgcc acgtcctcgc cgtctaagtg gagctcgtcc cccaggctga 840catcggtcgg gggggcggat cccccgggct gcaggaattc cggcgataca gtcaactgtc 900tttgaccttt gttactactc tcttccgatg atgatgtcgc acttattcta tgctgtctca 960atgttagagg catatcagtc tccactgaag ccaatctatc tgtgacggca tctttattca 1020cattatcttg tacaaataat cctgttaaca atgcttttat atcctgtaaa gaatccattt 1080tcaaaatcat gtcaaggtct tctcgaggaa aaatcagtag aaatagctgt tccagtcttt 1140ctagccttga ttccacttct gtcagatgtg ccctagtcag cggagacctt ttggttttgg 1200gagagtagcg acactcccag ttgttcttca gacacttggc gcacttcggt ttttctttgg 1260agcacttgag ctttttaagt cggcaaatat cgcatgcttg ttcgatagaa gacagtagct 1320tcatctttca ggaggctagg gccgccccac gtgcgcagca ggacgcagcg ctgcctgaaa 1380ctcgcgccgc gaggagaggg cggggccgcg gaaaggaaag gggggggctg ggaggcccgg 1440agggggctgg gccggggacc cgggaggggt cgggacgggg cggggtccgc gcggaggagg 1500cggagctgga aggtgaaggg gcaggacggg tgcccgggtc cccagtccct ccgccacgtg 1560gggagcgcgg tcctgggcgt ctgtgcccgc gaatccactg ggagcccggc ctggccccga 1620cagcgcagct gctccgggcg gacccggggg tctgggccgc gcttccccgc ccgcgcgccg 1680ctcgcgctcc cagggtgcag ggacgccagc gagggcccca gcggagagag gtcgaatcgg 1740cctaggctgt ggggtaaccc gagggagggg cctctagata taagggcgaa ttccagcaca 1800ctggcggccg ttactagtgg atccgagctc ggtacacaga cattgacatt gtgtcatcta 1860gtatacaaat aggttcttgg agtactttac taggcatgga caatgcccaa tgcctgtccc 1920attcttcagg catattttta tttgtgggct ttatgtccct attaagaaaa agactaagaa 1980caagatgcta tcatattttc ttaactggaa tggtagatgt ttaaacatga tgactaccaa 2040gcttggctag aacattgtgt catctagtat acaaataggt tcttggagta ctttactagg 2100catggacaat gcccaatgcc tgtcccattc ttcaggcata tttttatttg tgggctttat 2160gtccctatta agaaaaagac taagaacaag atgctatcat aagctccaag cttatcgcca 2220gctgggaata gagataggag gggacccagc tggatgcagt gggcagtggg ggtcatagag 2280tcaagagggt acagaataca atggggtcct agtatcatgg tggaggtcag aaagagccct 2340aaaagagagg gtcaaggtag gaggttagtg aaggtccacc tccaccctct ccaggacagg 2400gacatcaggc cacaattaat ttctctgcag ttggtgagtg gtcatggtct ctggagtccc 2460cagcatccag agtgtccctg gtctagtggt cccccctttc tgagccacag ccactttctc 2520catcaaatga ggccagtaat acccatccca tagtgatgct gtgaggatga gatgagcatc 2580tgtaagtgct gaagataatc cctgacacat cccaagcatt cagcagtgca agcatacact 2640tacacggcac tccccagagc caggcatgtg ctggtgcctc atacacgtga ccacatttga 2700tcgtcacaat gaccctgtga gggagactgt gcaacagagg actgaccttg ctcaaagacc 2760tcaggcgttt cccctcagag cctgagaggt catctctttt tttttttttt tttcctttct 2820ttctttttct tttccatttc tttttctttg caagaggtca tctctaatgc tttggaatat 2880cctgccagat tagagtccct ttgttcacct gaaggtttgg gccacaccag atagtctaac 2940ggtgtgattt gtgctgaagg ttttgagcca cactatatca gctagatttc tagagcggcc 3000ggccgcaata aaatatcttt attttcatta catctgtgtg ttggtttttt gtgtgaatcg 3060atagtactaa catacgctct ccatcaaaac aaaacgaaac aaaacaaact agcaaaatag 3120  
            
gctgtcccca gtgcaagtgc aggtgccaga acatttctct atcgataggt accgagctca 3180tttaggtgac actatagaat acaagcttgc atgcctgcag gtccggagga cagtactccg 3240ctcggaggac agtactccgc tcggaggaca gtactccgct cggaggacag tactccgctc 3300ggaggacagt actccgactc tagaggatcc ccagtcctat atatactcgc tctgcacttg 3360gccctttttt acactgtgac tgattgagct ggtgccgtgt cgagtggtgt ctcgagatct 3420gcgatctaag taagcttggc attccggtac tgttggtaaa gccaccatgg aagacgccaa 3480aaacataaag aaaggcccgg cgccattcta tccgctggaa gatggaaccg ctggagagca 3540actgcataag gctatgaaga gatacgccct ggttcctgga acaattgctt ttacagatgc 3600acatatcgag gtggacatca cttacgctga gtacttcgaa atgtccgttc ggttggcaga 3660agctatgaaa cgatatgggc tgaatacaaa tcacagaatc gtcgtatgca gtgaaaactc 3720tcttcaattc tttatgccgg tgttgggcgc gttatttatc ggagttgcag ttgcgcccgc 3780gaacgacatt tataatgaac gtgaattgct caacagtatg ggcatttcgc agcctaccgt 3840ggtgttcgtt tccaaaaagg ggttgcaaaa aattttgaac gtgcaaaaaa agctcccaat 3900catccaaaaa attattatca tggattctaa aacggattac cagggatttc agtcgatgta 3960cacgttcgtc acatctcatc tacctcccgg ttttaatgaa tacgattttg tgccagagtc 4020cttcgatagg gacaagacaa ttgcactgat catgaactcc tctggatcta ctggtctgcc 4080taaaggtgtc gctctgcctc atagaactgc ctgcgtgaga ttctcgcatg ccagagatcc 4140tatttttggc aatcaaatca ttccggatac tgcgatttta agtgttgttc cattccatca 4200cggttttgga atgtttacta cactcggata tttgatatgt ggatttcgag tcgtcttaat 4260gtatagattt gaagaagagc tgtttctgag gagccttcag gattacaaga ttcaaagtgc 4320gctgctggtg ccaaccctat tctccttctt cgccaaaagc actctgattg acaaatacga 4380tttatctaat ttacacgaaa ttgcttctgg tggcgctccc ctctctaagg aagtcgggga 4440agcggttgcc aagaggttcc atctgccagg tatcaggcaa ggatatgggc tcactgagac 4500tacatcagct attctgatta cacccgaggg ggatgataaa ccgggcgcgg tcggtaaagt 4560tgttccattt tttgaagcga aggttgtgga tctggatacc gggaaaacgc tgggcgttaa 4620tcaaagaggc gaactgtgtg tgagaggtcc tatgattatg tccggttatg taaacaatcc 4680ggaagcgacc aacgccttga ttgacaagga tggatggcta cattctggag acatagctta 4740ctgggacgaa gacgaacact tcttcatcgt tgaccgcctg aagtctctga ttaagtacaa 4800aggctatcag gtggctcccg ctgaattgga atccatcttg ctccaacacc ccaacatctt 4860cgacgcaggt gtcgcaggtc ttcccgacga tgacgccggt gaacttcccg ccgccgttgt 4920tgttttggag cacggaaaga cgatgacgga aaaagagatc gtggattacg tcgccagtca 4980agtaacaacc gcgaaaaagt tgcgcggagg agttgtgttt gtggacgaag taccgaaagg 5040tcttaccgga aaactcgacg caagaaaaat cagagagatc ctcataaagg ccaagaaggg 5100cggaaagatc gccgtgtaat tctaggtacc gagctcttac gcgtgctagc cctcgacaat 5160caacctctgg attacaaaat ttgtgaaaga ttgactggta ttcttaacta tgttgctcct 5220tttacgctat gtggatacgc tgctttaatg cctttgtatc atgctattgc ttcccgtatg 5280gctttcattt tctcctcctt gtataaatcc tggttgctgt ctctttatga ggagttgtgg 5340cccgttgtca ggcaacgtgg cgtggtgtgc actgtgtttg ctgacgcaac ccccactggt 5400tggggcattg ccaccacctg tcagctcctt tccgggactt tcgctttccc cctccctatt 5460gccacggcgg aactcatcgc cgcctgcctt gcccgctgct ggacaggggc tcggctgttg 5520ggcactgaca attccgtggt gttgtcgggg aagctgacgt cctttccatg gctgctcgcc 5580tgtgttgcca cctggattct gcgcgggacg tccttctgct acgtcccttc ggccctcaat 5640ccagcggacc ttccttcccg cggcctgctg ccggctctgc ggcctcttcc gcgtcttcgc 5700cttcgccctc agacgagtcg gatctccctt tgggccgcct ccccgcctgg aattcgagct 5760  
            
cggtacgggc tcgactagag tcggggcggc cggccgcttc gagcagacat gataagatac 5820attgatgagt ttggacaaac cacaactaga atgcagtgaa aaaaatgctt tatttgtgaa 5880atttgtgatg ctattgcttt atttgtaacc attataagct gcaataaaca agttaacaac 5940aacaattgca ttcattttat gtttcaggtt cagggggagg tgtgggaggt tttttaaagc 6000aagtaaaacc tctacaaatg tggtaaaatc gataaggatc cgtcgaccga tgcccttgag 6060agccttcaac ccagtcagct ccttccggtg ggcgcggggc atgactatcg tcgccgcact 6120tatgactgtc ttctttatca tgcaactcgt aggacaggtg ccggcagcgc tcttccgctt 6180cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact 6240caaaggcggt aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag 6300caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 6360ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 6420cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg 6480ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc 6540tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg 6600gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 6660ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga 6720ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg 6780gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 6840aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg 6900tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 6960ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 7020tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 7080aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 7140tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 7200ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 7260gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 7320gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 7380taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 7440tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 7500ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 7560tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 7620ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 7680tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 7740ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 7800aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 7860actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 7920aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 7980tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 8040aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 8100ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 8160ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 8220ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 8280ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 8340ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 8400  
            
gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 8460tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 8520ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc ccatt 8565<210>36<211>279<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>36gacactatag aatacaagct tgcatgcctg caggtccgga ggacagtact ccgctcggag 60gacagtactc cgctcggagg acagtactcc gctcggagga cagtactccg ctcggaggac 120agtactccga ctctagagga tccccagtcc tatatatact cgctctgcac ttggcccttt 180tttacactgt gactgattga gctggtgccg tgtcgagtgg tgtctcgaga tctgcgatct 240aagtaagctt ggcattccgg tactgttggt aaagccacc279<210>37<211>650<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>37gctagctacg ggccagatat acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat 60caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg 120taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 180atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 240ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 300acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 360ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 420ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcact cgagagacgg tgagagcgag 480tcagggattg gctggtctgc ttcgggcggg ctaaaggaag gttcaagtgg agctctccta 540accgacgcgc gtctgtggag aagcggcttg gtcgggggtg gtctcgtggg gtcctgcctg 600tttagtcgct ttcagggttc ttgagcccct tcacgaccgt caccaagctt650<210>38  
            
<211>701<212>DNA<213>人工序列<220>  
            
<223>人工序列的描述合成的引物<400>38gctagctacg ggccagatat acgcgttgac attgattatt gactagttat taatagtaat 60caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg 120taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt 180atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac 240ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg 300acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact 360ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt 420ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcact cgagcggccg ccagtgtgat 480ggatatctgc agaattcgcc cttgcgatct gtcagagcac ctcgcgagcg tacgtgcctc 540aggaagtgac gcacagcccc cctgggggcc gggggcgggg ccaggctata aaccgccggt 600taggggccgc catcccctca gagcgtcggg atatcgggtg aagggcgaat tccagcacac 660tggcggccgt tactagtgga tccgagctcg gtaccaagct t 70權利要求
            
1.一種突變型Bik多肽，該多肽包含抗細胞增殖活性，促凋亡活性，或這兩者。
            
2.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該多肽的抗細胞增殖活性，促凋亡活性，或這兩者，基本上與天然Bik多肽相同或更有效。
            
3.如權利要求1所述的多肽，其特征在于，該突變型Bik多肽包含至少一個氨基酸替代。
            
4.如權利要求3所述的多肽，其特征在于，所述替代阻止在導致未替代的Bik多肽磷酸化的條件下所述Bik多肽的磷酸化。
            
5.如權利要求4所述的多肽，其特征在于，所述氨基酸替代在Thr33，Ser35，或在Thr33和Ser35。
            
6.如權利要求5所述的多肽，其特征在于，所述替代是Thr33至Asp33的替代。
            
7.如權利要求5所述的多肽，其特征在于，所述替代是Ser35至Asp35的替代。
            
8.如權利要求5所述的多肽，其特征在于，所述替代是Thr33至Asp33的替代，Ser35至Asp35的替代，或兩者。
            
9.如權利要求1所述的多肽，進一步明確該多肽是藥學上可接受的賦形劑中的組合物，所述Bik多肽分散在該賦形劑中。
            
10.如權利要求1所述的多肽，進一步明確該多肽包含在藥學上可接受的賦形劑中。
            
11.如權利要求1所述的多肽，進一步明確該多肽包含在藥盒中合適的容器中。
            
12.一種方法，該方法包括給予細胞具有氨基酸替代的Bik多肽。
            
13.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述氨基酸替代在Thr33，Ser35，或在Thr33和Ser35。
            
14.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述替代是Thr33至Asp33的替代。
            
15.如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述替代是Ser35至Asp35的替代。
            
16.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述多肽還含有蛋白轉導結構域。
            
17.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述細胞包含在動物中。
            
18.如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述動物是人。
            
19.如權利要求18所述的方法，其特征在于，所述人患有增殖性細胞疾病。
            
20.如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述增殖性細胞疾病是癌癥。
            
21.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述癌癥是乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肉瘤、肺癌、腦癌、胰腺癌、肝癌、膀胱癌、胃腸道癌、白血病、淋巴瘤或骨髓瘤。
            
22.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述癌癥是雌激素受體陽性，是EGF受體過表達，是Her2/neu過表達，非Her-2/neu過表達，是Akt過表達，是雄性激素非依賴型，或是雄性激素依賴型。
            
23.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述癌癥是實體瘤，例如，肉瘤、肺、腦、胰腺、肝、膀胱、胃腸道癌，或血液癌，例如白血病，淋巴瘤或骨髓瘤。
            
24.如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述增殖性細胞疾病是再狹窄。
            
25.如權利要求12所述的方法，其特征在于，所述多肽包含在藥學上可接受的賦形劑中。
            
26.如權利要求25所述的方法，其特征在于，所述多肽與脂質復合。
            
27.如權利要求13所述的方法，其特征在于，給予所述細胞具有Thr33位氨基酸替代的Bik多肽包括給予所述個體編碼具有Thr33位氨基酸替代的Bik多肽的核酸。
            
28.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述核酸的表達受組織特異性控制序列調控。
            
29.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述核酸包含在質粒、反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關病毒載體、或脂質體中。
            
30.如權利要求27所述的方法，其特征在于，所述核酸分散在藥學上可接受的賦形劑中。
            
31.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述組織特異性控制序列是乳腺癌特異性控制序列。
            
32.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述組織特異性控制序列是前列腺癌特異性控制序列。
            
33.如權利要求28所述的方法，其特征在于，所述組織特異性控制序列是胰腺癌特異性控制序列。
            
34.如權利要求13所述的方法，其特征在于，給予細胞具有Ser35位氨基酸替代的Bik多肽包括給予所述個體編碼具有Ser35位氨基酸替代的Bik多肽的核酸。
            
35.如權利要求34所述的方法，其特征在于，所述核酸的表達受組織特異性控制序列調控。
            
36.如權利要求34所述的方法，其特征在于，所述核酸包含在質粒、反轉錄病毒載體、腺病毒載體、腺病毒相關病毒載體、或脂質體中。
            
37.如權利要求34所述的方法，其特征在于，所述核酸分散在藥學上可接受的賦形劑中。
            
38.如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述組織特異性控制序列是乳腺癌特異性控制序列。
            
39.如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述組織特異性控制序列是前列腺癌特異性控制序列。
            
40.如權利要求35所述的方法，其特征在于，所述組織特異性控制序列是胰腺癌特異性控制序列。
            
41.如權利要求12所述的方法，進一步明確該方法是阻止個體內細胞生長的方法。
            
42.如權利要求13所述的方法，進一步明確該方法包括在氨基酸33位、氨基酸35位、或這兩者修飾所述Bik多肽，其中，該修飾導致所述氨基酸不能被磷酸化。
            
43.一種抑制細胞增殖的方法，該方法包括使細胞與有效劑量的突變型Bik多肽相接觸以抑制細胞增殖。
            
44.如權利要求43所述的方法，其特征在于，所述突變型Bik多肽進一步明確為具有抗細胞增殖活性，促凋亡活性，或這兩者。
            
45.如權利要求44所述的方法，其特征在于，所述多肽的抗細胞增殖活性，促凋亡活性，或這兩者，基本上與天然Bik多肽相同或更有效。
            
46.如權利要求43所述的方法，其特征在于，所述突變型Bik含有氨基酸替代。
            
47.如權利要求46所述的方法，其特征在于，所述突變型Bik多肽中的替代阻止在導致未替代的Bik多肽磷酸化的條件下所述Bik多肽的磷酸化。
            
48.如權利要求47所述的方法，其特征在于，所述氨基酸替代在Thr33，Ser35，或在Thr33和Ser35。
            
49.如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述替代是Thr33至Asp33的替代。
            
50.如權利要求48所述的方法，其特征在于，所述替代是Ser35至Asp35的替代。
            
51.一種治療患有增殖性細胞疾病的個體的方法，該方法包括給予所述個體突變型Bik組合物的步驟。
            
52.如權利要求51所述的方法，其特征在于，所述突變型Bik多肽進一步明確為具有抗細胞增殖活性，促凋亡活性，或這兩者。
            
53.如權利要求51所述的方法，其特征在于，所述多肽的抗細胞增殖活性，促凋亡活性，或這兩者，基本上與天然Bik多肽相同或更有效。
            
54.如權利要求51所述的方法，其特征在于，所述突變型Bik含有氨基酸替代。
            
55.如權利要求54所述的方法，其特征在于，所述氨基酸替代在Thr33，Ser35，或在Thr33和Ser35。
            
56.如權利要求54所述的方法，其特征在于，所述突變型Bik多肽中的替代阻止在導致未替代的Bik多肽磷酸化的條件下所述Bik多肽的磷酸化。
            
57.如權利要求54所述的方法，其特征在于，所述替代是Thr33至Asp33的替代。
            
58.如權利要求54所述的方法，其特征在于，所述替代是Ser35至Asp35的替代。
            
59.一種治療患有癌癥的個體的方法，該方法包括使所述個體的至少一個癌細胞與治療有效劑量的多聚核苷酸相接觸，該多聚核苷酸編碼具有Thr33至Asp33的替代、Ser35至Asp35的替代、或這兩者的Bik多肽，其中所述多聚核苷酸包含在脂質體中。
            
60.如權利要求59所述的方法，其特征在于，所述編碼突變型Bik多肽的多聚核苷酸的表達受組織特異性控制序列調控。
            
61.如權利要求60所述的方法，其特征在于，所述組織特異性控制序列是乳腺癌特異性控制序列。
            
62.如權利要求60所述的方法，其特征在于，所述組織特異性控制序列是前列腺癌特異性控制序列。
            
63.如權利要求60所述的方法，其特征在于，所述組織特異性控制序列是胰腺癌特異性控制序列。
            
64.一種多聚核苷酸構建物，該構建物包含編碼突變型Bik多肽的核酸序列。
            
65.如權利要求64所述的多聚核苷酸，其特征在于，該構建物還含有操作性連接于所述編碼突變型Bik多肽的序列的組織特異性控制序列。
            
66.如權利要求65所述的多聚核苷酸，其特征在于，所述組織特異性控制序列包括乳腺癌特異性控制序列，前列腺癌特異性控制序列，或胰腺癌特異性控制序列。
            
67.如權利要求65所述的多聚核苷酸，其特征在于，所述組織特異性控制序列包括乳腺癌特異性控制序列。
            
68.如權利要求65所述的多聚核苷酸，其特征在于，所述組織特異性控制序列包括前列腺癌特異性控制序列。
            
69.如權利要求65所述的多聚核苷酸，其特征在于，所述組織特異性控制序列包括胰腺癌特異性控制序列。
            
70.如權利要求64所述的多聚核苷酸，其特征在于，所述突變型Bik多肽含有Thr33至Asp33的替代、Ser33至Asp35的替代、或這兩者。
            
71.如權利要求64所述的多聚核苷酸，該多聚核苷酸進一步明確為包含在脂質體中。
            
72.一種使腫瘤細胞對化療制劑敏感的方法，該方法包括向細胞遞送突變型Bik組合物。
            
73.如權利要求72所述的方法，其特征在于，使腫瘤細胞對化療制劑敏感進一步明確為增強所述細胞的化療制劑誘導的凋亡。
            
74.如權利要求72所述的方法，其特征在于，所述突變型Bik組合物進一步明確為突變型Bik多肽。
            
75.如權利要求72所述的方法，其特征在于，所述突變型Bik組合物進一步明確為編碼突變型Bik多肽的多聚核苷酸。
            
全文摘要
            
本發(fā)明涉及Bik的突變形式，這些突變形式具有抗細胞增殖和/或促凋亡活性。在具體實施方式
            
中，Bik多肽含有在Thr33位和Ser35位的替代，在有些實施方式中，抑制了這些位點的磷酸化。在更多具體的實施方式中，這些形式，尤其當與脂質體聯(lián)合給予時對癌癥治療是有用的。在給予突變型Bik多肽用于癌癥治療的實施方式中，該多肽可以以組織特異性方式調控。
            
文檔編號A61K38/17GK1771259SQ200480009298 
            
公開日2006年5月10日 申請日期2004年4月2日 優(yōu)先權日2003年4月2日
            
發(fā)明者M·-C·洪, Y·李, Y·聞 申請人:得克薩斯州大學系統(tǒng)董事會
            


                        
            
                        
            
                        
            
                            
                        
            

                        
                            
                    
            
                    
                    


                     
                        
                        
                    

                
            

                
                
            
                    
            
                        網友詢問留言
                        已有0條留言
                    
            
                    
            
                        
            
                            
                            
              

                                								

						

            • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊！
              • 


                            
            
                        
            
                        
            
                         1 
                    
            
                        
                        
            
                            
            
                              
                            
            
                            
                        
            
                    
            
                
            
            
            
            
            
                
                     
            
            
          
            
      
            
    
            
      

        

  
婷婷六月激情在线综合激情,亚洲国产大片,久久中文字幕综合婷婷,精品久久久久久中文字幕,亚洲一区二区三区高清不卡,99国产精品热久久久久久夜夜嗨
,欧美日韩亚洲综合在线一区二区,99国产精品电影,伊人精品线视天天综合,精品伊人久久久大香线蕉欧美

            

亚洲精品1区
国产成人一级
91精品国产欧美一区二区
亚洲精品乱码久久久久久下载
国产精品久久久久久久伊一
九色国产
国产精品九九视频
伊人久久成人爱综合网
欧美日韩亚洲区久久综合
欧美日本一道免费一区三区
夜夜爽一区二区三区精品
欧美日韩高清一区二区三区
国产成人av在线
国产精品对白交换绿帽视频
国产视频亚洲
国产在线欧美精品
国产精品综合网
国产日韩精品欧美一区色
国产日韩精品欧美一区喷
欧美日韩在线观看区一二
国产区精品
欧美视频日韩视频
中文字幕天天躁日日躁狠狠躁97
视频一二三区
欧美高清在线精品一区二区不卡
国产精品揄拍一区二区久久
99久久综合狠狠综合久久aⅴ
亚洲乱码视频在线观看
日韩在线第二页
亚洲精品无码专区在线播放
成人亚洲网站www在线观看
欧美三级一区二区
99久久精品免费看国产高清
91麻豆国产在线观看
最新日韩欧美不卡一二三区
成人在线观看不卡
日韩国产在线
在线亚洲精品
亚洲午夜久久久久中文字幕
国产精品成人久久久久久久
精品国产一区二区在线观看
欧美精品国产一区二区三区
中文在线播放
亚洲第一页在线视频
国产午夜精品福利久久
九色国产
精品国产九九
国产永久视频
久久精品人人做人人综合试看
国产一区二区三区免费观看
亚洲精品国产电影
9999热视频
国产精品资源在线
麻豆久久婷婷国产综合五月
国产精品免费一级在线观看
亚洲国产一区二区三区青草影视
中文在线播放
国产成人综合在线
国产在线观看色
国产亚洲三级
国产片一区二区三区
久久99精品久久久久久牛牛影视
亚洲欧美日韩国产
四虎永久免费网站
国产一毛片
国产精品视频在
九九热在线精品
99精品福利视频
色婷婷色99国产综合精品
97成人精品视频在线播放
精品久久久久久中文字幕
亚洲欧美一区二区三区孕妇
亚洲欧美成人网
日韩高清在线二区
国产尤物在线观看
在线不卡一区二区
91网站在线看
韩国精品福利一区二区
欧美日韩国产成人精品
99热精品久久
国产精品免费视频一区
高清视频一区
精品九九久久
欧美日韩在线观看免费
91欧美激情一区二区三区成人
99福利视频
亚洲国产精品91
久热国产在线
精品久久久久久中文字幕女
国产精品久久久久久久久99热
成人自拍视频网
国产精品视频久久久久久
久久影院国产
国产玖玖在线观看
99精品在线免费
亚洲欧美一区二区三区导航
久久久久久久综合
国产欧美日韩精品高清二区综合区
国产精品视频自拍
亚洲一级片免费
久久久久久九九
国产欧美自拍视频
视频一区二区在线观看
欧美日韩一区二区三区久久
中文在线亚洲
伊人热人久久中文字幕
日韩欧美亚洲国产一区二区三区
欧美亚洲国产成人高清在线
欧美日韩国产码高清综合人成
国产性大片免费播放网站
亚洲午夜综合网
91精品久久一区二区三区
国产无套在线播放
国产精品视频网站
国产成人亚洲精品老王
91在线网站
国产视频97
欧美黑人欧美精品刺激
国产一区二区三区免费在线视频
久久久国产精品免费看
99re6久精品国产首页
久久精品91
国产成人一级
国产成人精品曰本亚洲
日本福利在线观看
伊人成综合网
久久综合一本
国产综合久久久久久
久久精品成人免费看
久久福利
91精品国产91久久久久久麻豆
亚洲精品成人在线
亚洲伊人久久精品
欧美日本二区
国产永久视频
国产一区二
一区二区福利
国产一毛片
亚洲精品1区
毛片一区二区三区
伊人久久大香线蕉综合影
国产欧美在线观看一区
亚洲国产欧洲综合997久久
国产一区二区免费视频
国产91精品对白露脸全集观看
久久亚洲国产伦理
欧美成人伊人久久综合网
亚洲性久久久影院
久久99国产精一区二区三区!
91精品国产欧美一区二区
欧美日韩亚洲区久久综合
日韩精品一二三区
久久久夜色精品国产噜噜
国产在线精品福利91香蕉
久久久久久久亚洲精品
97se色综合一区二区二区
91国语精品自产拍在线观看性色
91久久国产综合精品女同我
日韩中文字幕a
国产成人亚洲日本精品
久久国产精品-国产精品
久久国产经典视频
久久国产精品伦理
亚洲第一页在线视频
国产精品久久久久三级
日韩毛片网
久久免费高清视频
麻豆国产在线观看一区二区
91麻豆国产福利在线观看
国产成人精品男人的天堂538
一区二区三区中文字幕
免费在线视频一区
欧美日韩国产成人精品
国产综合网站
国产资源免费观看
亚洲精品亚洲人成在线播放
精品久久久久久中文字幕专区
亚洲人成人毛片无遮挡
国产一起色一起爱
国产香蕉精品视频在
九九热免费观看
日韩亚洲欧美一区
九九热精品在线观看
精品久久久久久中文字幕专区
亚洲欧美自拍偷拍
国产精品每日更新
久久久久国产一级毛片高清板
久久天天躁狠狠躁夜夜中文字幕
久久精品片
日韩在线毛片
国产成人精品本亚洲
国产成人精品一区二区三区
九九热在线观看
国产r级在线观看
国产欧美日韩精品高清二区综合区
韩国电影一区二区
国产精品毛片va一区二区三区
五月婷婷伊人网
久久一区二区三区免费
一本色道久久综合狠狠躁篇
亚洲综合色站
国产尤物在线观看
亚洲一区亚洲二区
免费在线视频一区
欧洲精品视频在线观看
日韩中文字幕a
中文字幕日本在线mv视频精品
91精品在线免费视频
精品国产免费人成在线观看
精品a级片
中文字幕日本在线mv视频精品
日韩在线精品视频
婷婷丁香色
91精品国产高清久久久久
国产成人精品日本亚洲直接
五月综合视频
欧美日韩在线亚洲国产人
精液呈暗黄色
亚洲乱码一区
久久精品中文字幕不卡一二区
亚洲天堂精品在线
激情婷婷综合
国产免费久久精品久久久
国产精品亚洲二区在线
久久免费播放视频
五月婷婷丁香综合
在线亚洲欧美日韩
久久免费精品高清麻豆
精品久久久久久中文字幕
亚洲一区网站
国产精品福利社
日韩中文字幕免费
亚洲综合丝袜
91精品在线播放
国产精品18
亚洲日日夜夜
伊人久久大香线蕉综合影
亚洲精品中文字幕乱码影院
亚洲一区二区黄色
亚洲第一页在线视频
一区二区在线观看视频
国产成人福利精品视频
亚洲高清二区
国内成人免费视频
精品亚洲性xxx久久久
国产精品合集一区二区三区
97av免费视频
国产一起色一起爱
国产区久久
国产资源免费观看
99精品视频免费
国产成人一级
国产精品九九免费视频
欧美91精品久久久久网免费
99热国产免费
久久精品色
98精品国产综合久久
久久精品播放
中文字幕视频免费
国产欧美日韩一区二区三区在线
精品久久蜜桃
国产小视频精品
一本色道久久综合狠狠躁篇
91在线免费观看
亚洲精品区
伊人成综合网
伊人热人久久中文字幕
伊人黄色片
99国产精品热久久久久久夜夜嗨
久久免费精品视频
亚洲一区二区三区高清不卡
久久久久国产一级毛片高清板
国产片一区二区三区
久久狠狠干
99久久婷婷国产综合精品电影
国产99区
国产精品成人久久久久
久久狠狠干
青青国产在线观看
亚洲高清国产拍精品影院
国产精品一区二区av
九九热在线免费视频
伊人久久国产
国产精品久久久久久久久久一区
在线观看免费视频一区
国产精品自在在线午夜区app
国产精品综合色区在线观看
国产毛片久久久久久国产毛片
97国产免费全部免费观看
国产精品每日更新
国产尤物视频在线
九九视频这里只有精品99
一本一道久久a久久精品综合
久久综合给会久久狠狠狠
国产成人精品男人的天堂538
欧美一区二区高清
毛片一区二区三区
国产欧美日韩在线观看一区二区三区
在线国产二区
欧美不卡网
91在线精品中文字幕
在线国产福利
国内精品91久久久久
91亚洲福利
日韩欧美国产中文字幕
91久久精品国产性色也91久久
亚洲性久久久影院
欧美精品1区
国产热re99久久6国产精品
九九热免费观看
国产精品欧美日韩
久久久久国产一级毛片高清板
久久国产经典视频
日韩欧美亚洲国产一区二区三区
欧美亚洲综合另类在线观看
国产精品自在在线午夜区app
97中文字幕在线观看
视频一二三区
精品国产一区在线观看
国产欧美日韩在线一区二区不卡
欧美一区二三区
伊人成人在线观看
国内精品91久久久久
97在线亚洲
国产在线不卡一区
久久久全免费全集一级全黄片
国产精品v欧美精品∨日韩
亚洲毛片网站
在线不卡一区二区
99re热在线视频
久久激情网
国产毛片一区二区三区精品
久久亚洲综合色
中文字幕视频免费
国产视频亚洲
婷婷伊人久久
国产一区二区免费播放
久久99国产精品成人欧美
99国产在线视频
国产成人免费视频精品一区二区
国产不卡一区二区三区免费视
国产码欧美日韩高清综合一区
久久精品国产主播一区二区
国产一区电影
久久精品国产夜色
国产精品国产三级国产
日韩一区二区三区在线
久久97久久97精品免视看
久久国产免费一区二区三区
伊人久久大香线蕉综合电影网
99re6久精品国产首页
久久激情网
亚洲成人高清在线
国产精品网址
国产成人精品男人的天堂538
香蕉国产综合久久猫咪
国产专区中文字幕
91麻豆精品国产高清在线
久久国产经典视频
国产精品成人va在线观看
国产精品爱啪在线线免费观看
日本精品久久久久久久久免费
亚洲综合一区二区三区
久久五月网
精品国产网红福利在线观看
久久综合亚洲伊人色
亚洲国产精品久久久久久网站
在线日韩国产
99国产精品热久久久久久夜夜嗨
国产综合精品在线
国产区福利
精品亚洲综合久久中文字幕
国产制服丝袜在线
毛片在线播放网站
在线观看免费视频一区
国产精品久久久精品三级
亚洲国产电影在线观看
最新日韩欧美不卡一二三区
狠狠综合久久综合鬼色
日本精品1在线区
国产日韩一区二区三区在线播放
欧美日韩精品在线播放
亚洲欧美日韩国产一区二区三区精品
久久综合久久网
婷婷六月激情在线综合激情
亚洲乱码一区
国产专区91
97av视频在线观看
精品久久久久久中文字幕
久久五月视频
国产成人福利精品视频
国产精品网址
中文字幕视频在线
精品一区二区三区免费视频
伊人手机在线视频
亚洲精品中文字幕乱码
国产在线视频www色
色噜噜国产精品视频一区二区
精品亚洲成a人在线观看
国产香蕉尹人综合在线
成人免费一区二区三区在线观看
国产不卡一区二区三区免费视
欧美精品久久天天躁
国产专区中文字幕
久久精品国产免费中文
久久精品国产免费一区
久久无码精品一区二区三区
国产欧美另类久久久精品免费
欧美精品久久天天躁
亚洲精品在线视频
国产视频91在线
91精品福利一区二区三区野战
日韩中文字幕免费
国产精品99一区二区三区
欧美成人高清性色生活
国产精品系列在线观看
亚洲国产福利精品一区二区
国产成人在线小视频
国产精品久久久久免费
99re热在线视频
久久久久久久综合
一区二区国产在线播放
成人国产在线视频
亚洲精品乱码久久久久
欧美日韩一区二区综合
精品久久久久免费极品大片
中文字幕视频二区
激情粉嫩精品国产尤物
国产成人精品一区二区视频
久久精品中文字幕首页
亚洲高清在线
国产精品亚洲一区二区三区
伊人久久艹
中文在线亚洲
国产精品一区二区在线播放
国产精品九九免费视频
亚洲二区在线播放
亚洲狠狠婷婷综合久久久久网站
亚洲欧美日韩网站
日韩成人精品
亚洲国产一区二区三区青草影视
91精品国产福利在线观看
国产精品久久久久久久久99热
国产一区二区精品尤物
久碰香蕉精品视频在线观看
亚洲日日夜夜
在线不卡一区二区
国产午夜亚洲精品
九九热在线视频观看这里只有精品
伊人手机在线视频
91免费国产精品
日韩欧美中字
91精品国产91久久久久
国产全黄三级播放
视频一区二区三区免费观看
国产开裆丝袜高跟在线观看
国产成人欧美
激情综合丝袜美女一区二区
国产成人亚洲综合无
欧美精品一区二区三区免费观看
欧美亚洲国产日韩
日韩亚州
国产欧美日韩精品高清二区综合区
亚洲午夜国产片在线观看
精品久久久久久中文字幕
欧美精品1区
久久伊人久久亚洲综合
亚洲欧美日韩精品
国产成人精品久久亚洲高清不卡
久久福利影视
国产精品99精品久久免费
久久久久免费精品视频
国产日产亚洲精品
亚洲国产午夜电影在线入口
精品无码一区在线观看
午夜国产精品视频
亚洲一级片免费
伊人久久大香线蕉综合影
国产精品久久影院
久碰香蕉精品视频在线观看
www.欧美精品
在线小视频国产
亚洲国产天堂久久综合图区
欧美一区二区三区不卡
日韩美女福利视频
九九精品免视频国产成人
不卡国产00高中生在线视频
亚洲第一页在线视频
欧美日韩在线播放成人
99re视频这里只有精品
国产精品91在线
精品乱码一区二区三区在线
国产区久久
91麻豆精品国产自产在线观看一区
日韩精品成人在线
九九热在线观看
国产精品久久不卡日韩美女
欧美一区二区三区综合色视频
欧美精品免费一区欧美久久优播
国产精品网址
国产专区中文字幕
国产精品欧美亚洲韩国日本久久
日韩美香港a一级毛片
久久精品123
欧美一区二区三区免费看
99r在线视频
亚洲精品国产字幕久久vr
国产综合激情在线亚洲第一页
91免费国产精品
日韩免费小视频
亚洲国产精品综合一区在线
国产亚洲第一伦理第一区
在线亚洲精品
国产精品一区二区制服丝袜
国产在线成人精品
九九精品免视频国产成人
亚洲国产网
欧美日韩亚洲一区二区三区在线观看
在线亚洲精品
欧美一区二区三区高清视频
国产成人精品男人的天堂538
欧美日韩在线观看区一二
亚洲欧美一区二区久久
久久精品中文字幕首页
日本高清www午夜视频
久久精品国产免费
久久999精品
亚洲国产精品欧美综合
88国产精品视频一区二区三区
91久久偷偷做嫩草影院免费看
国产精品夜色视频一区二区
欧美日韩导航
国产成人啪精品午夜在线播放
一区二区视频在线免费观看
99久久精品国产自免费
精液呈暗黄色
久久99国产精品
日本精品久久久久久久久免费
精品国产97在线观看
99re视频这里只有精品
国产视频91在线
999av视频
亚洲美女视频一区二区三区
久久97久久97精品免视看
亚洲国产成人久久三区
99久久亚洲国产高清观看
日韩毛片在线视频
综合激情在线
91福利一区二区在线观看
一区二区视频在线免费观看
激情粉嫩精品国产尤物
国产成人精品曰本亚洲78
国产成人精品本亚洲
国产精品成人免费视频
国产成人啪精品视频免费软件
久久精品国产亚洲妲己影院
国产精品成人久久久久久久
久久大香线蕉综合爱
欧美一区二区三区高清视频
99热国产免费
在线观看欧美国产
91精品视频在线播放
国产精品福利社
欧美精品一区二区三区免费观看
国产一区二区免费视频
国产午夜精品一区二区
精品视频在线观看97
91精品福利久久久
国产一区福利
国产综合激情在线亚洲第一页
国产精品久久久久久久久久久不卡
九色国产
在线日韩国产
黄网在线观看
亚洲一区小说区中文字幕
中文字幕丝袜
日本二区在线观看
日本国产一区在线观看
欧美日韩一区二区三区久久
欧美精品亚洲精品日韩专
国产日产亚洲精品
久久综合九色综合欧美播
亚洲国产欧美无圣光一区
欧美视频区
亚洲乱码视频在线观看
久久无码精品一区二区三区
九九热精品免费视频
久久99精品久久久久久牛牛影视
国产精品成久久久久三级
国产一区福利
午夜国产精品视频
日本二区在线观看
99久久网站
国产亚洲天堂
精品国产一区二区三区不卡
亚洲国产日韩在线一区
国产成人综合在线观看网站
久久免费高清视频
欧美在线导航
午夜精品久久久久久99热7777
欧美久久综合网
国产小视频精品
国产尤物在线观看
亚洲国产精品综合一区在线
欧美一区二区三区不卡视频
欧美黑人欧美精品刺激
日本福利在线观看
久久国产偷
国产手机精品一区二区
国产热re99久久6国产精品
国产高清啪啪
欧美亚洲国产成人高清在线
国产在线第三页
亚洲综合一区二区三区
99r在线视频
99精品久久久久久久婷婷
国产精品乱码免费一区二区
国产在线精品福利91香蕉
国产尤物视频在线
五月婷婷亚洲
中文字幕久久综合伊人
亚洲精品一级毛片
99国产精品电影
在线视频第一页
久久99国产精品成人欧美
国产白白视频在线观看2
成人精品一区二区www
亚洲成人网在线观看
麻豆91在线视频
色综合合久久天天综合绕视看
久久精品国产免费高清
国产不卡一区二区三区免费视
欧美国产中文
99精品欧美
九九在线精品
国产中文字幕在线免费观看
国产一区中文字幕在线观看
国产成人一级
国产精品一区二区制服丝袜
国产一起色一起爱
亚洲精品成人在线
亚洲欧美精品在线
国产欧美自拍视频
99精品久久久久久久婷婷
久99视频
国产热re99久久6国产精品
视频一区亚洲
国产精品视频分类
国产精品成在线观看
99re6久精品国产首页
亚洲在成人网在线看
亚洲国产日韩在线一区
久久国产三级
日韩国产欧美
欧美在线一区二区三区
国产精品美女一级在线观看
成人午夜免费福利视频
亚洲天堂精品在线
91精品国产手机
欧美日韩视频在线播放
狠狠综合久久综合鬼色
九一色视频
青青视频国产
亚洲欧美自拍一区
中文字幕天天躁日日躁狠狠躁97
日韩免费大片
996热视频
伊人成综合网
亚洲天堂欧美
日韩精品亚洲人成在线观看
久久综合给会久久狠狠狠
日韩精品亚洲人成在线观看
日韩国产欧美
亚洲成aⅴ人片在线影院八
亚洲精品1区
99久久精品免费
国产精品高清在线观看
国产精品久久久免费视频
在线亚洲欧美日韩
91在线看视频
国产精品96久久久久久久
欧美日韩国产成人精品
91在线亚洲
热久久亚洲
国产精品美女免费视频观看
日韩在线毛片
亚洲永久免费视频
九九免费在线视频
亚洲一区网站
日本高清二区视频久二区
精品国产美女福利在线
伊人久久艹
国产精品久久久久三级
欧美成人精品第一区二区三区
99久久精品国产自免费
在线观看日韩一区
国产中文字幕一区
成人免费午夜视频
欧美日韩另类在线
久久99国产精品成人欧美
色婷婷中文网
久久天天躁夜夜躁狠狠躁2020
欧美成人伊人久久综合网
国产精品福利资源在线
国产伦精品一区二区三区高清
国产精品亚洲综合色区韩国
亚洲一区欧美日韩
色综合视频
国语自产精品视频在线区
国产高清a
成人国内精品久久久久影
国产在线精品香蕉综合网一区
国产不卡在线看
国产成人精品精品欧美
国产欧美日韩综合精品一区二区三区
韩国电影一区二区
国产在线视频www色
91中文字幕在线一区
国产人成午夜免视频网站
亚洲综合一区二区三区
色综合视频一区二区观看
久久五月网
九九热精品在线观看
国产一区二区三区国产精品
99久热re在线精品996热视频
亚洲国产网
在线视频亚洲一区
日韩字幕一中文在线综合
国产高清一级毛片在线不卡
精品国产色在线
国产高清视频一区二区
精品日本久久久久久久久久
亚洲国产午夜精品乱码
成人免费国产gav视频在线
日韩欧美一区二区在线观看
欧美曰批人成在线观看
韩国电影一区二区
99re这里只有精品6
日韩精品一区二区三区视频
99re6久精品国产首页
亚洲欧美一区二区三区导航
欧美色图一区二区三区
午夜精品视频在线观看
欧美激情在线观看一区二区三区
亚洲热在线
成人国产精品一区二区网站
亚洲一级毛片在线播放
亚洲一区小说区中文字幕
亚洲午夜久久久久影院
国产自产v一区二区三区c
国产精品视频免费
久久调教视频
国产成人91激情在线播放
国产精品欧美亚洲韩国日本久久
久久亚洲日本不卡一区二区
91中文字幕网
成人国产在线视频
国产视频91在线
欧美成人精品第一区二区三区
国产精品福利在线
久久综合九色综合精品
欧美一区二区三区精品
久久国产综合尤物免费观看
久久99青青久久99久久
日韩精品免费
久久国产精品999
91亚洲视频在线观看
国产精品igao视频
色综合区
在线亚洲欧国产精品专区
国产一区二区三区在线观看视频
亚洲精品成人在线
一区二区国产在线播放
中文在线亚洲
亚洲精品第一国产综合野
国产一区二区精品久久
一区二区三区四区精品视频
99热精品久久
中文字幕视频二区
国产成人精品男人的天堂538
99精品影视
美女福利视频一区二区
久久午夜夜伦伦鲁鲁片
综合久久久久久久综合网
国产精品国产欧美综合一区
国产99视频在线观看
国产亚洲女在线精品
婷婷影院在线综合免费视频
国产亚洲3p一区二区三区
91成人爽a毛片一区二区
亚洲一区二区高清
国产欧美亚洲精品第二区首页
欧美日韩导航
亚洲高清二区
欧美激情观看一区二区久久
日韩毛片在线播放
亚洲欧美日韩高清中文在线
亚洲日本在线播放
国产精品一区二区制服丝袜
精品国产一区二区三区不卡
国产不卡在线看
国产欧美网站
四虎永久在线观看视频精品
国产黄色片在线观看
夜夜综合
一本色道久久综合狠狠躁篇
欧美亚洲综合另类在线观看
国产91在线看
伊人久久国产
欧美一区二区在线观看免费网站
国产精品久久久久三级
久久福利
日韩中文字幕a
亚洲午夜久久久久影院
91在线高清视频
国产亚洲一区二区三区啪
久久人精品
国产精品亚洲午夜一区二区三区
综合久久久久久
久久伊人一区二区三区四区
国产综合久久久久久
日韩一区精品视频在线看
国产精品日韩欧美制服
日本精品1在线区
99re视频
无码av免费一区二区三区试看
国产视频1区
日韩欧美中文字幕一区
日本高清中文字幕一区二区三区a
亚洲国产欧美无圣光一区
国产在线视频一区二区三区
欧美国产第一页
在线亚洲欧美日韩
日韩中文字幕第一页
在线不卡一区二区
伊人久久青青
国产精品一区二区在线播放
www.五月婷婷
麻豆久久婷婷国产综合五月
亚洲精品区
久久国产欧美另类久久久
99在线视频免费
伊人久久中文字幕久久cm
久久精品成人免费看
久久这里只有精品首页
88国产精品视频一区二区三区
中文字幕日本在线mv视频精品
国产在线精品成人一区二区三区
伊人精品线视天天综合
亚洲一区二区黄色
国产尤物视频在线
亚洲精品99久久久久中文字幕
国产一区二区三区免费观看
伊人久久大香线蕉综合电影网
国产成人精品区在线观看
日本精品一区二区三区视频
日韩高清在线二区
久久免费播放视频
一区二区成人国产精品
国产精品免费精品自在线观看
亚洲精品视频二区
麻豆国产精品有码在线观看
精品日本一区二区
亚洲欧洲久久
久久中文字幕综合婷婷
中文字幕视频在线
国产成人精品综合在线观看
91精品国产91久久久久福利
精液呈暗黄色
香蕉国产综合久久猫咪
国产专区精品
亚洲精品无码不卡
国产永久视频
亚洲成a人片在线播放观看国产
一区二区国产在线播放
亚洲一区二区黄色
欧美日韩在线观看视频
亚洲精品另类
久久国产综合尤物免费观看
国产一区二区三区国产精品
高清视频一区
国产精品igao视频
国产精品资源在线
久久综合精品国产一区二区三区
www.五月婷婷
精品色综合
99热国产免费
麻豆福利影院
亚洲伊人久久大香线蕉苏妲己
久久电影院久久国产
久久精品伊人
在线日韩理论午夜中文电影
亚洲国产欧洲综合997久久
伊人国产精品
久草国产精品
欧美一区精品二区三区
亚洲成人高清在线
91免费国产精品
日韩精品福利在线
国产一线在线观看
国产不卡在线看
久久99青青久久99久久
亚洲精品亚洲人成在线播放
99久久免费看国产精品
国产日本在线观看
青草国产在线视频
麻豆久久婷婷国产综合五月
国产中文字幕一区
91久久精品国产性色也91久久
国产一区a
国产欧美日韩成人
国产亚洲女在线精品
一区二区美女
中文字幕在线2021一区
在线小视频国产
久久这里只有精品首页
国产在线第三页
欧美日韩中文字幕
在线亚洲+欧美+日本专区
精品国产一区二区三区不卡
久久这里精品
欧美在线va在线播放
精液呈暗黄色
91精品国产手机
91在线免费播放
欧美视频亚洲色图
欧美国产日韩精品
日韩高清不卡在线
精品视频免费观看
欧美日韩一区二区三区四区
国产欧美亚洲精品第二区首页
亚洲韩精品欧美一区二区三区
国产精品视频免费
在线精品小视频
久久午夜夜伦伦鲁鲁片
国产无套在线播放
久热这里只精品99re8久
欧美久久久久
久久香蕉国产线看观看精品蕉
国产成人精品男人的天堂538
亚洲人成网站色7799在线观看
日韩在线第二页
一本色道久久综合狠狠躁篇
国产一区二区三区不卡在线观看
亚洲乱码在线
在线观看欧美国产
久久福利青草精品资源站免费
国产玖玖在线观看
在线亚洲精品
亚洲成aⅴ人在线观看
精品91在线
欧美一区二三区
日韩中文字幕视频在线
日本成人一区二区
日韩免费专区
国内精品在线观看视频
久久国产综合尤物免费观看
国产精品系列在线观看
一本一道久久a久久精品综合
亚洲免费播放
久久精品国产免费
久久人精品
亚洲毛片网站
亚洲成a人一区二区三区
韩国福利一区二区三区高清视频
亚洲精品天堂在线
一区二区三区中文字幕
亚洲国产色婷婷精品综合在线观看
亚洲国产成人久久笫一页
999国产视频
国产精品香港三级在线电影
欧美日韩一区二区三区四区
日韩国产欧美
国产精品99一区二区三区
午夜国产精品理论片久久影院
亚洲精品中文字幕麻豆
亚洲国产高清视频
久久免费手机视频
日韩a在线观看
五月婷婷亚洲
亚洲精品中文字幕麻豆
中文字幕丝袜
www国产精品
亚洲天堂精品在线
亚洲乱码一区
国产日韩欧美三级
久久999精品
伊人热人久久中文字幕
久热国产在线视频
国产欧美日韩在线观看一区二区三区
国产一二三区在线
日韩国产欧美
91精品国产91久久久久
亚洲一区小说区中文字幕
精品一区二区免费视频
国产精品视频免费
国产精品亚洲综合色区韩国
亚洲国产精品成人午夜在线观看
欧美国产日韩精品
中文字幕精品一区二区精品


            
亚洲精品国产第七页在线|
午夜免费视频网站|
日韩欧美视频一区二区在线观看|
中文字幕乱视频|
亚洲一区二区观看|
亚洲免费高清视频|
久久99免费|
亚洲欧美日韩一级特黄在线|
97在线|亚洲|
日韩福利视频|
亚洲日韩第一页|
国产a高清|
91久久夜色精品国产网站|
伊人手机在线视频|
男人天堂久久|
国产天堂在线观看|
精品国产高清a毛片无毒不卡|
国产香蕉在线精彩视频|
国产成人资源|
欧美不卡二区|
国产香蕉精品视频|
久久乐国产综合亚洲精品|
日韩三级一区二区三区|
国内精品视频免费观看
|
亚洲热综合|
久久成年人电影|
亚洲国产精品综合久久20|
福利国产在线|
一级女人18毛片免费|
91在线播放国产|
精品国产区一区二区三区在线观看|
高清国产精品久久|
中文字幕亚洲欧美|
国产日韩欧美91|
午夜性色一区二区三区不卡视频|
成人亚洲视频|
六月婷婷导航福利在线|
99色精品|
天堂网在线网站成人午夜网站|
久久综合色网|
天天狠狠操|
在线播放一区|
久久婷五月|
精品999久久久久久中文字幕|
国产2021久久精品|
国产福利91精品一区二区三区|
91精品一区二区|
精品日韩二区三区精品视频|
日本一区欧美|
伊人网99|
99久久国语露脸精品国产|
久久久久久国产精品mv|
久久精品国产欧美成人|
久青草国产手机视频免费观看|
韩国精品一区二区|
国产成人精品免费大全|
久久久久综合网|
午夜怡红院|
精品欧美一区二区三区在线|
亚洲欧洲精品国产二码|
久久久精品波多野结衣|
国产日韩欧美亚洲综合|
亚洲成a人v欧美综合天堂下载|
欧美久久网|
色婷婷中文字幕在线一区天堂|
国产精品99精品久久免费|
精品久久一区|
亚洲日韩在线视频|
亚洲伊人成人网|
国产在线91精品|
日韩欧美一二区|
国产视频久久久|
国产成人免费网站|
亚洲欧洲第一页|
久久免费看视频|
成人久久精品|
色婷婷香蕉|
日本高清视频一区二区三区|
奇米一区二区三区四区久久|
狠狠色很很在鲁视频|
国内精品久久久久香蕉|
国产精品久久毛片完整版|
亚洲精品成人av在线|
精品国产1000部91麻豆|
国产原创在线观看|
91精品在线免费视频|
精品区在线观看|
成人精品一区二区三区中文字幕|
国产v亚洲v天堂a无|
91福利区|
成人毛片在线播放|
一区二区三区亚洲区|
亚洲国产夜色在线观看|
福利一区二区在线|
51国产偷自视频区视频|
精品日韩一区二区三区|
国产欧美在线一区二区三区|
国产视频二区|
91av手机在线观看|
天天综合网天天综合色|
日本成人不卡视频|
精品国产综合区久久久久久|
国产精品色|
久久久午夜|
日本a在线观看|
国产精品免费看久久久久|
国产男靠女免费视频网站|
久久99国产精品一区二区|
亚洲制服无码|
色偷偷91久久综合噜噜噜|
精品亚洲欧美无人区乱码|
国产亚洲综合|
2021国产精品久久久久|
99久久www免费|
亚洲国产日韩在线人高清磁力|
伊人色强在线网|
日韩精品在线一区|
日韩精品999|
www.综合色|
久久福利一区二区三区|
久久综合九色综合桃花|
亚洲人在线观看|
国产精品免费视频一区|
国产情侣久久|
亚洲国产日韩欧美在线|
欧美激情中文字幕一区二区|
综合久久久久久久综合网|
免费高清a级毛片在线播放|
99久久免费国产精精品|
亚洲欧美一区二区三区|
男人天堂avav|
www亚洲免费|
国产欧美综合精品一区二区|
欧美精品久久久久久久久大尺度|
99热在线观看|
亚洲欧美一区二区三区在线播放|
制服丝袜怡红院|
亚洲三级国产|
国产精品免费_区二区三区观看|
91手机在线视频观看|
免费在线色视频|
国语自产精品视频|
精品国产a|
亚洲欧美日韩中文在线|
亚洲国产欧美一区二区三区|
91看片在线观看|
99精品视频观看|
亚洲欧美日韩高清一区二区三区|
国产日日夜夜|
日日噜噜夜夜躁躁狠狠|
久久免费国产精品一区二区|
亚洲人成网男女大片在线播放|
国产精品亚洲欧美一级久久精品|
亚洲成人在线网|
激情成人综合网|
综合激情五月婷婷|
日韩字幕一中文在线综合
|
国产毛片在线看|
日本精品视频一区|
欧美一区二区三区不卡免费|
亚洲综合色一区二区三区小说|
久久青青视频|
亚洲黄色三级网站|
五月亭亭六月丁香|
久久精品播放|
国产九九热|
久久久精品成人免费看|
亚洲天堂最新地址|
精品国偷自产在线|
日韩毛片在线视频|
色综合久久中文字幕综合网|
婷婷综合久久狠狠色99h|
99自拍网|
久久综合热88|
久久久国产这里有的是精品|
精品久久蜜桃|
久久久久中文|
日本免费久久|
一区中文字幕|
2020国产成人精品视频人|
欧美日韩亚洲区久久综合|
亚洲一区二区三区视频|
亚洲欧美精品久久|
亚洲伊人色欲综合网|
精品成人一区二区|
国产原创精品视频|
欧美韩国日本在线|
五月激情综合|
99精品在线视频|
欧美午夜一区|
伊人成人久久|
99re在线视频观看|
99在线精品视频|
久久精品小视频|
亚洲品质自拍网站|
亚洲欧美日韩高清一区二区一|
青青草国产精品|
国产二区三区毛片|
欧美视频在线观看一区二区|
成人欧美日韩高清不卡|
日本精品一区二区三区视频|
一本一道久久a久久精品综合|
国产91一区二这在线播放|
久久99国产一区二区三区|
国产在线不卡视频|
亚洲一区自拍|
中文字幕视频免费在线观看|
综合久久久久久久|
99在线精品免费视频|
亚洲精品成人|
日韩国产精品99久久久久久|
婷婷丁香综合|
国产精品30p|
亚洲精品乱码久久久久久中文字幕
|
精品国产一区二区三区香蕉事|
日韩欧美在线中文字幕|
麻豆一区|
国产一区视频在线免费观看|
欧美日韩导航|
亚洲第一色图|
日本一二区视频|
免费视频久久久|
欧美另类视频一区二区三区|
国产午夜在线观看|
色综合久久久久|
亚洲自拍中文|
亚洲天堂男人网|
丁香欧美|
国产精品久久久久久久久夜色|
欧美一区二区在线免费观看|
色综合综合网|
国内自拍第一页|
国产精品美女久久久久久|
亚洲欧洲在线播放|
亚洲精品乱码国产精品乱码|
久久精品国产精品亚洲艾|
99久久精品国产片|
久久91精品国产91久久户|
国产成人毛片亚洲精品不卡|
麻豆19禁国产青草精品|
久久精品国产亚洲精品|
亚洲精品社区|
国产一区二区三区怡红院|
午夜性福利|
精品日韩一区二区三区|
99国产精品一区二区|
99在线精品国产不卡在线观看
|
久久精品国产400部免费看|
国产对白在线播放九色|
国产吧在线|
在线a国产|
亚洲一区二区欧美日韩|
国产伦理一区二区三区|
国产精品爱啪在线线免费观看|
亚洲天堂欧美|
91在线亚洲|
午夜精品久久久久|
久久精品一本到99热免费|
国产精品成aⅴ人片在线观看|
日本精品久久久久中文字幕2|
欧美精品免费一区欧美久久优播|
亚洲一区二区精品|
91福利视频网站|
亚洲欧美日韩高清在线看|
99久久精品费精品国产一区二区|
激情亚洲综合网|
99国产成+人+综合+亚洲欧美|
波多野氏免费一区|
亚洲一区浅井舞香在线播放|
亚洲视频中文字幕|
亚洲日本一区二区三区在线|
91精品国产亚洲爽啪在线观看|
久久免费精品|
青青操精品|
亚洲精品一二三|
91精品在线观看视频|
欧美亚洲激情视频|
日韩久久网|
精品女同一区二区三区免费站|
青青久久久国产线免观|
久久久这里有精品|
亚洲欧美日韩在线2020|
欧美黑人在线色天天久久|
日韩精品专区|
日韩精品一区二区三区乱码|
日韩欧美手机在线|
成人国产精品毛片|
狠狠色丁香婷婷综合久久片|
国产v在线|
欧美成人二区|
成人欧美一区二区三区黑人3p
|
免费在线观看国产|
亚洲国产精品网站久久|
国产精品日本一区二区在线播放|
亚洲网址在线|
国产精品乱码高清在线观看|
久久成人黄色|
亚洲国产精品久久精品成人|
久久男人的天堂|
日韩国产精品视频|
欧美乱码视频|
日韩精品福利在线|
国产激情在线|
99精品视频只99有精品|
精品国产综合|
欧美日韩亚洲国产精品一区二区|
中文字幕日韩一区|
亚洲国产亚洲综合在线尤物|
日韩一区视频在线|
99精品日韩|
99热这里只有精品1|
久久中文字幕日韩精品|
国产视频一区在线播放|
午夜爽爽性刺激一区二区视频|
国产欧美日韩另类va在线|
亚洲欧美日韩精品专区|
久久婷婷婷|
综合色网站|
久久久网站亚洲第一|
国产精品第九页|
久久高清一区二区三区|
亚洲国产精品久久精品怡红院|
青青视频国产|
久久成年人电影|
91精品国产福利在线观看|
青草视频免费看|
99久久免费国产精精品|
一区二区三区免费视频观看|
国产精品二区页在线播放|
国产免费一区二区三区免费视频|
亚州**色毛片免费观看|
欧美精品一二三|
国产成人精品一区二区|
99精品欧美一区二区三区美图|
亚洲综合色网站|
久久精品综合|
精品成人一区二区|
国产成人在线精品|
在线观看一区|
亚欧美综合|
国产精品高清在线观看地址|
亚洲七七久久综合桃花|
一区精品在线|
国产精品视频第一页|
九九精品成人免费国产片|
国内精品免费视频|
亚洲欧美精品中文字幕|
国产这里只有精品|
99热在线观看|
日韩在线视频免费|
日本免费一区视频|
久久精品一区二区国产|
日韩一区二区三区四区|
九九综合|
www.国产在线观看|
亚洲第一香蕉视频|
欧美成人精品不卡视频在线观看|
国产日韩一区二区三区|
91欧美在线|
伊人色综合网|
国产网址在线观看|
日韩a级毛片免费观看|
日韩一区二区在线免费观看|
热久久亚洲|
欧美亚洲另类在线观看|
久久亚洲国产成人影院|
九色视频在线观看|
91资源在线播放|
久久精品国产400部免费看|
成人综合国产乱在线|
国产亚洲综合在线|
亚洲福利一区二区精品秒拍|
亚洲国产高清在线|
国产青草视频免费观看97|
精品一区二区久久久久久久网精|
香蕉久久夜色精品国产小说|
国产伦精品一区二区三区精品|
日韩亚洲欧美一区|
99精品国内不卡在线观看|
国产视频第一页|
97国产在线观看|
五月综合久久|
国产精品免费在线播放|
亚洲人成一区二区不卡|
91精品国产麻豆国产自产在线|
狠狠色丁香婷婷综合精品视频|
日韩一区二区三区在线观看|
亚洲欧美日韩在线精品一区二区|
久久精品123|
福利一区在线|
香蕉蕉亚亚洲aav综合|
国产不卡福利|
伊人久久大香线蕉综合亚洲|
久久精品综合免费观看|
第一页亚洲|
国产一精品一av一免费爽爽|
久久精品成人一区二区三区|
视频精品一区|
巨臀中文字幕一区二区视频|
国产高清在线精品一区导航|
依人成人综合网|
国产成人精品免费青青草原app|
激情综合五月亚洲婷婷|
免费精品久久|
国产亚洲午夜精品|
视频一区二区三区免费观看|
亚洲欧美视频一区二区三区|
国产精品久久久久久久久久久久久久
|
久久精品国产72国产精福利
|
91精品国产高清久久久久久91|
在线视频不卡国产在线视频不卡|
国产一区二区免费在线|
国产精品综合在线|
亚洲午夜综合网|
欧美日韩国产最新一区二区|
91精品在线播放|
亚洲国产高清在线|
亚洲精品自在在线观看|
在线亚洲日产一区二区|
狠狠色丁香婷婷综合尤物|
狠狠色丁香婷婷综合尤物|
国产精品第一页爽爽影院|
亚洲一区二区在线播放|
午夜亚洲国产成人不卡在线|
国产精品一区二区三|
亚洲精品天堂在线|
国产自在线拍|
亚洲精品视频久久|
亚洲国产精品午夜电影|
99久久精品国产自免费|
日韩不卡一区二区|
久草中文视频|
色婷婷色综合|
99r在线视频|
欧美va亚洲va国产综合|
日韩精品欧美高清区|
国产91丝袜|
精品在线视频播放|
国产欧美日韩精品在线|
97视频在线播放|
国产天天色|
欧美日韩一区二区在线观看|
欧美日韩国产一区二区三区不卡|
九九精品视频一区二区三区|
亚洲国产成人超福利久久精品|
国产香蕉一区二区在线观看
|
欧美特级午夜一区二区三区|
91免费国产在线观看|
国产亚洲欧美一区二区三区
|
亚洲天堂免费观看|
狠狠亚洲|
九九精品99|
亚洲视频中文字幕在线观看|
国产精品亚洲午夜不卡|
91精品国产乱码在线观看|
日韩精品在线观看视频|
日韩精品成人|
亚洲一区二区黄色|
国产免费成人在线视频|
亚洲成人网页|
久久久中文|
国产成人在线视频观看|
国产乱理伦片a级在线观看|
日韩a无吗一区二区三区|
久久伊人天堂视频网|
久久国产精品一区二区三区|
中文字幕精品亚洲无线码二区|
国内精品99|
欧美精品一区二区三区免费观看|
精品国产_亚洲人成在线高清|
亚洲高清资源在线观看|
国产亚洲漂亮白嫩美女在线|
精品久久久久久国产|
视频一区日韩|
欧美国产视频|
99久久精品国产国产毛片|
国产高清在线精品免费不卡
|
国产夫妻久久线观看|
国产精品成人免费福利|
日韩午夜激情视频|
国产精品久久久久久|
国产91在线视频|
中文精品99久久国产|
亚洲欧美综合日韩字幕v在线|
在线免费观看国产精品|
99精品久久精品一区二区小说|
在线中文字幕|
亚洲国产成人久久|
欧美黑人在线|
欧美日韩综合精品一区二区三区
|
国产精品综合久成人|
九色欧美|
国产亚洲美女精品久久久久狼|
亚州精品永久观看视频|
欧美精品一国产成人性影视|
国产精品偷伦视频播放|
亚洲国产日韩欧美|
久久精品无码一区二区三区|
久久免费精彩视频|
91精品亚洲|
久久精品波多野结衣|
国产98色在线|
久久九色|
九九热视频免费|
国产精品国产三级国产专播|
久久99国产精品成人|
久久91亚洲精品中文字幕|
国产精品13页|
亚洲精品欧美精品中文字幕|
国产激情视频在线|
在线亚洲精品|
色综合激情网|
亚洲欧美日韩一级特黄在线|
亚洲片在线观看|
亚洲天堂网2014|
伊人精品影院一本到欧美|
亚洲成人一级|
精品国产品香蕉在线观看|
欧美精品免费在线|
夜精品a一区二区三区|
国产网站免费在线观看|
久久这里只是精品免费视频|
欧美中文字幕一二三四区
|
国产一区二区精品久久岳√|
国产亚洲福利精品一区|
欧美久久网|
国产精品亚洲精品观看不卡|
激情粉嫩精品国产尤物|
亚洲精品乱码在线观看|
噜噜噜噜天天狠狠|
久色免费视频|
国产精品亚洲成在人线|
亚洲精品一级片|
国产久视频|
国产资源在线播放|
国产一区二区在线看|
精品国产三级a在线观看|
久久久久久综合一区中文字幕|
久久国产欧美日韩精品免费|
综合色中色|
精品成人一区二区三区免费视频|
91精品国产综合久久青草|
国产在线喷潮免费观看|
欧美国产综合在线|
在线欧美日韩国产|
国产免费久久精品久久久|
日韩精品一区二区三区视频网|
欧美韩日在线|
亚洲精品不卡在线|
亚洲成人在线播放|
2021久久精品国产99国产|
精品一区狼人国产在线|
91久久天天躁狠狠躁夜夜|
伊人91在线|
亚洲成人高清|
69国产成人精品视频软件|
国产色婷婷精品综合在线手机播放|
精品一区久久|
日韩欧美国产亚洲制服|
欧美日韩国产色|
午夜精品亚洲|
中文久久|
正在播放国产巨作|
亚洲夜夜夜|
久久精品人人做人人试看|
亚洲人成网站在线|
久久久久国产精品免费网站|
欧美午夜精品久久久久免费视|
国产成人精品一区二三区2022
|
亚洲品质自拍网站|
国产精品对白刺激久久久|
亚洲人成综合在线播放|
国产在线视频资源|
97国产免费全部免费观看|
精品亚洲午夜久久久久|
午夜视频成人|
久久精品视频6|
91精品国产91久久久久久最新|
久青草国产免费观看|
久久精品a亚洲国产v高清不卡|
久久综合九色综合桃花|
天天插综合网|
亚洲欧美专区精品久久|
精品国产香蕉|
亚洲国产精久久久久久久|
日本一区二区三区不卡在线看|
国产九九热视频|
中文字幕精品视频在线观|
一本色道久久88综合亚洲精品高清|
欧美一区亚洲二区|
婷婷综合久久|
日韩精品中文字幕在线|
日韩精品一区二区三区中文在线|
99久久精品久久久久久清纯|
久青草视频在线播放|
亚洲欧美日韩第一页|
久久99精品国产免费观看|
久热中文|
99婷婷|
亚洲精品无码不卡|
伊人久久精品|
欧美日韩视频在线播放
|
精品一区二区在线|
亚洲国产中文在线|
亚洲国产成人精品91久久久|
国产精品成人一区二区不卡|
99久久免费观看|
91福利在线免费观看|
色综合一区二区三区|
欧美视频精品|
日韩一区二区三区四区|
亚洲欧美日韩一区二区在线观看|
国产一区二区高清视频|
色狠狠一区|
中文有码在线播放|
国产在线色站|
国产欧美视频综合二区|
成年女人毛片免费视频永久vip|
亚洲综合在线观看一区www|
免费jjzz在线播放国产|
国产一二区视频|
亚洲一级毛片在线播放|
91九色在线播放|
91一区二区在线观看精品|
久久99久久99|
九月色婷婷|
九九国产精品九九|
免费日韩精品|
国产精品7m凸凹视频分类大全|
99自拍网|
中文字幕视频在线观看|
亚洲国产天堂|
在线观看视频一区二区三区
|
午夜在线视频观看|
国产成人综合一区人人|
欧美日韩1区|
国产91丝袜|
国产精品lululu在线观看|
91系列在线|
亚洲国产成人va在线观看网址|
国产中文字幕免费观看|
欧美福利在线播放|
精品国产三级a∨在线|
久久99国产亚洲精品|
欧美亚洲欧美日韩中文二区|
国产精品亚洲欧美日韩一区在线|
国产成人青青热久免费精品|
女人国产香蕉久久精品|
在线中文字幕日韩欧美|
在线看一区二区|
狠狠色成色综合网|
青青草国产精品久久久久|
国语自产精品视频|
国产国语毛片|
国产欧美va欧美va香蕉在线观看
|
久久精品9|
欧美在线观看视频一区|
久久六月丁香婷婷婷|
久久亚洲精品人成综合网|
在线中文字幕网|
精品1区2区3区|
91免费国产精品|
蜜桃精品在线|
狠狠躁天天躁夜夜躁婷婷|
成人久久精品|
九九九精品视频免费|
国产香蕉一区二区在线观看|
黑人巨大精品欧美一区二区|
在线中文字幕一区|
亚洲午夜精品一区二区公牛电影院
|
日韩精品一区二区三区中文在线|
一本久道久久综合婷婷五|
亚洲精品成人a在线观看|
欧美日韩中文字幕一区二区高清|
色婷婷影视|
在线视频一区二区三区|
亚洲综合站|
九九精品成人免费国产片|
99精品在免费线视频|
九九精品在线|
亚洲一区二区三区免费|
亚洲综合网址|
99re在线观看|
国产日韩免费视频|
玖玖精品视频在线|
日韩亚洲视频|
久久这里有精品视频|
日韩综合在线观看|
精品无人区一区二区三|
欧美一区二区亚洲|
午夜爽爽性刺激一区二区视频|
国产福利精品在线|
一区二区网站|
日韩一区二区三区在线播放|
另类色区|
婷婷色网|
456亚洲视频|
国产一二三视频|
国产亚洲综合久久|
国产精品二区三区|
国产精品美女久久福利网站|
99re这里只有精品在线|
成人精品一区二区三区中文字幕|
欧美成人精品不卡视频在线观看
|
婷婷色亚洲|
九一色视频|
国产制服丝袜视频|
国产精品久久久久秋霞影视|
国产在线一区二区|
制服丝袜国产精品|
午夜免费小视频|
精精国产xxxx视频在线播放器|
欧美日韩v|
日本激情视频一区二区三区|
精品国产96亚洲一区二区三区|
色婷婷亚洲精品综合影院|
韩国电影一区二区|
亚洲午夜在线播放|
四虎永久影院|
国产精品免费看久久久久|
国产一区二区不卡视频|
国产亚洲三级|
欧美精品日韩一区二区三区|
久碰香蕉精品视频在线观看|
中文字幕精品一区二区精品|
99精品免费在线观看|
国产精品二区页在线播放|
91精品视频免费在线观看|
一区二区免费播放|
亚洲成人中文|
久久婷婷丁香|
国产亚洲高清不卡在线观看
|
欧美韩日在线|
996热视频|
国产91亚洲精品|
婷婷激情综合网|
久久成人亚洲|
亚洲精品美女久久久|
国产色网址|
国产91青青成人a在线|
在线亚洲激情|
亚洲欧美精品久久|
99re在线这里只有精品|
九九色综合网|
亚洲品质自拍视频网站|
精品三区|
性欧美video视频另类|
亚洲精品一二三区|
99成人精品|
日本成人不卡|
91华人在线视频|
欧美日韩在线精品一区二区三区|
亚洲精品91香蕉综合区|
日本中文字幕一区二区三区不卡|
色婷婷香蕉|
91久久香蕉国产线看观看软件
|
91精品国产免费久久久久久|
精品欧美一区二区三区免费观看|
99久久精品国产一区二区成人|
久久精品视频6|
亚洲精品国产精品乱码不卡√香蕉|
久久综合精品视频|
四虎永久在线|
九九热视频在线观看|
亚洲成人三级|
高清国产性色视频在线|
日本在线播放一区|
91在线精品麻豆欧美在线|
国产成人精品亚洲2020|
欧美日本综合一区二区三区|
久久亚洲精品玖玖玖玖|
奇米一区二区三区四区久久|
欧美精品www|
亚洲欧美在线免费|
亚洲综合色站|
欧美日韩国产在线人成app|
久国产精品视频|
日韩欧美国产中文|
欧美精品久久久久久久免费观看|
国产婷婷高清在线观看免费|
亚洲精品成人网|
国产精品一区三区|
成人国产精品免费视频不卡|
成人中文字幕在线|
欧美久久伊人|
日韩在线不卡视频|
色欧美亚洲|
亚洲视频免费观看|
国产精品久久久久9999高清|
91福利视频免费观看|
91精品国产一区二区三区左线|
欧美一二区|
国产精品伦理一二三区伦理|
成人久久久久久|
国产精品一区二区电影|
免费精品视频在线|
国产精品午夜久久|
亚洲美女综合网|
国产在线播放一区|
午夜在线不卡|
四虎国产精品永久免费网址|
亚洲国产天堂久久综合图区|
99re久久精品国产首页2020|
高清国产精品久久久久|
精品一区二区三区视频在线观看免|
国产免费一区二区在线看|
国产精品久久久久久久久久久威|
欧美日韩免费一区二区三区|
亚洲一区二区色|
日韩福利一区|
91精品福利在线观看|
亚洲一区二区在线免费观看|
日韩国产精品视频|
亚洲精品**中文毛片|
欧美激情一区|
一区二区三区中文字幕|
亚洲国产精品久久丫|
亚洲高清一区二区三区|
精品国产一区二区三区久久久狼|
欧美成人精品一区二区|
日韩免费一级|
欧美日韩成人在线视频|
色婷婷综合网|
91精品久久久久|
欧美自拍网|
国产成人亚洲精品91专区高清|
在线观看亚洲成人|
亚洲成人网页|
国产一区视频在线免费观看|
欧美天天视频|
国产精品久久久久久免费播放|
青青青手机在线视频|
国产区视频在线观看|
国产成人精品久久综合|
九九九精品视频免费|
久久国产高清|
狠狠色丁香久久婷婷综合五月|
亚洲精品高清国产一线久久97|
国产精品福利久久|
午夜免费小视频|
国产精品久久久久久久|
日韩精品成人|
国产91在线播放中文|
国产精品一区高清在线观看|
香蕉蕉亚亚洲aav综合|
久久久国产精品免费看|
国产视频一二三区|
国产99视频精品免费视频免里|
亚洲免费一区二区|
亚洲视频欧美视频|
久久久精品一区|
亚洲国产成人麻豆精品|
久久婷婷电影网|
欧美国产亚洲一区|
国产欧美精品国产国产专区|
欧美在线一区二区三区精品|
国产在线视频二区|
色综合久久久久久久久五月|
99综合网|
91精品观看91久久久久久|
国产91在线看|
欧美久久综合九色综合|
国产精品三区四区|
久久久毛片免费全部播放|
久久婷五月综合|
精品国产_亚洲人成在线高清|
亚洲一道本|
国产成人精品综合久久久久性色|
色婷婷精品大视频在线蜜桃视频|
91麻豆高清国产在线播放|
久久久香蕉|
伊人久久免费视频|
国产区精品在线|
久久久久综合网|
无码精品日韩中文字幕|
中文字幕在线不卡精品视频99|
成人欧美精品大91在线|
欧美国产免费|
欧美专区在线|
99在线观看精品视频|
99热成人精品免费久久|
国产片一区二区三区|
91免费高清视频|
国内精品视频在线观看|
久久93精品国产91久久综合|
日本综合欧美一区二区三区|
怡红院分站|
欧美一页|
欧美一级精品|
91精品视频免费在线观看|
久久艹精品|
久久精品欧美一区二区|
国产精品久久久久久久久久久搜索|
五月天婷婷在线视频|
亚洲激情网站|
亚洲制服无码|
欧美精品一区二区三区视频|
欧美亚洲国产精品久久|
99久久99久久精品国产片果冻|
国产日韩欧美在线观看不卡|
亚洲精品丝袜|
国内精品久久久久影院一蜜桃|
怡红院美国分院一区二区|
国产一区二区三区在线观看视频|
久久精品波多野结衣|
日本久久综合网|
五月婷婷六月爱|
国产无套在线观看视频|
色狠狠一区二区|
日本欧美高清|
毛片视频免费|
国产精品一区二区欧美视频|
午夜亚洲一区二区福利|
国产成人亚洲精品91专区高清|
99精品国产三级在线观看|
国产成人一区二区三区视频免费蜜|
日韩在线观看网站|
亚洲欧美精品一区|
成人午夜网址|
亚洲国产天堂|
91av视频免费在线观看|
色综合久久98天天综合|
欧美亚洲国产精品久久久|
国产精品日本一区二区不卡视频|
欧美在线香蕉在线现视频|
国产欧美久久久精品影院|
久久99精品久久久久久婷婷|
久久精品三级|
在线免费视频a|
国产视频一区在线|
日韩成a人片在线观看日本|
国产99精品视频|
日韩欧美1区|
天天拍夜夜拍高清视频|
亚洲一区二区三区视频|
国产婷婷色一区二区三区深爱网
|
国产va在线播放|
国产精品久久久久久久久电影网|
亚洲综合在线观看一区www|
国产综合精品一区二区|
国产亚洲精品成人久久网站|
91精品视频在线播放|
久久97久久97精品免视看清纯|
久久r精品|
免费观看国产精品视频|
狠狠色丁香婷婷综合久久来|
九九热这里|
97色伦欧美自拍视频|
欧美精品一区二区三区四区
|
四虎永久免费在线|
精品国产午夜肉伦伦影院|
日本不卡一区二区三区在线观看|
国产原创一区二区|
中文精品99久久国产|
成人9久久国产精品品|
九九九国产在线|
国产在线精彩视频二区|
久久美女免费视频|
国产亚洲精品午夜高清影院|
精品自拍一区|
国产精品毛片在线更新|
国产精品999在线|
一本久道久久综合婷婷五|
久久久综合网|
深夜性久久|
久久精品中文字幕首页|
五月婷婷六月天|
九九综合视频|
国产午夜三区视频在线|
欧美日韩在线视频播放|
亚洲一级毛片在线播放|
在线日韩国产|
精品亚洲午夜久久久久|
91成人爽a毛片一区二区|
亚洲国产美女福利直播秀一区二区|
99国产成人高清在线视频|
国产视频一二区|
国产精品久久久久影视青草|
综合激情在线|
国产免费人视频在线观看免费|
国产精品久久免费观看|
99久久综合狠狠综合久久|
中文字幕久久综合|
精品久久久久久中文字幕2017|
欧美日韩专区|
久久精品这里|
日韩在线观看精品|
国产欧美日韩一区二区三区在线|
日本一区二区在线看|
国产精品成人自拍|
中文字幕日本在线视频二区|
999人在线精品播放视频|
伊人热久久|
日韩在线观看一区二区不卡视频|
99精品在线视频观看|
亚洲国产精品日韩在线观看|
99久久99久久久99精品齐|
亚洲精品手机在线观看|
色婷婷成人|
亚洲一区二区色|
日韩一区二区三区精品|
99精品国产一区二区三区|
香蕉视频久久|
四虎永久免费在线观看|
欧美精品v国产精品v|
国产美女网址|
亚洲人成免费|
国内精品伊人久久久久妇|
久久久久一区二区三区|
久久一精品|
亚洲国产精品综合久久|
国产一区美女|
在线观看日韩一区|
国产精品亚洲午夜一区二区三区|
一区二区美女视频|
国产精品国产三级在线专区
|
国产福利麻豆精品一区|
99视频精品全部在线播放|
成人精品人成网站|
在线观看国产欧美|
久久尤物视频|
永久精品|
97在线免费视频|
欧美另类第一页|
国产高清精品91在线|
国产精品18|
午夜欧美精品久久久久久久|
亚洲天堂日本|
在线播放亚洲精品|
亚洲视频一区二区|
91久久国产成人免费观看资源|
国产精品网站在线进入|
99久久99久久精品|
国内自拍成人网在线视频|
欧美综合专区|
99香蕉国产线观看免费|
久久久久亚洲国产|
视频在线一区二区|
国产精品青草久久久久婷婷|
亚洲性影院|
久色免费视频|
在线播放国产一区|
韩国美女福利专区一区二区|
久久免费高清视频|
国产精品视频一区二区噜噜|
国产免费一级高清淫日本片|
久久久精品午夜免费不卡|
久久观看午夜精品|
国产天堂在线观看|
久久99精品久久久久久秒播|
91成人在线免费观看|
91精品在线免费视频|
久久影院国产|
狠狠激情五月综合婷婷俺
|
久久久久国产成人精品亚洲午夜|
婷婷综合久久中文字幕蜜桃三电影|
亚洲欧美日韩国产综合|
精品国产福利第一区二区三区|
欧美一区高清|
亚洲第一页在线|
视频在线一区二区三区|
国产伦精品一区二区三区|
久久最新精品|
国产福利小视频在线播放|
www亚洲一区|
国产在线麻豆一区二区|
国内精品在线视频|
国产毛片网|
亚洲午夜久久久久影院|
在线视频亚洲色图|
亚洲精品青青草原avav久久qv|
97精品伊人久久大香线蕉|
91精品在线观看视频|
国产精品亚欧美一区二区三区|
福利一区在线观看|
欧美午夜一区|
97久久久久国产精品嫩草影院|
成人久久18免费网|
国产一级高清|
国内精品视频|
国产成人尤物精品一区|
日韩欧美一区二区三区不卡|
日本成人不卡|
久久中文字幕综合婷婷|
精品久久香蕉国产线看观看亚洲|
亚洲天堂精品视频|
亚洲欧美一区二区三区|
亚洲欧美日韩高清在线电影|
欧美成人一区二区三区在线电影|
99精品在线播放|
中文字幕制服丝袜|
亚洲视频在线免费播放|
狠狠综合久久综合鬼色|
亚洲成人三级|
亚洲精品美女久久久久|
国产精品一区二区三区在线观看|
亚洲精品第一国产综合野|
国产毛片一级|
国产亚洲区|
蜜桃视频一区二区|
久久精品视频1|
国产精品国产香蕉在线观看网|
久久不卡精品|
精品欧美一区二区三区免费观看|
国产黑丝一区|
99精品视频在线播放2|
国产在线视频二区|
亚洲一级毛片在线播放|
久久精品天堂|
日韩一级欧美一级一级国产|
国产精品高潮呻吟久久av|
四虎永久在线免费观看|
91av在线免费观看|
久久久精品456亚洲影院|
国产va免费精品观看精品|
欧美69精品国产成人|
selao久久国产精品|
五月天婷婷一区二区三区久久|
国内精品久久久久香蕉|
久久精品国产无限资源|
欧美一区二区三区四区在线观看|
国产日韩亚洲不卡高清在线观看|
青青青青久久精品国产h|
国产精品999在线|
亚洲一区二区影院|
亚洲欧美一区二区三区麻豆|
欧美成在线播放|
国产亚洲精|
999在线观看视频|
亚洲天堂aa|
韩国三级一区|
欧美激情精品久久久久|
久久久久久一级毛片免费无遮挡
|
亚洲欧美日韩国产综合专区|
国产在线精品99一卡2卡|
久久青青草原精品国产不卡|
91精品国产麻豆91久久久久久|
国产6699视频在线观看|
综合久久综合|
韩国美女激情视频一区二区|
99国产精品农村一级毛片|
明星国产欧美日韩在线观看|
午夜怡红院|
高清一区二区三区视频|
亚洲国产第一区二区香蕉|
久久riav二区三区|
亚洲天堂成人在线观看|
精品中文字幕乱码一区二区|
欧美综合色|
欧美日韩一区二区在线视频|
国内精自视频品线六区免费|
国产精品v欧美精品∨日韩|
91麻豆国产在线观看|
国产a精品|
亚洲第一欧美|
91精品视频观看|
2020国产成人精品视频网站|
国产成人av在线|
麻豆国内精品久久久久久|
中文字幕乱偷乱码亚洲|
国产精品制服诱惑|
亚洲欧美日韩一区|
中文字幕在线视频精品|
91在线精品你懂的免费|
亚洲不卡在线|
狠狠色色综合网站|
日韩精品福利片午夜免费
|
国内精品久久久久久久久久影视
|
日韩精品午夜视频一区二区三区
|
91九色在线视频|
日韩国产午夜一区二区三区|
亚洲一区第一页|
国产综合色在线视频|
91精品在线观看视频|
亚洲综合美腿丝国产一区|
国产精品久久免费观看|
亚洲精品国产字幕久久不卡|
精品国产日韩久久亚洲|
久久久久性|
亚洲一区在线播放|
91日韩在线|
男人天堂成人|
欧美精品日韩|
韩国福利一区|
色婷婷在线播放|
国产福利在线高清导航大全|
亚洲自拍中文|
亚洲片在线观看|
久久久久久免费观看|
久久semm亚洲国产|
亚洲欧美日产综合在线看|
在线日韩亚洲|
免费国内精品久久久久影院|
69国产成人综合久久精|
日韩美女福利视频|
91在线视频免费观看|
欧美精品区|
亚洲欧美第一页|
亚洲第一天堂网|
在线a人片免费观看国产|
日本黄页网站免费|
欧美一区在线观看视频|
精品无人区一区二区三|
中文字幕在线2021一区|
欧美综合天天夜夜久久|
欧美日韩国产不卡在线观看|
99热这里只有精品在线观看|
亚洲图色在线|
欧美一区二区高清|
五月天国产精品|
国产一区二区在线看|
亚洲网在线|
亚洲国产精品免费视频|
91九色在线播放|
精品久久九九|
亚洲人成绝费网站色ww|
91啪国产在线观看|
久久婷五月|
久久综合一|
男女午夜免费视频|
亚洲色欧美|
国产精品一区在线免费观看|
日韩男人的天堂|
色吧五月婷婷|
亚洲欧美一区二区三区麻豆|
青娱极品盛宴国产一区|
国产v综合v亚洲欧美|
四虎影院久久|
日韩免费一区二区|
久久91精品国产一区二区|
日韩一区二区三区免费体验|
99精品一区二区免费视频|
精品国产91在线网|
亚洲性一区|
自拍一区在线观看|
国产伦精品一区二区三区|
亚洲区精品久久一区二区三区|
国产成人高清视频在线观看免费97|
国产精品久久久久免费a∨|
亚洲人av高清无码|
国产精品久久国产精品99|
亚洲国产www|
国产高清网站|
欧美大色网|
国产天堂在线观看|
欧美亚洲欧美日韩中文二区|
中文字幕另类|
久久国产网|
亚洲视频2|
亚洲欧美综合一区|
国产曰批免费视频播放免费s|
久久精品乱子伦免费|
亚洲a在线视频|
91资源在线视频|
亚洲黄网免费|
国产有码视频|
亚洲一区二区三区网站|
国产视频一区二区|
欧美亚洲一区二区三区导航|
国产精品亚洲一区在线播放|
毛片免费视频网站|
福利视频一区二区三区|
欧美精品首页|
日韩精品电影在线观看|
亚洲性夜夜夜谢夜夜2019|
久久久青青|
亚洲自拍中文|
亚洲精品国产电影|
欧美国产亚洲精品a第一页|
五月天久久婷婷|
91福利视频一区|
久久久黄色|
成人网在线视频|
91一区二区三区|
在线视频观看一区|
九九热这里只有国产精品|
99精品福利视频|
国产精品久久久久秋霞影视|
99久久精品费精品国产一区二区|
久久亚洲国产成人影院|
在线亚洲小视频|
久久久久夜色精品波多野结衣|
91久久|
亚洲系列国产精品制服丝袜第|
99国产视频|
精品无码一区在线观看|
国产精品无码制服丝袜|
亚洲高清国产拍精品影院|
亚洲国产精品激情在线观看|
日本在线观看www|
久久久久免费观看|
久久亚洲综合中文字幕|
中文字幕久久久|
欧美午夜网|
国产精品真实对白精彩久久|
99精品欧美|
亚洲国产99在线精品一区二区|
综合激情婷婷|
国产精品三级视频|
久久精品国产99久久3d动漫|
韩国精品一区二区三区在线观看|
伊人久久婷婷|
一区二区在线观看视频|
亚洲天堂成人在线|
欧美视频在线观看一区二区|
国产精品久久久久久久久岛|
成人免费无毒在线观看网站|
亚洲日本欧美在线|
视频精品一区二区|
日韩欧美第一页|
日韩成人中文字幕|
欧美综合一区|
日韩亚洲视频|
亚洲区在线|
国产在线色视频|
成人欧美一区二区三区黑人免费|
国产在线不卡视频|
99re5精品视频在线观看|
国产69久久精品成人看|
久久99精品久久久久久园产越南|
久久97视频|
91精品久久一区二区三区|
国产精品一区二区久久|
色综合久久久久综合99|
国产精品66|
九九热视频这里只有精品|
国产女人成人精品视频|
久久精品国产免费中文|
亚洲精品第一页中文字幕|
欧美日本在线播放|
五月婷婷亚洲|
久久99精品免费视频|
亚洲精品高清国产一线久久97|
成人在线观看不卡|
欧美激情视频二区三区|
成人亚洲性情网站www在线观看|
国产精品二区三区免费播放心|
亚洲精品视频在线|
国产精品第四页|
欧美婷婷综合|
日本aⅴ在线不卡免费观看|
伊人首页|
久久综合丁香激情久久|
成人精品国产亚洲欧洲|
久久久久久91香蕉国产|
亚洲一区自拍|
天堂在线v|
伊人成人在线观看|
亚洲天天干|
久久精品黄色|
手机在线播放av|
91热久久免费精品99|
婷婷色网站|
99视频国产精品|
国产午夜伦伦伦午夜伦|
精品一区二区91|
最新久久免费视频|
欧美综合成人网|
91精品国产免费久久久久久|
亚洲欧洲第一页|
成人国产亚洲欧美成人综合网|
成人欧美在线|
久久久美女|
国产剧情一区二区|
国产精品免费看|
婷婷尹人香蕉久久天堂|
最新毛片久热97免费精品视频
|
91在线精品视频|
久色精品|
国产午夜精品理论片小yo奈|
91一区二区午夜免费福利网站|
国产在线拍揄自揄视频不卡99|
国产精品第1页|
婷婷综合五月|
欧美视频第二页|
视频一区二区三区欧美日韩|
国产伦子一区二区三区四区|
日本中文字幕在线播放|
99精品视频免费|
欧美在线一级精品|
日本欧美一二三区色视频|
亚洲一区色|
欧美日韩国产色综合一二三四|
国产成人精品男人的天堂538|
波多野结衣中文字幕一区二区|
亚洲伊人久久综合一区二区|
国产精品成在线观看|
日韩国产第一页|
国产在线观看中文字幕|
久久久免费视频播放|
99精品国产福利在线观看|
午夜丁香婷婷|
国产激情视频在线观看首页|
日韩精品中文字幕视频一区|
一区二区三区波多野结衣|
制服丝袜一区二区三区|
99国产情在线视频|
这里只有精品网|
久久天天躁狠狠躁夜夜|
日韩欧美国产亚洲|
亚洲精品第一综合99久久|
中文在线1区二区六区|
国产丝袜制服在线|
在线观看欧美国产|
91久久综合九色综合欧美98
|
国产在线欧美日韩一区二区|
国产精品黄在线观看观看|
欧美在线黄|
在线免费国产视频|
国产成人亚洲精品91专区高清|
91久久精品|
国产v片在线观看|
国产一二精品|
国产精品福利一区二区|
亚洲综合15p|
日本一区二区在线免费观看|
亚洲福利一区|
亚洲人成网男女大片在线播放|
99久久婷婷国产综合精品hsex|
伊人久久综合网亚洲|
国产精品va在线观看无|
97精品国产综合久久|
亚洲欧美日韩在线观看|
国产福利第一页|
国产一区二区三区亚洲综合|
天天插夜夜操|
精品国产免费人成在线观看|
在线视频一区二区三区|
国产网址在线观看|
国产亚洲精品2021自在线|
国产精品日本不卡一区二区|
国产精品国产自线在线观看|
91孕妇精品一区二区三区|
99成人免费视频|
国产精品免费福利|
不卡视频在线播放|
亚洲九九视频|
亚洲免费a|
国产精品亚洲精品不卡|
国产午夜在线观看|
国产亚洲欧美ai在线看片|
国产成人愉拍免费视频
|
狠狠色网|
伊人久久中文字幕|
精品久久免费视频|
国产一区亚洲|
国内精品免费视频|
精品久久久久久国产|
国产视频久久|
亚洲欧美日韩国产综合久|
欧美精品另类|
久久精品免费|
国产呦在线观看视频|
亚洲午夜久久久精品影院视色|
亚洲深夜视频|
欧美另类日韩中文色综合|
亚洲国产精品美女|
精品亚洲成a人在线观看|
欧美成人在线免费|
日韩亚色|
欧美日韩国产最新一区二区|
伊人网在线免费视频|
色99视频|
成人免费视频一区|
国产成人a∨麻豆精品|
久青草国产在线视频_久青草免|
欧美自拍另类|
九九色网站|
久久高清精品|
国产欧美在线观看不卡|
欧美综合图区亚洲综合图区|
国产午夜亚洲精品不卡电影|
伊人欧美|
亚洲成人高清|
青草久久精品|
亚洲一区视频在线|
国产91在线播放边|
中文字幕在线观看网址|
精品久久久久久综合日本|
99在线国产视频|
99视频精品全部在线|
国产精品电影网|
九九国产视频|
亚洲精品另类|
国产高清一级毛片在线人|
99热这里只有精品6免费|
欧美在线一级精品|
亚洲热热|
玖玖精品国产|
中出在线|
久久国产精品亚洲综合|
久久精品这里热有精品|
日韩网站免费|
a级免费网站|
99国产精品视频久久久久|
国产精品久久久久久久久免费观看
|
亚洲国产精久久久久久久|
国产精品福利在线观看秒播
|
亚洲国产精品线在线观看|
国产在线极品|
蜜桃精品视频在线|
日本一区二区视频在线观看|
狠狠色丁香久久婷婷综合蜜芽五月|
国产视频一区二区在线播放|
亚洲精品99久久久久久|
99riav精品国产|
九九热中文字幕|
欧美精品九九99久久在观看|
国产亚洲精品美女久久久久|
亚洲精品视频在线观看视频|
亚洲天堂黄|
亚洲国产天堂|
国产精品亚洲第一区二区三区|
99久久99久久免费精品蜜桃|
99久久国产视频|
国产成人尤物精品一区|
亚洲天堂自拍|
欧美亚洲国产成人不卡|
99ri精品国产亚洲|
中文字幕av一区二区三区|
综合色伊人|
国产专区在线|
日韩免费小视频|
亚洲字幕久久|
久久久夜色精品国产噜噜|
最新国产精品视频|
久色国产|
伊人夜夜|
呦女亚洲一区精品|
国产欧美日韩在线观看|
国产精品久久久久亚洲|
精品色综合|
国产成人久久综合热|
在线视频第二页|
欧美日韩精品在线播放|
欧美日韩视频免费播放|
欧美一区二区三区视频在线观看|
99香蕉国产线观看免费|
亚洲二区在线播放|
精品国产一级毛片大全|
成人精品网|
色网站免费在线观看|
国产日韩欧美中文|
国产ts在线观看|
四虎国产精品影库永久免费|
久久久久久久91精品免费观看|
国产精品无码久久久久|
欧美一区亚洲二区|
久久99精品视免费看|
精品亚洲性xxx久久久|
中文字幕亚洲第一|
欧美日韩在线第一页|
国产真实交换配乱吟91|
亚洲福利一区二区精品秒拍|
国产天天色|
国产成人久久精品|
欧美亚洲欧美日韩中文二区|
亚洲成人久久|
久久久五月|
欧美特黄一区二区三区|
婷婷综合视频|
欧美日韩国产高清视频|
久久免费精品视频|
婷婷开心综合|
视频国产一区|
国产玖玖在线|
日韩精品视频网站|
国产日韩免费视频|
免费视频a|
欧美日韩免费播放一区二区|
国产激情视频在线播放|
国产精品亚洲一区二区三区正片|
国产高清视频91|
毛片免费视频网站|
欧美国产伦久久久久|
午夜精品福利视频|
日韩欧美一区二区在线|
99热这里只有成人精品国产|
日韩一区二区三区在线观看|
免费视频88av在线|
精品福利视频导航|
精品免费国产|
国产在线视频www色|
久久国产精品99国产精|
国产一区二区不卡精品网站|
久青草视频在线播放|
欧美色图一区|
亚洲欧洲视频在线观看|
国产主播喷水|
婷婷午夜影院|
亚洲欧美日韩成人|
亚洲天堂aa|
国产精品久久久久久久伊一|
国产精品成人久久久久久久|
中文字幕热久久久久久久|
97国产在线视频|
99香蕉精品视频在线观看|
亚洲伊人网站|
日本亚洲国产精品久久|
91精品国产免费自在线观看|
99久热只有精品视频免费看|
99爱精品|
国产日韩视频一区|
一区二区3区免费视频|
亚洲欧美日韩在线观看二区|
国产成人自拍|
国产高清一级毛片在线人|
国产一区在线观看视频|
国产精品亚洲第一区二区三区
|
四虎最新网址在线观看|
国产亚洲精品不卡在线|
欧美国产亚洲一区|
国产美女在线播放|
精品在线99|
一本久久精品一区二区|
九九99久久精品国产|
亚洲国产日韩在线|
国产吧在线|
亚洲欧美一区二区三区导航|
国产不卡视频一区二区在线观看|
日韩精品首页|
国产在线拍|
一区中文字幕|
国产成人亚综合91精品首页|
九九热精品免费|
伊人精品视频在线观看|
国产三级久久久精品麻豆三级|
欧美国产免费|
欧美国产一区二区三区|
国产一区二区三区免费观看|
99久久综合国产精品免费|
亚洲精品欧美在线|
国产精品三级国语在线看|
国产一区二区fc2ppv在线播放|
亚洲婷婷第一狠人综合精品|
99在线精品国产不卡在线观看|
91精品国产自产在线观看永久∴|
日韩中文字幕a|
制服丝袜国产在线|
亚洲二区在线播放|
国产精品第一区在线观看|
精品国产中文一级毛片在线看|
国产精品最新|
亚洲精品国产第一综合99久久|
亚洲自偷自偷在线制服|
伊人网成人|
日韩一区二区三区四区五区|
亚洲三级小说|
五月婷婷网址|
最新欧美精品一区二区三区|
91午夜激情|
欧美在线观看一区二区三区|
欧美日韩中文国产|
99在线精品免费视频|
久草青青在线|
久久久久久久久97|
国产色区|
国内精品免费视频|
香蕉久久国产|
91综合在线|
深夜国产一区二区三区在线看|
国产精品成人麻豆专区|
精品欧美日韩一区二区|
亚洲v天堂v手机在线观看|
亚洲男人天堂网址|
欧美国产在线精品17p|
欧美精品亚洲网站|
日韩国产成人精品视频|
亚洲精品中文字幕乱码三区一二|
九九精品视频免费|
亚洲国产精品久久精品怡红院|
制服丝袜第二页|
国产一区二区三区免费在线视频
|
日本亚洲欧美美色|
国产成人一区二区三区视频免费|
亚洲一级香蕉视频|
亚洲国产欧美另类va在线观看|
亚洲精品一二三|
中文字幕精品一区二区精品|
亚洲精品中文字幕麻豆|
日韩a级在线|
国内精品久久久久久影院8f|
97成人在线视频|
久久久国产精品免费看|
亚洲天堂视频网|
麻豆成人久久精品二区三|
亚洲精品乱码久久久久|
亚洲免费福利在线视频|
欧美国产日韩久久久|
久久免费精品|
国产56页|
激情五月五月婷婷|
国产婷婷成人久久av免费高清|
亚洲精品不卡久久久久久|
91中文字幕在线播放|
色综合视频在线观看|
欧美日韩国产亚洲一区二区三区|
久久综合免费视频|
国产精品成人h片在线|
欧美在线黄|
久久精品国产在热久久2019|
99热这里都是国产精品|
午夜免费视频网站|
久久伊人草|
国产在线精品观看|
自拍一区在线观看|
久久久青青|
久爱免费精品视频在线播放
|
伊人久久免费|
国产69页|
色婷婷在线视频|
99久久精品国产免费|
国产成人精品综合|
亚洲精品国产字幕久久不卡|
91精品国产美女福到在线不卡|
在线亚洲综合|
香蕉视频一区|
日韩欧美亚州|
亚洲成人综合网站|
91亚洲国产|
日本亚洲一区二区三区|
久久精品免观看国产成人|
91香蕉视频色|
久热这里只有精|
亚洲高清中文字幕综合网|
久久久久久久久毛片精品|
日韩免费一区二区|
日韩不卡中文字幕|
国产青青草视频|
99香蕉国产线观看免费|
97自拍视频在线观看|
国产成人综合亚洲欧美天堂|
8av国产精品爽爽ⅴa在线观看|
国产精品高清在线|
日韩美一区二区|
五月天男人天堂|
九九精品在线观看|
国产精品久久久久久久伊一|
国产成人高清视频|
欧美精品成人久久网站|
亚洲人成一区二区不卡|
亚洲福利视频一区二区|
国产成人欧美一区二区三区vr|
香蕉久久久久久狠狠色|
99色精品|
亚洲日韩精品欧美一区二区一|
久久99爰这里有精品国产|
欧美日韩亚洲成色二本道三区|
国产精品美女免费视频观看|
日韩欧美高清一区|
久久国产视频网|
国产日韩欧美综合一区二区三区|
国产亚洲一区二区三区啪|
久久国产99|
91精品一区二区三区在线观看|
欧美成亚洲|
2021国产精品久久久久|
成人中文在线|
久久亚洲国产成人影院|
午夜欧美日韩|
成人国产在线观看高清不卡|
国产美女精品三级在线观看|
久久久国产99久久国产久|
97国产在线视频|
中文字幕在线亚洲|
久草视频在线资源|
国产成人精品日本亚洲专区6|
国产精品一区在线免费观看|
国产91视频免费|
精品一区heyzo在线播放|
四虎永久免费影院|
在线观看视频一区二区|
四虎国产永久在线精品免费观看|
国产精品黄网站免费进入|
久久99青青久久99久久|
色综合精品久久久久久久|
日韩精品久久一区二区三区|
国产精品夜色一区二区三区|
日韩一区二区在线视频|
亚洲国产情侣一区二区三区|
日本欧美一区二区三区视频麻豆
|
欧美αv在线|
91av在线免费观看|
久久久无码精品亚洲日韩按摩|
久久精品免看国产|
在线观看国产区|
99成人在线观看|
91亚洲专区|
麻豆国产在线不卡一区二区|
国产三级一区|
五月婷婷在线播放|
国产精品入口麻豆|
欧美日韩成人|
九九精品免费|
国产成人亚洲综合a∨婷婷|
亚洲免费视频网站|
久久久精品成人免费看|
麻豆成人久久精品二区三
|
久久99国产精品亚洲|
国产一区二区三区亚洲综合|
亚洲视频精品|
亚洲欧美日韩国产精品第不页|
国产精品永久免费自在线观看|
中文字幕在线精品|
99久久99久久精品国产片果冻|
成人亚洲视频在线观看|
国产视频一区二区在线播放|
狠狠夜色午夜久久综合热91|
a级在线免费观看|
男人天堂综合|
第一区免费在线观看|
亚洲一区在线播放|
国产中文字幕视频|
国产乱码一区二区三区|
国产成人综合久久|
国产午夜人做人免费视频中文|
久久免费国产视频|
视频一区二区中文字幕|
亚洲福利在线观看|
高清视频一区|
国产精品久久久久无码av|
精彩视频一区二区|
国产黄色免费观看|
日本精品视频一视频高清|
久久精品免费|
亚洲欧美高清视频|
亚洲欧美日韩高清中文在线|
久久厕所精品国产精品亚洲|
亚洲一级在线|
国产情侣久久|
久久永久免费视频|
日韩欧美中文字幕在线播放|
久久久久免费精品国产|
亚洲一区二区高清|
久久亚洲综合|
日本精品视频一视频高清|
97色伦图片|
国产精品不卡在线|
亚洲丝袜在线观看|
青草青青产国视频在线|
日韩久久中文字幕|
亚洲精品国产国语|
精品国产高清自在线一区二区三区|
色综合久久久久久|
国产精品成人va在线观看入口|
亚洲三级在线看|
久久精品综合网|
高清性色生活片久久久|
色婷在线|
国产在线伊人|
99精品网站|
99视频精品全部在线播放|
久久成人精品|
久久久综合香蕉尹人综合网|
久久99中文字幕久久|
国产精品久久久久无码av|
久久青青热|
国产精品久久自在自2021|
国产午夜精品久久久久|
麻豆精品在线观看|
婷婷丁香久久|
国产精品久久久久桃色tv|
亚洲国产欧美日韩精品一区二区三区
|
欧美一区网站|
91免费国产高清观看|
日韩欧美国产视频|
久草视频在线资源|
国产成人综合高清在线观看|
国产成人啪精品视频免费软件|
成人精品视频|
日本久久99|
伊人精品在线视频|
国产爽的冒白浆的视频高清|
国产视频一区二区在线观看|
亚洲精品色婷婷在线影院麻豆|
91精品久久|
九九热视频这里只有精品|
亚洲视频手机在线观看|
欧美成人精品一区二区三区|
亚洲精品视频在线观看视频
|
91福利在线看|
国产拍拍拍精品视频|
久久亚洲精品国产亚洲老地址|
国产亚洲精品视频中文字幕|
久久精品vr中文字幕|
91综合国产|
亚洲国产精品欧美综合
|
亚洲精品中文字幕无乱码麻豆|
亚洲综合网在线观看|
夜精品a一区二区三区|
久久艹免费视频|
国产在线视频资源|
国产一区美女|
国产成人亚洲综合一区|
欧美亚洲国产一区二区|
亚洲制服无码|
欧美成人免费|
欧美精品一区二区三区免费观看|
69国产成人综合久久精品91|
国产精品99在线观看|
麻豆国产精品免费视频|
免费国产黄频在线观看视频|
国产成人精品一区二区免费视频|
亚洲永久免费视频|
日韩欧美成末人一区二区三区|
亚洲色图欧美色|
日本在线不卡视频|
www.欧美精品|
欧美日韩另类在线|
亚洲图色在线|
欧美精品第二页|
伊人伊成久久人综合网777|
国产综合精品在线|
国产一区精品视频|
成人日韩在线观看|
成人亚洲网站www在线观看|
国产精品免费_区二区三区观看|
九九九好热在线|
亚洲一级片在线播放|
久久99国产亚洲高清观看首页|
精品国产美女|
99久久伊人|
亚洲一区免费在线|
亚洲欧美日韩中文字幕在线|
国产精品你懂的在线播放|
国产一区免费视频|
福利国产在线|
久热国产视频|
国产午夜偷精品偷伦|
性做久久|
日韩国产欧美在线观看|
久久国产精品视频一区|
欧美日韩一区二区成人午夜电影|
欧美日韩中文字幕免费不卡|
欧美激情人成日本在线视频
|
97在线免费观看视频|
久久国产美女免费观看精品|
国产免费一级视频|
国产一区二区三区高清视频|
欧美成a人免费观看|
亚洲国产精品福利片在线观看|
激情五月激情综合色区|
国产精品毛片一区二区三区|
国产福利在线看|
国产欧美日本在线观看|
久久久99精品久久久久久|
97se色综合一区二区二区|
综合色99|
欧美亚洲一二三区|
91久久精品视频|
99久久亚洲国产高清观看|
精品日韩欧美一区二区三区在线播放|
自拍偷拍一区|
国产亚洲视频在线|
综合久久久久久|
国产成人精品日本亚洲直接|
国产一区自拍视频|
国产精品美女在线观看|
91亚洲欧美|
亚洲伊人久久网|
亚洲精品一二三四区|
久久这里有精品视频|
亚洲视频三区|
国产99久久精品|
91精品国产欧美一区二区|
一区二区三区四区日韩|
91在线网站|
国产最新在线视频|
中文有码第一页|
亚洲理论a中文字幕在线|
99视频精品全部免费免费观|
中文字幕一区二区三区免费视频|
国产香蕉久久精品综合网|
欧美日韩一区二区综合在线视频|
怡红院免费的全部视频国产a|
国产一级免费视频|
国产高清精品一区|
亚洲午夜在线播放|
日韩福利影视|
99久久久免费精品免费|
久热草在线|
99久热成人精品视频|
欧美国产日韩一区二区三区|
99久久这里只精品麻豆|
99久久久免费精品免费|
久久亚洲国产伦理|
精品国产一二三区在线影院|
2020av在线播放|
日本不卡影院|
欧美一区日韩一区中文字幕页|
中文字幕久久综合伊人|
日韩欧美国产亚洲制服|
6699久久国产精品免费|
久草中文视频|
国产一区二区在线观看免费|
亚洲一区毛片|
欧美在线一区二区三区不卡|
91福利小视频|
国产色婷婷|
欧美精品高|
欧美激情精品久久久久久不卡|
亚洲人成高清|
九九色综合网|
国产a精品|
99久久精品费精品国产一区二区|
国产一二三视频|
久久久久亚洲日日精品|
日韩免费视频一区|
国产在线乱码在线视频|
国产青青久久|
国产成人精品日本亚洲专|
国产精品伦理久久久久|
天堂网www天堂在线网|
久久福利青草精品资源站免费|
国产婷婷一区二区三区|
久久精品午夜视频|
国产精品视频不卡|
成人午夜电影免费完整在线看|
国产成人免费在线观看|
欧美a级片免费看|
国产精品国产精品国产三级普
|
国内精品视频在线观看|
亚洲天堂首页|
亚洲国产小视频|
国产一区二区三区免费播放|
亚洲欧美成人综合久久久|
久久成人黄色|
国内精品视频在线播放|
国产精品日韩欧美|
精品久久综合一区二区|
国产精品免费观看|
亚洲一区网站|
亚洲香蕉网综合久久|
亚洲综合视频在线观看|
色妞www精品视频免费看|
婷婷综合久久中文字幕蜜桃三电影|
九九久久国产精品|
色综合成人|
久久久综合色|
亚洲综合日韩精品欧美综合区|
国产成人免费在线|
91精品久久久久含羞草|
亚洲天堂精品在线|
国产精品一区二|
久久久精品456亚洲影院|
久久国产综合精品欧美|
99亚洲乱人伦精品|
久久这里精品|
亚洲人成伊人成综合网久久久|
亚洲国产电影在线观看|
久久精品视频16|
久久综合一|
国产精品久久久久无码av|
国产亚洲精品片a77777|
国产精品不卡视频|
色综合网站在线|
91精品视频免费在线观看|
亚洲国产精品毛片∧v卡在线|
日本在线www|
亚洲国产精品久久久久秋霞影院|
国产精品久久久久久|
伊人成年综合网|
亚洲婷婷影院|
自拍视频一区|
久久夜色国产精品噜噜|
亚洲国产成人精品91久久久|
在线观看一区二区三区视频|
亚洲一区中文字幕在线电影网|
亚洲国产精品一区二区三区久久|
免费视频久久久|
天天干在线观看|
国产91在线免费观看|
96精品在线|
亚洲一级片在线播放|
日韩精品免费|
久久国产这里只有精品|
日韩亚洲国产激情在线观看|
狠狠综合久久综合88亚洲日本|
九九久久国产精品|
国产视频第一页|
一区二区欧美视频|
亚洲a视频在线|
国产一区二区三区国产精品|
久久免费播放|
日本成人一区二区|
亚洲精品人成网在线播放影院
|
婷婷涩|
亚洲日本一区二区三区在线不卡|
久久99国产精品亚洲|
日本福利片国产午夜久久
|
国产精品日韩欧美|
91亚洲综合|
日韩成人在线观看|
狠狠综合久久综合网站|
亚洲伊人久久大香线蕉在观|
91精品丝袜国产高跟在线一区|
国产精品久久久久不卡绿巨人|
成年男女免费视频|
亚洲国产精品线播放|
蜜桃一区|
亚洲欧美日韩中文综合v日本|
欧美高清一区|
成人午夜免费在线观看|
国产色一区|
91精品国产免费久久久久久青草|
91精品视频观看|
国产精品视频九九九|
婷婷99|
亚洲国产第一区二区香蕉日日|
久久91av|
亚洲欧洲一区|
精品久久久久久久久久|
午夜在线不卡|
欧美日韩亚洲无线码在线观看|
亚洲免费色视频|
欧美在线专区|
久久毛片免费|
亚洲国产精品婷婷久久久久|
国产1000部成人免费视频|
久久综合日韩亚洲精品色|
亚洲日韩精品欧美一区二区一
|
青青草原国产在线观看|
亚洲精品美女在线观看|
www色综合|
国产色91|
亚洲精品国产成人专区|
国产精品美女免费视频大全|
国产一区欧美|
亚洲人成高清在线播放|
久久美女精品国产精品亚洲
|
国产精品第一|
99视频在线精品|
亚洲视频一二|
久久综合偷偷噜噜噜色|
五月婷婷综合激情|
天堂在线v|
日韩一区二区三区免费体验|
99久久免费国产精精品|
91精品福利手机国产在线|
性欧美日韩|
久久久香蕉视频|
欧美精品在线免费观看|
国产在线欧美精品|
日韩欧美视频一区二区在线观看
|
免费精品视频|
午夜丁香婷婷|
亚洲欧美日韩在线香蕉|
久久毛片免费看|
亚洲欧美日韩在线观看二区|
经典三级一区在线播放|
久久久久久久91精品免费观看
|
91福利国产在线观看香蕉|
日韩成人中文字幕|
婷婷丁香五月中文字幕|
性做久久久久久久久不卡|
伊人久久天堂|
日本久久中文字幕|
国产日韩久久久精品影院首页|
亚洲男人在线天堂|
99久久99久久精品|
狠狠色丁香九九婷婷综合五月|
综合99|
日韩一区二区免费|
91中文在线|
国产在线欧美日韩精品一区二区|
日韩视频中文字幕视频一区|
韩日福利视频|
国产开裆丝袜高跟在线观看|
九九在线精品视频播放|
欧美日韩资源|
九九久久精品|
欧美国产永久免费看片|
蜜桃精品视频|
国产精品视频播放|
青青青免费在线视频|
成人7777|
制服丝袜护士久久久久久|
精品国产成人|
青青在线国产视频|
精品国产一区二区三区在线|
欧美天堂久久|
国产乱对白刺激视频在线观看|
毛片免费视频|
国产在线一区二区|
色综合狠狠|
久久综合九色综合欧美播|
国产高清视频青青青在线|
亚洲国产欧美无圣光一区|
亚洲成a人片在线观看中文动漫|
日韩欧美视频一区|
热久久亚洲|
国产成人综合一区人人
|
久久精品国语|
婷婷丁香综合|
色综合手机在线|
九九精品九九|
欧美天天|
久久久久久久久毛片精品|
国产成年网站v片在线观看|
国产九九精品|
国产福利不卡一区二区三区|
亚洲天堂小视频|
四虎永久免费在线|
久久精品国产国产|
国产精品爽黄69天堂a|
99热这里只有免费国产精品|
亚洲精品98久久久久久中文字幕
|
国产a精品三级|
亚洲国产第一区二区香蕉日日|
欧美久久超级碰碰碰二区三区|
九九热这里只有国产精品|
午夜色婷婷|
久久精品免观看国产成人|
久久婷婷国产综合精品青草|
久久成人小视频|
亚洲综合另类|
久操不卡|
国产99视频精品免视看7|
国产欧美久久久精品|
日韩欧美高清|
日韩欧美中文亚洲高清在线|
久久香蕉国产线看观看精品蕉|
色丁香久久|
久久久久久久久中文字幕|
国产欧美日韩免费一区二区|
色婷婷中文字幕在线一区天堂
|
在线日韩一区|
久久伊人成人|
国产精品福利午夜在线观看|
免费播放春色aⅴ视频|
国产日本在线|
青青草国产在线视频|
亚洲国产成人久久综合一区|
9999热视频|
99精品国产福利在线观看|
欧美日韩国产在线人成app|
色婷婷中文字幕|
国产性做久久久久久|
亚洲精品少妇30p|
国产欧美久久精品|
婷婷综合视频|
久久精品国产72国产精福利
|
日韩一区二区三区在线免费观看|
国产视频一区二区在线播放|
久久精品香蕉|
七七久久综合|
中文字幕在线网|
麻豆日韩国产精品欧美在线|
国产高清在线精品一区导航|
国产高清在线精品一区二区app|
欧美一区二区三区精品|
香蕉网在线观看|
亚洲综合色婷婷中文字幕|
日韩在线不卡一区在线观看|
中文字幕在线二区|
国产色综合久久无码有码|
国产在线观看网站|
亚洲精品欧美日韩|
欧美区在线观看|
日韩欧美第一页|
五月婷中文字幕|
国产九九热视频|
99久久99久久精品免费看蜜桃|
手机看片1024久久精品你懂的|
亚洲欧美日韩国产综合高清|
国产一区二区精品在线观看|
久久精品免费观看久久|
日本久久久久|
热久久免费|
伊人网综合在线视频|
国产在线精品福利大全|
国产人成精品综合欧美成人|
中文字幕不卡在线播放|
国产免费一区二区三区在线观看|
中文字幕不卡一区|
国产99re|
一区二区三区四区国产|
韩国一区二区三区视频|
色香欲综合成人免费视频|
视频一区亚洲|
欧美精品日韩一区二区三区|
成人精品在线观看
|
亚洲资源在线播放|
国产成人在线播放视频|
91精品国产手机|
久久精品伊人|
欧美成a人免费观看|
亚洲综合影院|
伊在人亚洲香蕉精品区麻豆|
国内精品久久久久影院不卡|
国产精品日本一区二区不卡视频|
欧美日韩精|
免费国产午夜高清在线视频|
亚洲国产综合网|
九九视频国产|
久久99国产视频|
精品国产1000部91麻豆|
欧美日韩精品一区二区三区视频播放|
精品国产一区二区三区不卡|
欧美精品免费专区在线观看|
亚洲一区二区精品|
国产一区高清|
中出五十路免费视频|
婷婷综合久久|
999国产精品999久久久久久
|
黄色片久久|
日韩一区二区三区不卡|
色国产精品一区在线观看|
欧美婷婷综合|
青青久在线视频|
国产一区高清视频|
日本精品久久久免费高清|
呦女亚洲一区精品|
91免费视频观看|
国产精品伦理久久久久|
国产一区精品在线|
国产精品一区不卡|
99久久精品免费看国产四区|
亚洲精品在线播放视频|
性欧美极品xxxx欧美一区二区|
久久综合久久自在自线精品自|
久久久小视频|
欧美精品国产第一区二区|
蜜桃视频一区二区三区|
亚洲欧美日韩综合一区久久|
成年人一级毛片|
亚洲精品视频专区|
亚洲婷婷六月|
日韩精品永久免费播放平台|
国产精品18久久久久久不卡|
99精品久久久久久|
国产精品v欧美精品v日本精|
欧美久久超级碰碰碰二区三区|
亚洲精品理论电影在线观看|
91av中文字幕|
国外欧美一区另类中文字幕|
国产欧美综合在线一区二区三区|
狠狠干中文字幕|
97se亚洲国产综合自在线观看|
在线观看日本一区二区|
日韩中文字幕一区|
亚洲区精品久久一区二区三区|
在线日韩欧美|
永久免费观看午夜视频在线|
国产精品亚欧美一区二区三区
|
天天躁夜夜躁狠狠躁2021a|
亚洲人成a在线网站|
国产福利资源在线|
欧美日韩一区二区三区色综合|
亚洲经典在线|
色综合日本|
精品三级66在线播放|
亚洲国产色婷婷精品综合在线观看|
国产区第一页|
久久鸭综合久久国产|
久热中文|
一区二区三区免费高清视频|
久久免费精品|
88国产精品视频一区二区三区|
丁香激情综合色伊人久久|
亚洲精品乱码久久久久久麻豆|
国产女人在线观看|
国产日本韩国不卡在线视频|
国产欧美综合在线|
精品欧美一区二区在线观看|
久久精品麻豆日日躁夜夜躁|
五月婷婷丁香综合|
久久一区二区精品|
亚洲欧美自拍视频|
久久精品国产精品青草不卡|
91在线精品麻豆欧美在线|
日本久久久久久久|
欧美一级视频精品观看|
欧美视频第一区|
男人天堂影院|
亚洲综合色站|
99久久免费国产精品特黄|
99久久精品免费看国产情侣|
99在线视频网站|
国产精品免费在线播放|
亚洲国产欧美久久香综合|
精品久久中文久久久|
久草视频国产|
视频一区二区中文字幕|
99国产精品免费视频观看|
国产高清不卡码一区二区三区|
99久久免费精品国产免费高清
|
亚洲乱码在线播放|
91精品国产综合久久消防器材
|
午夜国产视频|
国产视频黄|
日韩欧美一区二区三区四区|
在线播放精品一区二区啪视频|
亚洲人成s大片在线播放|
狠狠干夜夜草|
国产欧美一区二区三区观看|
日韩精品在线播放|
久久视精品|
久久永久免费|
国产视频不卡|
亚洲日本在线免费观看|
亚洲综合天堂|
亚洲综合国产|
亚洲一区二区免费在线观看|
国产一区二区久久久|
波多野结衣中文字幕一区二区|
四虎在线看|
九九九久久久|
99视频在线精品|
成人中文字幕在线观看|
伊人色在线视频|
日韩欧美一区二区三区不卡视频|
亚洲国产人久久久成人精品网站|
亚洲成人欧美|
99久久精品自在自看国产|
亚洲国产青草|
最新在线精品国自产拍网站|
国内精品久久久久久中文字幕|
综合久久综合久久|
久青草视频在线|
欧美精品1区2区|
午夜精品福利在线观看|
亚洲色图欧美一区|
国产伦精品一区三区视频|
亚洲精品伊人久久久久|
色综合久久网|
青草国产在线视频|
草久视频在线观看|
小辣椒精品福利视频导航|
亚州视频一区二区|
久久中文视频|
99re在线视频免费观看|
日韩免费视频一区二区|
久久香蕉国产观看猫咪3atv|
国产久热精品|
九九九精品视频免费|
在线观看免费视频一区|
亚洲va中文字幕无码|
91亚洲专区|
色综合久久综合欧美综合网|
亚洲欧美精品久久|
国产在线极品|
国产精品免费在线播放|
日韩久久免费视频|
中文在线亚洲|
韩国美女激情视频一区二区|
亚洲精品视频导航|
亚洲国产美女精品久久久久∴|
国产91在线播放|
精品久久中文网址|
91久久精品国产91久久性色tv|
91精品国产91久久久久久麻豆|
国产在视频线精品视频二代|
中文字幕一区二区三区视频在线|
成人亚洲网站|
91av免费在线观看|
一区中文字幕|
欧美视频一区二区三区在线观看|
91播放在线|
欧美a级片免费看|
欧美一区二区三区在线视频|
在线视频三区|
精品国产免费第一区二区|
精品免费国产一区二区三区|
久久精品国产99久久72|
亚洲第一成人在线|
国产精品对白刺激久久久|
亚洲国产日韩在线观看|
亚洲一区二区中文字幕|
91精品啪在线观看国产91九色|
9久久这里只有精品国产|
国产尤物精品视频|
亚洲国产影视|
亚洲七七久久综合桃花|
久久精品福利|
98色花堂永久地址国产精品|
亚洲视频精选|
精品久久一区|
婷婷色亚洲|
亚洲国产精品自产拍在线播放|
久久精品视频16|
国产亚洲综合久久|
国产日韩精品一区二区在线观看播放|
国产99久久久国产精品免费直播|
亚洲欧美日韩在线一区|
91热久久免费频精品黑人99|
免费在线视频一区|
中文字幕亚洲精品日韩精品|
亚洲天堂免费|
亚洲天堂2018av|
国产成人综合久久精品亚洲|
亚洲网站在线观看|
日韩久久久精品首页|
成人中文在线|
国产亚洲精品电影|
亚洲成年网站在线观看|
91精品国产自产在线观看|
91麻精品国产91久久久久|
日本精品久久|
亚洲精品美女久久久久网站|