專利名稱：治療血友病的治療產(chǎn)品以及利用其治療血友病的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用中空納米粒子治療血友病的治療產(chǎn)品(藥物)以及利用其治療血友病的方法。尤其是，本發(fā)明涉及含有裝入用于轉(zhuǎn)入細(xì)胞的粒子中的物質(zhì)的治療產(chǎn)品(藥物)，所述物質(zhì)可以特異性導(dǎo)入細(xì)胞中用于血友病治療，本發(fā)明還涉及利用該產(chǎn)品治療血友病的方法。
本申請要求2003年3月17提交的日本專利申請2003-071788的優(yōu)先權(quán)，在此處引入作為參考。
背景技術(shù)：
在近年來醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，研制直接作用于感染位點(diǎn)顯示高治療效果又具有較少副作用的藥物正在活躍地進(jìn)行當(dāng)中。尤其是，稱作藥物遞送系統(tǒng)(DDS)的方法作為特異性轉(zhuǎn)運(yùn)有效組分諸如藥物的有效組分到靶細(xì)胞或者組織使得組分作用于目標(biāo)位點(diǎn)的方法正在吸引人們的廣泛關(guān)注。
另一方面，在近幾年來的分子細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，對基因轉(zhuǎn)移到指定細(xì)胞的研究也正在成為不可或缺的技術(shù)。而且，隨著人類基因組計(jì)劃的進(jìn)展，各種疾病的遺傳背景已經(jīng)變得不再神秘。因此，如果顯示出對于這些細(xì)胞或者組織高特異性的基因轉(zhuǎn)移方法目前已被建立，將該方法應(yīng)用于基因治療領(lǐng)域?qū)⒊蔀榭赡堋?br>
在將基因引入細(xì)胞的方法中，已知存在將基因轉(zhuǎn)入大分子然后通過內(nèi)吞作用吸入細(xì)胞的方法(磷酸鈣法或者ripofectomaine法)以及將電脈沖刺激施加于細(xì)胞膜使其通透從而使基因被吸入細(xì)胞的方法(電穿孔法或者基因槍方法)。這兩種方法目前都被應(yīng)用于分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中。
這些方法雖然簡單，但是易于直接物理性損傷細(xì)胞。而且，基因轉(zhuǎn)移的位點(diǎn)必須通過外科方法暴露。為此，該方法不能輕易地施加于活體的細(xì)胞或者組織。此外，它難以實(shí)現(xiàn)接近100％的轉(zhuǎn)移率。
還有已知作為將物質(zhì)較安全引入的脂質(zhì)體方法。該方法可應(yīng)用于活體的細(xì)胞或者組織因?yàn)槠洳粨p傷細(xì)胞。然而，該方法存在的問題是它難以對單純脂質(zhì)的脂質(zhì)體上的細(xì)胞或者組織賦予高特異性，而且體內(nèi)基因轉(zhuǎn)移率比期待值要顯著低。
近來發(fā)展了一種將目的基因摻入病毒DNA產(chǎn)生感染性病毒以便影響基因?qū)氲募夹g(shù)。本方法作為用于基因治療多種遺傳以及獲得性疾病的劃時(shí)代的方法吸引了廣泛關(guān)注，因?yàn)樵摲椒ú挥脤⑥D(zhuǎn)移位點(diǎn)暴露在外，可以應(yīng)用于個(gè)體并且具有接近100％的轉(zhuǎn)移效率。
例如，血友病為由于缺乏凝血因子以出血作為主要癥狀的遺傳性疾病。人們注意到血友病A由缺乏凝血因子VIII(抗血友病因子)引起，而且血友病B由缺乏凝血因子IX(克里斯馬斯氏因子)引起。血友病A以及血友病B分別由X染色體上因子VIII以及IX的基因失調(diào)引起。通常，通過靜脈注射VIII(IX)因子藥物的補(bǔ)充治療被用于血友病患者。在這一點(diǎn)上，為了恒量表達(dá)接近生理水平量的凝血因子VIII(IX)，例如在日本專利公開2002-527493中提出了制備包括編碼因子VIII的序列的腺伴隨載體以及將如此制備的載體施用于血友病A患者的技術(shù)。
然而，采用病毒DNA的基因轉(zhuǎn)移的嚴(yán)重問題在于病毒非特異性感染多種細(xì)胞，因此基因被引入除了靶細(xì)胞以外的其他細(xì)胞。還有一種可能就是病毒基因組本身被整合到染色體引起將來無法預(yù)料的副作用。而且，因?yàn)椴《救狈?xì)胞或者組織特異性，如果VIII因子將被表達(dá)于肝中，必須將載體施用于例如門靜脈，或者根據(jù)組織學(xué)類型連接編碼因子VIII的序列和特異性轉(zhuǎn)錄的控制序列。
本發(fā)明者也在日本公開特許公告2001-316298中提出了利用蛋白的中空納米粒子特異性安全地將諸如基因，蛋白或者化合物的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)以及引入靶細(xì)胞或者組織的方法，所述蛋白顯示出粒子形成能力并且向其中引入了生物識別分子。
根據(jù)公開在日本公開特許公告2001-316298中技術(shù)，借助于中空納米粒子可以轉(zhuǎn)運(yùn)多種物質(zhì)?，F(xiàn)在有責(zé)任進(jìn)一步開發(fā)利用該技術(shù)治療特定疾病諸如血友病的藥物。
發(fā)明公開鑒于上述本領(lǐng)域的發(fā)展?fàn)顩r，本發(fā)明的目的是提供治療血友病的藥物，其中凝血因子的基因可以通過簡單的引入方法被有效地引入肝細(xì)胞，同時(shí)具有最小的副作用，以及利用該藥物治療血友病的方法。
本發(fā)明者已經(jīng)進(jìn)行了長久的研究，并且通過靜脈內(nèi)注射包含凝血因子VIII以及IX的基因的乙型肝炎病毒表面抗原粒子的實(shí)驗(yàn)到植入了人肝癌細(xì)胞的試驗(yàn)動物，發(fā)現(xiàn)基因可以特異性引入來源于人肝臟的組織部分表達(dá)凝血因子從而產(chǎn)生治療血友病的有利結(jié)果。該發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明，提供了用于治療血友病包括由顯示出粒子形成能力的蛋白形成的中空納米粒子以及用于治療血友病埋入中空納米粒子的基因的藥物。
根據(jù)本發(fā)明，提供了用于治療血友病的藥物，包括由引入生物識別分子到蛋白粒子形成的中空納米粒子以及用于治療血友病，埋入中空納米粒子的基因，所述蛋白粒子獲得自真核細(xì)胞中表達(dá)的蛋白。
形成粒子的蛋白可以例如為乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。當(dāng)表達(dá)在真核細(xì)胞中時(shí)，蛋白作為膜蛋白表達(dá)并且聚集在泡囊膜上并作為粒子釋放。如此產(chǎn)生的中空納米粒子能夠識別肝細(xì)胞并特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)粒子中的物質(zhì)到肝細(xì)胞，以便通過埋入用于血友病治療的基因，具體為凝血因子VIII或者IX于中空粒子中，這些基因可以特異性表達(dá)在肝細(xì)胞中。
用于本發(fā)明治療的藥物可以通過靜脈注射的簡單方法有效地治療血友病并可以直接最小副作用危險(xiǎn)地用于臨床應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明用于治療血友病的方法通過施用用于治療本發(fā)明的血友病的藥物治療血友病。
本發(fā)明的其它目的以及優(yōu)點(diǎn)根據(jù)其下列優(yōu)選實(shí)施方案的說明特別是結(jié)合附圖將變得更加顯而易見。
圖1圖示了根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的HBsAg基因的不同蛋白區(qū)域。
圖2圖示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案采用重組體酵母表達(dá)以及純化HBsAg粒子的操作。
圖3顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案通過包含hFVIII基因的HBsAg粒子表達(dá)凝血因子VIII的表達(dá)效果。
圖4顯示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案通過包含hFIX基因的HBsAg粒子表達(dá)凝血因子IX的效果。
本發(fā)明的最佳實(shí)施方案體現(xiàn)本發(fā)明的中空納米粒子將生物識別分子引入具有粒子形成能力的蛋白使其可以特異性轉(zhuǎn)運(yùn)編碼凝血因子VIII以及IX的基因到目的細(xì)胞或者組織，例如到肝細(xì)胞或者肝臟組織。具有粒子形成能力的蛋白可以例如是從多種病毒獲得的亞病毒顆粒。蛋白例如可以是乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原蛋白。
由具有這種粒子形成能力的蛋白形成的蛋白粒子例如可以是通過在真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白獲得的蛋白粒子。簡而言之，如果具有粒子形成能力的蛋白表達(dá)在真核細(xì)胞中，蛋白作為膜蛋白表達(dá)并且聚集在囊泡膜上以便作為粒子釋放。真核細(xì)胞例如可以是酵母，重組體酵母，昆蟲細(xì)胞以及動物細(xì)胞。
如隨后實(shí)施例所述，本發(fā)明者發(fā)現(xiàn)并且報(bào)道，通過在重組體酵母中表達(dá)上述的HBV表面抗原L蛋白，可以形成大量基本上呈橢圓形的中空粒子，每一具有大約20nm的小頭直徑以及大約150nm的大頭直徑，并且每一具有埋于酵母來源雙脂質(zhì)層中的HBV表面抗原L蛋白(J.Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953-1961，1992)。因?yàn)檫@些粒子既不包含HBV基因組又不包含HBV蛋白并且由此不起病毒的作用，粒子對于人體是非常安全的。而且，這些粒子顯示特異于肝細(xì)胞的受體，該受體位于其表面上對HBV的肝細(xì)胞顯示極強(qiáng)的傳染力，由此粒子顯示出作為特異性轉(zhuǎn)運(yùn)物質(zhì)到肝細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)工具的高效力。
利用重組體酵母形成蛋白粒子的方法很方便，因?yàn)榱Ｗ涌梢愿咝У貜募?xì)胞裂解物中的可溶性蛋白產(chǎn)生。
另一方面，采用昆蟲細(xì)胞以及動物細(xì)胞的方法據(jù)報(bào)道是大量產(chǎn)生外源蛋白所希望的方法因?yàn)檫@些細(xì)胞是比酵母細(xì)胞更接近于高等動物細(xì)胞的真核細(xì)胞，并且因?yàn)槔ハx細(xì)胞以及動物細(xì)胞能夠再生酵母不能再生的高位結(jié)構(gòu)，諸如糖鏈。昆蟲細(xì)胞的常規(guī)系統(tǒng)采用巴庫洛病毒，并且伴隨表達(dá)病毒，因此在蛋白表達(dá)的時(shí)候細(xì)胞死亡或者溶解。因此，存在的問題就是連續(xù)地進(jìn)行蛋白表達(dá)或者通過從死細(xì)胞分離的蛋白酶分解蛋白。而且，如果蛋白表達(dá)在分泌物上，培養(yǎng)基中所含的胎牛血清大量地混合使其難以純化粒子。然而，不采用巴庫洛病毒并且可以進(jìn)行無血清培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)近來已由Invitrogen公司開發(fā)，并且正在進(jìn)入銷售。因此，借助于這種昆蟲細(xì)胞系統(tǒng)，有可能獲得可以及其容易純化并且可以再現(xiàn)高位結(jié)構(gòu)的蛋白粒子。
借助本發(fā)明的中空納米粒子，通過將上述各種方法獲得的粒子表面的受體改變?yōu)槿芜x的生物識別分子，可以將物質(zhì)極高特異性地轉(zhuǎn)運(yùn)并且引入除了肝細(xì)胞外任選的細(xì)胞或者組織。
當(dāng)然，顯示出粒子形成能力的蛋白不局限于上述的乙型肝炎病毒表面抗原蛋白，并且可以是來源于動物細(xì)胞，植物細(xì)胞，病毒或者細(xì)菌或者任何多種合成蛋白的任一天然蛋白。如果例如是來源于病毒的抗原蛋白可能誘導(dǎo)活體中的抗體，這種被修飾減小其抗原性的蛋白可以用作生物識別分子。
被引入顯示出粒子形成能力蛋白中的生物識別分子優(yōu)選地例如為生長因子，細(xì)胞功能調(diào)節(jié)分子，諸如細(xì)胞因子，細(xì)胞表面抗原，組織特異性抗原，識別細(xì)胞或者組織的分子，諸如受體，來源于病毒以及微生物的分子，抗體，糖鏈或者脂質(zhì)。這些可以根據(jù)靶細(xì)胞或者組織進(jìn)行合適地選擇以及應(yīng)用。
根據(jù)本發(fā)明，編碼凝血因子VIII以及IX，希望被引入任選的細(xì)胞或者組織假若是肝細(xì)胞或者組織的基因被封入上述中空納米粒子中產(chǎn)生用于治療血友病的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)工具。
為了將基因引入上述的中空納米粒子，可以利用用于化學(xué)實(shí)驗(yàn)或者分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的任何多種常規(guī)技術(shù)。這些方法的實(shí)例包括電穿孔法，超聲波法，單向擴(kuò)散法或者采用電荷脂質(zhì)的方法。
利用這些中空納米粒子或者物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)工具，將特定物質(zhì)體內(nèi)或者體外轉(zhuǎn)入細(xì)胞或者組織成為可能。此外，借助于中空納米粒子或者物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)工具可以將物質(zhì)引入特定細(xì)胞或者組織作為治療各種疾病的方法或者其中的一個(gè)步驟。
本發(fā)明的藥物的效力實(shí)際上已經(jīng)通過下面將要解釋的實(shí)施例所述的動物試驗(yàn)得以證實(shí)。在這些實(shí)施例中，包含編碼凝血因子VIII以及IX的本發(fā)明藥物的效力通過如下方法得以證實(shí)首先將藥物施用于移植有來源于人肝癌的細(xì)胞的裸鼠，然后測定血清中凝血因子VIII以及IX的表達(dá)水平。雖然藥物通過靜脈內(nèi)施用，藥物也可以口服，肌內(nèi)注射，腹膜內(nèi)或者皮下施用。
本發(fā)明現(xiàn)在將如同參考附圖一樣參考特定的實(shí)施例進(jìn)行更詳細(xì)的解釋。本發(fā)明不局限于下列實(shí)施例，并且可以包含各種變化，取代或等效物，只要不背離在權(quán)利要求中限定的本發(fā)明的目的以及范圍。
實(shí)施例在該實(shí)施例中，下述的HBsAg表示乙型肝炎病毒表面抗原。具體地，HBsAg是HBV.的外殼蛋白。參考圖1的示意圖，在HBsAg中有3個(gè)蛋白，也就是S-蛋白，M-蛋白以及L-蛋白。其中，S-蛋白是為這3個(gè)蛋白所共有的重要的外殼蛋白。M-蛋白是由55個(gè)氨基酸組成的前-S2肽，并且其連接于S-蛋白的N-末端側(cè)。L-蛋白是由108個(gè)或者119個(gè)氨基酸組成的前-S1肽，并且其連接于M-蛋白的N-末端側(cè)。這種L-蛋白的堿基序列以及氨基酸序列分別由序列1以及2表示。
在已知的方法中，HBsAg的L-蛋白的前-S1結(jié)構(gòu)域具有直接接合肝細(xì)胞的位點(diǎn)并且當(dāng)HBV結(jié)合于肝細(xì)胞時(shí)起重要的作用(Cell.Vol.46，429-436，1986J.of Virol.，Vol.73，2052-2057，1999)。
當(dāng)?shù)鞍譎BsAg表達(dá)在真核細(xì)胞中時(shí)，蛋白作為膜蛋白表達(dá)并且聚集在泡囊膜上。HBsAg的L-蛋白分子在絮凝期間絮凝在一起并且吸收在泡囊膜中。HBsAg的L-蛋白的這種絮凝的分子作為粒子以出芽方式釋放在細(xì)胞腔側(cè)。
在下述的實(shí)施例中，使用HBsAg的L-蛋白。圖2圖示了用于下列實(shí)施例中描述的HBsAg粒子純化的表達(dá)以及操作。
實(shí)施例1由重組體酵母表達(dá)HBsA粒子根據(jù)本發(fā)明者報(bào)道的文獻(xiàn)J.Bio.Chem.，Vol.267，No.3，1953-1961，1992，將具有L-蛋白表達(dá)質(zhì)粒pGLDLIIP39-RcT的重組體酵母(Saccharomyces Cerevisiae AH22R-菌株)培養(yǎng)在合成培養(yǎng)基High-Pi以及855N-P400中表達(dá)L-蛋白粒子(圖2a以及2b)。從穩(wěn)定生長期(大約72小時(shí)后)的重組體酵母，利用Pierce Chemicals有限公司生產(chǎn)的酵母蛋白質(zhì)提取試劑制備全細(xì)胞提取物。全細(xì)胞提取物中的蛋白由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)彼此分離，并且通過銀染色鑒定樣品中的HBsAg。以這種方式，HBsAg被證實(shí)是具有大約52kDa分子量的蛋白。
實(shí)施例2從重組體酵母純化HBsAg粒子(1)將培養(yǎng)在合成培養(yǎng)基855N-P400上的重組體酵母(濕重26g)懸浮在100ml的緩沖溶液A(7.5M尿素，0.1M磷酸鈉(pH 7.2)，15mMEDTA，2mM PMSF以及0.1％吐溫80)中，并且利用珠子攪拌器(BEAD-BEATER)用玻璃珠對酵母進(jìn)行勻漿化。勻漿化后，通過離心回收上清液(圖2c以及2d)。
(2)然后將上清液與0.75-倍體積的33％(wlw)PEG6OOO混合并且用冰冷卻產(chǎn)生的混合物30分鐘。然后，在7000rpm離心30分鐘后回收沉淀。然后將沉淀重新懸浮在不含吐溫80的緩沖液A溶液中。
(3)重新懸浮后將溶液在顯示10到40％密度梯度范圍的CsCl中進(jìn)行分層。然后將溶液在28000rpm超離心16小時(shí)。離心的樣品分離成12級分并且通過Western印跡法鑒定含HBsAg的級分，其中第一抗體是抗HBsAg單克隆抗體。進(jìn)一步，利用不含吐溫80的緩沖液A溶液透析含HBsAg的級分。
(4)在(3)中透析獲得的溶液(12ml)在糖上分層，顯示出從5到50％的密度梯度范圍。然后將生成的物質(zhì)在28000rpm超離心16小時(shí)。離心后，像(3)一樣鑒定含HBsAg的級分。含HBsAg的級分用不含尿素也不含吐溫80但是含0.85％NaCl的緩沖液A溶液進(jìn)行透析(圖2e中(2)到(4))。
(5)重復(fù)以上(4)的類似操作。利用Advantec公司生產(chǎn)的超濾器Q2000濃縮透析的樣品，并保藏在4℃直至使用(圖2f)。CsCl平衡離心后Western印跡(3)的結(jié)果表明HBsAg是分子量為52kDa顯示出S-抗原性的蛋白。最終，約24mg的純化HBsAg粒子可以從濕重26g來源于培養(yǎng)基2.5L的細(xì)胞裂解物獲得。
利用銀染色SDS-PAGE分析來自純化操作的序列的級分。另外，為了證實(shí)酵母來源的蛋白酶已通過凈化過程除去，將通過(5)獲得的HBsAg粒子培養(yǎng)在37℃12小時(shí)，并進(jìn)行SDS-PAGE 12小時(shí)，繼之以SDS-PAGE，通過銀染色進(jìn)行鑒定。結(jié)果，證實(shí)來源于酵母的蛋白酶在序列純化步驟中被完全除去。
實(shí)施例3將hFVIIJ以及hFIX基因封入HBsA粒子(制備包括hFVIII以及hFIX基因埋入其中的HBsAg粒子)將通過上述方法制備的HBsAg粒子中封入編碼人凝血因子VIII(IX)的基因(hFVIII以及hFIX)作為治療血友病的基因從而產(chǎn)生埋入基因(hFVIII以及hFIX)的HBsAg粒子作為本發(fā)明的藥物。
在本實(shí)施例中，由Torino大學(xué)的Dr.L.Naldini捐贈的pRRLsin.cPPT.CMV.FVIII.Wpre以及pRRLsin.cPPT.Alb.FIX.Wpre(Human Gene Therapy，Vol.13，243-260，2002)被用作用于將hFVIJI以及hFIX基因封入HBsAg粒子的表達(dá)載體。
具有hFVIII(hFIX)基因埋入其中的HBsAg粒子通過電穿孔法方將上述表達(dá)載體引入HBsAg粒子進(jìn)行制備。具體地，將20μg的上述表達(dá)載體添加給溶于500μl的PBS(pH 7.2)的HBsAg粒子中的100μg的L-蛋白粒子。利用4mm的樣品池在Gene Pulser II電穿孔系統(tǒng)(由Bio-Rad有限公司生產(chǎn))上，于50V以及750μF進(jìn)行電穿孔。
實(shí)施例4由埋入hFVIII(hFIX)基因的HBsAg粒子在移植有人肝癌的裸鼠中表達(dá)凝血因子VIII (IX)的效果利用試驗(yàn)用動物檢驗(yàn)由上述實(shí)施例制備的封入hFVIII(hFIX)基因的HBsAg粒子表達(dá)凝血因子VIII(IX)的效果。
在本實(shí)施例中，將來源于人肝癌Nue的1×107個(gè)細(xì)胞施用于從Nippon Clair有限公司購買的試驗(yàn)動物裸鼠(Balb/cnu/nu，雌性，5周齡)的兩側(cè)背部皮下區(qū)域。飼養(yǎng)小鼠大約5到6周直到實(shí)體癌生長到約1cm直徑的大小產(chǎn)生患有癌癥的小鼠。
埋入其中約20μg hFVIII(hFIX)基因表達(dá)載體的HBsAg粒子通過尾部靜脈施用于上述患癌小鼠，并且通過酶免疫分析(ELISA)測定血液中凝血因子VIII(IX)的量隨時(shí)間的變化。利用分別特異性于VIII以及IX因子的Asserachom VIIICAg試劑盒以及Asserachom IXAg試劑盒(由Diagnostica Stago Inc生產(chǎn))，進(jìn)行ELISA。
使用施用來源于人結(jié)腸癌WiDr的1×107個(gè)細(xì)胞獲得的患癌小鼠作為陰性對照，并且利用如上所述的方法測定血漿中凝血因子VIII(IX)的量。
測定的血漿中凝血因子VIII相對于上述試劑盒的陽性對照血漿中凝血因子VIII的轉(zhuǎn)移部分的％量顯示在圖3中。血漿中凝血因子IX的濃度轉(zhuǎn)移顯示在圖4中。從圖3以及圖4可以看出，陰性對照隨時(shí)間沒有變化，而施用了來源于人肝癌的腫瘤細(xì)胞的小鼠(Nue)約十天后觀察到凝血因子VIII以及IX的表達(dá)，并且表達(dá)水平達(dá)到人類病人從嚴(yán)重病態(tài)恢復(fù)到中度病態(tài)的值(Cur.Gene Therapy，Vol.1，301到305，2001)。然后該水平保持至少持續(xù)一個(gè)月并且隨后約40天后降低。這種表達(dá)的下降可能歸因于由于腫瘤細(xì)胞(Nue)引起癌癥的壞死。
因此，已經(jīng)證實(shí)含hFVIII(hFIX)基因作為體現(xiàn)本發(fā)明藥物的HBsAg粒子能夠?qū)⒒蚋咛禺愋圆⑶腋咝У匾肴祟惛渭?xì)胞，并且實(shí)際上顯示出抗血友病的療效。此外，根據(jù)本試驗(yàn)，由含F(xiàn)VIII(hFIX)基因的HBsAg粒子治療血友病的方案可以建立在試驗(yàn)動物的水平上。
雖然pRRRLsinPPTCMVFVIIIpre(pRRLsinPPTAlbFIXpre)在上述實(shí)施例中用作表達(dá)hFVIII(hflX)基因的載體，本發(fā)明并不限于此，諸如描述于出版物Cur.Gene Therapy，Vol.1，301-305，2001中的多種載體也可以使用。例如凝血因子VIII的輕以及重鏈可以整合在不同的載體中。此外，缺乏B-結(jié)構(gòu)域的凝血因子VIII也可以整合在載體中用于實(shí)現(xiàn)類似的結(jié)果。
工業(yè)實(shí)用性根據(jù)本發(fā)明用于治療血友病的上述藥物可以通過靜脈注射的簡單方法可以有效地治療血友病并可以直接最小副作用危險(xiǎn)地用于臨床應(yīng)用。
序列表<110>株式會社貝亞克萊(BEACLE Inc.)法蘭德斯校際生物技術(shù)研究所(VIB(VLAAMS INTERUNIVERSITAIRINSTITUUT VOOR BIOTECHNOLOGIE)VZW)D.COLLEN RESEARCH FOUNDATION VZW ONDERWIJS EN NAVORSINGCAMPUS GASTHUISERG K.U.LEUVEN<120>治療血友病的治療產(chǎn)品以及利用其治療血友病的方法(DRUG FOR TREATINGHEMOPHILIA AND METHOD OF TREATING HEMOPHILIA USING THESAME)<130>03P08BK01<160>2<210>1<211>1218<212>DNA<213>Hepatitis B virus<220>
<221>CDS<222>(1)..(1218)<400>1atg aga tct ttg ttg atc ttg gtt ttg tgt ttc ttg cca ttg gct gct48Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala1 5 10 15ttg ggt aag gtt cga caa ggc atg ggg acg aat ctt tct gtt ccc aat96
Leu Gly Lys Val Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn20 25 30cct ctg gga ttc ttt ccc gat cac cag ttg gac cct gcg ttc gga gcc144Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala35 40 45aac tca aac aat cca gat tgg gac ttc aac ccc aac aag gat caa tgg192Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Gln Trp50 55 60cca gag gca aat cag gta gga gcg gga gca ttc ggg cca ggg ttc acc240Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr65 70 75 80cca cca cac ggc ggt ctt ttg ggg tgg agc cct cag gct cag ggc ata288Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile85 90 95ttg aca aca gtg cca gca gca cct cct cct gcc tcc acc aat cgg cag336Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln100 105 110tca gga aga cag cct act ccc atc tct cca cct cta aga gac agt cat384Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His115 120 125cct cag gcc atg cag tgg aat tcc aca aca ttc cac caa gct ctg cta432Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu
130 135 140gat ccc aga gtg agg ggc cta tat ttt cct gct ggt ggc tcc agt tcc480Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser145 150 155 160gga aca gta aac cct gtt ccg act act gcc tca ccc ata tct ggg gac528Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Gly Asp165 170 175cct gca ccg aac atg gag aac aca aca tca gga ttc cta gga ccc ctg576Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu180 185 190ctc gtg tta cag gcg ggg ttt ttc ttg ttg aca aga atc ctc aca ata624Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile195 200 205cca cag agt cta gac tcg tgg tgg act tct ctc aat ttt cta ggg gga672Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly210 215 220gca ccc acg tgt cct ggc caa aat tcg cag tcc cca acc tcc aat cac720Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His225 230 235 240tca cca acc tct tgt cct cca att tgt cct ggc tat cgc tgg atg tgt768Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys245 250 255
ctg cgg cgt ttt atc ata ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc atc816Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile260 265 270ttc ttg ttg gtt ctt ctg gac tac caa ggt atg ttg ccc gtt tgt cct864Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro275 280 285cta ctt cca gga aca tca acc acc agc acg ggg cca tgc aag acc tgc912Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys290 295 300acg att cct gct caa gga acc tct atg ttt ccc tct tgt tgc tgt aca960Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr305 310 315 320aaa cct tcg gac gga aac tgc act tgt att ccc atc cca tca tcc tgg 1008Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp325 330 335gct ttc gca aga ttc cta tgg gag tgg gcc tca gtc cgt ttc tcc tgg 1056Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp340 345 350ctc agt tta cta gtg cca ttt gtt cag tgg ttc gta ggg ctt tcc ccc 1104Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro355 360 365
act gtt tgg ctt tca gtt ata tgg atg atg tgg tat tgg ggg cca agt1152Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser370 375 380ctg tac aac atc ttg agt ccc ttt tta cct cta tta cca att ttc ttt1200Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe385 390 395 400tgt ctt tgg gta tat att1218Cys Leu Trp Val Tyr Ile405<210>2<211>406<212>PRT<213>Hepatitis B virus<400>2Met Arg Ser Leu Leu Ile Leu Val Leu Cys Phe Leu Pro Leu Ala Ala1 5 10 15Leu Gly Lys Val Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn20 25 30Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala35 40 45Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Gln Trp50 55 60
Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly Pro Gly Phe Thr65 70 75 80Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile85 90 95Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln100 105 110Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His115 120 125Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His Gln Ala Leu Leu130 135 140Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser145 150 155 160Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Gly Asp165 170 175Pro Ala Pro Asn Met Glu Asn Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu180 185 190Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile195 200 205Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly
210 215 220Ala Pro Thr Cys Pro Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His225 230 235 240Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys245 250 255Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile260 265 270Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro275 280 285Leu Leu Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys290 295 300Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr305 310 315 320Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp325 330 335Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp340 345 350Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro355 360 365
Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser370 375 380Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe385 390 395 400Cys Leu Trp Val Tyr Ile40權(quán)利要求
1.用于治療血友病的治療產(chǎn)品，包括由顯示出粒子形成能力的蛋白形成的中空納米粒子；以及包埋入所述中空納米粒子的用于治療血友病的基因。
2.用于治療血友病的治療產(chǎn)品，包括由引入生物識別分子到在真核細(xì)胞中表達(dá)蛋白獲得的蛋白粒子中形成的中空納米粒子；以及包埋入所述中空納米粒子的用于治療血友病的基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的治療血友病的治療產(chǎn)品，其中所述真核細(xì)胞是酵母或者重組體酵母。
4.根據(jù)權(quán)利要求2的治療血友病的治療產(chǎn)品，其中所述真核細(xì)胞是昆蟲細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求2的治療血友病的治療產(chǎn)品，其中所述真核細(xì)胞是動物細(xì)胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的用于治療血友病的治療產(chǎn)品，其中所述顯示出粒子形成能力的蛋白是乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的用于治療血友病的治療產(chǎn)品，其中所述用于治療血友病的基因是凝血因子VIII或者IX。
8.根據(jù)權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的用于治療血友病的治療產(chǎn)品，其由治療產(chǎn)品通過靜脈注射被施用于人體。
9.治療血友病的方法，包括施用權(quán)利要求1到8任一項(xiàng)的治療產(chǎn)品。
全文摘要
用于治療血友病的治療產(chǎn)品或者藥物可以通過包括如下的簡單方法生產(chǎn)將用于治療血友病的凝血因子VIII(IX)的基因埋入由表達(dá)具有粒子形成能力的蛋白獲得的空納米粒子中，所述蛋白為真核細(xì)胞中的諸如乙型肝炎病毒表面抗原蛋白。如此產(chǎn)生的藥物能夠?qū)⒛蜃拥幕蛴行У刈钚「弊饔梦ｋU(xiǎn)地引入肝細(xì)胞。
文檔編號A61K47/42GK1787840SQ200480007428
公開日2006年6月14日 申請日期2004年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月17日
發(fā)明者上田政和, 黑田俊一, 谷澤克行, 妹尾昌治, 近藤昭彥, 蒂埃里·范登德里施, 蔡麗琴 申請人:株式會社貝亞克萊, 法蘭德斯校際生物技術(shù)研究所, 天主教魯汶大學(xué)加斯蒂斯伯格教學(xué)和研究校區(qū) D.科倫研究基金