專利名稱：仿生人工韌帶及其制備方法
技術領域：
本發明涉及仿生人工韌帶以及獲得該韌帶的方法。
用來代替生物關節韌帶尤其是膝蓋關節韌帶的人工韌帶，在某些特定情況下優選通過自生嫁接進行直接縫合來重建。的確，在過去的20年間，這些韌帶的質量無論是在機械水平還是在生物相容性上都有了顯著的提高。
因此，例如從法國專利FR-96 14263可知《orientated fibres》中所提到的聚對苯二甲酸乙二醇酯(polyethylene terephtalate，PET)制得的人工韌帶。這種韌帶由自身卷曲的或折疊的織物所組成，該織物包含兩個末端的骨內部分和一個中間的關節內部分通過彼此橫向不相連的一束縱向連接的活動的織物紗線構成的。在固定韌帶的時候，對每根活動紗線進行縱向扭曲，形成左旋或右旋韌帶再制造呈彎曲狀的韌帶的天然屈曲。PET材料具有共知的生物相容性，由PET制成的韌帶具有極高的抗張力、彎曲力和扭力的性能，因而比現有的已知韌帶可能會有更長的使用壽命。
盡管人工韌帶在生物力學上取得了顯著的進步，但是用在病人身上時仍然出現了失敗。對這些失敗原因進行的調查發現，移植后纖維原細胞的再生長能力差。這些細胞在韌帶表面的分布不均勻，纖維原細胞不在骨內修復區生長，而是聚集在關節內區域的纖維上。此外，這些纖維原細胞具有反常的圓形形態，它們在韌帶表面的錨定點很少。這些細胞的膠原蛋白分泌的無規律性導致了關節內區域纖維的個別化，纖維在修復區包膜和中心積聚，從而導致了移植的失敗。
為了給修復組織的纖維原細胞提供良好的再生長環境，法國專利FR 2 651 994建議將人工韌帶和膠原蛋白一起植入，膠原蛋白纖維沿韌帶的縱向軸方向，以便能通過活的連接組織為其再生長獲得適宜的方向。該方法除了有限的和不太滿意的效果外，還有一個主要缺點是依賴于所用的膠原蛋白的質量，而該膠原蛋白是很難再生產的。
因此，本發明發現了一種針對上述問題的補救辦法，本發明提供了一種韌帶的仿生功能化方法，尤其是為了改善韌帶的生物整合性能而為其提供了模擬活性材料的能力。
本發明的方法，即聚酯尤其是聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)的仿生功能化方法，建議用于修復假體中，因為該方法包含至少一個在所述假體的聚酯表面嫁接生物活性聚合物和共聚物的步驟，該嫁接步驟首先是用臭氧對表面進行過氧化作用，接著是在含有至少一種單體的溶液中進行基團聚合的步驟。值得注意的是，聚酯假體是指任何由PET或聚酯衍生纖維構成的假體，該假體用作韌帶時具有適宜性能，以及任何在表面或纖維表面上具有聚酯層尤其是PET層的假體。
已了解的是，前述法國專利FR-9614263制得的韌帶表面上生成了活性生物聚合物層，細胞的粘附和增生特性由此被改變，從所得的細胞培養結果可以說明這種改變有利于正常和同源的纖維原細胞的再生長。
此外，根據本發明的另一個技術方案，這些特性還可經附加下述步驟來改進在嫁接步驟之前，僅在溶劑介質中制備聚酯表面，或在溶劑介質中然后再在水性介質中制備聚酯表面。
這兩種二中擇一的制備步驟通過提高嫁接表面的質量以及提高所嫁接的共聚物的量而極大地促進了嫁接步驟的效率。同時對由此制得的韌帶的生物相容性特征發揮重要作用。
從下面的選擇性實施方式的描述中本發明其它的優點和特點將更加清楚，這些實施方式只是本發明功能化方法的非限制性實施例。
本發明的方法在此應用于已制成的韌帶假體上，或者甚至是用于制備所述假體所涉及的聚酯織物上。該方法分為下述步驟步驟1聚酯表面的制備1A)在溶劑介質中在制備用作韌帶結構的聚酯織物過程中，需要所謂的脫脂步驟來除去油脂和雜質。這能使韌帶在植入患者的過程中，避免急性滑膜炎型的病理反應。此外，經過該步驟，清潔的聚酯表面可以提供纖維原細胞的生長，而在不清潔的聚酯表面沒有觀察到這種生長。
在溶劑介質中進行的這兩種二中擇一的制備方法隨所選溶劑性質的不同而不同。
方法1不經任何表面膨脹的脫脂
用SOHXLET裝置進行最少12個萃取循環，在用己烷進行的第12個清洗循環后檢查脂肪殘留。用已烷清洗后接著用乙醚(RPE)沖洗最少3次，在第三次沖洗后檢查脂肪殘留情況。
方法2利用能引起聚酯表面膨脹的溶劑進行脫脂使用能引起聚酯表面膨脹的溶劑可提高臭氧作用步驟中被處理表面的過氧化物數量，從而獲得改進移植的優點。
這種溶劑具有介電常數大于30的特點。優選地，這種溶劑是環醚類型或脂肪醚類型。可選自下述溶劑四氫呋喃(THF)、二甲亞砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)。這些溶劑的優點是無毒或低毒，因而易于用在工業環境中。
處理是將聚酯部分浸入溶劑中達5分鐘至約1小時，優選在10-25分鐘之間。例如，可選擇在室溫下浸入四氫呋喃溶劑(THF)中15分鐘。
1B)在水性介質中選擇在水性介質中制備表面的目的是為了從制造的聚酯表面去除諸如低分子量有機酸的殘留物，例如PET中的對苯二甲酸，從而在臭氧化之前獲得一個完好的表面。
處理方法由下述步驟組成在5wt％Na2CO3的蒸餾水溶液中洗滌聚酯部分。該洗滌是在加熱條件下進行的，即，在60℃至120℃的溫度條件下，優選在微沸騰即100℃±5℃條件下洗滌10分鐘。當然，可以使用任何其它的堿金屬或堿土金屬碳酸鹽，例如K2CO3或CaCO3。洗滌后再用蒸餾水連續沖洗直至沖洗出的水的pH值回復到7。
1C)清洗無論先前步驟如何(采用步驟1A中的方法1或方法2，然后是步驟1B，或僅采用步驟1A)，聚酯產品都需要被清洗，例如用無水乙醇或四氫呋喃(THF)沖洗，接著烘干，如烘30分鐘。
步驟2在聚酯表面嫁接生物活性聚合物或共聚物2A)單體的選擇和制備本發明所用的單體是能進行基團聚合和共聚的單體，因而能產生刺激細胞尤其是纖維原細胞的增生和分化的生物相容性聚合物。這些包含羧酸鹽/酯(carboxylate)、磷酸鹽/酯(phosphate)、磺酸鹽/酯(sulfonate)和硫酸鹽/酯(sulfate)的單體，例如美國專利6,365,692中所記載的單體，在本發明中可單獨使用或混合使用。優選使用甲基丙烯酸和苯乙烯磺酸鹽/酯和它們的混合物。在使用這些單體聚合之前，首先要將單體純化。例如，對于苯乙烯磺酸鈉來說，將它從再蒸餾水/乙醇(10∶90，v∶v)混合物中進行重結晶來純化，然后在70℃溶于該溶液中。接著用孔隙指數為3的燒結玻璃盤進行真空過濾，然后置于4℃。形成的磺酸鈉晶體經過濾收集，所得的固體在50℃真空干燥直至恒重。
2B)臭氧化在常規使用的臭氧化裝置中引入假體或步驟1制得的這些預處理的假體的聚酯織物。
例如，可以使用一個含100cm3再蒸餾水的500cm3管狀反應器，該反應器具有提供臭氧的活塞管。例如，可采用相當于50g/m3氧的臭氧氣體流量。對于這種用量的臭氧，臭氧化PET的最佳時間是20到90分鐘。過氧化速度的測定顯示，在該臭氧流量下，在臭氧化30到60分鐘間獲得最佳速度。還需要注意的是，臭氧化時間超過90分鐘會極大損壞PET表面。
此外，對步驟1A的方法2的貢獻作如下描述。事實上，與采用不會引起膨脹的溶劑相比，使用能夠引起表面膨脹的溶劑會提高過氧化速度達5倍。一旦臭氧化完成，沖洗并清洗臭氧化裝置中的人工韌帶或聚酯織物，例如根據下述方法用再蒸餾水沖洗3次，然后用無水乙醇沖洗3次，再用四氫呋喃(THF)沖洗3次。接著，在真空烤箱中25℃干燥30分鐘。
2C)聚合將步驟2A制得的所選單體放到水溶液中，優選再蒸餾水中。只要能用于基團聚合反應的任何濃度都可采用，但必須不低于5％重量百分比。優選采用溶液中單體濃度接近于溶解度極限的濃度，具有比終止反應粘度大的介質，從而促進聚合物的增長反應，而獲得具有高分子量的嫁接的聚合物鏈。這相當于選擇重量百分比濃度k＝s-ε，其中s是溶解度極限，ε是1-7％重量百分比。例如在聚苯乙烯磺酸鹽的情況下，溶解度極限是20wt％，因而可選擇15％的濃度。
聚合步驟的持續時間依賴于單體的性質。估計是介質在反應溫度下凝膠化所需的時間。因而，例如聚苯乙烯磺酸鹽在70℃時的聚合時間需要1小時，在65℃需要1小時30分鐘。
聚合反應在無氧的密封小室中進行，例如在氬氣環境下。將用于反應的單體或共聚用單體的溶液、預臭氧化的假體或聚酯條引入到小室中。在預定的溫度下水浴加熱密閉容器達前述的預定時間。
反應結束后，將嫁接了的聚酯組分從反應器中取出。為了去除未反應的單體殘留物，對這些嫁接的材料進行清洗。例如，可用適當的單體溶劑例如蒸餾水清洗功能化表面幾次，為了去除可能的微量未被嫁接的聚合物，可任選地再采用任何適當溶劑例如無水乙醇完成清洗。
步驟3生化試劑的注入該步驟是任選的，可采用或不采用。該步驟的目的在于加強韌帶的生物整合性能力，如步驟1和2所述，仿生聚合物已在之前嫁接到韌帶上了。因而，將一種或多種生化試劑注入到假體中的目的在于提高它的細胞粘附和增生特性。這些促進纖維原細胞集落化的生化試劑是纖維連接蛋白和/或I型和/或III型膠原蛋白家族中的蛋白質。優選使用前述蛋白的混合物，即，纖維連接蛋白和I型和/或III型膠原蛋白的混合物觀察到了對纖維原細胞粘附的協同效果。將這些試劑注入假體可以采用如將韌帶浸入含膠原蛋白的溶液中的方式來進行。
顯然，注入步驟并不是一定要在嫁接步驟之后，根據韌帶的制備階段，注入步驟也可在制備韌帶的其它步驟中或介于其它步驟間進行。另外，優選在注入步驟后進行韌帶的滅菌步驟。
為了測定前述方法的效果，對由編織的PET纖維制得的織物進行對比實驗，聚酯是結晶速度為40％±5％的半晶體且熔點接近260℃±5℃。這些纖維織物是申請人制造和銷售的人工韌帶的構成部分。制備未嫁接的對照PET纖維和用聚苯乙烯磺酸鈉嫁接的以及用等重量的甲基丙烯酸(AM)和苯乙烯磺酸鈉(SSNa)的混合物嫁接的兩種類型的PET纖維。制備的不同條件見表1。
表1樣品的制備
然后，進行生物學評價的各種檢測，尤其是纖維原細胞培養的檢測，以及測試纖維原細胞在這些不同表面上粘附性的檢測，結果見下表。
表2生物學評價
觀察到，在聚酯韌帶表面上嫁接仿生聚合物，尤其是苯乙烯磺酸鹽/酯，為表面的纖維原細胞提供了正常和均一的發育環境。
此外，處理后的表面對蛋白質有很高的親合力，可以很好得吸附膠原蛋白以及纖維原細胞的其它集落刺激生化因子。因而能夠理解的是，韌帶表面經步驟1和2的方法處理后，再經過步驟3來注入此類生化因子，韌帶能明顯提高纖維原細胞的吸附能力并適宜性調整細胞的發育。
最后，本發明的仿生功能化方法顯然能用在任何類型的需要改善生物整合性的聚酯假體上，本發明給出的例子僅僅是說明性的，并不是用來限制本發明的應用。
權利要求
1.一種處理聚酯人工假體的方法，尤其是處理聚對苯二甲酸乙二醇酯的人工假體，以便使假體具有模擬存活物質的能力，其特征在于，所述的仿生功能化方法包括在所述假體的聚酯表面上嫁接生物活性聚合物和共聚物的至少一個步驟，該嫁接步驟是由臭氧化作用獲得表面的過氧化步驟以及接著在含有至少一種單體的溶液中進行基團聚合的步驟所組成。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，聚對苯二甲酸乙二醇酯是半晶體。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特征在于，對于50g/cm3的臭氧含量，臭氧化時間為20至90分鐘。
4.根據權利要求1-3任意一項所述的方法，其特征在于，單體是苯乙烯磺酸鈉。
5.根據權利要求1-4任意一項所述的方法，其特征在于，單體溶液中單體的濃度為5％至k％，其中濃度k接近于溶液中單體的溶解極限。
6.根據前述任一項權利要求所述的方法，其特征在于，在嫁接步驟之前還有一個步驟，即僅在溶劑介質中制備聚酯表面，或先在溶劑介質中然后在水性介質中制備聚酯表面。
7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，溶劑介質由己烷和乙醚組成。
8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，溶劑介質由至少一種能通過膨脹而改變表面的溶劑組成。
9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，能通過膨脹而改變表面的溶劑是低毒或無毒的環醚或脂肪醚。
10.根據權利要求8或9所述的方法，其特征在于，能通過膨脹而改變表面的溶劑具有大于30的介電常數。
11.根據權利要求8，9或10中任意一項所述的方法，其特征在于，能通過膨脹而改變表面的溶劑選自下述溶劑四氫呋喃(THF)、二甲亞砜(DMSO)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、N，N-二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)。
12.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，在水性介質中制備表面的過程由下述步驟組成為了去除制備的聚酯表面上的殘留物，在堿金屬或堿土金屬碳酸鹽溶液如Na2CO3或CaCO3溶液中，在熱條件下處理聚酯表面。
13.根據前述任意一項所述的方法，其特征在于，在嫁接步驟之后還包括將一種或多種纖維原細胞的促集落生化劑注入到假體中的步驟。
14.根據權利要求13所述的方法，其特征在于，所述的生化劑是纖維連接蛋白和/或I型和/或III型膠原蛋白家族中的蛋白質。
15.權利要求1-14中的任意一項方法用于紡織或編織的PET纖維形式的人工韌帶中。
全文摘要
本發明涉及由聚酯如聚對苯二甲酸乙二醇酯制得的仿生人工韌帶以及該韌帶的仿生功能化方法。本發明方法的特征在于該方法包括在所述假體的聚酯表面上嫁接生物活性聚合物和共聚物的步驟，該嫁接步驟是由臭氧化作用獲得表面的過氧化步驟以及接著在含有至少一種單體的溶液中進行基團聚合的步驟所組成。所述方法還任選地包括將纖維連接蛋白和/或I型和/或II型膠原蛋白注入到假體中的步驟。如此獲得的假體能使纖維原細胞正常均勻地再生，從而顯著改進聚酯假體的生物整合性。
文檔編號A61F2/08GK1777450SQ200480004135
公開日2006年5月24日 申請日期2004年1月19日 優先權日2003年1月17日
發明者貝爾納·布呂萊, 雅克-菲利浦·拉布羅, 韋羅妮克·米戈內, 米哈埃拉·喬巴努, 格拉謝拉·帕翁－賈維德, 阿蘭·西奧夫 申請人:拉思公司-科學研究與應用試驗室