專利名稱：穩定的無菌過濾性脂質體包封的紫杉烷和其他抗腫瘤藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及脂質體包封的紫杉烷和其他抗腫瘤藥物。
背景技術：
公知使用紫杉烷類，如紫杉醇作為抗腫瘤劑治療患有如卵巢癌和乳腺癌等疾病的患者。此外，當與放射治療聯合使用時，紫杉醇還表現出作為協同劑的臨床效力。紫杉醇具有獨特的作用機理和廣譜抗癌活性，這是因為紫杉醇表現出穩定微管而不是分解微管。
然而，紫杉醇在水中溶解度極低，使得難以提供適當的劑型。當前，在載體中制備和施用紫杉醇，該載體含有6mg/mL紫杉醇、527mg/mL純化的cremophor EL(一種聚乙氧基蓖麻油)和49.7％脫水醇，USP。該溶液在施用于人之前以1∶10稀釋于鹽水中。一旦在鹽水溶液中稀釋，紫杉醇的穩定性就相當低。藥物在24小時內降解，并且已經表明紫杉酚(taxol)不與通常的PVC靜脈內袋和輸注裝置相容，因此，處理患者的劑量變得相當困難。由于該藥物從稀釋液中沉淀，所以用在線濾器將藥物輸注到患者。降低的溶解度和制劑中存在Cremophor EL給患者帶來了危險，如類過敏反應和心臟毒性。長期使用紫杉酚也可導致癌細胞中多藥耐藥性的形成，這只使得紫杉酚所治療的疾病的病因變得復雜。
已經做出了努力以改善當前可利用的紫杉酚制劑。為此，美國專利5,648,090(Rahman等人)和美國專利5,424,073(Rahman等人)提供了一種脂質體包封的紫杉醇，用于使用這種脂質體包封的紫杉醇或者其抗腫瘤衍生物治療哺乳動物中的癌癥的方法。’090和’073專利公開了通過對哺乳動物宿主施用治療有效量的脂質體的藥物組合物調節癌細胞中多藥耐藥性的方法，其中脂質體包括脂質體-形成材料心磷脂和試劑如紫杉醇，或者紫杉醇的抗腫瘤衍生物，或者它們的混合物，和藥用載體。然而，仍然需要長時間保持穩定的紫杉烷脂質體制劑。
發明概述本發明提供了抗腫瘤藥物，如紫杉烷類，和其衍生物，和相關化合物的制劑，該制劑在臨床相關濃度下表現出提高的穩定性和降低的毒性。本發明制劑優選含有一種或多種穩定劑、抗氧化劑和防凍劑(lyoprotectant)。在許多制劑中，本發明制劑在室溫下，甚至在注射液中重構和稀釋后許多天內都保持穩定。本發明制劑可提高治療功效和最小化使用本紫杉烷制劑觀察到的多藥耐藥性。根據此處提供的本發明說明書和附圖，本發明的這些和其他優點，以及另外的創造性特征將是顯而易見的。
附圖描述
圖1圖示性給出了脂質體包埋的紫杉醇(LEP)和紫杉酚對SCID小鼠中異位人肺腫瘤(A549)生長的影響的研究結果。
圖2圖示性給出了脂質體包埋的紫杉醇(LEP)和紫杉酚對攜帶人肺腫瘤的SCID小鼠體重影響的研究結果。
發明詳述本發明至少部分預計提供包封在包括至少一種脂質部分以及抗腫瘤藥物的脂質體中的一種或多種抗腫瘤藥物的制劑，其中該組合物在水溶液中室溫下是穩定的，通常穩定至少3天。優選地，該制劑沒有或基本上沒有抗腫瘤藥物晶體或沉淀，最優選地，該制劑中沒有抗腫瘤藥物晶體或沉淀形式。
任何一種適當的抗腫瘤藥物都可用于本發明的上下文中。用于本發明制劑中的優選的化合物包括紫杉烷類或衍生物，如多西他賽、紫杉醇和相關化合物(例如，埃坡霉素A和B、埃坡霉素(epothilone)衍生物，等)。優選地，該化合物是紫杉醇。紫杉醇的適當衍生物是紫杉烷。其他適當的化合物為7-表紫杉醇、叔-乙酰基紫杉醇、10-去乙酰基-紫杉醇、10-去乙酰基-7-表紫杉醇、7-木糖基紫杉醇、10-去乙酰基-7-戊二酰基紫杉醇、7-N，N-二甲基甘氨酰基紫杉醇、7-L-丙氨酰基紫杉醇、泰索帝和它們的混合物。
由于本發明提供了抗腫瘤藥物的脂質體制劑，制劑還包括能夠形成脂質體的一種或多種化合物。從而，例如，該制劑可包括膽固醇或其衍生物、脂質或磷脂，和其他類似化合物。優選地，本發明的脂質體制劑的脂質部分包括一種或多種心磷脂，如合成的或天然存在的心磷脂或心磷脂類似物。
通常，脂質部分占本發明組合物的至少約3.5％(w/v)，更優選地至少約4.0％(w/v)，如該組合物的至少約5.0％或甚至至少約5.5％(w/v)。通常，不預期該脂質部分將超過約8.5％(w/v)，更優選地，最大脂質部分將是組合物的約8.0％(w/v)，如最高脂質濃度為約7.0％(w/v)或者甚至最大脂質濃度為約6.0％(w/v)。優選地，本發明制劑的脂質體含有約4.0％(w/v)到約8.0％(w/v)脂質，如約5.0％(w/v)到約6.0％(w/v)脂質。
此外，用于本發明制劑中的脂質與抗腫瘤藥物的比率典型地為至少約5∶1(摩爾比)，更優選至少約10∶1(摩爾比)，至少其中抗腫瘤藥物為紫杉烷(或相關化合物或其衍生物)。通常，用于本發明制劑的脂質與抗腫瘤藥物的比率為至少約20∶1(摩爾比)，如至少約30∶1或甚至40∶1。然而，通常，用于本發明制劑中的脂質與抗腫瘤藥物的比率不超過約75∶1(摩爾比)，更通常最多約75∶1(摩爾比)。通常，用于本發明制劑中的脂質與抗腫瘤藥物，特別是紫杉烷(或相關化合物或衍生物)的比率最多約60∶1(摩爾比)，如最多約50∶1或最多約40∶1(摩爾比)。優選地，用于本發明制劑中的脂質與藥物的比率為約10∶1到約70∶1(摩爾比)，如約25∶1到約55∶1(摩爾比)。
理想地，該制劑中的大部分抗腫瘤藥物都包埋在脂質體中。更優選地，制劑中抗腫瘤藥物的至少約2/3(如至少約75％)被包埋在脂質體中，甚至更優選地，抗腫瘤藥物的至少約85％(或甚至約90％以上)被包埋在本發明制劑中的脂質體中。
優選地，該制劑的脂質部分包括一種或多種選自下組的脂質1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC)、四肉豆蔻酰-心磷脂(CL)，和膽固醇(CH)，因為這些成分增強了制劑的穩定性并且可作為穩定劑。也可以使用其他飽和磷脂如二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)和二硬脂酰磷脂酰膽堿(DSPC)和不飽和的磷脂如氫化純化的大豆磷脂酰膽堿、氫化純化的蛋黃磷脂酰膽堿、二亞油酰磷脂酰膽堿(DLPC)、磷脂酰膽堿(DOPC)、棕櫚酰油酰二油酰磷脂酰膽堿(POPC)和鞘磷脂。還可以使用適當的帶負電荷的脂質如二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二油酰磷脂酰絲氨酸(DOPS)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)。
本發明組合物的脂質部分包含的最優選的成分包括1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC)、四肉豆蔻酰-心磷脂(CL)和膽固醇(CH)。期望兩種或多種這些脂質成分存在于脂質部分中，最優選地存在所有這些脂質成分(DOPC、CL和CH)。實際上，DOPC優選占脂質組分的約85％到約95％，甚至更優選占脂質組分的約90％到約92％。適當的制劑包括DOPC∶CH∶CL比率為約92∶0∶8到約90∶5∶5，然而CH和CL的量不必相等。在這方面，CH的濃度典型地為約0.3mg/ml到約3.5mg/ml，如約0.5mg/ml到約3.0mg/ml，或甚至約1mg/ml到約2mg/ml；而CL的量通常為約1mg/ml到約10mg/ml(更通常約2mg/ml到約8mg/ml)，如約5mg/ml。然而，本發明制劑的脂質部分中DOPC的量通常超過CH或CL的量，并且本發明制劑中DOPC的量典型地超過CH和CL的量之合。在這方面，本發明制劑的脂質部分中DOPC的量通常為約60mg/ml，并且通常為至少約40mg/ml，如至少約45mg/ml或甚至至少約50mg/ml。通常DOPC不超過約75mg/ml，如最多約65mg/ml或70mg/ml。DOPC的理想范圍是約44mg/ml到約74mg/ml。
為了進一步增強穩定性，本發明的制劑除了活性藥物(例如，紫杉烷或相關化合物)和脂質部分之外還可通常包括一種或多種抗氧化劑。盡管可以使用任何一種通常使用的脂溶性的抗氧化劑，在一些實施方案中，可以使用抗氧化劑如丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯和沒食子酸丙酯。D-α生育酸琥珀酸酯由于其穩定增強性質而是優選的。抗氧化劑通常以約0.1到約0.6mg/ml，如約0.2mg/ml到約0.5mg/ml，或甚至約0.3mg/ml到約0.4mg/ml的濃度包括于制劑中。
可通過任何適當的方法制備脂質體。優選的方法包括薄膜水合、溶劑注射、凍-融和脫水-再水化、除去表面活性劑、反向蒸發和乙醇注射。例如，可將抗腫瘤藥物和脂質部分溶于適當的溶劑，如二氯甲烷、乙醇、乙酸甲酯、甲酸乙酯等中。當使用抗氧化劑時，它們也可以與脂質部分溶于溶劑中。為了制備本發明組合物，可以使用任何適量的溶劑，當用二氯甲烷作為溶劑時，溶劑的用量典型地為約1000到1100mg/ml。然而，通常，該方法將需要至少約500mg/ml二氯甲烷，如至少約750mg/ml二氯甲烷，和差不多約2000mg/ml二氯甲烷，如高達約1500mg/ml二氯甲烷可用于溶解脂質部分。
抗腫瘤藥物、脂質部分和抗氧化劑溶于溶劑后，將溶液干燥。可以使用任何適當的干燥方法和設備，優選的干燥步驟包括減壓下旋轉蒸發器，然后在干燥器中進一步干燥。
干燥后，脂質(和抗氧化劑)殘渣可以在水性系統，如水中水合，該水性系統可以是溶液或混懸劑。優選地，溶液含有一種或多種防凍劑以幫助增強隨后凍干和凍干形式存在的制劑的穩定性。可以使用任何適當的防凍劑，如糖和甘露醇，但是這些化合物通常為糖。最優選的防凍劑是蔗糖，根據需要，也可以適當使用其他適當的防凍劑包括，例如，海藻糖、麥芽糖、乳糖、葡萄糖、葡聚糖、氨基糖苷類和鏈霉素和它們的組合物。通常，如果使用防凍劑，那么其為制劑的約50％(w/v)以下。更典型地，防凍劑為制劑的約40％(w/v)以下，如為制劑的最多約30％(w/v)。當防凍劑少至約1％(w/v)時，其也可以增強本發明制劑的穩定性；然而，更典型地，防凍劑為制劑的至少約5％(w/v)，如為制劑的至少約10％(w/v)或至少約20％(w/v)。水合溶液也可以含有張力調節劑，其優選為氯化鈉(NaCl)，但是可以是另一種適當的鹽或二糖。可以在任何適當體積的水合溶液中實現水合。
水合溶液中再水化導致形成多層泡囊(MLV，multilamellar vesicles)。在一些方法中，適當的制劑可以是多層泡囊和單層泡囊的混合物。一旦加入溶液，可以通過混合，例如，通過渦旋或使用任何適當的混合裝置混合形成脂質體。當希望更小的泡囊時，可以對溶液超聲處理。如果需要，可以通過，例如，通過篩網(其通常由聚碳酸酯纖維形成)擠出或者使用高壓勻漿機勻漿來控制這些MLV的大小。從而，使用預先選擇大小的篩網可控制組合物中MLV的大小(例如，通過具有所希望大小，如0.8μm、0.4μm、0.2μm、0.1μm等的篩網擠壓)。在本發明中，優選應用篩分處理使得包封藥物的脂質體的粒徑更均一。凍干之前，可以將本發明的制劑通過0.22微米的濾器無菌過濾。制劑的平均粒徑為約50到200nm，優選100-180nm，更優選120-160nm。
再水化和(如果需要)擠出以實現限定的粒徑后，優選使用任何適當的裝置或方法將組合物凍干。優選的裝置是臺式(benchtop)并且任何適當大小的凍干機(例如，VerTis生產的)。SUV制劑可以以凍干形式長時間保存(例如，在-5-8℃冷藏)，例如，長至少約幾個月到幾年。優選地，凍干的制劑穩定至少9個月。
為了使用，可將凍干的SUV脂質體制劑用適當體積的重構溶液重構，該重構溶液優選為極性溶劑，最優選為水性體系，其可以是去離子水或適當的鹽水溶液。可以使用任何適當體積的重構溶液，如約1ml到約50ml，更典型地約3ml到約25ml。為了使用，脂質體制劑可以根據需要在如適當的生理學上相容的緩沖液或鹽溶液中稀釋。為了幫助重構，該制劑可以根據需要輕輕混合或劇烈混合(例如，渦旋)，或甚至超聲處理。
不管是怎樣產生的，所得脂質體包封的紫杉烷重構后穩定至少約1天，更典型地至少3到4天。實際上，本發明的制劑可以在室溫保持穩定至少約4天，如一周或兩周，或甚至更長時間。如在下面的實施例部分所表明的，本發明的制劑可以在這些條件下保持穩定至少約17天。通過用例如粒徑分析儀，如Nicomp Submicron Particle Sizer通過隨時間評估脂質體的粒徑可監視穩定性(在該背景下可以通過一天內平均粒徑的改變小于約20％，更優選一天內粒徑的改變小于約5％，或者3或4天的時間內變化小于約10％或甚至5％，來表示穩定性)。備選地，通過評估(例如，使用光學顯微鏡)結晶的紫杉烷的存在來評估穩定性。不存在痕量以上的這些晶體表明為穩定制劑，并且希望本發明的制劑重構或在鹽水中稀釋，甚至室溫下3或4天后將保持基本上，或甚至相對完全地不含紫杉烷晶體。
本發明的脂質體制劑提供了藥物遞送系統，其允許穩定形式的紫杉烷或其他抗腫瘤藥物高濃度輸注并且提供了在靶位點的持續治療益處，同時保持不溶性游離紫杉烷的低濃度和毒副作用比以前知道的更低。
本藥物組合物可以以至少50到400mg活性化合物/m2哺乳動物宿主表面積的量，在小于約3小時，優選小于約2小時，最優選90分鐘內施用，而不導致明顯的毒性反應。例如，對于70kg的人，可以在約90分鐘內安全地施用約0.5到7.0mg活性化合物/kg體重。優選地，施用約1.0-5.0mg活性化合物/kg體重。備選地，優選的量包括75、135、175、250、300、325、和375mg/m2。
本發明的脂質體組合物可以靜脈內、腹膜內施用于哺乳動物身體，優選人體的單獨部分，如臂或腿，對于人，手，或者可以直接注射到腫瘤中。優選地，本發明的制劑可以是注射劑形式。
脂質體包封的紫杉烷對于克服進行化療的癌細胞中的多藥耐藥性具有明顯有益的效果。通過使用本發明的脂質體組合物，可以減小接受化療的癌細胞產生對用于化療的化療劑如蒽環霉素糖苷的抗性的傾向。該方法包括按照給藥方案對宿主施用本發明的脂質體包封的紫杉烷的藥物組合物。
紫杉烷類和其抗腫瘤衍生物可用于治療任何形式的哺乳動物癌癥。認為這些化合物通過促進微管裝配或者抑制微管去裝配過程而起作用。紫杉烷和其抗腫瘤衍生物在哺乳動物淋巴瘤、卵巢癌、乳腺癌、肺癌和結腸癌，尤其是人中的這些病癥的治療中尤其有利。
下面的實施例進一步闡明本發明，但是，它們當然不應被理解為以任何方式限制本發明的范圍。
實施例1該實施例闡明了本發明的脂質體包封的紫杉烷制劑的構建。以表1中所指出的量使用下面的成分表1
*將在蒸發和凍干過程中除去。
將脂質(DOPC、1，2-二肉豆蔻基心磷脂、膽固醇和D-α生育酸琥珀酸酯)和紫杉醇或多西他賽溶于二氯甲烷或脫水醇中。然后用旋轉蒸發器在真空下將脂質溶液蒸發至干。蒸發后，將脂質殘渣在干燥器中進一步過夜干燥。將蔗糖和NaCl溶于去離子水中得到所希望的一批濃度。然后，將干燥的脂質殘渣在蔗糖/NaCl溶液中水合形成多層泡囊(MLV)。通過0.8μm、0.4μm、0.2μm和0.1μm大小的聚碳酸酯濾器中擠出進一步減小MLV的大小。將5毫米最終制劑裝入玻璃小瓶并用臺式VIRTIS凍干機凍干。
實施例2該實驗闡明了本發明的脂質體包封的紫杉烷制劑的構建。以表2中所指出的量使用下面的成分表2
*將在蒸發和凍干過程中除去。
如實施例1中描述的制備該制劑。
實施例3該實驗闡明了本發明的脂質體包封的紫杉烷制劑的構建。以表3中所指出的量使用下面的成分表3
*將在蒸發和凍干過程中除去。
如實施例1中描述的制備該制劑。
實施例4該實施例闡明按照實施例1制備的制劑的性質。
將凍干的小瓶用4.5mL去離子水重構。完成重構后，將脂質體進一步以1∶8在生理鹽水或去離子水中稀釋。通過動態光散射技術(NicompSubmicron Particle Sizer)在17-37天的期間內測量重構和稀釋的制劑的脂質體泡囊大小，其中重構的制劑保持在室溫。還用光學顯微鏡(DMILMicroscope)檢查重構和稀釋的制劑中紫杉醇和多西他賽晶體的存在。
從凍干前的紫杉醇和多西他賽制劑得到的這些測量的結果在表4和5中給出。
表4.脂質體紫杉醇制劑的物理穩定性
表5.脂質體多西他賽制劑的物理穩定性
在凍干和重構后從實施例1的紫杉醇和多西他賽制劑得到的這些測量的結果在表6和7中給出。
表6凍干和重構后脂質體紫杉醇制劑的物理穩定性
在表7中給出了稀釋(1∶8生理鹽水)后實施例1的紫杉醇制劑的測量表7
在表8中給出了稀釋(1∶8生理鹽水)后實施例1的多西他賽制劑的測量表8
實施例4該實施例闡明按照實施例2制備的制劑的性質。方法和實施例3中描述的相同，在表9和10中給出了凍干前從紫杉醇和多西他賽制劑得到的測量。
表9
表10凍干前脂質體多西他賽制劑的物理穩定性
在表11和12中給出了凍干和重構后對實施例2的制劑測量的結果表11
表12在凍干和重構后脂質體多西他賽制劑的物理穩定性
在表13中給出了實施例2的制劑稀釋(生理鹽水中1∶8)后做出的測量表13
實施例5該實施例闡明了按照實施例3制備的制劑的包埋效率。通過大小排阻柱層析使用SEPHADAX G-50柱確定藥物包埋效率。通過HPLC方法確定藥物和脂質含量。
表14
表15
實施例6該實施例給出了紫杉酚和脂質體包封的紫杉醇(LEP)的比較性多IV劑量毒性研究。
材料和方法試驗系統從Harlan Sprague Dawley實驗室得到用于研究的CD2F1小鼠(4-6周齡，雄性和雌性)。通過耳部標簽識別每只小鼠。到達時，將動物隔離7天。將動物保持在環境受監視的、通風良好的室內，室內溫度為64-84°F，相對濕度為30％-70％。通過熒光提供每天約12小時的照明。在隔離和研究期間為小鼠隨意提供8656 HT嚙齒動物食物(Harlan Teklad，Madison，WI)。在研究的第一天小鼠的平均重量為16-22g(雌性)和20-27g(雄性)。研究的第一天小鼠的為6-7周齡。
試驗和對照物品試驗物品1.將按照本發明制備的凍干的脂質體紫杉醇(LEP-ETU)小瓶保存在2-8℃。
2.從Mead Johnson，Inc獲得紫杉酚小瓶(30mg/瓶，濃度6mg/ml)。
對照物品1.安慰劑脂質體保存在2-8℃。
劑量制劑制備在給藥的每一天新鮮制備載體制劑(LEP和安慰劑脂質體)。重構并稀釋的制劑(用0.9％鹽水稀釋高達8倍)的穩定性為20-25℃12小時。所有給藥溶液在重構和稀釋后12小時內使用。
實驗設計隨機化和組分配在第1周期間進行隨機化。隨機化前對動物稱重并將將重量為16-23g(雌性)和17-26g(雄性)的動物用于隨機化并分配到下面的組(7只動物/性別/組)。在表16中給出隨機化表16
物品(對照和試驗)施用給藥前對每只動物稱重。小鼠通過尾靜脈靜脈內地接受對照或試驗物品，每天一次，連續5天。注射體積基于每只小鼠的體重。組1中的對照小鼠接受脂質的量約與LEP的50mg/kg劑量中相同。組4和組5中的對照動物接受Cremophor EL/乙醇的量分別和組6和組7的相同，但是沒有紫杉醇。
觀察動物在給藥期間(第1-5天)每天稱重，之后每周三次，持續長達22天。在研究期間每天一次觀察動物的發病/死亡。觀察動物給藥后約1到2小時的臨床征象并且之后每天觀察。在第一天進行毒性的詳細體檢并且之后每周體檢一次。
結果體重接受安慰劑脂質體的動物體重沒有減輕。靜脈內施用LEP(25mg/kg/劑)的雌性小鼠在第8天體重減輕5.2％并在第10天完全恢復。接受LEP(25mg/kg/劑)的雄性小鼠在第8天體重減輕12.5％并在第15天完全恢復。組3(50/mg/kg/劑，LEP)中雄性和雌性小鼠在第8天的體重減輕為20.6和28.7％。用Cremophor EL/乙醇注射的對照動物體重沒有減輕。組5中(12.5mg/kg/劑，紫杉酚)雌性的體重減輕可忽略不計。組5中的雄性動物在第5天的體重減輕為4.7％，并在第12天完全恢復。組7(25mg/kg/劑，紫杉酚)中的雌性動物在第8天體重減輕6.3％，并且它們在第12天體重完全恢復。組7中雄性動物在第8天的體重減輕為10.4％并在第15天完全恢復。存活百分數(存活數/總數)在表17和18中給出。在第4天，組7(25mg/kg/劑，紫杉酚)中的1只雄性動物在物品施用后1小時死亡。組4中的1只動物由于尾巴受傷而在第17天被處死。
表17紫杉酚和LEP的比較性多IV劑量毒性研究雌性動物的存活百分數(存活數/總數)
組1安慰劑脂質體，相當于50mg/kg的LEP劑量中存在的脂質量。
組2LEP 25mg/kg；組3LEP 50mg/kg；
組4Cremophor EL/乙醇，相當于12.5mg/kg紫杉酚劑量中存在的Cremophor EL/乙醇；組5Cremophor EL/乙醇，相當于25mg/kg紫杉酚劑量中存在的Cremophor EL/乙醇；組6紫杉酚12.5mg/kg組7紫杉酚25mg/kg表18紫杉酚和LEP的比較性多IV劑量毒性研究雄性動物的存活百分數(存活數/總數)
組1安慰劑脂質體，相當于50mg/kg的LEP劑量中存在的脂質量。
組2LEP 25mg/kg；組3LEP 50mg/kg；組4Cremophor EL/乙醇，相當于12.5mg/kg紫杉酚劑量中存在的Cremophor EL/乙醇；組5Cremophor EL/乙醇，相當于25mg/kg紫杉酚劑量中存在的Cremophor EL/乙醇；組6紫杉酚12.5mg/kg組7紫杉酚25mg/kg毒性臨床征象各天每組動物的毒性征象在表19中給出。從第4天開始在組7(25mg/kg/劑，紫杉酚)動物中觀察到中毒臨床征象，其表現為蜷縮姿勢和皮毛粗糙。從第9天到第15天，組7中動物表現出神經中毒征象，表現為行走困難和將后腿拖向腹部。在第6天，組6(12.5mg/kg/劑，紫杉酚)中4只雄性動物皮毛粗糙并且三只脫水，但是到第7天時它們看起來正常了。組3中動物(50mg/kg/劑LEP)在第6-9天具有嚴重的中毒征象，表現為蜷縮姿勢、脫水和皮毛粗糙，該組的動物到第9天時或者死亡或者垂死而被處死。
臨床觀察在表20中給出了在第1、10、17和22天進行的毒性詳細體檢。
4)異常當alloc指令試圖修改SOR(size of local rotating)域，而RRB寄存器不為0時，產生Reserved register/Field異常；如果SOF大于96，或者SOR大于SOF，產生非法操作異常；如果沒有足夠的寄存器來完成移動寄存器窗口的分配，處理機將產生等待STORE操作的完成，并產生相關異常。
2.Branch1)匯編語法(qp)br.btype.bwh.ph.dh target25(qp)br.btype.bwh.ph.dh b1＝target25br.btype.bwh.ph.dh target25br.ph.dhtarget25
組2LEP 25mg/kg；組3LEP 50mg/kg；組4Cremophor EL/乙醇，相當于12.5mg/kg紫杉酚劑量中存在的Cremophor EL/乙醇；組5Cremophor EL/乙醇，相當于25mg/kg紫杉酚劑量中存在的Cremophor EL/乙醇；組6紫杉酚12.5mg/kg組7紫杉酚25mg/kg表20CD2F1小鼠中紫杉酚(紫杉醇)和LEP的比較性多IV劑量毒性研究臨床觀察
組1安慰劑脂質體，相當于50mg/kg的LEP劑量中存在的脂質量。
組2LEP 25mg/kg；組3LEP 50mg/kg；組4Cremophor EL/乙醇，相當于12.5mg/kg紫杉酚劑量中存在的Cremophor EL/乙醇；組5Cremophor EL/乙醇，相當于25mg/kg紫杉酚劑量中存在的Cremophor EL/乙醇；組6紫杉酚12.5mg/kg組7紫杉酚25mg/kg表21LEP和紫杉酚的比較性多IV劑量毒性研究不定期觀察不定期觀察
組1安慰劑脂質體，相當于50mg/kg的LEP劑量中存在的脂質量。
組2LEP 25mg/kg；組3LEP 50mg/kg；組4Cremophor EL/乙醇，相當于12.5mg/kg紫杉酚劑量中存在的Cremophor EL/乙醇；組5Cremophor EL/乙醇，相當于25mg/kg紫杉酚劑量中存在的Cremophor EL/乙醇；組6紫杉酚12.5mg/kg組7紫杉酚25mg/kg
實施例7本實施例提供基于脂質體的制劑紫杉酚(LEP)在具有人肺腫瘤(A549)的SCID小鼠中的療效評估結果。
材料和方法細胞系和培養條件從美國典型培養物保藏中心(Rockville，MD)得到肺腺癌細胞系A-549并將其保持在補加10％熱失活的胎牛血清(Life Technologies Inc.，Grandisland，NY)的RPMI-1640培養基(Life Technologies Inc.，Grand island，NY)中。細胞系生長在37℃，濕潤的5％CO2培養箱中。
小鼠C.B-17SCID雌性小鼠(3-4周齡)從Harlan Sprague Dawley(Indianapolis，IN)得到。無菌處理小鼠并按照新藥研究和開發(NeoPharm Research andDevelopment)的標準操作方法(SOPs)將小鼠裝在微型隔離器中，并隨意接受無菌食物和水。研究開始前使小鼠適應至少5天。
藥物和制劑紫杉酚從MeadJohonson(Lot#IL5302)得到。如上述得到包埋紫杉酚的脂質體和空白脂質體。
腫瘤移植制備對數生長期的A549細胞混懸劑50×106個/mL并用其以5×106個細胞(0.1mL)在左側腹區皮下移植到小鼠(6)。用數字卡鉗(MitutoyoCorporation，日本)測量腫瘤生長并用公式[長×(寬/2)2×p]確定腫瘤的體積。
實驗設計腫瘤適當生長后(23天)，將動物隨機分成不同的治療組(5-7只動物/組)并用LEP(12.5或25.0mg/kg×3)或者紫杉酚(12.5或25.0mg/kg×3)或空白脂質體或cremophor-EL在第1、4、和8天處理。監視腫瘤生長抑制，直到處理后28天。
結果和討論在SCID小鼠中確立的皮下移植的人肺腫瘤異種移植模型中評估了抗腫瘤功效。在第1、4和8天多劑量靜脈內注射中確定了LEP和紫杉酚的效能。與空白脂質體處理的組相比，以12.5和25.0mg/kg紫杉酚處理的動物組分別導致37％和57％(圖1)。然而，用LEP處理的動物組中腫瘤生長的抑制更明顯。與對照組相比，以12.5、25.0和50mg/kg LEP處理導致44％、85％和95％抑制。
LEP和紫杉酚在所有試驗的劑量下都能良好耐受，這通過體重減輕進行判斷(圖2)。對于LEP 50mg/kg處理的動物組中觀察到僅小于5％的體重減輕。
LEP治療的動物的更高的腫瘤生長抑制可以是由于紫杉酚在靶標位點的最優利用度時間更長。基于脂質體的紫杉酚制劑有兩個優點1)其幫助遞送藥物而不用任何表面活性劑和2)更長時間地提供持續的藥物水平以發揮其抗腫瘤作用。
此處引用的所有參考文獻，包括專利、專利申請、和出版物，都在此處完整(SP)結合作為參考。
盡管本發明著重于優選的實施方案進行描述，但是對本領域技術人員顯而易見的是，也可使用優選的實施方案的變體并且意欲本發明可以以和此處特別描述的不同的方式實施。因此，本發明包括所有修改方案，它們包括在通過下面的權利要求書定義的本發明的精神和范圍內。
權利要求
1.包封在脂質體中的一種或多種抗腫瘤藥物的制劑，該脂質體包括至少一種脂質部分以及抗腫瘤藥物，其中該組合物在水溶液中室溫下穩定至少3天。
2.權利要求1的制劑，該制劑基本上不含抗腫瘤藥物晶體和沉淀。
3.權利要求1的制劑，該制劑不含抗腫瘤藥物晶體和沉淀。
4.權利要求1-3中任何一項的制劑，其中抗腫瘤藥物是紫杉烷或相關化合物。
5.權利要求4的制劑，其中抗腫瘤藥物是埃坡霉素A、埃坡霉素B、或其衍生物。
6.權利要求4的制劑，其中抗腫瘤藥物是紫杉醇。
7.權利要求1-6中任何一項的制劑，其中抗腫瘤藥物的至少約85％被包埋在脂質體中。
8.權利要求1-7中任何一項的制劑，其中脂質與抗腫瘤藥物的比率按照組合物的摩爾比為約10∶1到約70∶1。
9.權利要求1-8中任何一項的制劑，其中脂質部分包括選自1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸膽堿(DOPC)、四肉豆蔻酰心磷脂(CL)，和膽固醇(CH)中的一種或多種脂質。
10.權利要求9的制劑，其中脂質部分包括選自DOPC、CL和CH中的兩種或多種脂質。
11.權利要求9或10的制劑，其中DOPC∶CH∶CL的摩爾百分數比率為約92∶0∶8到約90∶5∶5。
12.權利要求9-11中任何一項的制劑，其中脂質部分包括DOPC、CL和CH。
13.權利要求1-12中任何一項的制劑，其還含有一種或多種抗氧化劑。
14.權利要求13的制劑，其中抗氧化劑是D-α生育酸琥珀酸酯。
15.權利要求1-14中任何一項的制劑，其還含有防凍劑。
16.權利要求15的制劑，其中防凍劑包括選自海藻糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、乳糖和葡聚糖中的一種或多種保護性糖。
17.權利要求15或16的制劑，其中防凍劑是蔗糖。
18.權利要求1-17中任何一項的制劑，其已經通過0.22微米濾器無菌過濾。
19.凍干形式的權利要求1-18中任何一項的制劑。
20.權利要求19的制劑，其在凍干前通過0.22微米濾器無菌過濾。
21.權利要求19或20的凍干制劑，其穩定至少9個月。
22.制備成水性系統中的溶液或混懸劑的權利要求1-18中任何一項的制劑。
23.權利要求22的制劑，其中水性系統是水。
24.權利要求22或23的制劑，其在重構和稀釋后的3天時間中平均脂質體粒徑的改變小于約5％。
25.可注射形式的權利要求22-24中任何一項的制劑。
26.權利要求1-25中任何一項的制劑，其保持基本上不含結晶的抗腫瘤藥物至少約3天。
全文摘要
本發明提供了包封在脂質體中的一種或多種抗腫瘤藥物的制劑，該脂質體包括至少一種脂質部分以及抗腫瘤藥物，其中該組合物在水溶液中室溫下是穩定的。
文檔編號A61K31/337GK1700906SQ200480001175
公開日2005年11月23日 申請日期2004年2月3日 優先權日2003年2月3日
發明者張家艾, S·烏古, 馬嵐, G·阿尼蘭布哈特拉, I·艾哈邁德 申請人:新藥物公司