專利名稱：乳癌耐性蛋白抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及乳癌耐性蛋白(BCRP)抑制劑及對BCRP抑制劑的篩選有用的SN-38耐性癌細胞。
背景技術：
在癌癥化療法中，出現自然耐性、獲得性耐性等是一個比較嚴重的問題，自然耐性是指從治療開始時起抗癌劑就無效的情況，獲得性耐性是指長時間連續使用抗癌劑時其療效降低的情況。如果能夠克服該對抗癌劑的耐性，就有望提高癌癥化療法的治療成績。目前，已經明確了存在各種耐性機制。一般認為，其中藥物轉運蛋白質的表達起到了耐性機制的中心的作用，該藥物轉運蛋白質主動地將抗癌劑向細胞外轉運，使抗癌劑在細胞內的蓄積量減少。
特別是七十年代發現的由MDR1基因編碼的藥物轉運蛋白質P-糖蛋白質，由于其對化學結構及作用機制等不同的多種抗癌劑產生交叉耐性，因此成為多劑耐性克服劑的主要靶分子。但是，以后隨著認知的加深，逐漸清楚了僅僅用P-糖蛋白質無法完全說明抗癌劑的耐性機制，還希望開發出以新的藥物轉運蛋白質為靶分子的耐性克服劑。
在這種情況下，1988年發現了一種乳癌耐性蛋白(BCRP)(參考Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，15665-15670(1998))，它和P-糖蛋白質一樣，是屬于被稱為ATP結合盒(ABC)轉運體超家族的一族的藥物轉運蛋白質。BCRP的結構中只有一個ATP結合盒，在結構上不同于具有兩個ATP結合盒的P-糖蛋白質及其它藥物轉運蛋白質。BCRP與對鹽酸依立替康(CPT-11)及拓樸替康等拓樸異構酶(トポイソメラ-ゼ)I抑制劑、米托蒽醌(ミトキサソトロソ)等拓樸異構酶II抑制劑的耐性作用具有非常深的關系。另一方面，BCRP對通過P-糖蛋白質排出的紫杉醇及長春新堿等沒有作用，而與不是通過P-糖蛋白質向細胞外排出的CPT-11及SN-38(CPT-11的活性體)等喜樹堿衍生物的排出有關(Cancer Res.59，5938-5946(1999))，由此明確了BCRP具有和P-糖蛋白質不同的基質特異性。此外，有資料顯示，BCRP還與口服的抗癌劑的生物利用度的限制有關(參考J.Clin.Oncol.20，2943-2950(2002))。基于這些情況，抑制BCRP的藥物有希望對用以往的耐性克服劑不能克服的抗癌劑的耐性發揮出克服效果，并且使抗癌劑的生物利用度得到提高，因此希望能夠進行這方面的開發研究工作。
到目前為止，以克服對抗癌劑的耐性為目的，一直在進行大量的P-糖蛋白質抑制劑的開發。而另一方面，針對BCRP的特異性的抑制劑的相關報告卻很少，而且其抑制作用也十分有限，因此希望開發出具有更加強有效的BCRP抑制作用的藥物(參考Mol.Cancer.Ther.1，427-434(2002))。另外，有報告稱，類黃酮化合物中有對P-糖蛋白質顯示出抑制作用的化合物(J.Med.Chem.41，4161-4164(1998)；Biochem.Biophys.Res.Commun.295，832-840(2002))，但是對BCRP具有抑制作用的類黃酮化合物還未知。
本發明的目的是提供對抑制BCRP的藥物的篩選有用的癌細胞及抑制BCRP的藥物制劑。
發明的揭示為了解決上述課題，本發明者通過使用含SN-38的培養基對來自人非小細胞肺癌的癌細胞A549細胞進行繼代培養，確定了通過BCRP高表達而獲得了抗癌劑耐性的人癌細胞。再使用該癌細胞，以耐性克服作用作為指標，對各種來自植物的成分進行篩選，結果發現下式(1)、(2)、(3)、(4)或(5)表示的類黃酮化合物具有極強的BCRP抑制作用。并據此最終完成了本發明。
即，本發明提供了以下式(1)、(2)、(3)、(4)或(5)表示的類黃酮化合物或其苷、酯或鹽為有效成分的BCRP抑制劑，針對獲得了與BCRP有關的耐性的癌癥的抗癌劑耐性克服劑，或針對表達BCRP、對抗癌劑的感受性低的癌癥的抗癌劑耐性克服劑； 式中，R1表示氫原子、羥基、鹵原子、低級烷氧基或低級烷基，7個R2可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基、低級烷氧基、低級烷基、低級鏈烯基或糖殘基，或者也可以和相鄰的R1一起形成為可被低級烷基取代的吡喃環，R3表示氫原子、羥基、鹵原子、低級烷基、低級烷氧基、氨基或硝基； 式中，R4表示氫原子、羥基、鹵原子、低級烷氧基、低級烷基或低級鏈烯基，7個R5可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基、低級烷氧基或低級烷基，或者相鄰的2個R5可以一起形成為可被低級烷基取代的吡喃環，R6表示氫原子、羥基、鹵原子、低級烷氧基、低級烷基、氨基或硝基； 式中，R7表示氫原子、羥基、鹵原子、低級烷氧基或低級烷基，2個R8可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基、低級烷氧基或低級烷基，R9表示氫原子、羥基、鹵原子或低級烷氧基，5個R10可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或低級烷氧基； 式中，3個R11可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或低級烷氧基；
式中，R12表示氫原子或低級鏈烯基，R13表示氫原子或羥基，R14表示表示氫原子。
本發明還提供了含有上述BCRP抑制劑及可成為BCRP的基質的抗癌劑的抗癌劑。
本發明還提供了下式(6) 表示的新的類黃酮化合物，式中，R15表示氨基或硝基。
本發明還提供了高水平表達BCRP的SN-38耐性人非小細胞肺癌A549細胞。
附圖的簡單說明
圖1為表示A549/SN-38-4細胞所獲得的對SN-38(A)和米托蒽醌(B)的耐性的程度的圖。
圖2為表示A549細胞和A549/SN-38細胞中的各種藥物轉運蛋白質的mRNA的表達的RT-PCR法分析結果的圖。
圖3為表示A549細胞和A549/SN-38細胞中的BCRP(A)及MRP2(B)mRNA的表達的實時RT-PCR法定量分析結果的圖。
圖4為表示A549細胞和A549/SN-38-4細胞的SN-38(A)及SN-38葡糖醛酸軛合體(B)的蓄積量的圖。
圖5為表示類黃酮化合物[化合物1-1(A)、化合物1-4(B)、化合物1-6(C)、化合物1-14(D)、化合物3-4(E)及化合物3-6(F)]對P388/BCRP細胞的SN-38耐性的克服作用的圖。
圖6為表示類黃酮化合物使P388/BCRP細胞的SN-38蓄積量增大的作用的圖。
圖7為表示類黃酮化合物使MCF-7細胞的SN-38蓄積量增大的作用的圖。
實施發明的最佳方式已知人非小細胞肺癌A549細胞容易培養，能夠植入小鼠，而且對CPT-11的活性本體SN-38表現出高感受性(J.Clin.Invest.101，1789-1796(1998))。通過在逐步地提高培養基中的SN-38濃度的條件下持續地培養該A549細胞，確立SN-38耐性A549細胞。如后面的實施例所述，所得的SN-38耐性A549細胞高水平表達BCRP，使細胞內SN-38的蓄積量減少，從而獲得耐性，對BCRP抑制劑的篩選有用。SN-38耐性A549細胞也可以用于體外的篩選，此外，通過植入小鼠，可以用于體內的篩選。
使用該細胞，以SN-38耐性克服作用作為指標，對各種來自植物的成分進行篩選，結果發現類黃酮化合物具有極強的BCRP抑制作用。
本發明的類黃酮化合物是上式(1)表示的黃酮衍生物、式(2)表示的黃烷酮衍生物、式(3)表示的查耳酮衍生物、式(4)表示的異黃酮衍生物或式(5)表示的類黃酮衍生物。
式(1)～(4)中，R1～R11為低級烷氧基時，優選碳原子數1～4的烷氧基，特別優選的是甲氧基。R1～R8為低級烷基時，優選碳原子數1～4的烷基，特別優選的是甲基。式(1)、(2)及(5)中的R2、R4或R12為低級鏈烯基時，優選碳原子數2～5的鏈烯基，特別優選的是3-甲基-1或2-丁烯基。鹵原子可例舉氟、氯、溴及碘原子，優選氯或溴原子。式(1)中相鄰的R1和R2形成的吡喃環可以被碳原子數1～4的低級烷基取代，該取代基特別優選的是甲基。式(2)中形成吡喃環的相鄰的2個R5最好是位于二氫苯并吡喃環上的R5。相鄰的2個R5形成的吡喃環可以被碳原子數1～4的低級烷基取代，該取代基特別優選的是甲基。
在式(6)中，R15為硝基的化合物(2’-硝基-4’，5，5’，6，7，8-六甲氧基黃酮)也稱為2’-硝基川皮苷，R15為氨基的化合物(2’-氨基-4’，5，5’，6，7，8-六甲氧基黃酮)也稱為2’-氨基川皮苷，都是新化合物。
上述類黃酮化合物也包括例如β-D-葡糖苷等糖加成所得的苷。此外，還能夠與鈉、鉀、鹽酸鹽等加成，形成藥理學允許的鹽，這種鹽也包含在本發明的范圍中。再有，能夠例如與乙酸、丙酸、乳酸、丁酸等低級脂肪酸類加成，形成藥理學允許的酯，這種酯也包含在本發明的范圍中。類黃酮化合物有時也以水合物等溶劑合物的形態存在，該溶劑合物也包含在本發明的范圍中。各異構體及其混合物也包含在本發明的范圍中。
對本發明的類黃酮化合物的來源沒有特別的限定，可以來源于植物，也可以是化學合成品或半合成品。對從植物中獲取本發明的類黃酮化合物的方法沒有特別的限定，例如有將植物的根、莖、葉、果實及/或花朵用水、甲醇、乙醇等低級醇或丙酮等水溶性有機溶劑在室溫或加熱下進行提取的方法；利用水和這些有機溶劑的混合物進行提取的方法；利用氯仿、二氯甲烷、乙酸酯類、甲苯或由二氧化碳氣體形成的超臨界流體等疏水性有機溶劑和甲醇等水溶性有機溶劑的混合物進行提取的方法。效果特別好的是將根、莖及/或葉切細或粉碎，用甲醇等低級醇進行提取的方法。然后，再通過采用柱色譜法等對所得的提取物進行分離、精制，能夠分離出本發明的類黃酮化合物。
式(6)中的R15為硝基的2’-硝基-4’，5，5’，6，7，8-六甲氧基黃酮可以通過常用方法將4’，5，5’，6，7，8-六甲氧基黃酮硝基化來制造。硝基化試劑例如可以采用硝酸-硫酸這類混合酸。
式(6)中的R15為氨基的2’-氨基-4’，5，5’，6，7，8-六甲氧基黃酮可以通過常用方法將2’-硝基-4’，5，5’，6，7，8-六甲氧基黃酮還原來制造。
本發明的類黃酮化合物可以就這樣直接給藥，也可以在不會降低療效的前提下和分散助劑、賦形劑等制劑中常用的載體混合，制成粉劑、液劑、膠囊劑、懸浮劑、乳劑、糖漿劑、酏劑、顆粒劑、丸劑、片劑、糖錠劑、乳液劑等口服劑或注射劑等劑型使用。
上述載體可例舉水溶性的單糖或低聚糖或多糖類，例如甘露糖醇、乳糖、葡聚糖等；凝膠形成性或水溶性的纖維素類，例如羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素、甲基纖維素等；水吸收性且水難溶性的纖維素類，例如結晶性纖維素、α-纖維素、交聯羧甲基纖維素鈉及它們的衍生物等；水吸收性且水難溶性的多糖類，例如羥丙基淀粉、羧甲基淀粉、交聯淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉、果膠及它們的衍生物等；水吸收性且水難溶性的樹膠類，例如阿拉伯膠、黃蓍膠、グリコマソナソ及它們的衍生物等；交聯乙烯基聚合物類，例如聚乙烯吡咯烷酮、交聯聚丙烯酸及其鹽、交聯聚乙烯醇、聚羥乙基甲基丙烯酸酯及它們的衍生物等；形成核糖核蛋白體等分子集合體的脂質類，例如磷脂、膽甾醇等。
本發明的類黃酮化合物的溶解性較低時，可以進行可溶化處理。可溶化處理可采用制藥中常用的方法，例如添加聚氧乙烯醇醚、聚氧乙烯酰基酯類、山梨糖醇酐酰基酯類、聚氧乙烯山梨糖醇酐酰基酯類等表面活性劑的方法；使用聚乙二醇等水溶性高分子的方法等。此外，還可以根據需要，采用形成可溶性鹽的方法，使用環糊精等形成包合物的方法等。可溶化處理的方法可以根據目標類黃酮化合物作適當的變更。
對于通過投入抗癌劑而獲得了與BCRP有關的耐性的癌癥，BCRP抑制劑可以用作為抗癌劑耐性克服劑。此外，對于原本就BCRP表達、對抗癌劑的感受性低的癌癥，可以用作為抗癌劑的增效劑。作為成為以BCRP抑制劑為有效成分的抗癌劑耐性克服劑和抗癌劑的增效劑的對象的抗癌劑，只要是可成為BCRP的基質的抗癌劑即可，對其沒有特別的限定，可例舉鹽酸依立替康/CPT-11(活性本體SN-38)或拓樸替康等拓樸異構酶I抑制劑；米托蒽醌、阿霉素、道諾紅菌素、ビスアソトレソ、依托泊苷等拓樸異構酶II抑制劑；甲氨喋呤等葉酸代謝拮抗藥物等。
本發明的BCRP抑制劑的給藥量可以根據給藥方法及患者的癥狀等作適當調整，較好是成人1天1mg～10g，更好是100mg～10g，特別好的是500mg～10g。此外，對抗癌劑和BCRP抑制劑的比例沒有特別的限定，其合適的范圍隨所用的抗癌劑、抑制劑的種類而有所不同，例如抗癌劑使用鹽酸依立替康時，按重量換算，抗癌劑BCRP抑制劑為1∶1～1∶500，更好是1∶1～1∶100，特別好的是1∶1～1∶10。
本發明所用的類黃酮的具體例示于表1、表2、表3、表4及表5。
表1 黃酮衍生物
表2 黃烷酮衍生物
表3 查耳酮衍生物
表4 異黃酮衍生物
表5 類黃酮衍生物
實施例以下，例舉實施例對本發明作更詳細的說明，但這僅僅是示例，并不限定本發明。
實施例13’，5-二羥基-4’，6，7-三甲氧基黃酮(化合物1-6)的分離將368g巴西產的藥物カルケ一ヅ，在甲醇中回流2小時，將提取液減壓干固。在所得的提取物8.1g中取5.09g，采用中壓色譜法將其用己烷進行洗脫后(A組分)，用己烷-乙酸乙酯(4∶1)混合溶液進行洗脫(B組分)，接著用乙酸乙酯洗脫(C組分)，然后再用甲醇進行洗脫(D組分)。在所得的C組分1.53g中取1.0g，采用中壓色譜法，將其在254nm監測下用己烷洗脫后，按照己烷-乙酸乙酯(2∶1)混合溶液、己烷-乙酸乙酯(1∶1)混合溶液、乙酸乙酯、甲醇的順序依次進行洗脫，得到12組分。采用高效液相色譜法[Mightysil RP-18 GP、6.0×250mm、用乙腈-水的(45∶55)混合溶液洗脫]，對用己烷-乙酸乙酯混合溶液(2∶1)洗脫后所得的C6組分(100.1mg)進行分析，分析結果表明得到了顯示保持時間為15.2分鐘的峰的組分。將該C6組分用氯仿-甲醇(1∶1)混合溶液進行重結晶，得到47.9g化合物1-6。該化合物的分析結果如下所示。
IR νmax(KBr)cm-11649(C＝O)EI-MS m/z315[M]+1H-NMR(DMSO-d6)δ3.74(C6-OCH3，s)，3.88(C4’-OCH3，s)，3.94(C7-OCH3，s)，6.83(C3-H，s)，6.92(C8-H，s)，7.10(C5’-H，d，J＝8.8Hz)，7.48(C2’-H，d，J＝2.2Hz)，7.57(8.5，C6’-H，dd，J＝2.4Hz)，9.44(C3’-OH，s)，12.90(C5-OH，s)，13C-NMR(DMSO-d6)δ56.2(C6-OCH3)，56.9(C7-OCH3)，60.5(C6-OCH3)，92.0(C-8)，103.7(C-3)，105.4(C-10)，112.5(C-5’)，113.2(C-2’)，119.3(C-6’)，123.2(C-1’)，132.2(C-6)，147.0(C-3’)，151.7(C-4’)，152.0(C-5)，153.1(C-9)，159.1(C-7)，164.3(C-2)，182.5(C-4)實施例25，4’-二羥基-6，7-二甲氧基黃酮(化合物1-19)的分離將500g從高砂藥業株式會社獲得的茵陳蒿在甲醇中回流2小時，將提取液減壓干固。在所得的提取物40.1g中取5.07g，將其涂滿硅膠，采用中壓色譜法，用己烷進行洗脫后(A組分)，用己烷-乙酸乙酯(4∶1)混合溶液進行洗脫(B組分)，接著用乙酸乙酯洗脫(C組分)，然后再用甲醇進行洗脫(D組分)。在所得的C組分1.56g中取1.5g，采用中壓色譜法，將其在254nm監測下用氯仿洗脫后按照氯仿-甲醇(99∶1)混合溶液、氯仿-甲醇(9∶1)混合溶液、甲醇的順序依次進行洗脫，得到14組分。將用氯仿洗脫后所得的C6組分(112.4mg)溶于甲醇，得到C6甲醇不溶性組分(70mg)。采用高效液相色譜法[Mightysil RP-18GP、6.0×250mm、用乙腈-0.7甲酸溶液的(30∶70)混合溶液洗脫]，對該C6甲醇不溶性組分進行分析，分析結果顯示出保持時間為28.0分鐘的峰。精制該具有保持時間28.0分鐘的峰的組分，得到化合物1-19。該化合物1-19的分析結果如下所示。
IR νmax(KBr)cm-11655(C＝O)MS(ESI)m/z315[M+H]+1H-NMR(CDCL3)δ3.87(OCH3，s)，3.99(OCH3，s)，6.57(C3-H，s)，6.62(C8-H，s)，6.96(C3’-H，C5’-H，dd，J＝8.8Hz，1.7)，7.79(C2’-H，C6’-H，dd，J＝8.8Hz，1.5)，9.89(C4’-OH，s)，12.88(C5-OH，s)實施例32’-硝基-4’，5，5’，6，7，8-六甲氧基黃酮(化合物1-20)的合成在冰浴中將831mg的4’，5，5’，6，7，8-六甲氧基黃酮溶于17ml濃硫酸中。向溶液中滴入1.7ml的5％發煙硝酸-硫酸混合液，在冰浴中攪拌30分鐘。然后，將反應液倒入50ml的冰水中攪拌10分鐘。吸濾所析出的晶體，將晶體用乙酸乙酯清洗。水層用50ml乙酸乙酯萃取2次。將所得的乙酸乙酯層在減壓下濃縮干固。將得到的固體物質和先前的晶體合在一起，采用硅膠柱色譜法[關東化學制SiO2、用己烷-乙酸乙酯(1∶1)洗脫]進行分離。然后，將所要的組分在減壓下濃縮干固，得到2’-硝基-4’，5，5’，6，7，8-六甲氧基黃酮(產量326mg產率35％)。
IR νmax(KBr)cm-13489，2943，2838，1655，1530MS(ESI)m/z448[M+H]+1H-NMR(CDCl3)δ3.83(3H，s)，3.95(3H，s)，3.97(3H，s)，3.98(3H，s)，4.03(3H，s)，4.08(3H，s)，6.41(1H，s)，7.00(1H，s)，7.67(1H，s)實施例42’-氨基-4’，5，5’，6，7，8-六甲氧基黃酮化合物(1-5)的合成將135g的2’-硝基-4’，5，5’，6，7，8-六甲氧基黃酮溶于5ml濃鹽酸-甲醇(1∶1)混合液，加入51.6mg鐵粉末，在室溫下攪拌4小時。然后，向反應液中加入20ml精制水、20ml乙酸進行分液。用飽和碳酸氫納水溶液將所得的水層的pH調整至8，用130ml乙酸乙酯萃取2次。將乙酸乙酯層用70ml飽和食鹽水清洗后，用無水硫酸鎂干燥。接著，濾去硫酸鎂，用乙酸乙酯清洗后，將乙酸乙酯層在減壓下濃縮干固。然后，采用硅膠柱色譜法[關東化學制SiO2、用己烷-乙酸乙酯(1∶1)洗脫]對所得的固體物質進行分離。將所要的組分在減壓下濃縮干固，得到2’-氨基-4’，5，5’，6，7，8-六甲氧基黃酮(產量66mg產率52％)。
IR νmax(KBr)cm-13496，3326，1624，1560，1520MS(ESI)m/z418[M+H]+1H-NMR(CDCl3)δ3.85(3H，s)，3.89(3H，s)，3.96(6H，s)，3.99(3H，s)，4.09(3H，s)，6.28(1H，s)，6.48(1H，s)，6.96(1H，s)實施例54’，5-二羥基-3，3’，7-三甲氧基黃酮(化合物1-22)的分離在室溫下，用甲醇對泰國產藥物Pogostemon cablin的枝葉53.8g進行一周的提取，將提取液減壓干固。在所得的提取物4.9g中取4.7g，采用中壓色譜法，將其用己烷進行洗脫后(A組分)，用己烷-乙酸乙酯(4∶1)混合溶液進行洗脫(B組分)，接著用乙酸乙酯洗脫(C組分)，然后再用甲醇進行洗脫(D組分)。在所得的B組分1.3g中取0.5g，采用離心色譜法，將其在254nm監測下用氯仿洗脫后，按照氯仿-甲醇(9∶1)混合溶液、甲醇的順序依次進行洗脫，得到18組分。采用高效液相色譜法[Mightysil RP-18 GP、6.0×250mm、用乙腈-水的(45∶55)混合溶液洗脫]，對用氯仿-甲醇(9∶1)混合溶液洗脫后所得的B9組分(14.8mg)進行分析，分析結果表明得到了顯示保持時間為14.5分鐘的峰的組分。該化合物的分析結果如下所示。
MS(ESI)m/z345[M+H]+，343[M-H]-1H-NMR(CDCl3)δ3.85(C3’-OCH3，s)，3.88(C7，-OCH3，s)，3.98(C3-OCH3，s)，6.36(C6-H，d，J＝2.4)，6.44(C8-H，d，J＝2.4)，7.09(C5，-H，d，J＝8.8)，7.67(C6’-H，dd，J＝8.8，2.0)，7.70(C2’-H，d，J＝2.013C-NMR(CDCl3)δ55.8(C3’～OCH3)，56.1(C7-OCH3)，60.2(C3-OCH3)，92.2(C-8)，97.8(C-6)，106.0(C-10)，110.9(C-2’)，114.6(C-5’)，122.4(C-1’)，122.7(C-6’)，138.8(C-3)，146.3(C-3’)，148.3(C-4’)，155.9(C-2)，156.7(C-5)，162.0(C-9)，165.4(C-7)，178.7(C-4)
實施例65-羥基-3’，4’，7-三甲氧基黃酮(化合物1-23)的分離將約300g中國產藥物獨角柑(Striga asiatica的全草)在甲醇中回流2小時，將提取液減壓干固。在所得的提取物6.8g中取5.0g，采用中壓色譜法，用己烷進行洗脫后(A組分)，用己烷-乙酸乙酯(4∶1)混合溶液進行洗脫(B組分)，接著用乙酸乙酯洗脫(C組分)，然后再用甲醇進行洗脫(D組分)。采用離心色譜法，將所得的B組分480mg在254nm監測下用氯仿洗脫后，按照氯仿-甲醇(9∶1)混合溶液、甲醇的順序依次進行洗脫，得到9組分。采用高效液相色譜法[MightysilRP-18 GP、6.0×250mm、用乙腈-甲醇-水的(45∶5∶50)混合溶液洗脫]，對用氯仿洗脫后所得的B3及B4組分(各42.3mg)進行分析，分別得到了保持時間為16.5分鐘的峰。該化合物的分析結果如下所示。
MS(ESI)m/z329[M+H]+1H-NMR(CDCl3)δ3.89，3.97，3.99(C7，C3’，C4’-OCH3，s)，6.38(C6-H，d，J＝2.4)，6.50(C8-H，d，J＝2.4)，6.59(C3-H，s)，6.98(C5’-H，d，J＝8.8)，7.34(C2’-H，d，J＝2.4)，7.53(C6’-H，dd，J＝8.8，2.4)，12.79(C5-OH，s)13C-NMR(CDCl3)δ55.8(C7-OCH3)，56.1(C3’-OCH3，C4’-OCH3)，92.7(C-2)，98.1(C-8)，104.7(C-3)，105.6(C-10)，108.9(C-2’)，111.2(C-5’)，120.1(C-6’)，123.8(C-1’)，149.3(C-3’)，152.3(C-4’)，151.7(C-4’)，157.7(C-9)，162.2(C-2)，164.0(C-5)，165.5(C-7)，182.4(C-4)實施例73，3’，4’，5，6，7，8-七甲氧基黃酮(化合物1-24)和3’，4’，5，6，7-五甲氧基黃酮(化合物1-25)的分離將約2Kg中國產藥物桔皮(Citrus tangerina的果皮)在甲醇中回流2小時，將提取液減壓干固。在所得的提取物356.5g中取35.2g，采用中壓色譜法，用己烷進行洗脫后(A組分)，用己烷-乙酸乙酯(4∶1)混合溶液進行洗脫(B組分)，接著用乙酸乙酯洗脫(C組分)，然后再用甲醇進行洗脫(D組分)。采用中壓硅膠柱色譜法，將所得的C組分556mg在254nm監測下用氯仿洗脫后，按照氯仿-甲醇(98∶2)混合溶液、氯仿-甲醇(95∶5)混合溶液、甲醇的順序依次進行洗脫，得到10組分。接著，采用中壓硅膠柱色譜法，將用氯仿洗脫后所得的C3及C4組分(總計230mg)在254nm監測下用己烷洗脫后，按照己烷-乙酸乙酯(19∶1)混合溶液、己烷-乙酸乙酯(9∶1)混合溶液、己烷-乙酸乙酯(8∶2)混合溶液、己烷-乙酸乙酯(7∶3)混合溶液、己烷-乙酸乙酯(5∶5)混合溶液、己烷-乙酸乙酯(1∶2)混合溶液、乙酸乙酯、甲醇的順序依次進行洗脫，得到10組分。采用高速液相色譜法[Mightysil RP-18 GP、6.0×250mm、用乙腈-5％甲酸-甲醇-水的(30∶10∶20∶40)混合溶液洗脫]，對用己烷-乙酸乙酯(5∶5)混合溶液洗脫后所得的C23G組分(90.0mg)及(1∶2)混合溶液洗脫后所得的C23J組分(5.2mg)進行分析，分析結果表明得到了顯示保持時間為18.3分鐘(化合物1-24)和10.6分鐘(化合物1-25)的峰的組分。該化合物的分析結果如下所示。
化合物1-24MS(ESI)m/z433[M+H]+1H-NMR(CDCl3)δ3.91(OCH3，s)，3.96(OCH3，s)，3.98(OCH3×2，s)，3.99(OCH3，s)，4.02(OCH3，s)，4.11(OCH3，s)，7.03(C5’-H，d，J＝8.3)，7.82(C2’-H，d，J＝2.4)，7.85(C6’-H，dd，J＝8.3，2.4)13C-NMR(CDCl3)δ56.6，56.7(C3’，C4’-OCH3)，60.5，62.4，62.5，62.7，63.0(C3，C5，C6，C7，C8-OCH3)，107.4(C-2’)，111.7(C-5’)，115.2(C-10)，122.7(C-6’)，124.1(C-1’)，138.6(C-8)，141.5(C-6)，144.6(C-3)，147.4(C-5)，148.9(C-9)，149.5(C-3’)，151.8(C-2)，152.0(C-7)，153.8(C-4’)，174.6(C-4)化合物1-25MS(ESI)m/z373[M+H]+，371[M-H]-1H-NMR(CDCl3)δ3.93(OCH3，s)，3.96(OCH3，s)，3.98(OCH3，s)，3.99(OCH3×2，s)，6.60(C3-H，s)，6.80(C8-H，s)，6.97(C5’-H，d，J＝8.8)，7.33(C2’-H，d，J＝2.0)，7.51(C6’-H，J＝8.3，2.0)13C-NMR(CDCl3)δ56.3，56.3，56.5(C7，C3’，C4’-OCH3)，61.7，62.5(C5，C6-OCH3)，96.4(C-8)，107.6(C-3)，108.8(C-2’)，111.3(C-5’)，112.9(C-10)，119.8(C-6’)，124.3(C-1’)，140.4(C-6)，139.3(C-3’)，152.0(C-4’)，152.6(C-9)，154.7(C-5)，157.8(C-7)，161.3(C-2)，177.4(C-4)實施例85-羥基-6，7-二甲氧基黃酮-4’-葡糖苷(化合物1-26)的分離在室溫下，用甲醇對北海道產的チシマアザミ的莖葉55.0g進行一周的提取，將提取液減壓干固。在所得的提取物13.5g中取5.1g，采用中壓色譜法，將其用己烷進行洗脫后(A組分)，用己烷-乙酸乙酯(4∶1)混合溶液進行洗脫(B組分)，接著用乙酸乙酯洗脫(C組分)，然后再用甲醇進行洗脫(D組分)。在所得的D組分3.8g中取2.0g，采用中壓硅膠柱色譜法，在254nm監測下用氯仿洗脫后，按照氯仿-甲醇(9∶1)混合溶液、氯仿-甲醇(8∶1)混合溶液、氯仿-甲醇(3∶7)混合溶液、甲醇的順序依次進行洗脫，得到10組分。用氯仿將由氯仿-甲醇(9∶1)混合溶液洗脫后所得的D4組分1.34g進行重結晶，得到白色晶體。然后，采用高效液相色譜法[Mightysil RP-18 GP、6.0×250mm、用乙腈-水的(20∶80)混合溶液洗脫]進行分析，分析結果表明得到了顯示保持時間為27.6分鐘的峰的化合物。
該化合物的分析結果如下所示。
MS(ESI)m/z477[M+H]+1H-NMR(DMSO-d6)δ3.74(C7-CH3，s)，3.94(C6’-CH3，s)，4.59(t，J＝5.6)，5.04(d，J＝7.8)，5.06(d，J＝5.6)，5.13(d，J＝4.4)，5.37(d，J＝4.6)，6.98(C8-H，s)，6.96(C3-H，s)，7.20(C3’-H，C5’-H，d，J＝9.0)，8.07(C2’-H，C6’-H，d，J＝9.0)，12.9(C5-OH，s)13C-NMR(DMSO-d6)δ56.5(C7-OCH3)，60.0(C6-OCH3)，60.6(C-6’’)，69.6(C-4’’)，73.1(C-2’’)，76.5(C-3’’)，77.2(C-5’’)，91.7(C-8)，99.8(C-1’’)，103.6(C-3)，105.2(C-10)，116.6(C-3’，C-5’)，123.8(C-1’)，128.2(C-2’，C-6’)，131.9(C-6)，152.0(C-5)，152.7(C-9)，158.7(C-7)，160.3(C-4’)，163.4(C-2)，182.3(C-4)實施例95-羥基-7-二甲氧基黃酮-4’-葡糖苷(化合物1-27)的制備將化合物1-1(5，4’-二羥基-7-甲氧基黃酮)(100mg)溶于丙酮，向其中加入α-D-乙酰溴葡糖(647mg)和碳酸鉀(231mg)，在劇烈的攪拌下進行一晝夜的沸騰回流。過濾除去不溶物，用氯仿清洗濾取物，合并濾洗液，將其在減壓下濃縮干固。通過硅膠色譜法用氯仿/甲醇系對殘留物進行精制。然后將其懸浮于無水甲醇，滴入28％的NaOMe，在室溫攪拌0.5小時。向反應混合物中加入水，用離子交換樹脂(磺酸-+H型)中和。過濾除去樹脂，將溶劑在減壓下濃縮干固，通過硅膠色譜法用氯仿/甲醇系進行精制，得到目標產物(產量10mg產率6％)。
淡黃色結晶，MS(ESI)m/z447[M+H]+1H-NMR(DMSO-d6)δ3.18(1H，t，J＝9Hz)，3.28(1H，t，J＝9Hz)，3.32(1H，t，J＝9Hz)，3.41(1H，m)，3.50(1H，dd，J＝6Hz，12Hz)，3.71(1H，dd，J＝2Hz，11Hz)，3.88(3H，s)，5.04(1H，d，J＝7Hz)，6.40(1H，d，J＝2Hz)，6.83(1H，d，J＝2Hz)，6.94(1H，s)，7.21(2H，d，J＝9Hz)，8.07(2H，d，J＝9Hz)實施例104H，8H-苯并[1，2-b3，4-b’]二吡喃-4-酮，2-(2，4-二羥基苯基)-5-羥基-8，8-二甲基-3-(3-甲基-2-丁烯基)(化合物1-28)的分離在室溫下，用甲醇對泰國產藥物Jack Fruit Tree(Artocarpus heterophyllus的木部)169g進行一周的提取，將提取液減壓干固。在所得的提取物8.1g中取4.7g，采用中壓色譜法，將其用己烷進行洗脫后(A組分)，用己烷-乙酸乙酯(4∶1)混合溶液進行洗脫(B組分)，接著用乙酸乙酯洗脫(C組分)，然后再用甲醇進行洗脫(D組分)。采用中壓硅膠柱色譜法，將所得到的C組分3.2g在254nm監測下用氯仿洗脫后，按照氯仿-甲醇(98∶2)混合溶液、氯仿-甲醇(19∶1)混合溶液、氯仿-甲醇(9∶1)混合溶液、氯仿-甲醇(4∶1)混合溶液、氯仿-甲醇(2∶1)混合溶液、氯仿-甲醇(1∶1)混合溶液、甲醇的順序依次進行洗脫，得到10組分。采用高效液相色譜法[Mightysil RP-18GP、6.0×250mm、用乙腈-水的(70∶30)混合溶液洗脫]，對用氯仿洗脫后所得的C4組分(217mg)進行分析，結果得到了保持時間為9.8分鐘(化合物1-28)的峰。該化合物的分析結果如下所示。
化合物1-28MS(ESI)m/z421[M+H]+，419[M-H]-1H-NMR(CD3OD)δ1.36(CH3，s)，1.43(CH3×2，s)，1.58(CH3，s)，3.08(H，d，J＝6.8)，5.09(H，tt，J＝6.8，3.9)，5.66(C9-H，d，J＝9.8)，6.25(C6-H，s)，6.39(C5，-H，dd，J＝8.3，2.4)，6.40(C3’-H，s)，6.67(C10-H，d，J＝9.8)，7.06(C6’-H，d，J＝8.3)13C-NMR(CD3OD)δ24.6(CH3)，25.6(CH3)，28.3(C8-CH3×2)，78.7(C-8)，95.4(C-6)，103.5(C-3’)，105.8，107.7(C-9)，113.0(C-1’)，116.1(C-5’)，121.8(C-3)，122.5，132.2(C-10)，132.5，157.0，157.5(C-2’)，158.7(C-4’)，160.3(C-7)，161.7(C-2)，163.4(C-5)，183.6(C-4)實施例112’，4’，5-三羥基-7-甲氧基-6-(3-甲基-1-丁烯基)-3-(3-甲基-2-丁烯基)-黃酮(化合物1-29)的分離在室溫下，用甲醇對泰國產藥物Jack Fruit Tree(Artocarpus heterophyllus的木部)169g進行一周的提取，將提取液減壓干固。在所得的提取物8.1g中取4.7g，采用中壓色譜法，將其用己烷進行洗脫后(A組分)，用己烷-乙酸乙酯(4∶1)混合溶液進行洗脫(B組分)，接著用乙酸乙酯洗脫(C組分)，然后再用甲醇進行洗脫(D組分)。接著，采用高效液相色譜法[Mightysil RP-18 GP、6.0×250mm、用乙腈-水的(70∶30)混合溶液洗脫]，對用氯仿洗脫后所得的C4組分(217mg)進行分析，結果得到了保持時間為8.5分鐘(化合物1-29)的峰。該化合物的分析結果如下所示。
化合物1-29MS(ESI)m/z437[M+H]+，435[M+H]-1H-NMR(CD3OD)δ1.02(C17，C18-CH3，d，J＝6.83)，1.33(C12-CH3，s)，1.52(C13-CH3，s)，2.33(C16-H，m)，3.02，3.04(C9-CH2，s)，3.77(C7-OCH3，s)，5.04(C10-H，tt，J＝5.4，1.5)，6.33(C8-H，s)，6.34(C5’-H，d，J＝9.3)，6.36(C3’-H，d，J＝3.4)，6.43(C14-H，dd，J＝16.1，1.0)，6.56(C15-H，dd，J＝16.1，7.3)，7.02(C6’-H，J＝8.3)13C-NMR(CD3OD)δ18.5(C-13)，24.1(C-17，C-18)，25.8(C-9)，26.7(C-12)，35.2(C-16)，57.3(C7-OCH3)，91.5(C-8)，104.6(C-3’)，106.7(C-4a)，108.8(C-5’)，111.2(C-6)，114.1(C-1’)，118.0(C-14)，122.9(C-3)，123.7(C-10)，133.4(C-11)，133.5(C-6’)，143.5(C-15)，158.6(C-2’)，158.6(C-8a)，160.4(C-5)，162.6(C-4’)，164.3(C-2)，165.0(C-7)，184.6(C-4)實施例122H，6H-苯并[1，2-b5，4-b’]二吡喃-6-酮，7，8-二氫-5-羥基-8-(4-羥基苯基)-2，2-二甲基-10-(3-甲基-2-丁烯基)(化合物2-3)的分離在室溫下，用甲醇對泰國產藥物Albizzia myriophylla的枝干60.0g進行一周的提取，將提取液減壓干固。在所得的提取物4.4g中取3.80g，采用中壓色譜法，將其用己烷進行洗脫后(A組分)，用己烷-乙酸乙酯(4∶1)混合溶液進行洗脫(B組分)，接著用乙酸乙酯洗脫(C組分)，然后再用甲醇進行洗脫(D組分)。接著，采用高效液相色譜法[Mightysil RP-18 GP、6.0×250mm、用乙腈-水的(70∶30)混合溶液洗脫]，對所得的B組分(1.2g)進行分析，分析結果表明得到了顯示保持時間為15.2分鐘的峰的組分。該化合物的分析結果如下所示。
MS(ESI)m/z407[M+H]+，405[M-H]-1H-NMR(CDCl3)δ1.43，1.45(C2’’’-CH3×2，s)，1.65(C3’’-CH3×2，s)，2.80(C3-H，dd，J＝17.1，3.2)，3.39(C3-H，dd，J＝17.1，2.9)，3.21(C1’’-H2，d，J＝7.3)，5.14(C2’’-H，t，J＝7.3)，5.34(C2-H，dd，J＝12.7，2.9)，5.50(C3-‘’’H，d，J＝10.0)，6.63(C4’’’-H，d，J＝10.0)，6.87(C3’-H，C5’-H，d，J＝8.8)，7.32(C2’-H，C6’-H，d，J＝8.8)13C-NMR(CDCl3)δ17.8(C-5’’-CH3)，21.5(C-1’’)，25.8(C4’’-CH3)，28.3(C-6’’’-CH3)，28.4(C-5’’’-CH3)，43.2(C-3)，78.1(C-2’’’)，78.5(C-2)，102.7(C-10)，102.8(C-6)，108.6(C-8)，115.5(C-3’，C-5’)，115.7(C-4’’’)，122.5(C-2’’)，126.0(C-1’)，127.7(C-2’，C-6’)，131.1(C-3’’’)，155.8(C-4’)，156.6(C-9)，159.3(C-5)，160.0(C-7)，196.4(C-4)實施例136H，7H-[1]苯并吡喃并[4，3-b][1]苯并吡喃-7-酮，3，8，10-三羥基-9-(3-甲基-1-丁烯基)-6-(2-甲基-1-丙烯基)(化合物5-1)的分離在室溫下，用甲醇對泰國產藥物Jack Fruit Tree(Artocarpus heterophyllus的木部)169g進行一周的提取，將提取液減壓干固。在所得的提取物8.1g中取4.7g，采用中壓色譜法，將其用己烷進行洗脫后(A組分)，用己烷-乙酸乙酯(4∶1)混合溶液進行洗脫(B組分)，接著用乙酸乙酯洗脫(C組分)，然后再用甲醇進行洗脫(D組分)。采用中壓硅膠柱色譜法，將所得到的C組分3.2g在254nm監測下用氯仿洗脫后，按照氯仿-甲醇(98∶2)混合溶液、氯仿-甲醇(19∶1)混合溶液、氯仿-甲醇(9∶1)混合溶液、氯仿-甲醇(4∶1)混合溶液、氯仿-甲醇(2∶1)混合溶液、氯仿-甲醇(1∶1)混合溶液、甲醇的順序依次進行洗脫，得到10組分。采用高效液相色譜法[Mightysil RP-18GP、6.0×250mm、用乙腈-水的(70∶30)混合溶液洗脫]，對用氯仿洗脫后所得的C3組分進行分析，結果得到了保持時間為10.8分鐘(化合物5-1)的峰。該化合物的分析結果如下所示。
化合物5-1MS(ESI)m/z421[M+H]+1H-NMR(CD3OD)δ1.92(CH3×2，d，J＝6.6)，1.70(CH3，d，J＝1.2)，1.95(CH3，d，J＝1.2)，2.41(CH，m)，5.40(CH＝，dt，J＝9.5，1.2)，6.14(C6-H，d，J＝9.3)，6.30(C2-H，d，J＝2.2)，6.42(C11-H，s)，6.50(C4-H，dd，J＝8.5，2.2)，6.53(＝CH，dd，J＝16.1，1.0)，6.68(CH＝，dd，J＝16.1，7.0)，7.59(C5-H，d，J＝8.5)13C-NMR(CD3OD)δ19.3(CH3)，23.9(CH3×2)，26.6(CH3)，35.0，67.3，71.3，95.0(C-11)，105.6(C-4)，106.0，109.3，110.9，111.6，118.0(C-2)，123.2，126.8(C-5)，140.4，143.2，156.9，157.6(C-5)，160.1，161.2(C-8)，163.6(C-3)，165.3(C-10)，180.4(C-7)實施例14 SN-38耐性A549細胞的確立對人非小細胞肺癌A549細胞使用含有10％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的Ham’s F-12培養基(10％FBS/Ham’s F-12)在5％CO2、37℃的條件下進行繼代培養。逐步(4～10ng/ml)增加培養基中的SN-38濃度，對A549細胞進行2個月的繼代培養，選擇出SN-38耐性A549細胞。然后，采用有限稀釋法對該SN-38耐性A549細胞進行克隆，確立6株克隆化SN-38耐性A549細胞(A549/SN-38-1～6)。
實施例15 A549/SN-38細胞的抗癌劑感受性試驗將A549或A549/SN-38-1～6各細胞懸浮于10％FBS/Ham’s F-12，接種于96孔微孔板，在5％CO2、37℃的條件下進行培養(2×103cells/50μl/well)。培養一晚后，加入50μl溶有抗癌劑的10％FBS/Ham’s F-12，在5％CO2、37℃的條件下培養48小時。培養后，使用活細胞測定用試劑[TetraColor ONE(商標名)，生化學工業制]，按照附帶的操作程序測定活細胞數。A549細胞及6株A549/SN-38細胞對各種抗癌劑的感受性示于表6和圖1。其中，IC50值是抑制細胞增殖50％時的抗癌劑的濃度。相對耐性度是A549/SN-38細胞的IC50值除以A549細胞的IC50值所得的值，該值越大，表示耐性獲得的程度越高。A549/SN-38細胞對作為BCRP的基質的SN-38及米托蒽醌表現出特別強的耐性。
表6
實施例16 A549/SN-38細胞的RT-PCR分析采用RT-PCR法對A549細胞、6株A549/SN-38細胞及已知表達BCRP的人乳癌MCF-7細胞中的各種藥物轉運蛋白質的mRNA的表達水平進行分析。用RNA提取用試劑[ISOGEN(商標名)、ニツポソヅ一ソ制]從細胞中提取全部的RNA，使用RT-PCR用試劑[Ready To Go RT-PCR Beads(商標名)、Amershampharmacia biotech制]和熱循環儀[iCycler(商標名)、BIO-RAD制]，按照附帶的操作程序進行RT-PCR(總RNA0.5μg)。PCR產物用2％瓊脂糖凝膠進行電泳后，實施溴化乙啶染色，其后用透射儀進行檢測。此外，使用實時RT-PCR用試劑[SYBR Green RT-PCR Reagents(商標名)，Applied Biosystems制]和PCR產物自動檢測/定量系統[ABI PRISM7000(商標名)、Applied Biosystems制]，按照附帶的操作程序采用實時RT-PCR法進行定量的分析(總RNA 0.1μg)。另外，與BCRP、MDR1、MRP1、MRP2、MRP3和內在性控制基因G3PDH相對應的各PCR引物分別按照公知的mRNA堿序列(登錄號AF098951、AF016535、L05628、U63970、AF009670、M33197)進行設計。RT-PCR的結果示于圖2，實時RT-PCR的結果示于圖3。與A549細胞相比，所有的6株A549/SN-3 8細胞中BCRP的表達都顯著增加。另一方面，與BCRP一樣以SN-38為基質的MRP2的表達水平則沒有發現大的差異。此外，其它的藥物轉運蛋白質也一樣，在A549細胞和A549/SN-38細胞間沒有發現其表達水平的差異。該結果意味著，BCRP與A549/SN-38細胞的抗癌劑耐性機制有關。通過該RT-PCR分析還確認人乳癌MCF-7細胞中的BCRP表達。另一方面，除了藥物轉運蛋白質的表達之外，還通過蛋白印跡法，以有關拓樸異構酶I活性的DNA弛緩反應為指標研究了拓樸異構酶I、拓樸異構酶II、Bc1-2、Bax和IκBα的表達，但沒有得到顯示它們與A549/SN-38細胞的抗癌劑耐性機制有關的數據。
實施例17A549/SN-38細胞的抗癌劑蓄積量向1ml懸浮著A549細胞或A549/SN-38-4細胞(4×106cells/ml)的10％FBS/RPMI1640中加入1μl的SN-38 DMSO溶液(最終濃度300ng/ml)，于37℃恒溫60分鐘后，進行離心分離(2℃、1400xg、1min)除去上清液。在沉淀出的細胞中加入冰冷的PBS，使其再次懸浮后進行離心分離(2℃、1400xg、1min)，清洗細胞。再重復進行一次該清洗操作后，加入375μl PBS，通過進行超聲波處理將細胞破壞。在該細胞破壞液中加入375μl甲醇和15μl的10％硫酸鋅溶液，攪拌后進行離心分離(2℃、12500xg、5min)，回收上清液。將回收的上清液分配到熒光強度測定用的白色96孔微孔板后(200μ/well)，利用微孔板熒光光度計[SPECTRA max GEMINI XS(商標名)，Molecular Devices制]測定上清液中的SN-38和SN-38葡糖醛酸軛合體量(SN-38激勵波長380nm，測定波長560nm；SN-38葡糖醛酸軛合體激勵波長370nm，測定波長430nm)，算出細胞內的蓄積量。其結果如圖4所示，A549/SN-38-4細胞的SN-38蓄積量減少到A549細胞中的蓄積量的約1/5。該結果進一步佐證BCRP與A549/SN-38細胞的抗癌劑耐性機制有關。另一方面，在兩種細胞中基本沒有檢測出SN-38葡糖醛酸軛合體，這表示葡糖醛酸軛合活性與耐性機制無關。
實施例18類黃酮化合物對A549/SN-38-4細胞的抗癌劑耐性的克服作用將A549或A549/SN-38-4細胞懸浮于10％FBS/Ham’s F-12，接種于96孔微孔板，在5％CO2、37℃的條件下進行培養(2×103cells/50μl/well)。培養一晚后，分別加入類黃酮化合物和溶有SN-38的10％FBS/Ham’s F-12各25μl，在5％CO2、37℃的條件下培養48小時。培養后，使用TetraColor ONE，按照附帶的操作程序測定活細胞數。各類黃酮化合物的耐性克服效果以EC50值示于表7。EC50值是使相對耐性度降低50％時的類黃酮化合物的濃度。其結果是，類黃酮化合物對A549/SN-38-4細胞的SN-38耐性顯示出極強的克服作用。另一方面，在能夠克服耐性的濃度范圍內，類黃酮化合物本身不會影響A549細胞和A549/SN-38-4細胞的增殖。該結果表明，本發明的類黃酮化合物是通過抑制BCRP來克服癌細胞的抗癌劑耐性的。
表7
實施例19類黃酮化合物使MCF-7細胞對抗癌劑的感受性增強的作用使用已知表達BCRP的人乳癌MCF-7細胞(Blood 99，3763-3770(2002))，研究類黃酮化合物在癌細胞對抗癌劑的感受性上所帶來的作用。將MCF-7細胞懸浮于10％FBS/RPMI1640，再接種于96孔微孔板，在5％CO2、37℃的條件下進行培養(3×103cells/50μl/well)。培養一晚后，分別加入類黃酮化合物和溶有SN-38的10％FBS/RPMI1640各25μl，在5％CO2、37℃的條件下培養48小時。培養后，使用TetraColor ONE，按照附帶的操作程序測定活細胞數。受類黃酮化合物的作用MCF-7細胞對SN-38的感受性的變化以IC50值(將細胞增殖抑制50％時的SN-38的濃度)表示，示于表8。其結果是，類黃酮化合物增強了MCF-7細胞對SN-38的感受性。另一方面，在能夠增強感受性的濃度范圍內，類黃酮化合物本身不會影響MCF-7細胞的增殖。該結果表明，本發明的類黃酮化合物是通過抑制BCRP來增強癌細胞對抗癌劑的感受性的。
表8
實施例20類黃酮化合物對人BCRP基因導入小鼠白血病P388細胞的抗癌劑耐性的克服作用將小鼠白血病P388細胞或人BCRP基因導入P388細胞(P388/BCRP細胞，取自財團法人癌研究會癌化學療法中心 杉本芳一氏)懸浮于10％FBS/RPMI1640，再接種于96孔微孔板后(1×104cells/50μl/well)，分別加入類黃酮化合物和溶有SN-38的10％FBS/RPMI1640各25μl，在5％CO2、37℃的條件下培養48小時。培養后，使用TetraColor ONE，按照附帶的操作程序測定活細胞數。其結果示于圖5。類黃酮化合物對P388/BCRP細胞的SN-38耐性表現出極強的克服作用。而在P388細胞對SN-38的感受性上沒有影響。該結果證明，本發明的類黃酮化合物具有BCRP抑制作用。
實施例21類黃酮化合物對MES-SA/Dx5細胞的多劑耐性的作用將人子宮癌MES-SA細胞或高水平表達P-糖蛋白質而獲得多劑耐性的MES-SA/Dx5細胞[Cancer Res.45，4091-4096(1985)]懸浮于10％FBS/DMEM，再接種于96孔微孔板，在5％CO2、37℃的條件下進行培養(3×103cells/50μl/well)。培養一晚后，分別加入類黃酮化合物和溶有紫杉醇的10％FBS/DMEM各25μl，在5％CO2、37℃的條件下培養48小時。培養后，使用TetraColor ONE，按照附帶的操作程序測定活細胞數。各類黃酮化合物對多劑耐性的作用以ECx值表示，示于表9。EC50值是使相對耐性度降低50％時的類黃酮化合物的濃度。其結果是，在所研究的濃度范圍內，類黃酮化合物對MES-SA/Dx5細胞的紫杉醇耐性沒有影響。此外，類黃酮化合物本身對MES-SA細胞和MES-SA/Dx5細胞的增殖沒有影響。該結果表明，本發明的類黃酮化合物對P-糖蛋白質沒有作用，對BCRP具有特異性。
表9
實施例22類黃酮化合物對BCRP表達細胞的抗癌劑蓄積量的作用向1ml懸浮著P388細胞和P388/BCRP細胞(1×107cells/ml)或MCF-7細胞(3×106cells/ml)的10％FBS/RPMI1640中加入類黃酮化合物和SN-38(最終濃度500ng/ml)，于37℃恒溫60分鐘后，進行離心分離(2℃、1400xg、1min)除去上清液。向沉淀出的細胞中加入冰冷的10％FBS/RPMI1640，使其再次懸浮后，進行離心分離(2℃、1400xg、1min)，清洗細胞。再重復進行一次該清洗操作后，加入375μl PBS，通過進行超聲波處理將細胞破壞。在該細胞破壞液中加入375μl甲醇和15μl 10％硫酸鋅溶液，攪拌后進行離心分離(2℃、12500xg、5min)，回收上清液。將回收的上清液分配到熒光強度測定用的白色96孔微孔板后(200μ/well)，利用微孔板熒光光度計測定上清液中的SN-38量(SN-38激勵波長380nm，測定波長560nm)，算出細胞內的蓄積量。其結果如圖6所示，本發明的類黃酮化合物使P388/BCRP細胞的SN-38細胞內蓄積量增加。還有，如圖7所示，本發明的類黃酮化合物使MCF-7細胞的SN-38蓄積量增加。該結果表明，本發明的類黃酮化合物可抑制BCRP，使抗癌劑在細胞內的存在量增加。
實施例23類黃酮化合物的體內的抗癌劑耐性克服作用在6周齡的CDF1類、雌小鼠(5只/組)的腹腔內植入P388細胞或P388/BCRP(1×106cells/小鼠)，從腫瘤植入后的第1天至第10天，1天1次將類黃酮化合物和鹽酸依立替康(CPT-11)投入腹腔內，共計10次。類黃酮化合物以懸浮于乙醇、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐單油酸酯[Tween 80(商標名)、東京化成工業制]和5％葡萄糖混合液(乙醇/Tween 80/5％葡萄糖＝5∶5∶90)的形式投入，CPT-11以溶于生理鹽水的形式投入，而在對照組中僅投入溶劑。調查植入腫瘤后的小鼠的生存天數，按照下式求出壽命延長率T/C(％)，判斷抗腫瘤效果。
壽命延長率T/C(％)＝(給藥組小鼠的平均生存天數)÷(對照組小鼠的平均生存天數)×100結果示于表10。該結果表明，本發明的類黃酮化合物在體內也可抑制BCRP，發揮抗癌劑耐性克服效果。
表10
實施例24混合下述成分，將該混合物制成藥片。
表11
利用本發明，能夠克服與BCRP有關的抗癌劑耐性。此外，對于原本就表達BCRP的癌癥有增強抗癌劑的效果。此外，有望提高抗癌劑的生物利用度，提高癌癥化療法的治療成績。
權利要求
1.以下式(1)、(2)、(3)、(4)或(5)表示的類黃酮化合物或其苷、酯或鹽為有效成分的乳癌耐性蛋白抑制劑， 式中，R1表示氫原子、羥基、鹵原子、低級烷氧基或低級烷基，7個R2可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基、低級烷氧基、低級烷基、低級鏈烯基或糖殘基，或者也可以和相鄰的R1一起形成為可被低級烷基取代的吡喃環，R3表示氫原子、羥基、鹵原子、低級烷基、低級烷氧基、氨基或硝基； 式中，R4表示氫原子、羥基、鹵原子、低級烷氧基、低級烷基或低級鏈烯基，7個R5可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基、低級烷氧基或低級烷基，或者相鄰的2個R5可以一起形成為可被低級烷基取代的吡喃環，R6表示氫原子、羥基、鹵原子、低級烷氧基、低級烷基、氨基或硝基； 式中，R7表示氫原子、羥基、鹵原子、低級烷氧基或低級烷基，2個R8可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基、低級烷氧基或低級烷基，R9表示氫原子、羥基、鹵原子或低級烷氧基，5個R10可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或低級烷氧基； 式中，3個R11可以相同也可以不同，表示氫原子、羥基或低級烷氧基； 式中，R12表示氫原子或低級鏈烯基，R13表示氫原子或羥基，R14表示表示氫原子。
2.以權利要求1所述的類黃酮化合物(1)、(2)、(3)、(4)或(5)、其苷、酯或鹽為有效成分的針對獲得了與BCRP有關的耐性的癌癥的抗癌劑耐性克服劑，或針對表達BCRP、對抗癌劑的感受性低的癌癥的抗癌劑耐性克服劑。
3.抗癌劑，其特征在于，含有權利要求1所述的類黃酮化合物(1)、(2)、(3)、(4)或(5)或其苷、酯或鹽及可成為BCRP的基質的抗癌劑。
4.類黃酮化合物，其特征在于，由下式(6) 表示，式中，R15表示氨基或硝基。
5.如權利要求4所述的類黃酮化合物，其特征還在于，式(6)中的R15表示硝基。
6.如權利要求4所述的類黃酮化合物，其特征還在于，式(6)中的R15表示氨基。
7.高水平表達BCRP的7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)耐性人非小細胞肺癌A549細胞。
全文摘要
本發明提供了對抑制BCRP的藥物制劑的篩選有用的癌細胞及抑制BCRP的藥物制劑。提供了以下式(1)、(2)、(3)、(4)或(5)表示的類黃酮化合物或其苷、酯或鹽為有效成分的BCRP抑制劑，以及含有該BCRP抑制劑和可成為BCRP的基質的抗癌劑的抗癌劑。
文檔編號A61P43/00GK1744887SQ20048000329
公開日2006年3月8日 申請日期2004年2月3日 優先權日2003年2月4日
發明者山崎竜太, 西山由紀子, 古田富雄, 松崎健, 簱野博, 松本幸子, 相山律男, 吉田央, 長岡正人, 橋本秀介, 杉本芳一 申請人:株式會社益力多本社