河豚毒素衍生物的制備和戒毒鎮痛用途的制作方法

專利名稱：河豚毒素衍生物的制備和戒毒鎮痛用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及河豚毒素的各衍生物的制備和制劑的戒毒和鎮痛用途。
背景技術：
河豚毒素(Tetrodotoxin簡稱TTX)是從河豚魚卵巢或肝臟中提取的一種小分子化合物，其分子式為C11H17N3O8，分子量為319.27。生物學研究證實TTX是專一性強的鈉離子通道阻斷劑，臨床應用涉及到內科、外科、皮膚科和眼科等領域，該毒素具有很強的鎮痛和麻醉療效，其鎮痛效果是杜冷汀的四倍，鎮痛時間可長達2-20小時，而無成癮性，國外已有粗制劑可以代替嗎啡、杜冷丁、阿托品和南美筒箭毒堿等用于治療神經痛的臨床報導，河豚毒素可用來替代現在通用的麻醉藥品，且無任何副作用。
自古以來，河豚魚就和人類結下不解之緣，有統計數字表明因貪食河豚者有數萬人之多。19世紀就有人將之用于麻風病，50年代前后，“水煎劑”型的所謂[成藥]已用作鎮痛、鎮靜、鎮驚。這種純度不到1％的粗制品曾試銷全世界。
1950年獲得TTX結晶單體，1964年經美、日四個資深研究小組多年研究闡明了其化學結構。1972年在美國哈佛大學工作的日本學者岸義人小組合成了它。
雖然已經在兩棲類、魚類、軟體類、棘皮類、節肢類等動物臟亂細菌和藻類等上百種生物中檢測到河豚毒素，但具有提取和開發價值的仍然是河豚魚及產毒的生物源弧菌。但利用弧菌發酵的生物工程技術尚待進一步完善。
1930-1940年，日本三共公司已把純度為0.2-1％的粗制品用于臨床，在內科、外科、皮膚和眼科廣泛試用。這種也稱為河豚毒的粗制品已作為[成藥]，臨床功效為鎮靜、鎮痙和鎮痛，一般皮下注射0.5ml。推算當時的商品安瓿每支中含毒素5-35.7ug，國內外眾多文獻報道粗品針劑的臨床適應癥有；1.用作鎮痛劑；對一般神經痛及關節炎、創傷、火傷、打斗傷、挫傷等所產生的疼痛均有顯著的療效，尤其是對及痛、脈管痛等癥狀的有效率近100％。對癌癥、麻瘋病患者的疼痛、肌肉痛以及戶僵硬等療效亦很好的療效。
2.作鎮靜劑對各種皮膚瘙癢、癬疥、止癢效果甚佳；對氣喘和百日咳，遺尿癥等均有效。
3.作鎮靜劑對胃痙攣及其他肌肉痙攣，尤其是對于破傷風痙攣稱為特效藥。
4.作性興奮劑對陽瘺及婦女性欲缺乏諸癥有療效。
5.作戒毒劑對海洛因、阿片等成癮者手除毒癮有良效。
我國歷代本草對河豚魚藥用均有記載。從古對今研究河豚的歷史悠久，具有廣泛的民間基礎和藥用河豚魚的正反兩方面的經驗。國內1982年以來對TTX臨床應用進行了廣泛的研究，包括TTX的三致、電生理、藥物動力、解毒藥、復方以及TTX的分析檢測方法等等。在部分臨床試驗中已經發現有一定療效的是晚期癌癥鎮痛和局麻手術及臨床脫毒。
我國年產河豚魚2萬噸以上，占全世界的75％，除少數品種和規格出口日、韓外，其他急待開發、應用。河豚魚(主要指東方豚)雖“毒”名在外，但并非全身含毒。河豚毒素(TTX)主要含于卵巢和肝臟，其肉基本不含毒，而且營養價值極高，肉味鮮美無比，正如民間所流傳“不食河豚焉知魚味，食不了河豚百味無。”而含毒臟正好是本題目的原料。
此外，TTX在分子生物學及生理學等領域已經成為一種不必不可少的工具藥和分子探針。1992年Sigma公司的售價為115.75-127.30美圓/mg。我國生產的TTX在世界各國均已試用，隨原來壟斷世界市場的日本河豚資源的枯竭，我國TTX已經和正在逐漸占領國際市場。
自國內TTX分離成功后，國內多家單位先后對之臨床應用及電生理應用等方面進行過初步研究。但終國為國內體制和經費的緣故而被擱置起來。
國內對河豚毒素(TTX)的分離純化技術已經成熟，并有相關的專利保護(專利號02121463.8，01142658.6，03138706.3)，用河豚毒素于戒毒和鎮痛治療的專利有一項(02117928.x)，該發明涉及河豚毒素的醋酸鹽和枸緣酸鹽的戒毒和鎮痛功效，但在實例中所用的酸為緩沖劑，制備用酸的mol數說明多數TTX仍然未形成鹽，與本發明的等mol成鹽衍生物無專利相關性。

發明內容
本發明的目的是提供一種質量可控，使用安全，高效，低毒，非成癮的TTX鹽衍生物的制備，和TTX鹽衍生物所形成的固體制劑和注射劑在臨床上用于戒毒和鎮痛的用途。
該發明的河豚毒素的化學結構如下 河豚毒素的英文名Tetrodotoxin化學名八氫-12-(羥甲基)-2-亞氨基-5，97，10a-二甲基-10aH-[1，3]二氧橋[6，5-d]嘧啶-4，7，10，11，12-五醇系統命名Octahydro-12-(hydroxymethyl)-2-imino-5，9，7，10a-dimethano-10aH-[1，3]dioxocino[6，5-d]pyrimidine-4，7，10，12-pentol分子式C11H17N3O8含量測定照高效液相色譜法(中國藥典1995年版二部附表VD)測定。色譜條件與系統適用性試驗用辛烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；磷酸二氨鉀與磷酸氫二鈉700mg加水稀釋成1000ml，濾過)，流速為0.2ml/min，檢測波長為210nm；取每1ml中含0.5μg的本品溶液20μgl，注入液相色譜儀，調節檢測靈敏度，使主峰的峰面積滿足準確測定的要求；另取本品溶液(每1ml中含有100μg的河豚毒素)，在100℃加熱10分鐘，進樣分析，在與峰相對保留時間約1.1處出現的雜質峰與主峰的分離度不得小于1.5。
測定法取本品適量，精密穩定，加水溶解并制成每ml含100μg溶液。取20μgl注入液相色譜儀，記錄色譜圖；按歸一化法以峰面積計算，即得。
河豚毒素定量方法改為峰面積歸一化法，含量不得低于98.0％。
河豚毒素有關物質和含量結果如下(歸一化法)

含量平均為98.82％有關物質為河豚毒素酯0.45％未知雜質0.63％河豚毒素對照品是由河豚毒素原料經HPLC制備柱分離純化而成，精制后立即進行HPLC分析，純度達98％以上。
上述高純度的河豚毒素一種以河豚毒素為原料的各種鹽形式制備成的高水溶性的河豚毒素鹽衍生物(包括酒石酸鹽，馬來酸鹽，甲黃酸鹽，鹽酸鹽，硫酸鹽，氫溴酸鹽，甲磺酸鹽，醋酸鹽，枸緣酸鹽的等當量衍生物)，該類衍生物可制備成注射劑(包括水針，凍干粉針)，固體制劑(包括膠囊，片劑)。各種衍生物的制劑，每種制劑可用于戒毒和鎮痛的治療，治療的給藥量為每次1-10μg范圍。各種衍生物的制劑用于戒毒和鎮痛的治療，藥物應無藥物依賴性。
具體實施例
實施例1(1)河豚毒素酒石酸鹽的制備取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml熱蒸餾水(40-60℃)中，加等mN的酒石酸，充分超聲振動，使溶液處于全溶解狀態，靜止數分鐘，減壓濃縮至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中靜止，形成結晶，或直接減壓濃縮得白色結晶。
(2)河豚毒素馬來酸鹽的制備取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml熱蒸餾水(40-60℃)中，加等mN的馬來酸，充分超聲振動，使溶液處于全溶解狀態，靜止數分鐘，減壓濃縮至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中靜止，形成結晶，或直接減壓濃縮得白色結晶。
(3)河豚毒素磺酸鹽的制備取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml熱蒸餾水(40-60℃)中，加等mN的磺酸，充分超聲振動，使溶液處于全溶解狀態，靜止數分鐘，減壓濃縮至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中靜止，形成結晶，或直接減壓濃縮得白色結晶。
(4)河豚毒素鹽酸鹽的制備取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml熱蒸餾水(40-60℃)中，加等mN的鹽酸，充分超聲振動，使溶液處于全溶解狀態，靜止數分鐘，減壓濃縮至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中靜止，形成結晶，或直接減壓濃縮得白色結晶。
(5)河豚毒素硫酸鹽的制備取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml熱蒸餾水(40-60℃)中，加等mN的硫酸，充分超聲振動，使溶液處于全溶解狀態，靜止數分鐘，減壓濃縮至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中靜止，形成結晶，或直接減壓濃縮得白色結晶。
(6)河豚毒素氫溴酸的制備取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml熱蒸餾水(40-60℃)中，加等mN的氫溴酸，充分超聲振動，使溶液處于全溶解狀態，靜止數分鐘，減壓濃縮至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中靜止，形成結晶，或直接減壓濃縮得白色結晶。
(7)河豚毒素甲磺酸鹽的制備取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml熱蒸餾水(40-60℃)中，加等mN的甲磺酸，充分超聲振動，使溶液處于全溶解狀態，靜止數分鐘，減壓濃縮至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中靜止，形成結晶，或直接減壓濃縮得白色結晶。
(8)河豚毒素醋酸鹽的制備取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml熱蒸餾水(40-60℃)中，加等mN的醋酸，充分超聲振動，使溶液處于全溶解狀態，靜止數分鐘，減壓濃縮至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中靜止，形成結晶，或直接減壓濃縮得白色結晶。
(9)河豚毒素枸緣酸鹽的制備取河豚毒素100mg(0.31mN)，溶解于1.0ml熱蒸餾水(40-60℃)中，加等mN的枸緣酸，充分超聲振動，使溶液處于全溶解狀態，靜止數分鐘，減壓濃縮至0.3-0.5ml，在-5至5℃的冰箱中靜止，形成結晶，或直接減壓濃縮得白色結晶。
實施例2河豚毒素酒石酸鹽注射劑的鎮痛活性(1)大鼠甩尾法鎮痛實驗大鼠隨機分為四組，♂♀各半，每組8只。實驗前禁食12小時，自由飲水。以55±1℃恒溫水浴為熱致痛源，大鼠固定后將其尾尖部以上5cm放入熱水中，記錄大鼠尾部入水到甩出水面的反應時間。試驗前先挑選大鼠間隔5min連測3次，挑選甩尾反應時間在3-7s以內的大鼠用于試驗。試驗時s.c給藥30min后，測定甩尾反應時間，以給藥后甩尾反應時間大于給藥前1倍以上為鎮痛有效。用Bliss法[2]計算ED50值。
(2)大鼠甲醛法鎮痛試驗[3](簡稱甲醛法)選用♂大鼠，隨機分為6組，一組為NS組其余為給藥組。試驗前禁食12小時，飲水不限。致痛源為2.5％的甲醛(40％甲醛，北京化工三廠生產，批號930502，化學純，用蒸餾水稀釋成2.5％溶液作為化學致痛劑)。大鼠s.c不同劑量的受試藥右后足背s.c2.5％甲醛0.05ml/只，立即觀察記錄5min內大鼠的疼痛反應，表現為添/咬、抽、抬右后足，并根據不同的痛反應評分，具體為舔/咬后足時間(sec)x3+抽動后足次數x2/3+抬后足時間(sec)然后將各給藥組的痛反應分數與NS組的痛反應分數進行比較，以Logit法算出全氨啉在該模型上的ID50值。
(3)小鼠熱板法鎮痛實驗選取♀小鼠，隨機分為四組，每組10只。實驗前禁食12h，飲水不限。實驗開始前將小鼠放在預先加熱到55±1℃的測痛儀上(GJ-8402型板測痛儀)，以小鼠舔后足潛伏期為痛反應指標，去除痛反應過敏(反復跳躍)及痛反應遲鈍(舔后足潛伏期＞20″)的小鼠。合格小鼠s.c給予不同劑量的受試藥物，45min后測定小鼠的舔后足時間，與給藥前比，潛伏期延長1倍以上為鎮痛有效。用Bliss法計算ED50。
(4)小鼠醋酸扭體鎮痛實驗(簡稱扭體法)將小鼠隨機分為5組，1組為NS對照組，其余為給藥組，每組20只。實驗前禁食12小時，飲水不限。實驗以0.6％醋酸為致痛劑(30％醋酸，北京化工廠生產，批號940406)，i.p 0.1ml/10g。NS組20只小鼠先s.cNS，40min后i.p醋酸，5min后開始記錄10min以內小鼠扭體數。以小鼠出現腰部肌肉反復收縮、拱背，臀部扭轉和后肢伸展為扭體反應陽性。給藥組小鼠s.c組藥45min后i.p醋酸，觀察方法同NS組。將給切組NS組小鼠扭體數進行比較，用Logit法計算半數抑制量ID50。
(5)河豚毒素酒石酸鹽的鎮痛時效關系用小鼠扭體法，方法同6.4，測出ID50后，用2倍ID50劑量給小鼠s.c河豚毒素酒石酸鹽，于給藥后15，30，60，120，180，300，330分鐘，各測定一次小鼠扭體反應，并用阿斯匹林作對照。將各時間點鎮痛有效百分率繪制河豚毒素酒石酸鹽的時效曲線。
(6).動物給藥后反應定量觀察指標計算大鼠甩尾、小鼠熱板及大鼠甲醛法、小鼠扭體的鎮痛ED50值及95％可信限。
(7).劑量設置大鼠甩尾，小鼠熱板，大鼠甲醛和小鼠醋酸扭體實驗各設4-5個劑量組。
(8).給藥方法上述實驗均采用sc給藥方法，模擬推薦的臨床給切方法。阿斯匹林為P.O給藥，哌替喧和嗎啡s.c給藥。
(9).試驗對照空白對照大鼠甩尾實驗和小鼠熱板實驗均采用給藥前后動物自身對照。小鼠扭體實驗和大鼠甲醛實驗均采用NS對照。
陽性對照河豚毒素酒石酸鹽具有較強的鎮痛作用，但其鎮痛機理還不太清楚，故在4種試驗中分別采用了消炎止痛藥阿斯匹林和麻醉性鎮痛藥哌替定、嗎啡做為陽性對照藥，以了解河豚毒素酒石酸鹽的鎮痛作用強度。
阿斯匹林粉劑，青海制藥廠生產，批號940305鹽酸哌替啶粉劑，青海制藥廠生產，批號930412硫酸嗎啡，青海制藥廠生產，批號9407011.試驗結果2.河豚毒素酒石酸鹽注射液、哌替定和阿斯匹林對小鼠的鎮痛效應河豚毒素酒石酸鹽、哌替定和阿斯匹林用小鼠熱板法和扭體法測定基鎮痛效應，結果見表1和表2。
表1河豚毒素酒石酸鹽、阿斯匹林和哌替定對小鼠的鎮痛ED50(熱板法)

從表1可以看出，河豚毒素酒石酸鹽的鎮痛強度大大超過哌替定，是它的1650倍。在熱板試驗中，小鼠p.o阿斯匹林45min后，只有少數小鼠舔后足，多數小鼠不舔后足而是在熱板上快速走動，或不斷跳躍，表明阿斯匹林在引起小鼠行為明顯異常的劑量下不能抑制熱傷害刺激引起的痛反應。
表2.河豚毒素酒石酸鹽、阿斯匹林和哌替定對小鼠的鎮痛ED50(扭體法)

從表2可以看出，河豚毒素酒石酸鹽的鎮痛強度遠遠超過阿斯匹林，比哌替定大670倍。
(10)河豚毒素酒石酸鹽注射液對大鼠的鎮痛效應用大鼠甩尾法和甲醛法測定河豚毒素酒石酸鹽的鎮痛效應，結果見表3和表4。
表3河豚毒素酒石酸鹽、阿斯匹林對大鼠的鎮痛ED50(甩尾法)

從表3可以看出，河豚毒素酒石酸鹽和阿斯匹林在大鼠甩尾試驗中對熱刺激均不敏感，無時顯鎮痛作用.全氨啉在15ug/kg時個別大鼠出現中毒死亡現象。
表4.河豚毒素酒石酸鹽、嗎啡對大鼠的鎮痛ID50(甲醛法)

由表4可見，河豚毒素酒石酸鹽和嗎啡在大鼠甲醛模型上均有明顯鎮痛作用，河豚毒素酒石酸鹽的鎮痛作用比嗎啡大2900倍。河豚毒素酒石酸鹽在2.5ug/kg時，對痛反應的抑制率已達70％，但隨劑量增加，鎮痛效應沒有明顯增加。
(11)河豚毒素酒石酸鹽和阿斯匹林的小鼠鎮痛時—效曲線測定采用小鼠醋酸扭體法測定了河豚毒素酒石酸鹽的鎮痛時—效曲線，并以阿斯匹林作為河豚毒素酒石酸鹽和阿斯匹林的劑量均為2倍的小鼠扭體ID50值，為6ug/kg和400ug/kg。結果見5、6及

圖1、2。
表5.河豚毒素酒石酸鹽在小鼠扭體鎮痛試驗中的時—效關系

*與NS組的平均扭體數比(28.2±12.4)。
表6.阿斯匹林在小鼠扭鎮痛試驗中的時—效關系

*與NS組的平均扭體數比(18.4±6.4)。
(12).實驗結論采用熱刺激法(大鼠甩尾法、小鼠熱板)和化學刺激法(大鼠甲醛法、小鼠扭體法)測定了河豚毒素酒石酸鹽注射液的鎮痛效應并與消炎止痛藥阿斯匹林和麻醉鎮痛藥哌替定\嗎啡進行了對比.結果表明，河豚毒素酒石酸鹽在大鼠甩尾鎮痛試驗中無鎮痛作用，說明它對熱刺激不敏感。大鼠甲醛法鎮痛ID50為0.93ug/kg，小鼠扭體法鎮痛ID50為2.86ug/kg，小鼠熱板法鎮痛ED50為10.39ug/kg。在大鼠甲醛法的鎮痛試驗中，河豚毒素酒石酸鹽的鎮痛強度是嗎啡的2900倍。在小鼠扭體法的鎮痛實驗中，河豚毒素酒石酸鹽的鎮痛強度大大超過阿斯匹林，比哌替定大670倍。在小鼠熱板法的鎮痛試驗中，河豚毒素酒石酸鹽的鎮痛強度比哌替定大1650倍。
河豚毒素酒石酸鹽的鎮痛時—效測定結果表明，其鎮痛起效時間為給藥后15min，1h達高峰，鎮痛作用持續5h。阿斯區林的鎮痛起效時間為給藥后20min，30min達高峰，鎮痛持續時間為100min。
在四種鎮痛實驗中，河豚毒素酒石酸鹽的鎮痛效果以大鼠甲醛法的鎮痛效果最好，其次為小鼠扭體的鎮痛效果，提示河豚毒素酒石酸鹽可對化學性傷害刺激較為敏感。
以小鼠扭體法測定河豚毒素酒石酸鹽注射劑的鎮痛作用時—效關系，結果表明S.C給全氨啉后15min開始起效，起效后1h達高峰，鎮痛作用持續約5h，其鎮痛作用時間明顯比阿司匹林長。
實施例3河豚毒素酒石酸鹽注射劑的戒毒活性和依賴性試驗以3種動物5種模型進行河豚毒素酒石酸鹽注射劑的身體依賴性試驗，結果表明，河豚毒素酒石酸鹽注射劑兩個劑量組，對大、小鼠s.c恒量給藥7天，然后以催促，進行小鼠催促跳躍和大鼠催促戒斷試驗，同嗎啡對照組比，小鼠未出現的跳躍反應，大鼠未出現明顯戒斷反應和體重下降；大鼠組繼續恒量給藥至第22天做自然戒斷試驗，停藥后觀察4天，未見體重明顯下降或其它戒斷反應，猴i.m劑量遞增給藥，無論是一個月用納洛酮催促戒斷還是三個月自然戒斷，均未出現嗎啡樣戒斷癥狀和體重下降。這些結果表明該藥不具備阿片類身體依賴性，提示該藥在臨床應用中不會出現依賴性問題。
1.試驗目的了解河豚毒素酒石酸鹽注射劑的依賴性潛力，預測的臨床應用中可能出現的依賴性問題。
2.受試藥物名稱河豚毒素酒石酸鹽注射劑3.對照品陽性對照鹽酸嗎啡、青海制藥廠生產，批號940701陰性對照生理鹽水4.動物來源及種屬wistar大鼠，合格證書號01-3056。昆明種小鼠，合格證書號01-3049。北京醫科大學實驗動物部提供，符合國家一級實驗動物標準。
廣西猴(恒河猴亞種)，由實驗動物部外購，體驗合格，驅蟲治療，飼養兩周后用于實驗。
體重大鼠190-230g，小鼠20-25g，猴3-6。
性別大、小鼠♂♀各半，猴♂♀搭配。
組動物數小鼠20只，大鼠10只，猴3-6只。
給藥容量小鼠0.1ml/10g；大鼠0.2ml/10g，猴0.1ml/kg6.試驗方法的選擇參照新藥臨床前研究指導原則匯編(1)有關藥物依賴性試驗一章中身體依賴性試研方法，選擇以下試驗方法(1)小鼠催促跳躍試驗
(2)大鼠催促戒斷試驗(3)大鼠自然戒斷試驗(4)猴催促戒斷試驗(5)猴自然戒斷試驗7.劑量設置(1)小鼠設置催促跳躍試驗由于河豚毒素酒石酸鹽注射劑應用中是恒量給藥，故本實驗取最大耐受劑量，兩組恒量給藥。
河豚毒素酒石酸鹽注射劑大量劑量組11.5ug/kg(2/3LD50)河豚毒素酒石酸鹽注射劑小劑量組5.5ug/kg(1/3LD50)陽性對照組嗎啡20mg/kg恒量給藥陰性對照組等容量的生理鹽水(NS)(2)大鼠催促戒斷試驗河豚毒素酒石酸鹽注射劑大劑量組由3ug/kg(1/5LD50)增至12ug/kg(4/5LD50陽性對照組嗎啡劑量遞增給藥，從15mg/kg增至35mg/kg陰性對照組等容量的生理鹽水(NS)(3)大鼠自然戒斷試驗第一周劑量同大鼠催促戒斷試驗，后兩周維持催促實驗的最大全氨啉劑量(接近2/3LD50，為最大耐受劑量)。
陽性對照組嗎啡劑量遞增至70mg/kg。
陽性對照組等容量的生理鹽水(NS)。
(4)猴催促戒斷試驗河豚毒素酒石酸鹽TTX組由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)劑量遞增給藥，從開始1ug/kg3ug/kg。
陽性對照組嗎啡劑量遞增給藥，從每天3ug/kg增至15ug/kg。
(5)猴自然戒斷試驗開始同猴催促戒斷試驗，從第三周維持最大耐受劑量(3ug/kg)。
8.給藥期大、小催促試驗一周大鼠自然戒斷3周，猴催促戒斷1個月和自然戒斷3個月。
9.給藥途徑大、小鼠s.c給藥(因大、小鼠肢體肌肉少，連續i.m有困難)，猴I.m給藥，摸似臨床給藥途徑。
10.試驗方法10.1小鼠催促跳躍試驗給藥方案嗎啡組恒量20mg/kg；河豚毒素酒石酸鹽TTX組由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)設置兩組，其劑量分別為5.5ug/kg、11.5ug/kg，恒量給藥7天，NS。第8天早8:30末次給藥后2小時用10mg/kgM50(s.c)催促，記錄跳躍發生率和跳躍次數。
10.2大鼠催促戒斷試驗給藥方案嗎啡組5、10、15、20、25、30、35mg/kg各1天；河豚毒素酒石酸鹽TTX組由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)設兩個劑量組，其劑量分別為1.5ug/kg、3.0ug/kg，遞增劑量給藥7天，分別達9和12ug/kg。第8天早30末次給藥后2小時用2mg/kgM50(s.c催促，按觀察表(附1)記錄戒斷反主尖和體重下降程度，并評分。
10.3大鼠自然戒斷試驗(3周)河豚毒素酒石酸鹽TTX組由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)第一周給藥劑量同大鼠催促戒斷試驗，以后繼續給藥2周，嗎啡組劑量依次為5、10、15、20、25、30、35mg/kg各1天；40、50、60mg/kg各3天，70mg/kg4天，于第21天停藥觀察體重變化，每天稱重3次，至體重恢復。
10.4猴催促戒斷試驗將猴分為嗎啡陽性對照組，NS陰性對照組和河豚毒素酒石酸鹽TTX組由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)組，每天給藥3次(8:30，14:30，20:30)。以劑量遞增法形成嗎啡依賴模型。劑量為3、6mg/kg個3天，9、12mg/kg各4天，第3周15mg/kg維持至1個月。河豚毒素酒石酸鹽TTX組由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)劑量為1、2、3ug/kg，各一周，第4周增至4ug/kg時發現明顯毒性反應(嘔吐)，又降至3ug/kg，共給藥1個月。第31天早上8:30末次給藥1小時，sc納洛酮13mg/kg.立即觀察給藥后1小時內猴的戒斷癥狀及體重便化百分率，并按觀察表(附2)評分。
10.5猴自然工業斷試驗將猴分為嗎啡陽性對照組、NS陰性對照組和河豚毒素酒石酸鹽TTX組由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)組，試驗步驟和給藥方法同催促試驗。30天后維持催促試驗大劑量至90天時停止給嗎啡、河豚毒素酒石酸鹽TTX組由1.5ug/kg(1/10LD50)增至9ug/kg(6/10LD50)和NS，然后觀察停藥一周內各組猴戒斷癥狀和體重變化情況，每天3次，并按觀察表(附2)評分。
11.觀察指標
小鼠催促跳躍試驗以跳躍發生率及次為指標；大鼠催促戒斷試驗以體重下降和戒斷癥狀為觀察指標；大鼠自然戒斷試驗以體重下降和戒斷癥狀為觀察指標；猴催促戒斷試驗以體重下降和戒斷癥狀為觀察指標；猴自然戒斷試驗以體重下降和戒斷癥狀為觀察指標。
12.結果12.1小鼠催促跳躍試驗結果見表1表1.河豚毒素酒石酸鹽、嗎啡和NS組小鼠跳躍結果比較

*與注射劑量、NS組比較P＜0.05經單因素方差分析。嗎啡組與TTX組和NS對照組均有顯著性差異，而TTX組與NS對照組則無顯著性差異。這表明，在所用劑量下，注射劑量對小鼠s.c上周恒量給藥后與NS結果一樣，均未出現身體依賴性指癥。
12.2大鼠催促戒斷試驗結果見表2表2注射劑量、嗎啡和NS催促戒斷分值比較

**與TTX組和NS組比P＜0.01注射劑量兩個劑量組的戒斷癥狀分和體重下降分均與NS組相近，都明顯低于嗎啡組并有非常顯著性差異(P＜0.01)。這表明，注射劑量對大鼠s.c在所試用劑量下未產生身體依賴性反應。
12.3大鼠自然戒斷試驗(3周)各組大鼠連續給藥3周后停藥觀察體重變化情況，每天3次(8:30，14:30，20:30)。第4天時注射劑量兩個劑量組的體重已恢復并超過停藥前，故未再繼續觀察。表3所示為4天內各組大鼠體重減輕最明顯時各時間點的體重變化情況。
表3注射劑量、嗎啡組體重變化情況比較(X±SD)。體重下降百分率

**與TTX組及NS組比P＜0.01從表3結果看，注射劑量兩個劑量組連續給藥3周停藥后體重變化不大，各時間點體重與NS比較均顯著性差異(P＜0.05)，且第48小時的體重均比NS組高，注射劑量小劑量組的體重已恢復并超過停藥前。而嗎啡組的體重明顯下降，與NS組及TTX組的體重下降比有非常顯著性差異(P＜0.01)。這表明，注射劑量該藥在大鼠自然戒斷試驗中，沒有使鼠體重明顯下降，即沒有產生身體依賴性指征。
12.4猴催促戒斷試驗各組猴連續給藥30天后，次日早8:30末次給藥后1小時，s.c，納洛酮1mg/kg，立即觀察1小時內各組猴的戒斷癥狀及體重下降變化百分率，結果見表4。
戒斷癥狀和體重下降百分率均與NS組非常接近，說明注射劑量長期給藥后用嗎啡拮抗劑納洛酮催促未出現嗎樣戒斷癥狀，即說明無阿片類身體依賴特性。
12.5猴自然戒斷試驗各組在連續給藥90天后停藥，觀察各組猴在一周內的戒斷癥狀和體重變化情況，結果見表5。
表5各組猴自然戒斷期間戒斷癥狀分值比較(X±SD)


表6.各組猴自然戒斷期間體重變化百分率(X±SD)
**與注射劑量和NS組比P＜0.01從表5、6結果可以看出，注射劑量在連續給藥三個月后停藥觀察一周，未出現任何戒斷癥狀。停藥的前3天個別猴有時有些興奮多動現象，但很快消失。體重非但沒有減輕反而比給藥期間增加。嗎啡對照則出現明顯的戒斷癥狀，說明注射劑量長期給藥沒有出現身體依賴性指征。
13.結論河豚毒素酒石酸鹽注射劑對小鼠s.c恒量給藥一周，在所試劑量下，小鼠催促跳躍試驗中，未出現明顯跳躍反應。
河豚毒素酒石酸鹽注射劑對大鼠s.c遞增劑量給藥一周，催促戒斷試驗中未出現明顯戒斷反應和體重下降。河豚毒素酒石酸鹽注射劑先遞增給藥三周停藥后觀察4天未見體重明顯下降。
河豚毒素酒石酸鹽注射劑對猴i.m劑量遞增給藥一個月后，納洛酮催促戒斷還是給藥3個月后自然戒斷試驗，均未出現嗎啡樣戒斷癥狀和體重下降。
以上試驗結果表明，河豚毒素酒石酸鹽注射劑不是具有阿片類身體依賴特性，提示河豚毒素酒石酸鹽注射劑在臨床應用中不可能出現阿片類依賴問題。
實施例4河豚毒素酒石酸鹽注射劑的急性毒性河豚毒素酒石酸鹽對動物一次性注射后，觀察7天，測得該藥對小鼠的靜脈毒性LD50為17.25ug/kg(14.55-20.45)，對大鼠的皮下毒性LD50為17.21ug/kg(13.43-22.07)，對大鼠的肌肉毒性LD50為15.82ug/kg(8.96-27.95).主要中毒癥狀有注射后1-2分鐘動物表現安靜\行動緩慢\5-10分鐘，后肢低步太及扭體樣動用.并有呼吸減慢，靜脈注射的動物死得較快，死前有驚厥.皮下和肌肉注射的動物比靜脈注射的死得慢，低劑量時驚厥不明顯，安靜地死去。
1.試驗目的觀察河豚毒素酒石酸鹽一次給予動物后所產生的急性毒性反應和死亡情況，為臨床安全用藥提供參考。
2.受試藥物名稱河豚毒素酒石酸鹽配制方法生理鹽水配制所需濃度溶劑生理鹽水3.動物來源、種屬wistar大白鼠，合格證號01-3056。昆明種小鼠，合格證號01-3049。由北京醫科大學實驗動物中心提供，符合國家一級實驗動物標準。
體重大鼠170-240g；小鼠18-22g性別雌雄各半每組動物數大鼠每組10只，小鼠每組20只。
4.劑量劑量設量小鼠分5個劑量組，分別為10、15、20、25、30ug/kg。大鼠皮下給藥分5個劑量組，分別為10、15、20、25u g/kg。大鼠肌肉給藥分4個劑量組，分別為10、15、20、25u g/kg。
每只動物接受容量小鼠i.v＜0.2ml大鼠s.c＜1ml大鼠i.m＜0.4ml5.給藥途徑小鼠i.v，大鼠s.c和i.m，(模擬推薦的臨床給藥途徑)1.試驗方法按照衛生部新藥審批辦法(1992)中有關毒理研究的技術標，將受試物一次給藥后，觀察7天。每天記錄動物中的毒癥狀及死亡數。對死亡動物和未死亡動物進行尸檢，必要時進行檢查，最后根據所給劑量和死亡率，用Bliss法(2)求出動物各種給藥途徑的LD50值及其95％可信息。
2.觀察指標觀察期一次給藥后觀察7天毒性反應小鼠i.v河豚毒素酒石酸鹽后，很快出現毒性反應，大劑量時注射完后立即死亡，一般在30min內死亡，30min內不死者，基本不會死亡。死亡前的主要中毒癥狀為，注射后1-2分鐘動物表現安靜、行動緩慢、5-10分鐘，后肢低步態及扭體樣動物，并有呼吸減慢，死前有驚厥。
大鼠s.c和i.m后，死亡時間略比小鼠慢，所出現的癥狀與小鼠基本相似，但驚厥現象只在高劑量時才出現，低劑量時是安靜地死去。死亡動物尸檢，各臟器未見異常。觀察一周后，存活動物解剖，各臟器均為正常。
3.結果劑量-反應數據表對大鼠、小鼠的急性毒性試驗結果進行統計處理，用Bliss法求出大量鼠、s.c、i.m和iv對河豚毒素酒石酸鹽的LD50值，試驗中未發現動物性別與中毒癥狀及死亡率有明顯差別。結果見表1、2、3。
表1小鼠一次I.v河豚毒素酒石酸鹽的急性試驗結果

表2大鼠一次s.c河豚毒素酒石酸鹽的急性毒性試驗結果

表3大鼠一次i.m河豚毒素酒石酸鹽的急性毒性試驗結果

死亡原因和毒性反應分析全氨啉對大\小鼠的毒性反應其本相似，其特點是作用迅速，一般死亡出現在給藥后30分鐘內，靜脈給藥途徑死得更快。給藥后有中樞作用癥狀，如安靜、低步態、扭體樣動作、呼吸減慢、大劑量時有驚厥現象。解剖死亡動物，各臟器未見明顯變化。因此，其死亡原因是由于中樞抑制作用引起的，特別是抑制呼吸作用。
權利要求
本發明涉及一種海洋天然產物河豚毒素各種以鹽形式制備成的河豚毒素衍生物，各種衍生物在戒毒和鎮痛方面的功效，以及各種衍生物的制劑形式。1.一種以河豚毒素為原料的各種鹽形式制備成的高水溶性的河豚毒素鹽衍生物，該類衍生物可制備成注射劑(包括水針，凍干粉針)，固體制劑(包括膠囊，片劑)，用于戒毒和鎮痛治療。
2.根據權利1所述的衍生物，可制成河豚毒素的酒石酸鹽，馬來酸鹽，磺酸鹽，鹽酸鹽，硫酸鹽，氫溴酸鹽，甲磺酸鹽，醋酸鹽，枸緣酸鹽的等當量衍生物。
3.根據權利2所述的各種衍生物，每種衍生物可制備成注射劑和固體制劑。
4.根據權利3所述的各種衍生物的制劑，每種制劑可用于戒毒和鎮痛的治療，治療的給藥量為每次1-10μg范圍。
5.根據權利4所述的各種衍生物的制劑用于戒毒和鎮痛的治療，藥物應無藥物依賴性。
全文摘要
本發明涉及一種海洋天然產物河豚毒素各種以鹽形式制備成的河豚毒素衍生物(包括河豚毒素的酒石酸鹽，馬來酸鹽，磺酸鹽，鹽酸鹽，硫酸鹽，氫溴酸鹽，甲磺酸鹽，醋酸鹽，枸緣酸鹽的等當量衍生物)及其制備方法，各種衍生物的制劑形式，以及各種制劑在戒毒和鎮痛方面的用途。
文檔編號A61P25/36GK1795863SQ200410102449
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月27日 優先權日2004年12月27日
發明者林文翰, 葉祖光, 孫蓉 申請人:林文翰, 葉祖光, 孫蓉