血腦屏障破壞的抑制劑的制作方法

專利名稱：血腦屏障破壞的抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及含有吡唑啉酮衍生物、或其生理學上允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物作為有效成分的用于抑制血腦屏障破壞的抑制劑。
背景技術：
所謂的血腦屏障是限制血液中的物質進入腦組織內的屏障，由此保護腦組織免受有害物質的侵害。尼古丁、咖啡因或海洛因之類的脂溶性物質可容易地通過血腦屏障，但極性和強電解質之類的非脂溶性物質一般難以通過血腦屏障。一方面，已經知道的是，腦代謝所必需的D-葡萄糖等水溶性物質通過載體經血腦屏障而被運送到腦組織內。在腦毛細血管中，相互鄰接的內皮細胞之間形成被稱為“tight-junction”的緊密結合，因此，物質不能從細胞之間的間隙漏出，原則上必須是能通過腦毛細血管的內皮細胞的物質才能出入腦內。如上所述，腦毛細血管的內皮細胞不僅向腦內輸送營養物質，還通過細胞膜上存在的各種轉運系統將藥物運送到腦內。
多發性硬化癥、腦膜炎、大腦炎或腦膿腫等是血腦屏障被破壞引起的中樞神經系統的炎癥性疾病，已有報告報道了這些疾病顯示在腦脊液中存在大量的炎癥性細胞因子，TNF-α和IL-1β。(S.L.Hauser，et al.，Cytokine accumulation in CSF of multiple sclerosis patientsfrequent detection of interleukin-1 and tumor necrosis factor but not interleukin-6.Neurology，401735-1739(1990))。
一方面，眾所周知，下述通式(I)
(式中，R1表示氫原子、芳基、碳數為1～5的烷基或總碳數為3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氫原子、芳氧基、芳巰基、碳數為1～5的烷基或碳數為1～3的羥基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳數為3～5的亞烷基，R3表示氫原子、碳數為1～5的烷基、碳數為5～7的環烷基、碳數為1～3的羥基烷基、芐基、萘基、苯基或由1～3個相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基選自由碳數為1～5的烷氧基、碳數為1～3的羥基烷基、總碳數為2～5的烷氧基羰基、碳數為1～3的烷基巰基、碳數為1～4的烷基氨基、總碳數為2～8的二烷基氨基、鹵原子、三氟甲基、羧基、氰基、羥基、硝基、氨基及乙酰胺基組成的組)表示的吡唑啉酮衍生物在藥物的應用中具有維持腦功能正常化的作用(請參見日本專利公告No.5-31523號公報)、抑制過氧化脂質生成的作用(請參見日本專利公告No.5-35128號公報)、抗潰瘍的作用(請參見日本專利公開No.3-215425號公報)、以及抑制血糖上升的作用(請參見日本專利公開No.3-215426公報)等。
另外，上述通式(I)所示的化合物中，以3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮為有效成分的藥劑已經自2001年6月作為腦保健劑(通用名為“依達拉奉”(ェダラボン)、商品名為“ラジカット”)，由三菱制藥株式會社制造銷售)上市。有報告報道該依達拉奉對活性氧具有很高的反應性(請參見Kawai，H.，et al.，J.Phamacol.Exp.Ther.，281(2)，921，1997；及Wu，TW.et al.，Life Sci，67(19)，2387，2000)。如上所述，依達拉奉是一種通過消除以活性氧為主的各種自由基而起到防止細胞損害等的作用的自由基清除劑。但是，到目前為止，還沒有研究依達拉奉對血腦屏障的破壞是否有抑制作用的報告。

發明內容
本發明的課題在于提供一種血腦屏障破壞的抑制劑。
本發明者為了解決上述課題，采用體內和體外方法研究了式(I)所示吡唑啉酮衍生物用于抑制血腦屏障破壞的效果。結果發現，在給予了上述吡唑啉酮衍生物后，發現血腦屏障的破壞受到抑制，患有中樞神經系統炎癥性疾病的患者的神經癥狀可以得到緩解。在上述發現的基礎上完成了本發明。
也就是，本發明提供含有下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物作為有效成分的、用于抑制血腦屏障破壞的抑制劑， (式中，R1表示氫原子、芳基、碳數為1～5的烷基或總碳數為3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氫原子、芳氧基、芳巰基、碳數為1～5的烷基或碳數為1～3的羥基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳數為3～5的亞烷基，R3表示氫原子、碳數為1～5的烷基、碳數為5～7的環烷基、碳數為1～3的羥基烷基、芐基、萘基、苯基或由1～3個相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基選自由碳數為1～5的烷基、碳數為1～5的烷氧基、碳數為1～3的羥基烷基、總碳數為2～5的烷氧基羰基、碳數為1～3的烷基巰基、碳數為1～4的烷基氨基、總碳數為2～8的二烷基氨基、鹵原子、三氟甲基、羧基、氰基、羥基、硝基、氨基及乙酰胺基組成的組。)根據本發明的優選實施方式，提供了一種對血腦屏障的通透性增大具有抑制作用的血腦屏障破壞抑制劑，以及提供了一種對腦脊液中的炎癥性細胞因子含量的增大具有抑制作用的血腦屏障破壞抑制劑。
根據本發明的優選實施方式，其中式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮、或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物。
另一方面，本發明提供了含有式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物作為有效成分的用于預防和/或治療多發性硬化癥、腦膜炎、大腦炎或腦膿腫的藥物。在優選的實施方式中，式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
再一方面，本發明提供了一種血腦屏障破壞的抑制方法，該方法包括將有效劑量的以式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物對包括人在內的哺乳動物給藥的步驟；并且本發明還提供了一種用于預防和/或治療多發性硬化癥、腦膜炎、大腦炎或腦膿腫的方法，該方法包括將有效劑量的以式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物對包括人在內的哺乳動物給藥的步驟。
另一方面，本發明還提供了一種由式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物在制造用于抑制血腦屏障破壞的抑制劑中的用途，以及由式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物在制造用于預防和/或治療多發性硬化癥、腦膜炎、大腦炎或腦膿腫的藥物中的用途。


圖1是表示血腦屏障共培養模型的概貌的圖(左圖)以及在所制作的共培養模型中熒光素鈉擴散速度和TEER(跨內皮細胞電阻)之間的關系的圖(右圖)。在圖1中，術語“PSendo”代表在內皮細胞層中熒光素透過的清除率。向位于雙層通透的培養皿(Transwell)頂層(內皮細胞側)的培養基中添加熒光素，并且觀察熒光素向位于Transwell底層(星形膠質細胞側)的培養基中透過的情況。到了規定的時間，用透過底層的熒光素的量除以頂層培養基中的熒光素的濃度，以此得到所述的透過清除率。因為在實驗中測定的該透過清除率是內皮細胞層+Transwell濾膜層+星形膠質細胞層各層合在一起的總的透過清除率(PStotal)，因而，還同時要用在Transwell濾膜中只培養星形膠質細胞的透過清除率(PSastro+filter)進行校正。校正公式為1/PStotal＝1/PSendo+1/PSastro+filter。
圖2是表示TNFα(腫瘤壞死因子α)和IL-1β(白介素-1β)對TEER的影響的試驗結果。術語“αMSH”代表α黑素細胞刺激激素。
圖3是表示NK-κB(核因子-κB)抑制劑和iNOS(誘導型一氧化氮合酶)抑制劑對TEER的效果圖。
圖4是表示NK-κB抑制劑和iNOS抑制劑對NO產生量的效果圖。
圖5是表示依達拉奉對TEER的效果圖。
圖6是表示EAE大鼠中TNFα和IL-1β的量和BBB通透性的試驗結果圖。
圖7是表示依達拉奉對EAE大鼠中TNFα和IL-1β的量和BBB通透性的效果圖。術語“CSF”表示腦脊液。
圖8是表示在EAE模型大鼠中，對未給藥組(對照組)、地塞米松給藥組以及依達拉奉給藥組進行四肢神經麻痹得分評價的結果圖。術語“i.p.”表示腹腔內給藥。
具體實施例方式
作為本發明的用于抑制血腦屏障破壞的抑制劑和用于預防和/或治療多發性硬化癥、腦膜炎、大腦炎或腦膿腫的藥物(以下將其總稱為本發明的藥物)，其包含本說明書定義的由通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物。
由于互變異構性，本發明中使用的式(I)表示的化合物可以具有以下的通式(I’)或(I”)顯示的不同結構。為了方便，本說明書中的通式(I)顯示了互變異構體中的一種，本領域的技術人員顯然知道存在下述的互變異構體。作為本發明藥物的有效成分，也可以使用下述的通式(I’)或(I”)顯示的化合物、或其生理學上允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物。
式(I)中，在R1定義中的芳基可以是單環或多環芳基中的一種。其實例包括苯基、萘基等以及由例如甲基、丁基等烷基、例如甲氧基、丁氧基等烷氧基、例如氯原子等鹵原子、或者羥基等取代基取代的苯基等。其它具有芳基部分的取代基(例如芳氧基)中的芳基部分也同樣如此。
在R1、R2、R3定義中的碳數為1～5的烷基可以是直鏈狀、支鏈狀中的任何一種。例如有甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基等。其它具有烷基部分的取代基(烷氧基羰基烷基)中的烷基部分也同樣如此。
在R1定義中的總碳數為3～6的烷氧基羰基烷基的實例包括甲氧基羰基甲基、乙氧基羰基甲基、丙氧基羰基甲基、甲氧基羰基乙基、甲氧基羰基丙基等。
在R2定義中的芳氧基例如有對甲基苯氧基、對甲氧基苯氧基、對氯苯氧基、對羥基苯氧基等，芳基巰基例如有苯基巰基、對甲基苯基巰基、對甲氧基苯基巰基、對氯苯基巰基、對羥基苯基巰基等。
在R1和R2的定義中的碳數為3-5的亞烷基例如有三亞甲基、四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基、甲基三亞甲基、乙基三亞甲基、二甲基三亞甲基、甲基四亞甲基等等。
在R2和R3定義中的碳數為1～3的羥基烷基例如有羥基甲基、2-羥基乙基、3-羥基丙基等。在R3定義中的碳數為5～7的環烷基例如有環戊基、環己基、環庚基等。
在R3的定義中，其中所述作為苯基取代基的碳數為1～5的烷氧基的實例包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、異丙氧基、丁氧基、戊氧基等，總碳數為2～5的烷氧基羰基的實例包括甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基等，碳數為1～3的烷基巰基的實例包括甲基巰基、乙基巰基、丙基巰基等，碳數為1～4的烷基氨基的實例包括甲基氨基、乙基氨基、丙基氨基、丁基氨基等，總碳數為2～8的二烷基氨基的實例包括二甲基氨基、二乙基氨基、二丙基氨基、二丁基氨基等。
作為本發明藥物的有效成分優選使用的化合物(I)例如有如下的化合物。
3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(2-甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；
3-甲基-1-(3-甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(4-甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(3，4-二甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-乙基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(4-丙基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-三氟甲基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-三氟甲基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(2-甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3，4-二甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-乙氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(4-丙氧基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(2-氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3，4-二氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-溴代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氟代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-氯-4-甲基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-甲基巰基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲基巰基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；4-(3-甲基-5-氧代-2-吡唑啉-1-基)苯甲酸；1-(4-乙氧基羰基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-硝基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；3-乙基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；1-苯基-3-丙基-2-吡唑啉-5-酮；1，3-二苯基-2-吡唑啉-5-酮；
3-苯基-1-(對甲苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲氧基苯基)-3-苯基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氯代苯基)-3-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3，4-二甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；4-異丁基-3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；4-(2-羥基乙基)-3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-4-苯氧基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-4-苯基巰基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3，3’，4，5，6，7-六氫-2-苯基-2H-吲唑-3-酮；3-(乙氧基羰基甲基)-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；1-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1，3-二甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-乙基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-丁基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(2-羥基乙基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-環己基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-芐基-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(α-萘基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-甲基-3-苯基-2-吡唑啉-5-酮；3-甲基-1-(4-甲基苯基)-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁氧基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氯代苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-羥基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3，4-二羥基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(2-羥基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(3-羥基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-羥基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；
1-(3，4-羥基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-羥基苯基)-3-苯基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-羥基甲基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-甲基氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-乙基氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-丁基氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-二甲基氨基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(乙酰胺基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；1-(4-氰基苯基)-3-甲基-2-吡唑啉-5-酮；作為本發明藥物的有效成分，除通式(I)表示的游離形態的化合物之外，也可以使用其生理學允許的鹽。該生理學允許的鹽例如可以使用與鹽酸、硫酸、氫溴酸、磷酸等無機酸形成的鹽，與甲磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、乙酸、乙醇酸、葡糖醛酸、馬來酸、富馬酸、草酸、抗壞血酸、檸檬酸、水楊酸、煙酸、酒石酸等有機酸形成的鹽，與鈉、鉀等堿金屬形成的鹽，與鎂、鈣等堿土金屬形成的鹽，與氨、三(羥基甲基)氨基甲烷、N，N-二(羥基乙基)哌嗪、2-氨基-2-甲基-1-丙醇、乙醇胺、N-甲基谷氨酰胺、L-谷氨酰胺等胺形成的鹽。另外，還可使用與甘氨酸等氨基酸形成的鹽。
作為本發明藥物的有效成分，例如可以使用上述通式(I)表示的化合物或其生理學允許的鹽的水合物，或上述通式(I)表示的化合物或其生理學允許的鹽的溶劑化物。對形成溶劑化物的有機溶劑的種類沒有特別限制，例如有甲醇、乙醇、乙醚、二噁烷、四氫呋喃等。另外，上述通式(I)表示的化合物有時由于取代基的種類不同而具有1個或更多的不對稱碳原子，有時存在光學異構體或非對映異構體等立體異構體。作為本發明藥物的有效成分，也可以使用純的立體異構體、立體異構體的任意混合物、外消旋體等。
通式(I)表示的所有化合物是公知的化合物，本領域的技術人員利用例如日本專利公報No.5-31523號等記載的方法可以容易地進行合成。
對本發明藥物的給藥量沒有特別限定。通常，按照作為有效成分的由通式(I)表示的化合物的重量，一般口服的劑量為每天0.1～1000mg/kg體重，優選每天0.5～50mg/kg體重；非口服時，該劑量為每天0.01～100mg/kg體重，優選每天0.1～10mg/kg體重。上述劑量優選按一天一次或一天分幾次(2～3次)服用，可以根據年齡、病情、癥狀適當增減。
作為本發明的藥物，可以將上述通式(I)表示的化合物或其生理學上允許的鹽，或其水合物或其溶劑化物直接給藥，一般優選將之制備成含有上述物質作為有效成分以及含有藥理學和藥劑學允許的添加劑的藥物組合物，并以該藥物組合物的形式給藥。
在本發明中可以使用的所述藥理學和藥劑學允許的添加劑例如有賦形劑、崩解劑或崩解助劑、粘合劑、潤滑劑、包衣劑、色素、稀釋劑、基劑、溶解劑或溶解助劑、等滲劑、pH調節劑、穩定劑、噴射劑及粘接劑等。
對于適合口服的藥物組合物，作為添加劑例如可以使用，賦形劑如葡萄糖、乳糖、D-甘露糖醇、淀粉或結晶纖維素等；崩解劑或崩解助劑如羧基甲基纖維素、淀粉或羧基甲基纖維素鈣等，粘合劑如羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙烯吡咯烷酮或明膠等；潤滑劑如硬脂酸鎂或滑石粉等，包衣劑如羥基丙基甲基纖維素、蔗糖、聚乙二醇或氧化鈦等，基劑如凡士林、液體石蠟、聚乙二醇、明膠、高齡土、丙三醇、純凈水或硬脂肪等。
對于適合注射或點滴用的藥物組合物，可以使用諸如注射用蒸餾水、生理鹽水、丙二醇等水性或在使用時可以構成溶液型注射劑的溶解劑或溶解助劑，諸如葡萄糖、氯化鈉、D-甘露糖醇、丙三醇等的等滲劑，諸如無機酸、有機酸、無機堿或有機堿等的pH調節劑等添加劑。
對本發明的藥物的形態沒有限制，可以制成本領域技術人員可以利用的各種形態。作為適合口服的藥物，例如可以使用固體藥劑添加劑，制成片劑、粉劑、顆粒劑、硬膠囊劑、栓劑或錠劑等；可以使用液狀的藥劑添加劑，配制成糖漿、乳劑、軟膠囊劑等。另外，作為適合非口服的藥物，例如可以配制成注射劑、點滴劑、吸入劑、栓劑、經皮吸收劑、經粘膜吸收劑等。另外，以上述通式(I)所示的化合物為有效成分的腦保健劑(點滴劑)因為已經在臨床上使用(通用名為依達拉奉(ェダラボン)、商品名“ラジカット”，由三菱制藥株式會社制造、銷售)，故在本發明的藥物中可以直接使用上述市售的制劑。
本發明的藥物可有效抑制中樞神經系統的炎癥性疾病中的血腦屏障的破壞。作為中樞神經系統的炎癥性疾病，可以舉出多發性硬化癥、腦膜炎、大腦炎和腦膿腫等，特別是多發性硬化癥和腦膜炎。本發明優選的藥物對血腦屏障的通透性增大具有抑制作用，并且對在腦脊液中炎癥性細胞因子(TNF-α、IL-1β等)的含量增大具有抑制作用。
對本發明藥物的給藥方法沒有特別限定，可以口服或非口服給藥。對于非口服給藥的方式沒有特別的限制，可以經靜脈內、肌肉內、皮內或皮下注射給藥。
此外，在血腦屏障的破壞發生之前可以預防性地給予本發明的藥物。對于已經發生了血腦屏障破壞的患者，為了防止癥狀惡化或使癥狀減輕，可以對該患者給予本發明的藥物。
實施例下面，通過實施例更具體地說明本發明，本發明不限于下述的合成例3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮(下面稱作依達拉奉)的合成在乙醇50ml中加入乙酰乙酸乙酯13.0g及苯肼10.8g，回流攪拌3小時。放置冷卻該反應液之后，過濾收集析出的結晶，利用乙醇再結晶，得到無色結晶的標題化合物11.3g。
收率67％熔點127.5～128.5℃
實施例1使用血腦屏障共培養模型，評價依達拉奉對血腦屏障破壞的抑制作用(1)血腦屏障共培養模型的制作按照已經報道的方法制作血腦屏障共培養模型(Eur.J.Pharm.Sci.，12215-222，2001)。具體地講，分離出腦微小毛細血管內皮細胞和大鼠的星形膠質細胞，以在TranswellTM濾膜的兩面上進行培養的方式制作共培養模型。下面是該方法的說明。
從牛腦中分離出腦毛細血管。除去腦膜和白質，在添加了10％胎牛血清的DMEM(DMEM+S)中收集灰質。使用Wheaton勻化器通過手動勻化制備血管碎片，在150微米的尼龍篩上收獲血管碎片。在DMEM+S中用膠原酶(コラゲナ一ザ)、胰蛋白酶和DNAse I在37攝氏度消化血管1小時，用200微米的尼龍篩過濾。將腦毛細血管級分重新懸浮于冷凍混合物(含有10％DMSO的胎牛血清(FCS))，于-80攝氏度保存。
從新生Wister大鼠(Harlan，Zeist，The Netherlands)分離星形膠質細胞。將分離出的皮質打碎，在37攝氏度與含有胰蛋白酶-EDTA的DMEM一起溫育。所得的懸浮液用120微米和45微米的尼龍篩分別過濾，在塑料組織培養瓶(Greiner，Alphen a/d Rijn，TheNetherlands)內于DMEM+S中在37攝氏度在10％的CO2環境下培養3天。此后，每兩日更換一次培養基。在培養至匯合時，按1∶3的比例將培養物在用多聚D-賴氨酸包覆的培養瓶中使用胰蛋白酶-EDTA進行繼代培養。使培養物生長，直至再次匯合。接著，在兩周的時間里，每隔一天回收星形膠質細胞的條件培養基，并用液氮保存在冷凍混合物中。
在用IV型膠原和纖連蛋白包覆的塑料組織培養瓶中接種腦毛細血管，4個小時使細胞黏附，此后，將培養基更換成生長培養基(添加了50％(v/v)星形膠質細胞條件培養基和125μg/ml肝素的DMEM+S)，在37攝氏度在10％CO2氣氛下培養生長的細胞(大量的腦毛細血管內皮細胞以及各種少量的外皮細胞)。
在IV型膠原包覆的Transwell聚碳酸酯濾膜(表面積為0.33cm2，孔徑為0.4μm；Corning Costar，Cambridge，MA，USA)上制備體外血腦屏障模型。在長到約70％匯合(接種腦毛細血管4或5天后)時，用胰蛋白酶-EDTA處理腦毛細血管內皮細胞約1分鐘，使外皮細胞仍舊附著于下層。以45000個細胞/濾膜的密度將星形膠質細胞接種于濾膜的底部，以此制備腦毛細血管內皮細胞和星形膠質細胞的共培養物。10分鐘內使星形膠質細胞在濾膜的底部黏附，此后2或3日后對腦毛細血管內皮細胞進行繼代培養。以30000個細胞/濾膜的密度接種腦毛細血管內皮細胞。腦毛細血管內皮細胞和星形膠質細胞的共培養物，在剛開始的頭2或3天用補充了125μg/ml肝素的DMEM+S培養，在最后的2或3天用DMEM+S或分化培養基(即，補充了5μg/ml的去鐵鐵傳遞蛋白、8μg/ml的腐胺、2.5μg/ml亞硒酸鈉、312.5μM的8-(4-氯代苯基硫基(CPT))-cAMP、17.5μM的RO-20-1724和1μM的全反式視黃酸的DMEM+S培養基)培養，直至長成緊密的細胞單層。按照同樣的方式培養腦毛細血管內皮細胞的單層，只是向培養基中添加50％(v/v)星形膠質細胞的條件培養基。
在圖1的左側的圖中顯示的是所制作的共培養模型的概貌。在所做成的共培養模型中，熒光素鈉的擴散速度和TEER(跨內皮細胞電阻)之間的相互關系表示在圖1中右側的圖中。采用Millipore公司的Millicell-ERS(產品編號MERS00001)測定TEER。
(2)TNFα和IL-1β對TEER的影響采用上述的血腦屏障共培養模型，向細胞中加入TNFa(50ng/mL)和IL-1β(5ng/mL)，采用Millipore公司的Millicell-ERS(產品編號MERS00001)測定作為通透性指標的TEER。在TranswellTM濾膜的BBS共培養模型的基底外側添加TNF-α和IL-1β。結果(n＝3，平均值±SEM，*P＜0.05)顯示在圖2中從圖2所示的結果可以看出，添加TNF-α(50ng/mL)和/或IL-1β(50ng/mL)使TEER顯著下降。
(3)NF-κB抑制劑、iNOS抑制劑和依達拉奉使TEER減少的恢復在作為NF-κB抑制劑的BAY11-7082(CALBIOCHEM公司)(10μM)或α-MSH(Sigma公司)(1μM)、作為iNOS抑制劑的1400W(CALBIOCHEM公司)(0.5nM)或依達拉奉(10μM)的存在下，向細胞中添加TNF-α(50ng/mL)和/或IL-1β(5ng/mL)，使用Millipore公司的Millicell-ERS(產品編號MERS00001)測定作為通透性指標的TEER。而且，使用Griess法測定培養液中的NO。
結果顯示在圖3至圖5中(在各實驗中，n＝3，平均值±SEM，*P＜0.05)。圖3表示的是NF-κB抑制劑和iNOS抑制劑對TEER的效果。圖4顯示的是NF-κB抑制劑和iNOS抑制劑對NO產生量的效果。圖5顯示的是依達拉奉對TEER的效果。從圖3至圖5的結果可以看出，由于添加了NF-κB抑制劑、iNOS抑制劑或依達拉奉，使得由TNF-α或IL-1β引起的TEER減少可以得以恢復。
實施例2采用實驗用自體免疫性腦脊髓炎(EAE)模型評價依達拉奉對血腦屏障破壞的抑制作用利用已知的方法制做EAE(實驗用自體免疫性腦脊髓炎)模型大鼠(Int.J.immunopharmacol，7497-503，1995)。首先制備由等量的豚鼠脊髓、無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)和不完全弗氏佐劑作成的腦炎誘發性乳液，向其中補充10mg/ml的結核桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)H37Ra(Difco Laboratories)。通過對各大鼠(近交雄性Lewis大鼠，體重200-250g)的兩后肢的腳底皮下注射接種0.1ml如此制成的腦炎誘發性乳液，從而制成EAE模型大鼠。給對照大鼠接種不含脊髓的乳液。
在給對照大鼠和EAE模型大鼠給藥依達拉奉的情況下和不給藥依達拉奉的情況下，測定血漿和腦脊液中的TNF-α和IL-1β的濃度、腦脊液蛋白質/血漿蛋白質的比率和血腦屏障通透性(測定靜脈注射熒光素鈉20分鐘后的腦/血漿濃度(Kp，app))。“Kp，app”表示表觀分布比率(apparent distribution ratio)，是在靜脈注射給藥熒光素后其在腦組織中的濃度除以其在血漿中濃度所得的值(×100，以％表示)。而且，以腦組織的比重為1進行換算(因為濃度的單位為/g組織的重量)。從致敏(給予抗原溶液)后第10天每隔24小時在3日內(＝在致敏后第10天、第11天、第12天，共3次)給予依達拉奉，給藥量為3mg/kg/日(腹腔內給藥)。結果顯示在圖6和圖7中(在各實驗中，n＝3，平均值±SEM，*P＜0.05)。
從圖6和圖7顯示的結果可以看出，與對照大鼠相比較而言，EAE模型大鼠腦脊液中的TNF-α和IL-1β的濃度增加，腦脊液蛋白質/血漿蛋白質的比率增大，而且血腦屏障通透性(靜脈注射熒光素鈉的腦/血漿濃度)也增大。但是，從圖7的結果可以看出，證實了這些作用通過給予依達拉奉而被抑制。
而且，對沒有給藥的EAE模型大鼠(對照組)、地塞米松(1mg/kg/日，腹腔內給藥)給藥組和依達拉奉(3mg/kg/日，腹腔內給藥)給藥組的四肢神經麻痹的得分進行評。四肢神經麻痹的得分根據以下標準評價。
表1EAE大鼠的Paul臨床得分得分 神經癥狀0正常1尾巴松弛以及步行運動失調2后肢部分麻痹3后肢完全麻痹并伴有失禁4四肢完全麻痹評價結果顯示在圖8中(在各實驗中，n＝3，平均值±SEM，*P＜0.05)。如圖8的結果所表明的那樣，給藥地塞米松的情況與給藥依達拉奉的情況一樣，EAE模型大鼠的四肢神經麻痹得分得到了恢復。
上述的實施例1和實施例2的結果證實，依達拉奉能保護血腦屏障系統、能改善多發性硬化癥模型的神經癥狀。
產業上利用的可能性本發明的藥物對抑制中樞神經系統的炎癥性疾病中的血腦屏障破壞很有用。
本申請要求日本專利申請No.2003-004813的優選權，該基礎申請的說明書中記載的全部內容，以引用方式并入本文，作為本說明書公開的一部分。
權利要求
1.一種血腦屏障破壞的抑制劑，其包含了作為有效成分的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物 式(I)中，R1表示氫原子、芳基、碳數為1～5的烷基或總碳數為3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氫原子、芳氧基、芳巰基、碳數為1～5的烷基或碳數為1～3的羥基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳數為3～5的亞烷基，R3表示氫原子、碳數為1～5的烷基、碳數為5～7的環烷基、碳數為1～3的羥基烷基、芐基、萘基、苯基或由1～3個相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基選自由碳數為1～5的烷基、碳數為1～5的烷氧基、碳數為1～3的羥基烷基、總碳數為2～5的烷氧基羰基、碳數為1～3的烷基巰基、碳數為1～4的烷基氨基、總碳數為2～8的二烷基氨基、鹵原子、三氟甲基、羧基、氰基、羥基、硝基、氨基及乙酰胺基組成的組。
2.如權利要求1所述的血腦屏障破壞的抑制劑，其具有抑制血腦屏障的通透性增大的作用。
3.如權利要求1或2所述的血腦屏障破壞的抑制劑，其具有抑制腦脊液中炎癥性細胞因子的含量增大的作用。
4.權利要求1-3中任意一項所述的血腦屏障破壞的抑制劑，其中由式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
5.一種用于預防和/或治療多發性硬化癥、腦膜炎、大腦炎或腦膿腫的藥物，其含有作為有效成分的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物 式(I)中，R1表示氫原子、芳基、碳數為1～5的烷基或總碳數為3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氫原子、芳氧基、芳巰基、碳數為1～5的烷基或碳數為1～3的羥基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳數為3～5的亞烷基，R3表示氫原子、碳數為1～5的烷基、碳數為5～7的環烷基、碳數為1～3的羥基烷基、芐基、萘基、苯基或由1～3個相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基選自由碳數為1～5的烷基、碳數為1～5的烷氧基、碳數為1～3的羥基烷基、總碳數為2～5的烷氧基羰基、碳數為1～3的烷基巰基、碳數為1～4的烷基氨基、總碳數為2～8的二烷基氨基、鹵原子、三氟甲基、羧基、氰基、羥基、硝基、氨基及乙酰胺基組成的組。
6.如權利要求5所述的藥物，其中由式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
7.一種抑制血腦屏障破壞的方法，其包括對包括人在內的哺乳動物給藥有效量的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物的步驟 式(I)中，R1表示氫原子、芳基、碳數為1～5的烷基或總碳數為3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氫原子、芳氧基、芳巰基、碳數為1～5的烷基或碳數為1～3的羥基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳數為3～5的亞烷基，R3表示氫原子、碳數為1～5的烷基、碳數為5～7的環烷基、碳數為1～3的羥基烷基、芐基、萘基、苯基或由1～3個相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基選自由碳數為1～5的烷基、碳數為1～5的烷氧基、碳數為1～3的羥基烷基、總碳數為2～5的烷氧基羰基、碳數為1～3的烷基巰基、碳數為1～4的烷基氨基、總碳數為2～8的二烷基氨基、鹵原子、三氟甲基、羧基、氰基、羥基、硝基、氨基及乙酰胺基組成的組。
8.如權利要求7所述的方法，其中通過抑制血腦屏障的通透性增大來抑制血腦屏障的破壞。
9.如權利要求7或8所述的方法，其中通過抑制腦脊液中炎癥性細胞因子數量的增多來抑制血腦屏障的破壞。
10.權利要求7-9中任意一項所述的方法，其中由式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
11.一種預防和/或治療多發性硬化癥、腦膜炎、大腦炎或腦膿腫的方法，其包括對包括人在內的哺乳動物給藥有效量的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物的步驟 式(I)中，R1表示氫原子、芳基、碳數為1～5的烷基或總碳數為3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氫原子、芳氧基、芳巰基、碳數為1～5的烷基或碳數為1～3的羥基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳數為3～5的亞烷基，R3表示氫原子、碳數為1～5的烷基、碳數為5～7的環烷基、碳數為1～3的羥基烷基、芐基、萘基、苯基或由1～3個相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基選自由碳數為1～5的烷基、碳數為1～5的烷氧基、碳數為1～3的羥基烷基、總碳數為2～5的烷氧基羰基、碳數為1～3的烷基巰基、碳數為1～4的烷基氨基、總碳數為2～8的二烷基氨基、鹵原子、三氟甲基、羧基、氰基、羥基、硝基、氨基及乙酰胺基組成的組。
12.如權利要求11所述的方法，其中以式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
13.下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物在制備用于抑制血腦屏障破壞的抑制劑中的應用， 式(I)中，R1表示氫原子、芳基、碳數為1～5的烷基或總碳數為3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氫原子、芳氧基、芳巰基、碳數為1～5的烷基或碳數為1～3的羥基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳數為3～5的亞烷基，R3表示氫原子、碳數為1～5的烷基、碳數為5～7的環烷基、碳數為1～3的羥基烷基、芐基、萘基、苯基或由1～3個相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基選自由碳數為1～5的烷基、碳數為1～5的烷氧基、碳數為1～3的羥基烷基、總碳數為2～5的烷氧基羰基、碳數為1～3的烷基巰基、碳數為1～4的烷基氨基、總碳數為2～8的二烷基氨基、鹵原子、三氟甲基、羧基、氰基、羥基、硝基、氨基及乙酰胺基組成的組。
14.如權利要求13所述的應用，其中所述血腦屏障破壞的抑制劑具有抑制血腦屏障的通透性增大的作用。
15.如權利要求13或14所述的應用，其中所述血腦屏障破壞的抑制劑具有抑制腦脊液中炎癥性細胞因子的含量增多的作用。
16.權利要求13-15中任意一項所述的應用，其中以式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮
17.由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物、或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物在制備用于預防和/或治療多發性硬化癥、腦膜炎或大腦炎或腦膿腫的藥物中的應用， 式(I)中，R1表示氫原子、芳基、碳數為1～5的烷基或總碳數為3～6的烷氧基羰基烷基，R2表示氫原子、芳氧基、芳巰基、碳數為1～5的烷基或碳數為1～3的羥基烷基，或者R1和R2合在一起表示碳數為3～5的亞烷基，R3表示氫原子、碳數為1～5的烷基、碳數為5～7的環烷基、碳數為1～3的羥基烷基、芐基、萘基、苯基或由1～3個相同或不同的取代基取代的苯基，所述取代基選自由碳數為1～5的烷基、碳數為1～5的烷氧基、碳數為1～3的羥基烷基、總碳數為2～5的烷氧基羰基、碳數為1～3的烷基巰基、碳數為1～4的烷基氨基、總碳數為2～8的二烷基氨基、鹵原子、三氟甲基、羧基、氰基、羥基、硝基、氨基及乙酰胺基組成的組。
18.如權利要求17所述的應用，其中由通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物是3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮。
全文摘要
本發明的目的在于提供一種血腦屏障破壞的抑制劑。本發明提供一種用于抑制血腦屏障破壞的抑制劑，其包含了作為有效成分的由下述通式(I)表示的吡唑啉酮衍生物或其生理學允許的鹽、或其水合物或其溶劑化物，式(I)中，R
文檔編號A61P7/00GK1723201SQ200480001908
公開日2006年1月18日 申請日期2004年1月9日 優先權日2003年1月10日
發明者川上純一 申請人:三菱制藥株式會社