專利名稱：包含吡咯并喹啉醌的維生素及其用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及作為2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶的輔酶的吡咯并喹啉醌、及其用途。
背景技術：
在體內分解氨基酸、糖等時，包括蛋白質在內的多種有機物質作為輔助因子發揮作用。其中，作為輔助氧化還原反應的輔助因子(氧化還原輔酶)，已知有煙酰胺化合物(NAD、NADP)和黃素化合物(FAD、FMN)。1979年，發現了對甲醇營養性菌的甲醇脫氫酶產生輔助作用的新的氧化還原酶，將其命名為吡咯并喹啉醌(也簡寫為PQQ，化學結構如下所示)。
之后，逐漸弄清楚了，PQQ作為包含大腸菌在內的原核生物的脫氫酶的輔酶發揮作用。使人驚奇的是，已證實不僅原核生物，而且植物(蔬菜)、動物(肉類)也含有PQQ。以不含PQQ的飼料喂養小鼠的試驗結果表明，PQQ缺少會導致各種異常。已觀察到缺乏PQQ的小鼠的皮膚的脆弱性、骨質疏松樣骨骼異常、免疫應答低下，大量妊娠鼠在分娩后會將幼鼠吃掉。而且，存活下來的幼鼠的生長狀況差。通過在飼料中添加微量PQQ(每1g飼料大于等于800ng)，這些異常得到糾正。只有一部分細菌能夠合成PQQ，且由腸道內細菌合成的PQQ量在可檢測水平以下。如此提示了PQQ是哺乳類須從外部攝取的重要的營養素，但其在生物體內所擔負的生化方面的作用并不清楚(Killgore，J.，Smidt，C.，Duich，L.，Romero-Chapman，N.，Tinker，D.，Reiser，K.，Melko，M.，Hyde，D.，and Rucker，R.B.(1989).Nutritionalimportance of pyrroloquinoline quinone.Science 245，850-852；Smidt，C.R.，Bean-Knudsen，D.，Kirsch，D.G.，and Rucker，R.B.(1991).Doesthe intestinal microflora synthesize pyrroloquinoline quinone？Biofactors 3，53-59；Steinberg，F.M.，Gershwin，M.E.，and Rucker，R.B.(1994).Dietary pyrroloquinoline quinonegrowth and immuneresponse in BALB/c mice.J.Nutr.124，744-753；以及Stites，T.E.，Mitchell，A.E.，and Rucker，R.B.(2000).Physiological importance ofquinoenzymes and the o-quinone family of cofactors.J.Nutr.130，719-727)。
發明內容
本發明要解決的問題是，通過確定在哺乳類中利用吡咯喹啉醌(PQQ)作為輔酶的酶，進而闡明生物體內PQQ作為輔酶參與的氧化還原反應，由此，闡明PQQ在生物體內的生化作用。本發明要解決的又一問題是，著眼于PQQ在生物體內的生化作用，提供新穎的維生素制劑。
發明人為解決上述問題經過銳意研究結果，成功確定了2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶為哺乳類利用吡咯并喹啉醌(PQQ)作為輔酶的酶。進而，作為鑒定該酶的結果，確定了在包括人在內的動物中PQQ作為一種新的維生素類的重要營養素。
即，根據本發明，提供一種采用吡咯并喹啉醌作為2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶的輔酶的方法。
根據本發明的另一種實施方式，提供一種將2-氨基己二酸-6-半醛轉化為2-氨基己二酸的方法，其包含在吡咯并喹啉醌存在下，使2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶作用于2-氨基己二酸-6-半醛。
根據本發明的再又一種實施方式，提供一種維生素制劑，其含有吡咯并喹啉醌作為2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶的輔酶。
圖1表示哺乳類和酵母的賴氨酸代謝途逕。
在哺乳類的賴氨酸分解途逕(黑色箭頭)中，并行存在酵母氨酸途逕(上)和六氫吡啶羧酸(下)這兩條途逕。酵母的賴氨酸合成途逕以白色箭頭表示。雙箭頭表示的是自發反應。例如，2-氨基己二酸半醛(AAS)和Δ1-哌啶-6-羧化物(P6C)在生物體內處于平衡狀態。LYS2是由LYS5經過翻譯后修飾而4’-磷酸泛酰巰基乙胺化。AASS是AAS的合成酶，AASDH是AAS脫水酶，mLYS5是LYSS的哺乳類同源體。
圖2表示小鼠U26的結構。
腺苷酸化結構域(Pfam00501)、巰基化結構域(Pfam00550)、以及PQQ結合基元(Pfam01011)分別以粉紅色、綠色、淡藍色表示。
(A)表示小鼠U26(小鼠)、果蠅U26(果蠅)、以及酵母LYS2(酵母)的一部分(Ile239-Glu915)推定氨基酸序列的排序。整列的蛋白質之間，一致的氨基酸殘基以黑色背景(黑色背景，白色文字)，雖然不一致但性質相似的氨基酸殘基，則以灰色背景表示。此外，橫線表示的是與細菌的非核糖體肽合成酶群中保存的很好的核心序列相當的區域。
(B)表示小鼠U26的功能結構域的構成和輔助因子的分子結構。巰基化結構域內的絲氨酸殘基(Ser592)被4’-磷酸泛酰巰基乙胺化而進行翻譯后修飾。此外，借助7個串聯PQQ結合基元，PQQ能夠以非共價鍵結合。
圖3表示小鼠U26和其他相關蛋白質之間的比較。
(A)表示PQQ結合基元的結構域的結構。橫線表示的是蛋白質的全長，長方形表示的是PQQ結合基元。公共數據庫的序列號如下所示。大腸菌葡萄糖脫氫酶P15877，假單胞菌(Pseudomonas sp.)聚乙烯醇脫氫酶BAA94193，嗜甲醇營養菌(M.methylotrophus)甲醇脫氫酶P38539。
(B)表示U26和LYS2同源體的分子體系樹。A/T結構域的氨基酸序列(相當于小鼠U26的第34～626號的氨基酸殘基)由親緣近鄰結合法得到。短芽孢桿菌(Bacillus brevis)的短桿菌肽S合成酶A作為外群體(outgroup)。橫線長度表示進化距離，各節點數值表示的是基于1000次試驗的bootstrap概率(％)。公共數據庫的序列號如下所示。鏈孢霉(Neurospora)LYS2同源體CAB97293，短芽孢桿菌短桿菌肽S合成酶AP14687。
圖4表示mU26mRNA表達的組織分布。
Northern blot購自Clonetech公司，以32P標記的mU26cDNA作為探針。各泳道有2μg Poly(A)+RNA進行電泳。
圖5表示影響賴氨酸代謝類酶的mRNA水平的高賴氨酸飼料的效果。
(A和B)表示對于施用了高賴氨酸飼料(黑色圓圈)或通常飼料(白色圓圈)的小鼠，各自血液中賴氨酸(A)和2-氨基己二酸(B)的水平。賴氨酸的量是以相對于血液中的總氨基酸的百分率來表示。2-氨基己二酸是用血液中的賴氨酸進行標準化來表示。圖中的數值是平均值±標準差。
(C)表示賴氨酸代謝類酶的mRNA水平。在從喂養高賴氨酸飼料開始的第20天，摘取心臟和肝臟，采用定量RT-PCR對mAASS、mLys5、mGAPDH的mRNA進行定量。以相對于mGAPDH的相對值作為各mRNA的量，取對照組小鼠的平均值作為1。
圖6表示PQQ缺乏小鼠的賴氨酸和2-氨基己二酸在血液中的水平。
將不含PQQ(-PQQ)或添加有PQQ(+PQQ)的在化學上進行了限定的飼料施用于小鼠20天，采取末梢血，用氨基酸分析儀定量血中的氨基酸。賴氨酸的量(A)以相對于總氨基酸的百分率表示，2-氨基己二酸的量用賴氨酸(B)或甘氨酸進行標準化。橫線是表示各組小鼠的平均值。盡管賴氨酸的量在PQQ缺乏/補給小鼠之間沒有顯著性差異(t＝0.16、d，f＝11)，但PQQ缺乏小鼠的血中2-氨基己二酸的量，與補給小鼠相比，顯著減小(*P＝0.01、**p＝0.05)。
具體實施例方式
以下，針對本發明的實施方式進行詳細說明。
對于高等真核生物的賴氨酸代謝，對于氧化2-氨基己二酸-6-半醛(AAS)而轉換為2-氨基己二酸(AAA)的反應進行催化的酶(AAS脫氫酶；AASDH)到目前為止仍未被確認。本發明人此次從小鼠分離出編碼該酶(AAS脫氫酶；AASDH)的新基因。進而本發明人在該基因產物中找到和PQQ的結合基元，表示其是首個真核生物利用PQQ的酶。到目前為止各跡象提示，PQQ是哺乳類重要的營養素之一，但其在生物體內的生化作用仍不清楚，因而，通常并不被認為是維生素。本發明人證實，PQQ缺乏小鼠中血液中的AAA濃度顯著低下。該事實表明PQQ對于AASDH的活性是必須的，此前不清楚的PQQ的生化之類的作用(即，賴氨酸代謝所必須的氧化還原輔酶)得以澄清。由這些結果應該可以認為，PQQ是一種新的維生素。
如上述，根據本發明，此番首次確認2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶是利用吡咯并喹啉醌作為輔酶的酶。本發明包括使用吡咯并喹啉醌作為2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶的輔酶的全部方法。作為上述使用方法的具體例子，可以舉出，包含在吡咯并喹啉醌存在下，使2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶作用于2-氨基己二酸-6-半醛，并將2-氨基己二酸-6-半醛轉換為2-氨基己二酸的方法。這些反應包括在生物體內進行的情況，以及在生物體外進行的情況(在細胞內進行的情況，在試管內進行的情況這兩方面)這兩方面。
2-氨基己二酸-6-半醛是公知物質，例如，在Aspen，A.J.等，Thepreparation and some properties of α-aminoadipie-δ-semialdehyde(Δ1-piperideine-6-carboxylic acid).Biochemistry 1，600-605(1962)、以及Sacksteder，K.A.等，Identification of the α-aminoadipic semialdehyde synthase gene，which is defective in familial hyperlysinemia.Am.J.Hum.Genet.66，1736-1743(2000)等中已有記載。此外，吡咯并喹啉醌也是公知物質，例如，可以從、sigma-Aldrich 日本以及光純藥工業株式會社等購買。
2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶的堿基序列和氨基酸序列已記載在公共數據庫中，另外在本說明書的序列表中，記載為序列1和2。
當在試管內進行上述本發明轉換反應等情況下，需要使用分離純化的2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶時，可以將編碼該酶的基因進行克隆，再重組入表達載體內，導入宿主進行轉化，并培養得到的轉化體，用常規方法從得到的培養物回收、分離并純化2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶。利用上述基因重組技術制造重組蛋白質，可以依照本領域技術人員公知的方法進行。此外，在生物體或細胞內進行上述本發明的轉換反應時，可以利用生物體或細胞內原本存在的2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶進行轉換反應。
如上述，根據本發明的見解，PQQ由此首次被確認為一種新的維生素。即，根據本發明，可以提供含有吡咯并喹啉醌作為2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶的輔酶的維生素制劑。
維生素是指正常代謝、生長發育或細胞機能調節所必須的物質群，是與酶、輔酶(輔助酶的物質)或其他物質共同發揮功能的物質。此外，維生素是體內合成量不能滿足需要的微量維生素，必須從食物等攝取。
本發明的維生素制劑的劑型并不特別限定，可以從口服或非口服用的劑型中選擇適宜的形式。作為適宜口服的劑型，可以舉出例如，片劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、微粒劑、糖漿劑、溶液劑、乳劑、懸濁劑、咀嚼劑等，作為適于非口服施用的劑型，可以舉出例如，注射劑(皮下注射、肌肉注射、或靜脈注射等)、點滴劑、外用劑(例如，軟膏劑、貼劑、或粘膠劑等形式的透皮吸收劑等)，但并不限于這些。優選點滴(中心靜脈營養)施用、適于透皮施用或口服施用的劑型。
適宜口服施用的液體制劑，例如，溶液劑、乳劑、或糖漿劑等，可以使用水，蔗糖、山梨糖醇、果糖等糖類，聚乙二醇、丙二醇等醇類，芝麻油、橄欖油、大豆油等油類、對羥基苯甲酸酯類等防腐劑，草莓調味劑、薄荷等調味劑等，進行制造。此外，在膠囊劑、片劑、散劑、或顆粒劑等固體制劑的制造中，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖等賦形劑、淀粉、藻酸鈉等崩解劑、硬脂酸鎂、滑石粉等滑潤劑、聚乙烯醇、羥丙基纖維素、明膠等粘合劑、脂肪酸酯等表面活性劑、甘油等可塑劑。
適宜非口服施用的注射用、點滴用或外用制劑，優選在滅菌水性溶劑中以溶解或懸濁狀態含有作為有效成分的PQQ。例如，注射劑的情況下，可以使用鹽溶液、葡萄糖溶液或由鹽水和葡萄糖溶液的混合物構成的水性溶劑等，配制溶液。在非口服施用制劑中，也可以添加從醇類、油類、調味劑類、防腐劑、賦形劑、崩解劑、滑潤劑、粘合劑、表面活性劑、可塑劑等中選擇的1種或2種或2種以上的輔助成分。
進而還可以在本發明的維生素制劑中添加在各種藥品、非處方藥品或食品中公知的維生素類物質。具體而言，也可以在本發明的維生素制劑中添加醋酸視黃酯，棕櫚酸視黃酯、維生素A油、肝油、魚肝油、麥角鈣化醇、維生素D3、d-α-生育酚醋酸酯、dl-α-生育酚醋酸酯、d-α-生育酚、dl-α-生育酚、黃素腺嘌呤二核苷酸鈉、核黃素、核黃素磷酸鈉、核黃素丁酸酯、鹽酸吡哆胺、磷酸吡哆醛、鹽酸羥鈷胺素、醋酸羥鈷胺素、氰鈷胺素、羥鈷胺素、煙酸、煙酰胺、泛酰醇、泛酸鈣、泛酸鈉、生物素、天冬氨酸鉀·鎂等量混合物、煙酸肌醇酯、烏索脫氧膽酸、L-鹽酸半胱氨酸、L-半胱氨酸、乳清酸、γ-谷維素、甘油磷酸鈣、葡萄糖酸鈣、沉淀碳酸鈣、乳酸鈣、無水磷酸氫鈣、磷酸氫鈣、葡萄糖醛酸內酯、葡萄糖醛酰胺、軟骨素硫酸鈉等。對于本領域技術人員來說，可以將這些成分中的1種或2種或2種以上以適當配合比例酌情添加。
本發明的維生素制劑中所含的吡咯并喹啉醌(PQQ)的比例不受特別限定，但一般為0.0001～10重量％，優選為0.0002～0.5重量％左右。例如，維生素制劑中含有的吡咯并喹啉醌(PQQ)的量為0.001～10mg左右的范圍，優選例如0.002～5mg左右的范圍。
本發明的維生素制劑的施用量以及施用次數，可以根據患者年齡、體重以及癥狀等各種重要因素適宜設定，但作為有效成分的吡咯并喹啉醌(PQQ)的施用量一般為每日5～1000μg/體重kg，優選為15～500μg/體重kg左右。本發明的維生素制劑，可以給人或其他任意動物(例如，哺乳類、鳥類等)使用。
本發明使用的吡咯并喹啉醌(PQQ)不只是作為維生素制劑單獨使用，還可以調配入液體營養飲品、作為食品添加劑調配入健康食品。作為含有吡咯并喹啉醌(PQQ)的制品的具體例子，可以舉出包括飲料在內的健康食品或輔助食品，它們一般被稱為，清涼飲料、液體飲品、健康食品、特定保健用食品、功能性食品、功能活性型食品、營養輔助食品、添加劑、飼料、飼料添加物等。作為上述飲食品的具體例子，可以舉出，口香糖、巧克力、糖果、塊狀點心、奶油餅干、餅干、酸奶等點心類、冰激淋、冰點等冷點類、茶、清涼飲料(果汁、咖啡、可口可樂等)、營養液體飲品、美容液體飲品等飲料、面包、熱狗、湯、果醬、通心粉、冷凍食品等所有的飲食品。此外，吡咯并喹啉醌(PQQ)也可以在調味料、食品添加劑等中添加使用。此外，化妝品、洗發香波、生發劑、其他護膚品及護發用品中使用。此外，也可以在磨牙粉、口腔清潔液等口內衛生維持用品中使用。
通過施用本發明的維生素制劑，發揮吡咯并喹啉醌(PQQ)所具有的作為2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶的輔酶的生化功能，由此可以預防、改善或治療PQQ缺乏所致各癥狀。作為這種癥狀，可以舉出皮膚脆弱性、骨質疏松樣骨骼異常、免疫應答低下等。
通過下面的實施例對本發明進一步詳細說明，但本發明的范圍并不限定于實施例所限定的范圍。
實施例實施例1對小鼠U26基因的克隆和結構域構造的評價酵母的2-氨基己二酸(AAA)還原酶為LYS2，具有腺苷酸化(A)結構域和巰基化(T)結構域。這些結構域是在細菌、霉菌的非核糖體肽合成酶(NRPS)中也可以看到的結構(Morris，M.E.等，(1991)Gene98，141-145；Ehmann，D.E.等，(1999)Biochemistry 38，6171-6177；以及關于NRPS的綜述Konz，D.等，(1999)Chem.Biol.6，R39-R48)。
首先，從果蠅(Drosophila melanogaster)的基因組序列數據庫中找出具有結構域A和結構域B兩者的基因產物。采用TBlast檢索法，以保存有結構域A/T的序列為基礎，找到EBONY(公共數據庫保藏號CAA11962)和U26(AAF52679)。這些基因產物都分別具有1個結構域A和結構域T。EBONY被認為是β-丙氨酰多巴胺合成酶(Hovemann，B.T.，等，(1998)Gene 221，1-9)，但U26的功能仍不清楚。重要的是，U26的C末端區域存在有幾個PQQ結合基元。PQQ是作為引起氧化(接受電子)的輔酶而被細菌的脫氫酶利用的分子(Goodwin，P.M.等，(1998)Adv.Microb.Physiol.40，1-80)。由于具有結構域A/T和PQQ結合基元，故而推測U26是果蠅的氨基己二酸半醛脫氫酶(AASDH)。但是，由于有關昆蟲的賴氨酸代謝的信息少，因此轉而研究果蠅U26(dU26)的哺乳類同源體。采用TBlastN法檢索人基因組序列后，在染色體4的q12中找到了具有相同性的序列。以該序列為基礎，分離出小鼠同源體(圖2A)。小鼠U26(mU26)的堿基序列和氨基酸序列在序列表中記載為序列1和序列2。在為得到包含編碼區域全長的cDNA而進行的逆轉錄(RT)-PCR中使用的合成DNA引物如下所示Fw5’-AACTCCTGAGATTTCTCAGCCAC-3’(序列3)Rv5’-ACATTTCCAACCCTCTCACTGAC-3’(序列4)小鼠U26(mU26)的cDNA編碼具有1,100個氨基酸殘基的蛋白質，和dU26比較，有23％個氨基酸殘基相同、43％個相似。mU26也在N末端側各具有一個結構域A/T，C末端側有連續的PQQ結合序列(圖2)。采用ClustalW程序，整列比較mU26、dU26、和酵母LYS2的結構域A/T的序列(圖2A)。檢測到幾個保存完好的部分，幾乎全部這些序列在NRPS識別底物(通常是氨基酸)過程中都相當于必須的核心序列。這表明，和NRPS和LYS2一樣，U26用結構域A/T結合底物。此外，在mU26的C末端區域，具有PQQ結合基元的7次重復結構(圖2、3A)。在細菌的PQQ依賴性脫氫酶中，也已知有6～7次PQQ結合基元的重復結構(Mathews，F.S.(1995)Methods Enzymol.258，191-216)，mU26的結構域和其一致。這些結果(圖3A)支持了mU26是利用PQQ作為氧化還原輔酶的脫氫酶。
實施例2 根據系統解析，AAS·AAA氧化還原酶家族是存在的mU26的序列為基礎，采用TBlastN檢索，清楚了，在線蟲(Caenorhabditis elegans)和擬南芥(Arabidopsis thaliana)中也有U26的同源體(分別為CAB04944和BAA97455)。兩者都作為推測蛋白(從基因組序列推定的假定意義上的蛋白質)記載在數據庫中，但和mU26、dU26一樣，在N末端側分別具有一個結構域A/T，在C末端側存在PQQ結合基元(未顯示數據)。高等真核生物具有U26同源體，這和動物、高等植物具有經由2-氨基己二酸-6-半醛(AAS)的賴氨酸分解通路的事實相符。
這里，針對U26同源體和AAA還原酶(酵母和AKAPAN霉)，進行分子進化學解析。以在這些蛋白質中共同發現的結構域A/T的氨基酸序列為基礎，制成分子系統樹。此時，將短芽孢桿菌的短桿菌肽S合成酶A(Stachelhaus，T.，等，(1995)J.Biol.Chem.270，6163-6169)作為outgroup使用(圖3B)，該酶是已被充分解析的NRPS中的一種。將小鼠、果蠅、線蟲、擬南芥的U26同源體歸類于一組，而AAA還原酶則形成另一組。該系統樹的分枝模式，和真核生物的系統產生模式一致，顯示U26同源體和AAA還原酶具有共通的祖先基因。由該解析表明，含有U26同源體的這些蛋白質群形成了催化AAS←→AAA氧化還原反應的新的酶家族。
實施例3轉換賴氨酸為AAS的AAS合成酶(AASS)在很多器官組織中轉錄(Papes，F.等，(1999)Biochem.J.344，555-563；以及Sacksteder，K.A.等，(2000)Am.J.Hum.Genet.66，1736-1743；參考圖1)，調查了mU26的基因表達是否顯示同樣廣的組織分布。從各種組織提取出來的Poly(A)+RNA，進行Northern印跡解析(印跡板購自Clonetech)，確認在調查的所有組織mU26基因都表達(圖4)。以32P進行放射性標記的mU26的cDNA探針，在所有組織和3種不同長度的轉錄產物進行了雜交。RT-PCR試驗中，由于未檢測到在翻譯區域含有大量缺失的mRNA(數據未顯示)，因而，可以認為這3種轉錄產物是3’非翻譯區中的剪接變異體。mU26和AASS的總體表達類型相似，兩者的mRNA都在心臟、肝臟、以及腎臟高表達。
實施例4通過攝取高賴氨酸飼料，mU26的表達增強使用小鼠，對mU26是否和哺乳類的賴氨酸代謝相關進行了調查。通過攝取含有大量賴氨酸的飼料，分析mU26的mRNA是否增加。與施用小鼠相對于通常飼料，含有2000倍或其以上的游離賴氨酸的飼料(1g通常飼料中添加40mg的L-賴氨酸鹽酸鹽。施用高賴氨酸飼料10天后，血中賴氨酸和AAA的量顯著增加，其高水平維持到第20天(圖5A、B)。它們在血中含量的測定如下進行。從小鼠尾部采取末梢血(15μl)，添加三氯醋酸(終濃度4％)。離心(18,000×g)后，將上清置于氨基酸分析儀(L-8500A；日立)中，對含有賴氨酸的通常氨基酸進行定量。AAA定量中，將離心后的上清在5M鹽酸存在下加水分解(110℃，2小時)，使其干燥后，再次溶解到稀鹽酸中，置于氨基酸分析儀。由于擔心血中的酵母氨酸和AAS的量少，不能采用利用水合茚三酮反應的氨基酸分析儀進行檢測。此外，由于AAS在生物體內的條件下反應性高(不穩定)(Basso，L.V.等，(1962)J.Biol.Chem.237，2239-2245)，因而，檢測出血中的AAS大概很困難。
在開始施用高賴氨酸飼料的第20天，測定肝臟和心臟中的mU26的mRNA水平(小鼠葡萄糖醛-3-磷酸脫氫酶[mGAPDH]的mRNA水平的相對值)。mRNA水平的定量中，使用Applied Biosystems的SYBRGreen PCR Master Mix進行實時PCR(ABI7000)。PCR探針如下mGAPDH5’-TGCACCACCAACTGCTTAG-3’(序列5)5’-GGATGCAGGGATGATGTTC-3’(序列6)mAASS5’-CGCAGACCAGCAAATTATTCAC-3’(序列7)5’-ATTCCGTAGCCTCGATTGGA-3’(序列8)mU265’-CTGGTGAGAGCGGCTGTACA-3’(序列9)
5’-GGACAGGTCGACAGCCTTCA-3’(序列10)mLys55’-TGATGAATGGACTCAGCTGGAT-3’(序列11)5’-CCTGACCAATGTCCATGTTTAATG-3’(序列12)其結果和施用了通常飼料的小鼠相比，施用了高賴氨酸飼料的小鼠的mU26mRNA量，在肝臟增加了1.6倍，在心臟增加了1.4倍(圖5C)。作為對照，同時測定了mAASS和mLyS5(酵母Lys5的小鼠同源體；參考圖1)的mRNA水平，兩者在施用了高賴氨酸飼料的小鼠的肝臟和心臟都增加。這些試驗事實表明，在賴氨酸代謝系中存在有反饋系統，意味著除mAASS、mLYS5外，mU26也與賴氨酸降解相關。
實施例5PQQ缺乏小鼠的血中氨基己二酸減少為弄清楚PQQ的賦予AASDH活性的作用，施用小鼠不含PQQ的飼料，調查其影響。按照文獻(Killgore，J.等，(1989)Science 245，850-852；Steinberg，F.M.等，(1994)J.Nutr.124，744-753)，配制化學上進行了限定的飼料(不添加PQQ，每1g飼料添加1000ng的PQQ·2Na)，施用于沒有進行過交尾的雌性小鼠(ICR，4周齡)20天。根據已經敘述的方法，測定各氨基酸和AAA在血中的濃度。其結果是，賴氨酸的量并沒有因為攝取缺乏PQQ飼料而發生變化(圖6A)，確認進行著有關賴氨酸分子本身來保持平衡的代謝。如前所述，沒能檢測到酵母氨酸和AAS，但在PQQ缺乏的小鼠中，發現AAA的血中水平顯著減少(圖6B、C)。該AAA減少的情況，無論用何種氨基酸(例如甘氨酸；圖6C)的量將AAA的量標準化，都是有意義的，尤其當以賴氨酸的量進行標準化時，AAA的減少更為明顯(圖6B)。其結果是，在PQQ缺乏小鼠中，AASDH(即mU26)的活性減弱，指示PQQ作為氧化還原輔酶對AASDH來說是必要的。
產業上利用可能性根據本發明，確認在哺乳類中利用吡咯并喹啉醌(PQQ)作為輔酶的酶是2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶，由此，特定了在生物體內PQQ作為輔酶而參與的氧化還原反應，闡明了生物體內的PQQ的生化作用。根據本發明，提供利用PQQ的新的維生素制劑成為可能。
序列表<110>RIKEN<120>由吡咯并喹啉醌構成的維生素及其用途<130>A31759A<160>12<210>1<211>3303<212>DNA<213>小鼠<400>1atgactcttc aggagttggt gcttcggact gcctctgtct atatggatag aacagctgta 60tgttttgacg aaggcaataa ccagcctcca gtgtgctatt cctacaaggc tctgttgagc 120gcggcttcag aattatccca ttttctgata gcacactgtg actttggagg aattcgggaa 180attggtctct attgtcaacc tgggataaac ttaccctcct ggattttagg gattcttcag 240gtccccgcag cgtatgcgcc cattgatcca gactccccac cgtccttatc aacttacttt 300atgaaaaaat gtgacctaaa gtatgttctc gttgaaaaac agcagcttag taaattcaaa 360tcttcacatg agacagttct gaactatgac acagtttccg tggaacacaa ggacctggca 420ctcttcagac tgcattggga agatggtcgg gtgagcacag tgcttggtga cagagcagat 480cagcacaagg tgacggatag agaagacaga gtgagtgctg agagcaggac cccagagaag 540gagcacatgg acatgcggca tgacggttgc ttggcttatg tcctccatac ctcagggacc 600acggggacac cgaagattgt cagagtgccc catgcatgca tactgcctaa tatccagcac 660ttccggtcac tttttgacat cactcaagaa gacattttgt ttctggcttc tcctctgacc 720ttcgatccat ctgttgtgga gatatttgtt tctctgtcca gtggggcctg cctgcttatc 780gtgccaactt ctgtcaaagt gctaccatca aaattagctg acattctctt ttcccgccac 840agagtgactg ttttacaggc aacgccaaca ttgctgagaa gatttggatc tgagctcatc 900aagtccactg tcctgtcagc gcatacgtct ctgagagtcc tggccctcgg tggggaagcc 960ttcccctcgc tgaccatcct caaaagctgg cgaggcaaag gcaacagaac ccagatattt 1020aacatctatg gtatcacaga ggtatccagc tgggccactt tttacaggat cccagaggag 1080attcttaatt ctgccgtgaa acatgaatcc cctgtgcagc tggggtcgcc actacttgga 1140acggtgattg aagtcagaga ccaaaatggt tctccagttc tcgaaggcac tggccaagta 1200tttttaggtg ggaagaacag agtgtgtttt cttgatgatg aaatgacagt gccccttggc 1260accatgagag ccacaggaga ctttgtgact gtgaaagatg gagagatatt tttcttggga 1320agaaaggaca gccagatcaa gcgccatggc aaacgtctta acattgcact tgtgcaacag 1380gttgctgaag aacttcgcca ggtggagtcc tgcgcggtca cttggtataa tcaggaaaga 1440ttgattctct tcatcgtatc caaagttgac ttagtaaagg actgcatctt taaagaattg 1500cagaaacacc ttccagcaca cgccctgcct gatgacatgg tgctgatcga taccctgcca 1560tttacatgcc atggcaaagt tgatgtttct gagttaaaca agatatattt agactacata 1620agctcacagc ctaggaatga actccatgga aaagaggaac tttggggaaa attacagtat 1680ttatggaagt ctattctgtg tctccctgag gatccagagg atactctgaa ggttcccgcc 1740aactccgtct ttttagatag tggtggggat tccctcaagt ccatgcggct cctcagtgag 1800attgagaggc tcaccgggac agccatccct ggccttctgg aagttatcct cagcagttcc 1860ctcttagacg tttacaacca catcgttcaa gccgtgttca caccggagga caggaaagcc 1920aacaggagtt acaccacaaa aaggaaattc agtgatgctg atccagagga agccagcggg 1980
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<223>人工序列的描述合成DNA<400>8attccgtagc ctcgattgga 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA
<400>9ctggtgagag cggctgtaca 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
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<223>人工序列的描述合成DNA<400>11tgatgaatgg actcagctgg at 22<210>12<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述合成DNA<400>12cctgaccaat gtccatgttt aatg2權利要求
1.吡咯并喹啉醌作為2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶的輔酶的使用方法。
2.將2-氨基己二酸-6-半醛轉換為2-氨基己二酸的方法，其包含在吡咯并喹啉醌存在下，使2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶作用于2-氨基己二酸-6-半醛。
3.一種維生素制劑，其包含作為2-氨基己二酸-6-半醛脫氫酶的輔酶的吡咯并喹啉醌。
全文摘要
本發明的目的在于，確定哺乳類中利用吡咯并喹啉醌(PQQ)作為輔酶的酶，進而闡明生物體內PQQ作為輔酶參與的氧化還原反應，由此闡明PQQ在生物體內的生化作用。根據本發明，提供吡咯并喹啉醌作為2－氨基己二酸－6－半醛脫氫酶的輔酶的使用方法。
文檔編號A61P43/00GK1771038SQ20048000903
公開日2006年5月10日 申請日期2004年1月29日 優先權日2003年1月30日
發明者笠原和起, 加藤忠史 申請人:獨立行政法人理化學研究所