從竹筍中提取的植物甾醇類提取物及其制備方法和用途的制作方法

專利名稱：從竹筍中提取的植物甾醇類提取物及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及農(nóng)副產(chǎn)品深加工及綜合利用領(lǐng)域。更具體地涉及一種從竹筍中提取的植物甾醇類提取物及其制法和用途。
背景技術(shù)：
竹子是禾本科(Gramineae)多年生常綠植物，全世界約有70多屬、1200多種，竹林面積約2000萬公頃(3億畝)，東南亞地區(qū)及其附近島嶼是世界竹子分布的中心。我國位于世界竹子分布的中心地區(qū)，是世界上主要產(chǎn)竹國，素有“竹子王國”之稱，擁有十分豐富的竹類資源，擁有竹林面積約400萬公頃，竹筍年產(chǎn)量為250萬噸，其中經(jīng)濟利用價值較高的毛竹(phyllostachys pubescens)林的面積約為250萬公頃，約占世界毛竹總量的90％以上。
關(guān)于竹子有效成份及其生物活性的研究，日本的研究工作起步較早，主要集中在對赤竹屬(Sasa Makino et shbata)的赤竹亞屬(Subgen.Sasa)中華箬竹亞科(Subgen.Sasamorpha)中的一類草本型竹子[(中)竹草，(英)Bamboo grass，即Sasa albomarginta Makino&Shibata等品種]的研究。中國、印度、巴西、美國和韓國等也有對竹子有效成分的研究，基本局限在具有本國資源特色的竹子品種上。
中國是竹筍生產(chǎn)、利用和研究的古國。然而國內(nèi)外科研工作者在對竹筍資源的深入開發(fā)和綜合利用上僅僅作了初步的探索，如利用筍殼、筍頭制備膳食纖維、提取過氧化物酶、分離活性蛋白、多糖，開發(fā)高營養(yǎng)的飼料等。
Sakai koji等(1999)首次從筍殼中分離出2種抗氧化成份苜蓿素(Tricin)和紫杉葉素(Taxifolin)，并用POV方法測得其抗氧化活性分別為α-生育酚的10％和1％。Ishii-T等人對竹筍細(xì)胞壁化學(xué)成分進行了系統(tǒng)的研究，從中分離得到果膠多糖、半纖維多糖、rhamnogalacturonan、硼多糖復(fù)合物、p-coumaroyl-或feruloylated-阿(拉伯)糖基木聚四糖等組分，并發(fā)現(xiàn)竹筍的多糖組成與大槭樹等雙子葉植物相似。
然而，迄今為止人們對竹筍中的許多構(gòu)成成分和功能還了解甚少。為了更有效地開發(fā)和利用竹筍資源，本領(lǐng)域迫切需要發(fā)現(xiàn)和開發(fā)竹筍中具有有益功能的各種成分。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種從竹筍中提取有益成分-即竹筍的植物甾醇類提取物，及其制備方法和用途。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種竹筍甾醇提取物，該提取物中總甾醇含量為5-50％，并且所述的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇和蕓苔甾醇。
在另一優(yōu)選例中，所述的甾醇中至少30％由β-谷甾醇、豆甾醇和蕓苔甾醇構(gòu)成。
在另一優(yōu)選例中，所述的提取物的總甾醇中的β-谷甾醇含量為10-40％，并且β-谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇之間比例為10～40∶1～3∶2～5。
在另一優(yōu)選例中，所述的提取物中總甾醇含量為20-40％，并且總甾醇中的β-谷甾醇含量為15-30％。
在另一優(yōu)選例中，β-谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇之間比例為15～30∶2～3∶3～4。
在另一優(yōu)選例中，所述的提取物外觀為淡黃或金黃的膏狀物，經(jīng)溴化鉀壓片后的紅外圖譜顯示該提取物在3440、2925、2850、1710、1465和720cm-1左右處有特征性吸收峰；將提取物溶于光譜純的二氯甲烷后，在190～700nm的波長范圍內(nèi)進行掃描，顯示在240nm左右處有最強吸收，在275nm左右處有次強吸收。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種組合物，它含有0.01-99.9wt％(更佳地0.1-90wt％)本發(fā)明的竹筍甾醇提取物和可接受的載體(包括藥學(xué)上、食品學(xué)上或化學(xué)品上可接受的載體)。
在另一優(yōu)選例中，所述的組合物是藥物組合物、保健品組合物、食品組合物或化妝品組合物。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種本發(fā)明竹筍甾醇提取物的制備方法，它包括步驟(a)在分離釜中，于以下條件下，對竹筍原料進行超臨界流體萃取萃取劑為CO2，萃取壓力為15～35MPa，萃取溫度為40～70℃，分離溫度為30～50℃，分離壓力為4～8MPa，循環(huán)動態(tài)萃取1～5h，
(b)從分離釜中取出萃取物，從而獲得竹筍甾醇提取物。
在另一優(yōu)選例中，步驟(a)中的萃取壓力為20～30MP，萃取溫度為45～65℃，并且可使用選自下組的夾帶劑C1～C4的醇或酮類有機溶劑，其用量按照重量計算為竹筍原料量的5～15％。
在本發(fā)明的第四方面，提供了一種本發(fā)明竹筍甾醇提取物的用途，它被用于制備消炎的藥物、日用化妝品、或保健品，或者用于制備防治白血病的藥物或保健品。


圖1是毛竹筍甾醇提取物的紅外光譜圖。經(jīng)溴化鉀壓片后的紅外圖譜顯示該提取物在3440、2925、2850、1710、1465和720cm-1左右有特征性吸收峰。
圖2是毛竹筍甾醇提取物的紫外光譜圖。提取物溶于光譜純的二氯甲烷后，在190～700nm的波長范圍內(nèi)進行掃描，結(jié)果顯示在240nm處有最強吸收，在275nm處有次強吸收。
圖3是竹筍甾醇提取物的GC-MS譜圖。竹筍甾醇提取物的GC-MS圖譜顯示20min前都是不飽和脂肪酸，26min左右為β-谷甾醇，23.5min左右為蕓苔甾醇，24.5min左右為豆甾醇。
圖4是β-谷甾醇(β-sitosterol)的結(jié)構(gòu)及MS譜圖。
圖5是豆甾醇(stigmasterol)的結(jié)構(gòu)及MS圖譜。
圖6是蕓苔甾醇(campesterol)的結(jié)構(gòu)及MS圖譜。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過多年深入研究，對竹筍的各種成分進行了提取分離，獲得了一種可有效消炎、防治心腦血管和白血病的提取物，對該提取物的研究表明，該提取物主要含β-谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇等成分。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
如本文所用，竹筍指竹子膨大的芽和幼嫩的莖?？捎糜诒景l(fā)明竹筍可以是筍肉，也可以是竹筍全株，也可以是竹筍加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，如筍殼、筍頭和筍衣等。優(yōu)選原料是筍殼和筍頭。
本發(fā)明采用的原料可以進行預(yù)處理，也可以不經(jīng)過預(yù)處理。一種優(yōu)選原料是粉末形式的竹筍。例如，收集竹筍、筍肉筍殼、筍頭或筍衣，切成片后，打成漿壓榨或直接晾曬到一定程度，再干燥到含水量約5～10％，將其粉碎到約20～40目的粉末。
可用于本發(fā)明的竹子品種沒有特別限制，可以是不同屬的竹子，優(yōu)選剛竹屬品種的竹筍為主，如毛竹。
如本文所用，“本發(fā)明的活性物質(zhì)”指竹筍甾醇提取物。較佳地，該竹筍甾醇提取物的總甾醇含量為5-50％，其中β-谷甾醇含量為10-40％，β-谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇之間比例為10～40∶1～3∶2～5。
如本文所用，“本發(fā)明的活性物質(zhì)制劑”或“本發(fā)明的活性組合物”指含有竹筍甾醇提取物的組合物，包括藥物組合物和保健品組合物。
本發(fā)明的竹筍甾醇提取物宜用超臨界流體萃取技術(shù)提取，雖然也可其他方法提取。
一種優(yōu)選的方法是采用超臨界流體萃取技術(shù)從竹筍及其筍加工廢棄物(筍殼、筍頭、筍衣)中提取甾醇類化合物。在一優(yōu)選例中，萃取劑為CO2，萃取壓力為15～35MPa，萃取溫度為40～70℃，分離溫度為30～50℃，分離壓力為4～8MPa，并可在萃取過程中加入醇或酮作為夾帶劑，起到增效作用。
在更優(yōu)選例中，將約20-40目竹筍粉末放入超臨界萃取釜中，萃取劑選CO2，CO2經(jīng)壓縮機升壓同時對萃取釜加溫，當(dāng)萃取壓力達到15～35MPa，萃取溫度達到40～70℃時，開始循環(huán)；在循環(huán)過程中，CO2和萃取物在分離器中經(jīng)減壓，將萃取物在分離器中析出，CO2循環(huán)使用，分離釜1設(shè)定分離壓力為6～8MPa、溫度為35～45℃，分離釜2設(shè)定分離壓力為4～7MPa、溫度為30～35℃；在萃取過程中使用或不使用夾帶劑的狀態(tài)下，循環(huán)動態(tài)萃取1～5h，使用的夾帶劑可以是C1～C4的醇或酮類有機溶劑(如甲醇、乙醇、丙酮、丁醇或其混合物等)，用量一般為原料重量的5～15％。萃取完成后，從分離釜中取出萃取物，經(jīng)低溫干燥、粉碎后，就得到竹筍甾醇提取物，并從分離釜中回收夾帶劑，停機從萃取釜中取出萃余物。
本發(fā)明的竹筍甾醇提取物是一種以β-谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇為主的混合物。用Liebermann Burchard分光光度法檢測，以β-谷甾醇為標(biāo)準(zhǔn)品，測得提取物中總甾醇的含量為5～50％(較佳地為20-40％)；用GC及GC-MS技術(shù)分析，其中β-谷甾醇含量為10～40％(較佳地為15-30％)，β-谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇之間比例為10～40∶1～3∶2～5，更佳地為15～30∶2～3∶3～4。
本發(fā)明的竹筍甾醇提取物具有消炎、抑制白血病細(xì)胞增生等有益作用，因此可用于制備消炎、防治白血病的藥物、日用化妝品、保健品。因此，本發(fā)明還提供了一種含有本發(fā)明的竹筍甾醇提取物作為有效成份的組合物(包括藥物組合物、保健品組合物、食品組合物和化妝品組合物等)。這些組合物可用于預(yù)防、治療或輔助治療炎癥。此外，本發(fā)明的竹筍甾醇提取物還可用于制備降膽固醇等防治心腦血管疾病的藥物、保健品和食品。
在獲得竹筍甾醇提取物后，可用常規(guī)方法將其與藥學(xué)上、食品學(xué)上或保健品或化妝品上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑相混合，形成本發(fā)明的藥物組合物、食品組合物、保健品組合物或化妝品組合物。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。
以藥物組合物或保健品組合物為例，它們可以為固態(tài)(如顆粒劑、片劑、凍干粉、栓劑、膠囊、舌下含片)或液態(tài)(如口服液)或其他合適的形狀。本發(fā)明的活性成分(竹筍甾醇提取物或其提取物)的含量通常為組合物重量的1-99％，較佳地為2-95％，更佳地為5-90％，最佳地10-80％。
藥物組合物可以為單劑或多劑形式。按施用劑量計，通常含有10-2000mg/劑，較佳地約20-1000mg/劑，更佳地50-500mg/劑。
本發(fā)明的藥物組合物可以通過常規(guī)途徑進行給藥，優(yōu)選方式是口服。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明藥物的施用量，按活性物質(zhì)計算，通常為每天約0.1-500mg/kg體重，較佳地約0.5-50mg/kg體重。此外，本發(fā)明的制劑還可與其他治療劑一起使用，例如，其他治療劑包括各種現(xiàn)有的消炎藥。
本發(fā)明的主要優(yōu)點是(a)提供了一種來源廣闊、組成明晰、品質(zhì)優(yōu)良、質(zhì)量可控、用途廣泛并具有多種生理和藥理活性的竹筍甾醇提取物。
(b)通過超臨界CO2流體萃取技術(shù)實現(xiàn)了竹筍及其加工廢棄物中植物甾醇的高效提取，并且工藝操作簡便，得到的竹筍甾醇提取物質(zhì)量好，品質(zhì)穩(wěn)定。
下面結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
通用方法1)、竹筍甾醇提取物中植物甾醇含量測定——Liebermann Burchard比色法將樣品用三氯甲烷萃取溶解后取下層三氯甲烷層。準(zhǔn)確移取1ml三氯甲烷樣品溶液，加入醋酐2ml和濃硫酸1滴，振蕩搖勻后用1cm的比色杯在625nm波長處測定吸光值。每一個樣品平行測定2次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算成相應(yīng)的總甾醇含量，取平均值得到樣品中植物總甾醇的含量。
2)、竹筍甾醇提取物的有效成分分析——氣相及氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)通過使用氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)和氣相色譜分析萃取物中存在的主要成分和含量。
GC條件Agilent公司的GC6890；FID檢測器溫度為280℃；HP5毛細(xì)管柱；載氣為氮氣，氫氣流速30ml/min，空氣流速200ml/min，尾沖氣流50ml/min；程序升溫為在100℃下保持3min后，以20℃/min的速度上升到280℃，保持20min，進樣(不分流)量1μl。
GC-MS的條件Agilent公司的GC6890-MS5973；HP5-MS毛細(xì)管柱；載氣為氦氣，柱流速1ml/min；程序升溫為在100℃下保持3min后，以20℃/min的速度上升到280℃，保持20min，檢測為掃描質(zhì)量范圍50-600m/z，倍增管電壓1600ev，數(shù)據(jù)庫為NIST98。
實施例1將毛竹筍剝殼后，將筍肉打成漿，經(jīng)壓榨除水后，曬干到一定程度，再用微波干燥到水分含量為5％，粉碎成20目的筍殼粉末5kg，并將其放入超臨界萃取釜中，升溫到50℃，開動柱塞泵泵入CO2，通過預(yù)熱器進入萃取釜中，當(dāng)壓力達到25MPa，開始循環(huán)；開啟夾帶劑泵，使10％原料重量的乙醇通過預(yù)熱器后同時進入萃取釜；在循環(huán)過程中，CO2和萃取物在分離器中經(jīng)減壓，將萃取物在分離器中析出，CO2循環(huán)使用，分離釜1設(shè)定分離壓力為8MPa、溫度為40℃，分離釜2設(shè)定分離壓力為5MPa、溫度為30℃；萃取4h后，從分離釜1、2中取出萃取物50g，得率為1.0％，經(jīng)低溫干燥后，得到竹筍甾醇提取物，并從分離釜1、2中回收夾帶劑；停機從萃取釜中取出萃余物。
對提取物進行成分分析，結(jié)果如圖1-6所示。
圖1表明，該提取物在3440、2925、2850、1710、1465和720cm-1左右有特征性吸收峰。
圖2表明，該提取物在240nm處有最強吸收，在275nm處有次強吸收。
圖3表明竹筍甾醇提取物成分包括20min前都是不飽和脂肪酸，26min左右為β-谷甾醇，23.5min左右為蕓苔甾醇，24.5min左右為豆甾醇。
圖4-6證實了提取物中含β-谷甾醇(β-sitosterol)、豆甾醇(stigmasterol)、蕓苔甾醇(campesterol)。
比色法與GC法分析竹筍甾醇提取物的成分含量，其總甾醇含量為25±5％，β-谷甾醇含量為20±5％，β-谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇之間比例為20～25∶2～3∶3～4。
實施例2將毛竹筍筍殼曬干到一定程度后用熱風(fēng)干燥到水分含量為5％，粉碎成20目的筍殼粉末5kg，并將其放入超臨界萃取釜中，升溫到60℃，開動柱塞泵泵入CO2，通過預(yù)熱器進入萃取釜中，當(dāng)壓力達到30MPa，開始循環(huán)；開啟夾帶劑泵，使10％體積比的丙酮通過預(yù)熱器后同時進入萃取釜；在循環(huán)過程中，CO2和萃取物在分離器中經(jīng)減壓，將萃取物在分離器中析出，CO2循環(huán)使用，分離釜1設(shè)定分離壓力為8MPa、溫度為45℃，分離釜2設(shè)定分離壓力為5MPa、溫度為30℃；萃取2.5h后，從分離釜1、2中取出萃取物40g，得率為0.8％，經(jīng)低溫干燥后，得到竹筍甾醇提取物，并從分離釜1、2中回收夾帶劑；停機從萃取釜中取出萃余物。
對提取物進行成分分析，結(jié)果同實施例1。比色法與GC法分析提取物的成分含量，其總甾醇含量為25±5％，β-谷甾醇含量為20±5％，β-谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇之間比例為20～25∶2～3∶3～4。
實施例3將毛竹筍筍頭切片后打成漿，經(jīng)壓榨除水后曬干到一定程度，用微波干燥到水分含量為5％，粉碎成20目的筍頭粉末6kg，并將其放入超臨界萃取釜中，升溫到45℃，開動柱塞泵入CO2，通過預(yù)熱器進入萃取釜中，當(dāng)壓力達到20MPa，開始循環(huán)；在循環(huán)過程中，CO2和萃取物在分離器中經(jīng)減壓，將萃取物在分離器中析出，CO2循環(huán)使用，分離釜1設(shè)定分離壓力為6MPa、溫度為35℃，分離釜2設(shè)定分離壓力為5MPa、溫度為30℃；萃取1h后，從分離釜1、2中取出萃取物60g，得率為1.0％，經(jīng)低溫干燥后，得到竹筍甾醇提取物；停機并從萃取釜中取出萃余物。
對提取物進行成分分析，結(jié)果同實施例1。比色法與GC法分析提取物的成分含量，其總甾醇含量為30±5％，β-谷甾醇含量為25±5％，β-谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇之間比例為25～28∶2～3∶3～4。
實施例4將麻竹筍全筍切碎后打成漿，經(jīng)壓榨除水后曬干到一定程度，用微波干燥到水分含量為5％，粉碎成20目的竹筍粉末6kg，并將其放入超臨界萃取釜中，升溫到50℃，開動柱塞泵泵入CO2，通過預(yù)熱器進入萃取釜中，當(dāng)壓力達到到15MPa，開始循環(huán)；開啟夾帶劑泵，使10％體積比的乙醇通過預(yù)熱器后同時進入萃取釜；在循環(huán)過程中，CO2和萃取物在分離器中經(jīng)減壓，將萃取物在分離器中析出，CO2循環(huán)使用，分離釜1設(shè)定分離壓力為7MPa、溫度為40℃，分離釜2設(shè)定分離壓力為5MPa、溫度為30℃；萃取2.5h后，從分離釜1、2中取出萃取物65g，得率為1.1％，經(jīng)低溫干燥后，得到竹筍甾醇提取物，從分離釜1、2中回收夾帶劑，停機從萃取釜中取出萃余物。
對提取物進行成分分析，結(jié)果同實施例1。比色法與GC法分析提取物的成分含量，其總甾醇含量為25±5％，β-谷甾醇含量為20±5％，β-谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇之間比例為18～22∶2～3∶3～4。
實施例5將綠竹筍筍衣切碎后曬干到一定程度，用微波干燥到水分含量為5％，粉碎成20目的筍衣粉末5kg，并將其放入超臨界萃取釜中，升溫到50℃，開動柱塞泵泵入CO2，通過預(yù)熱器進入萃取釜中，當(dāng)壓力達到到25MPa，開始循環(huán)；在循環(huán)過程中，CO2和萃取物在分離器中經(jīng)減壓，將萃取物在分離器中析出，CO2循環(huán)使用，分離釜1設(shè)定分離壓力為8MPa、溫度為45℃，分離釜2設(shè)定分離壓力為5MPa、溫度為30℃；萃取4h后，從分離釜1、2中取出萃取物45g，得率為0.9％，經(jīng)低溫干燥后，得到竹筍甾醇提取物，停機并從萃取釜中取出萃余物。
對提取物進行成分分析，結(jié)果同實施例1。比色法與GC法分析提取物的成分含量，其總甾醇含量為20±5％，β-谷甾醇含量為15±5％，β-谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇之間比例為12～16∶2～3∶3～4。
活性測試?yán)谝韵聹y試?yán)袦y試實施例1的竹筍甾醇提取物抗炎作用、抑制白血病細(xì)胞增生的作用。
實施例6竹筍甾醇提取物的抗炎作用1)對巴豆油所致小鼠耳廓腫脹的影響小鼠按體重隨機分成5組，每組12只，設(shè)置如下①空白對照組等體積生理鹽水，0.8mL/20g；②陽性對照組消炎痛10mg/kg；③高劑量組200mg/kg的竹筍甾醇提取物；④中劑量組100mg/kg的竹筍甾醇提取物，劑量；⑤低劑量組50mg/kg的竹筍甾醇提取物。動物每天ip給藥1次，連續(xù)7d(消炎痛僅給藥1次)，末次給藥后1h，小鼠右耳涂2％巴豆油0.02mL/只、致炎，4h后處死，沿耳廓剪下左右耳，以9mm環(huán)鉆沖下左右耳片，稱重，以左右耳片重量之差值作為腫脹率。
實驗結(jié)果表明，小鼠灌胃給予100mg/kg和200mg/kg劑量的竹筍甾醇提取物連續(xù)7d后，對巴豆油所致的耳廓腫脹具有顯著(p＜0.05)和極顯著(p＜0.01)的抑制作用，并呈明顯的劑量依賴關(guān)系。
表1竹筍甾醇提取物對小鼠巴豆油所致耳廓腫脹的影響(X±SD)

*p＜0.05，**p＜0.01，與對照組相比。
2)對二甲苯所致小鼠耳廓腫脹的影響小鼠按體重隨機分成5組，每組10只，設(shè)置同上1。動物每天ig給藥1次，連續(xù)7d(消炎痛僅給藥1次)，末次給藥后30min，小鼠右耳涂二甲苯0.05mL/只、致炎，15min后處死，沿耳廓剪下左右耳，以9mm環(huán)鉆沖下左右耳片，稱重，以左右耳片重量之差值作為腫脹率。并與對照組比較，判斷療效。
表3顯示，小鼠灌胃給予2mg/kg劑量的竹筍甾醇提取物連續(xù)7天后，對二甲苯所致耳廓腫脹具有顯著(p＜0.05)的抑制作用，中、低劑量時作用不明顯。
表2竹筍甾醇提取物對小鼠二甲苯所致耳廓腫脹的影響(X±SD)

*p＜0.05，**p＜0.01，與對照組相比。
實施例7竹筍甾醇提取物抑制白血病細(xì)胞生長的作用1.細(xì)胞株及培養(yǎng)條件常用的人早幼粒白血病細(xì)胞株(HL-60)，培養(yǎng)基為RPMI-1640，含20％滅活小牛血清和青霉素100u/ml、鏈霉素50μg/ml，5％二氧化碳孵箱中培養(yǎng)傳代。
2.MTT比色法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×105～2.0×105/ml，分裝于96孔板中，每孔90μl，用藥組加入10μl不同濃度的提取物，每組設(shè)3個平行孔，并設(shè)對照孔。細(xì)胞加藥后37℃、5％CO2培養(yǎng)至相應(yīng)時間，然后按10μl/孔加入5mg/ml的MTT，振蕩器振蕩1～2min，孵箱中反應(yīng)5h。接著加入20％SDS+50％DMF200μl，振蕩器振蕩5～10min，保溫2h，使結(jié)晶物充分溶解。反應(yīng)完成后，振蕩器振蕩2～3min。選擇570nm作為測定波長，450nm作為參比波長，以空白孔調(diào)零，在酶標(biāo)免疫測定儀上測定各孔的光吸收值(A)。按下式計算藥物對細(xì)胞增殖的抑制率(IR)。IR＝[1-(用藥組測定的平均A值/對照孔測定的平均A值)]×100％。
表3竹筍甾醇提取物抑制白血病細(xì)胞HL-60細(xì)胞生長(2h)的數(shù)據(jù)(X±SD)

n＝3(孔數(shù))；各組與對照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01。
結(jié)果表明，竹筍甾醇提取物有抑制白血病細(xì)胞生長的作用。
討論植物甾醇是3位為羥基的甾體化合物，以環(huán)戊烷全氫菲為主體骨架，天然植物甾醇種類繁多，主要包括β-谷甾醇、豆甾醇、菜籽甾醇和菜油甾醇四種無甲基甾醇。一般認(rèn)為，植物油及其加工產(chǎn)品是植物甾醇最豐富的天然來源，其次是谷物副產(chǎn)品和堅果。玉米油、菜籽油、米糠油、小麥胚芽油、黑麥、小麥、大麥和燕麥都含有豐富的甾醇。關(guān)于植物甾醇的應(yīng)用，迄今已發(fā)表了大量的著作，領(lǐng)域涉及醫(yī)藥、化妝品、食品、飼料、光學(xué)產(chǎn)品、油漆、顏料、樹脂、造紙、紡織、殺蟲劑及除草劑等。以植物甾醇為原料，可合成幾乎所有的甾體藥物，其在世界范圍內(nèi)是一個有著40億美元的產(chǎn)業(yè)。因此，植物甾醇的分離和純化得到了人們的高度重視。
植物油精煉副產(chǎn)物，制糖副產(chǎn)物以及造紙廢液中都具有豐富的甾醇。其中，植物油精煉副產(chǎn)物是甾醇的主要來源。從原料中提取甾醇通常分兩步進行。先從原料中提取粗甾醇，然后再進一步精制。常用方法包括溶劑結(jié)晶法、分子蒸餾法、酶法、干式皂化法和絡(luò)合法。但這些工藝均還不夠理想，或是耗費大量易燃有機溶劑，或是產(chǎn)品純度不高，或是高溫易使甾醇分解。
本發(fā)明采用超臨界CO2流體萃取技術(shù)從竹筍及其加工廢棄物中提取植物甾醇類提取物。不僅工藝操作簡便，而且得到的竹筍甾醇提取物質(zhì)量好，品質(zhì)穩(wěn)定。而且該提取物具有良好的消炎、抑制白血病細(xì)胞生長、降血脂和血膽固醇等功效，在化妝品、食品、保健品、藥品中有廣泛的應(yīng)用前景。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種竹筍甾醇提取物，其特征在于，該提取物中總甾醇含量為5-50％，并且所述的甾醇包括β-谷甾醇、豆甾醇和蕓苔甾醇。
2.如權(quán)利要求1所述的提取物，其特征在于，在總甾醇中的β-谷甾醇含量為10-40％，并且β-谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇之間比例為10～40∶1～3∶2～5。
3.如權(quán)利要求1所述的提取物，其特征在于，該提取物中總甾醇含量為20-40％，并且總甾醇中的β-谷甾醇含量為15-30％。
4.如權(quán)利要求2所述的提取物，其特征在于，β-谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇之間比例為15～30∶2～3∶3～4。
5.如權(quán)利要求1所述的提取物，其特征在于，該提取物外觀為淡黃或金黃的膏狀物，經(jīng)溴化鉀壓片后的紅外圖譜顯示該提取物在3440、2925、2850、1710、1465和720cm-1左右處有特征性吸收峰；將提取物溶于光譜純的二氯甲烷后，在190～700nm的波長范圍內(nèi)進行掃描，顯示在240nm左右處有最強吸收，在275nm左右處有次強吸收。
6.一種組合物，其特征在于，它含有0.01-99.9wt％的權(quán)利要求1所述的竹筍甾醇提取物和可接受的載體。
7.如權(quán)利要求6所述的組合物，其特征在于，所述的組合物是藥物組合物、保健品組合物、食品組合物或化妝品組合物。
8.如權(quán)利要求1所述的竹筍甾醇提取物的制備方法，其特征在于，包括步驟(a)在分離釜中，于以下條件下，對竹筍原料進行超臨界流體萃取萃取劑為CO2，萃取壓力為15～35MPa，萃取溫度為40～70℃，分離溫度為30～50℃，分離壓力為4～8MPa，循環(huán)動態(tài)萃取1～5h，(b)從分離釜中取出萃取物，從而獲得竹筍甾醇提取物。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，步驟(a)中的萃取壓力為20～30MP，萃取溫度為45～65℃，并且可使用選自下組的夾帶劑C1～C4的醇或酮類有機溶劑，其用量按照重量計算為竹筍原料量的5～15％。
10.一種權(quán)利要求1所述的竹筍甾醇提取物的用途，其特征在于，用于制備消炎的藥物、日用化妝品、或保健品，或者用于制備防治白血病的藥物或保健品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從竹筍中提取的竹筍甾醇提取物及其制法和用途。本發(fā)明竹筍甾醇提取物含有5－50％總甾醇，并且在總甾醇中的β－谷甾醇含量為10－40％，β－谷甾醇、豆甾醇、蕓苔甾醇之間比例為10～40∶1～3∶2～5。本發(fā)明的竹筍甾醇提取物具有良好的消炎、抑制白血病細(xì)胞增生等功效，可用于化妝品、食品、保健品、藥品領(lǐng)域。
文檔編號A61P29/00GK1796400SQ200410099219
公開日2006年7月5日 申請日期2004年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月29日
發(fā)明者張英, 陸柏益, 吳曉琴, 梁艷 申請人:杭州浙大力夫生物科技有限公司, 福建建甌穎食物產(chǎn)有限公司