專利名稱：：Her－2模擬抗原表位及含有該表位的肽的制作方法
技術領域：
：本發明涉及針對HER-2的主動免疫的誘導和增強，具體地，本發明涉及一種通過噬菌體展示技術分離的HER-2模擬抗原表位模擬肽及經過修飾，但仍然保持免疫原性的這種抗原表位肽的衍生物。本發明還涉及含有這種表位肽或其衍生物的疫苗。該疫苗通過誘導產生針對HER-2的體液和細胞免疫反應而用于對腫瘤的預防和治療。本發明還涉及編碼這些肽的核苷酸、核苷酸與其它分子的重組融合蛋白、含有該核苷酸的載體和細胞，以及利用這些肽、核酸、或細胞治療腫瘤的方法和藥物組合物。
背景技術：
：HER-2受體屬于表皮生長因子受體(Epidermalgrowthfactorreceptor，EGFR)家族成員。在結構上，它包括糖基化的胞外區，水化穿膜區和胞內酪氨酸激酶區[1]。目前尚未發現HER-2的配體。在以EGFR家族為起始的信號通路中，HER-2發揮了重要的調節作用。HER-2是通過與EGFR，ErbB-3，ErbB-4形成異源二聚體而發揮作用的[2]。異源二聚體可與EGF樣配體形成高親和力結合，同時激活下游多種信號通路[3]。原癌基因HER-2/c-erbB2/neu在多種惡性腫瘤中有基因擴增及過表達，特別是在乳腺癌、卵巢癌、胃腺癌、結腸癌中其表達水平升高更為明顯。HER2過表達與癌癥患者預后不良、易復發、存活率低有關[4]。近十年來，HER-2被認為是腫瘤免疫治療的理想靶點之一。這不僅是因為HER-2的過表達見于多種人類腫瘤，而且其過表達與惡性腫瘤(如乳腺癌)預后不良有關。此外，在正常成人組織HER-2表達很低，而在腫瘤原發灶和轉移灶中均有HER-2的穩定表達[5，6]。因此抗HER-2免疫治療可產生針對腫瘤的特異性療效。在被動免疫治療中，人們獲得了多種針對HER-2胞外區的單克隆抗體，一些抗體可抑制腫瘤生長。其中一株抗體——Herceptin(Trastuzumab)目前已經過臨床評估，并于1998年9月被美國FDA批準用于臨床治療[8]。Herceptin是第一個用于乳腺癌治療的生物學制劑，它可單獨用藥或與化療藥聯合應用[7，8]。由于Herceptin的價格昂貴，用藥量大，需反復多次使用，致使一般病人在經濟上難以承受。除了上述被動免疫治療，使病人產生針對HER-2的主動免疫反應也是有效的免疫治療方法。HER-2作為潛在的腫瘤疫苗具有許多優勢。首先，一些HER-2表達陽性的腫瘤病人體內有針對HER-2的免疫反應，這就提示機體可以克服針對自身蛋白的免疫耐受。其次，由于HER-2在腫瘤細胞過表達，而在正常組織低表達，使得病人產生的針對HER-2的免疫反應具有腫瘤組織特異性，而對正常組織毒性很小或沒有毒性。最后，HER-2作為一個重要的生長因子受體，病人體內產生的針對HER-2的體液免疫反應可通過多種機制誘導腫瘤細胞死亡。Pupa等人于1993年首次報道，HER-2過表達的乳腺癌患者體內存在針對HER-2的血清抗體和T細胞反應[10，11]。此外，其它報道也證明乳腺癌患者體內存在針對HER-2的內源性體液和細胞免疫反應。Disis等人研究發現在127個乳腺癌患者中，14人(11％)血清抗HER-2抗體滴度大于1∶100，而100個正常女性中無一例檢測到抗HER-2抗體。特別是其中處于乳腺癌早期的5名患者體內存在強烈的體液免疫反應，血清抗體滴度大于1∶5000[12]。血清中高滴度抗HER-2抗體的出現與早期原發癌HER-2過表達相關[12，13]。而在晚期乳腺癌患者沒有發現這種相關性，病人血清中可檢測到HER-2胞外區蛋白(ECD)[14]，但其體內的抗體檢出率明顯低于早期腫瘤患者[12]。結腸癌患者血清中也可檢測到抗HER-2抗體[13]。此外，在不同類型上皮惡性腫瘤患者體內可檢測到針對所有EGFR受體的抗體反應[74]。針對HER-2的輔助性T細胞免疫反應一般可與抗HER-2抗體一起檢測到[10]。血清中的抗HER-2抗體主要是IgG或IgA[12，13，65]，抗體從IgM到IgG或IgA的轉型反應需要T細胞的輔助作用，這一過程需要HER-2含有輔助性T細胞表位。潛在的輔助性T細胞表位一般是通過計算機程序算法(computeralgorithms)選擇的。通過合成這些表位相對應的肽并檢測它們誘導產生細胞因子或刺激外周血淋巴細胞增殖的能力來評估小肽的活性[10，16，18]。Kobayashi等人研究發現了一系列具有HLA-DR結合特性的輔助性T細胞表位。其中一個肽在體外可誘導HER-2特異的HLA-DR限制型輔助性T細胞反應。此外，小肽激活的輔助性T細胞可識別抗原遞呈細胞表面天然遞呈的HER-2蛋白[17]。在HER-2過表達的腫瘤病人體內還可檢測到HER-2反應性細胞毒T淋巴細胞(CytotoxicTLymphocytes，CTL)[19，20，21]。這些CTL細胞可在體外被分離培養，通過用自身固有的腫瘤細胞進行刺激，CTL細胞得到擴增[19，22，23]。由于誘導HER-2特異性CTL細胞需要小肽的遞呈和在細胞表面的暴露，目前已發現一些HLA種型限制性HER-2CTL小肽表位。這些肽段具有結合特定HLA種型的同源序列。這些潛在的CTL表位可激發樹突狀細胞，并進一步產生CTL細胞，這些CTL細胞可裂解HER-2轉染的永生化細胞或自身固有的腫瘤細胞[23，24，25，26]。表1詳細列出了目前已發現的HER-2CTL表位和輔助性T細胞表位。HER-2特異性CTL細胞可裂解自身固有的腫瘤細胞，這一作用提示多種HER-2來源的表位可通過天然遞呈作用暴露在細胞表面。實際上，通過用酸性洗脫液洗滌腫瘤細胞，可得到腫瘤細胞表面HLA-I類分子上暴露的HER-2抗原肽[20，27]。一些腫瘤，如乳腺癌[20]、卵巢癌[20，24]、非小細胞肺癌[27]、胰腺癌[75]、腎細胞癌[23，26]和結腸癌[23]，都可檢測到HER-2CTL表位表達。此外，一些完全不同類型的上皮性腫瘤擁有相同的HER-2CTL表位[20，23]。總之，這些研究提示HER-2不僅可被呈遞在腫瘤細胞表面，還可引起腫瘤患者的體液和細胞免疫反應。在發現病人體內免疫反應的同時，人們提出了一個重要問題這種免疫反應是否具有抗腫瘤作用？一些研究提示病人體內的免疫反應是有益的。針對1000例以上乳腺癌患者的研究發現，在原發癌有淋巴漿細胞浸潤(LymphoplasmacyticInfiltration，LPI)的I期病人，HER-2過表達提示有較好的預后[28]。最近的研究發現，同是淋巴結未受腫瘤侵襲的病人，如果沒有LPI反應，HER-2過表達提示預后不良；而具有LPI的病人則預后較好[29]。在原發乳腺癌腫瘤內部可檢測到T細胞，但并沒有檢測到HER-2過表達，這是因為在HLA-A2陽性的乳腺癌患者，宿主的免疫反應可去除HER-2過表達的腫瘤細胞，因此HER-2檢測呈陰性反應[30，31]。這些發現均提示在腫瘤發生早期，免疫反應可延緩腫瘤發展進程。表1HER-2的輔助性T細胞(helperTcell)表位和細胞毒T細胞(cytotoxicTcell)表位數字代表HER-2蛋白的氨基酸所在位置；N/A代表未進行評估。然而，目前的研究結果只反應了小部分病人的免疫反應情況。自身固有的T細胞和特異性抗體反應是否真正有益，還需要大量流行病學研究和長時間的隨訪來驗證。病人體內抗HER-2免疫反應的存在提示疫苗可誘導并增強針對HER-2的免疫反應。近幾年，許多動物模型均證實疫苗可引起針對HER-2的免疫反應。應用于動物體內的抗HER-2疫苗被證明具有免疫原性，而且是安全有效的。腫瘤疫苗的主要目的是引起針對腫瘤抗原的特異性免疫反應，這種免疫反應可避免腫瘤發生，并建立長期的免疫記憶。設計疫苗和免疫方式時應考慮免疫原的應用形式。由于HER-2是自身蛋白，因此對于抗HER-2疫苗還應考慮耐受性和自體免疫毒性。應用轉基因鼠可評估疫苗針對HER-2的免疫耐受性。目前已建立兩種neu轉基因鼠，一種是基因組中導入由鼠源性乳腺腫瘤病毒(Murinemammarytumourvirus，MMTV)3’長末端重復啟動子調控的野生型鼠neucDNA[32]。由于鼠neu的過表達，雌性鼠出現自發性原位乳腺癌。這些腫瘤在組織學上與人乳腺癌相似，因此轉基因鼠為評估疫苗能否克服免疫耐受提供了一個良好的模型。另一種轉基因鼠基因組中導入具有一個點突變的活化形式的neu[32，33]，由于neu原癌基因活化導致小鼠發生自發性乳腺癌。對于這兩種轉基因鼠，可通過檢測動物是否自發腫瘤來評估疫苗的效果。Bernards等人首先報道，給小鼠注射表達突變的大鼠neu蛋白的成神經細胞瘤細胞系，小鼠不再發生腫瘤。這一研究應用了表達大鼠neu胞外區的牛痘病毒重組體作為疫苗。然而，同樣的方法應用于大鼠，注射大鼠腫瘤細胞系后，大鼠仍可發生腫瘤，這說明大鼠對自身neu蛋白產生了耐受性[34]。與此相同，Disis等人也報道應用完整的neu蛋白不能引起鼠的抗neu免疫反應[15]。為了克服免疫耐受性，有人應用與大鼠neu高度同源的重組人HER-2胞外區免疫大鼠，并推論這種免疫方法將引起針對大鼠neu的交叉免疫反應，從而使動物注射腫瘤細胞后不再發生腫瘤。結果大鼠產生了針對HER-2和大鼠neu的交叉免疫反應。然而，誘導產生的交叉免疫反應非常微弱，皮下注射neu轉染的大鼠腫瘤細胞后大鼠仍可發生腫瘤[35]。最近，應用轉基因動物得到了一些可喜的結果。Esserman等人報道應用neu胞外區蛋白進行免疫可誘導動物產生針對自身蛋白的免疫反應[36]。此研究應用了過表達野生型大鼠neu基因的N202轉基因鼠系。用neu胞外區免疫轉基因鼠可產生抗neu體液和細胞免疫反應，經免疫的轉基因鼠有50％沒有發生腫瘤[36]。Reilly等人也報道，應用相似的轉基因鼠模型，盡管小鼠對轉基因產生了明顯的耐受性，小鼠在免疫前產生的neu特異性免疫反應類似于乳腺癌病人體內觀察到的免疫反應。更重要的是應用經放射線照射的完整細胞和重組的牛痘病毒作為neu特異性疫苗可加強轉基因鼠針對neu的特異性體液和細胞免疫，注射neu表達的腫瘤細胞后轉基因鼠不再發生腫瘤，同時自發腫瘤形成延遲[37]。在另一個研究中，具有活化大鼠neu基因的轉基因鼠模型應用異源細胞疫苗，盡管轉基因鼠可產生neu特異的抗腫瘤反應，而且沒有產生自發腫瘤或形成移植瘤，但應用疫苗對已形成的自發性腫瘤沒有影響[38]。總之，盡管機體具有對HER-2的耐受性，但同時通過免疫，誘導并加強HER-2特異性免疫反應也具有可行性。免疫耐受是否可被克服并不明確，但在特定的轉基因鼠免疫耐受并不完全存在。此外，應用HER-2或細胞疫苗的主要困難是疫苗的生產和保存，疫苗污染的可能性較大，這將阻礙此類疫苗的臨床應用。合成肽的應用為疫苗策略提供了新的前景。合成肽作為疫苗有多種優勢肽非常簡單、合成過程經濟并可誘導特異的免疫反應。此外，研究提示合成肽可避免耐受性的發生[15]。目前，多種肽疫苗正處于評估階段。肽抗原在體內的運輸方式對其免疫原性有很大影響。目前應用的方法有肽疫苗與免疫佐劑合用[39]，構建多聚糖-肽復合物或將肽直接附著在脾細胞或樹突狀細胞表面[40]。Gu等人構建了疏水多聚糖/原癌蛋白復合物疫苗，使機體更容易運輸147個氨基酸長的HER-2蛋白片斷，這一肽段包括針對MHCI類分子途徑的一個或多個T細胞表位[72]。目前已發現的可被輔助性T細胞或CTL細胞識別的肽表位是設計抗HER-2疫苗的主要依據。Disis等人研究發現，盡管整個的大鼠neu蛋白不具免疫原性，但應用來源于大鼠neu蛋白的多種輔助性T細胞表位肽免疫大鼠可引發強烈的體液和輔助性T細胞反應[15]。最近，研究發現應用多種人HER-2蛋白輔助性T細胞表位肽，乳腺癌和卵巢癌患者可產生針對肽和HER-2特異的輔助性T細胞反應[76]。多種腫瘤可能具有相同的CTL表位，因此以CTL表位為基礎的肽疫苗可應用于更廣泛的人群。Nagata等人研究發現，應用CTL表位肽疫苗可成功誘導CTL反應，從而抑制小鼠腫瘤形成，但不引起任何自身免疫毒性[40]。進一步研究提示相同的肽，如p63或p780可使腫瘤患者或正常人的外周血淋巴細胞(PBMC)在體外致敏[41，73]。誘導產生的HER-2特異性HLA-A24限制性CTL反應可裂解HER-2過表達的腫瘤細胞。目前肽p63已被用于臨床實驗[73]。Dakappagari等人研究發現應用B細胞表位也可引起腫瘤抑制性免疫反應。應用位于HER-2胞外區最接近穿膜區的肽段足以誘導產生腫瘤抑制性抗體反應[9，77]。Herceptin作用表位也位于近膜區[23]，由此推測這一區域可有效增強保護性免疫反應。DNA疫苗包括直接接種表達質粒。注射的DNA一但被細胞吸收，可穿過核膜并作為非復制游離基因分子長期存在，從而導致外源蛋白較長時間的表達。因此，DNA疫苗對于誘導針對表達抗原的長期免疫反應具有潛在優勢[78]。一些研究小組應用這一方法成功誘導了抗HER-2免疫反應[42，43，44]。Concetti等首先報道，將大鼠neu全長DNA注射至小鼠體內可產生抗鼠neu自身抗體[45]。neu轉基因荷瘤小鼠應用neuDNA疫苗可阻止乳腺腫瘤生長，并降低轉移能力[42]。在另一研究中，轉基因鼠應用編碼大鼠neu穿膜區和胞外區質粒的DNA疫苗可引起抗neu抗體反應，盡管只是部分抑制腫瘤細胞成瘤，但腫瘤進程得到明顯控制[46]。然而，DNA疫苗的效應也受到一定限制[42]。研究發現DNA疫苗不能突破CTL耐受性[77]。此外，DNA疫苗是否具有突變整合的可能性，以及應用質粒DNA后對腫瘤發展是否會產生影響，這些均缺乏系統的評估[47]。近些年來，人們應用復雜的動物模型對HER-2疫苗進行體內免疫學評估。研究結果提示誘導抗HER-2免疫反應是可能而且有效的。盡管Disis等人，及其它一些研究小組發現用完整的HER-2蛋白或胞外區進行免疫可導致免疫耐受的出現[15，34]，但應用與臨床條件非常接近的轉基因鼠模型進行研究發現應用較大的HER-2分子可克服免疫耐受性[36，37，38]。實際上，具有內源性抗HER-2免疫的腫瘤病人已經克服或部分克服了針對HER-2的耐受性[10，62]。有效的抗HER-2免疫包括針對一系列自身表位的內源性天然免疫反應的活化。Cefai等人進一步研究提示抗HER-2疫苗可誘導產生針對自發HER-2表達腫瘤的特異性免疫反應。顯然，如果抗HER-2免疫反應已經產生，應對潛在的自身免疫毒性進行評估。HER-2在正常組織的低表達使得免疫反應只針對腫瘤細胞而不會產生自身免疫毒性。截止目前，所有的研究均提示機體產生的neu特異性免疫在動物不會引起自身免疫反應[15，40，42，45]。然而，由于HER-2在胎兒組織廣泛表達，因此對胎兒是否有毒性需進行評估[48]。動物實驗結果表明，疫苗足以引起動物產生抑制移植瘤或自發性腫瘤形成的能力[37，38]，并延緩增生性病變的進程[42，46]。而對于機體已經形成的腫瘤，疫苗不能發揮以上作用[46]。這就提示已經形成的腫瘤有著特殊的性質，它們可逃避免疫監控。免疫逃逸機制可通過腫瘤的微環境進行調節[49，50]。此外，HLA-I類分子在許多乳腺癌[51]和其它腫瘤[52，53]的表達下調可能限制了依賴CTL反應的疫苗發揮作用[37，54，55]。實驗證明，針對腫瘤細胞HER2/neu的治療可有效逆轉HER-2/neu過度表達引起的腫瘤惡性表型。HER-2人源化抗體Herceptin已被美國FDA批準用于治療HER-2過度表達的轉移性乳腺癌，并獲得較好的臨床效果。Herceptin目前已在國內臨床試用，但其價格相當昂貴，絕大部分病人在經濟上難以承受。雖然通過被動免疫方法應用腫瘤抑制性抗體有較好的臨床療效，但同時也存在一些問題，如產生抗同型抗體(idiotypicantibody)，組織分配不足，用藥量大，價格昂貴等，這些均限制了被動免疫治療。與此相比，應用疫苗誘導機體產生內源性腫瘤抑制性抗體，并刺激免疫記憶，這種方法可能更容易使病人產生長期有效的作用，而且更為經濟。
發明內容發明人利用已上市的Herceptin抗體，通過篩選噬菌體12肽庫得到能與Herceptin特異性結合的小肽。噬菌體展示技術是近年發展起來的一種技術，它在抗原表位分析、蛋白質分子結合特性研究及先導化合物的發現等領域有廣泛的應用前景，利用噬菌體展示技術獲得活性肽也是近年用于肽藥開發的常用方法[7]。噬菌體肽庫技術是研究大分子相互作用的理想工具。人們可以在對結構-功能關系缺乏了解的情況下，利用噬菌體肽庫技術，篩選可以同受體、酶、DNA結合蛋白、細胞因子、抗體等結合的多肽或蛋白質，用于研究天然蛋白質的結合特性，鑒定具有高親和力與特異性的酶作用底物，定位抗體結合表位等。其中利用抗HER-2抗體N21從HER-2基因片斷噬菌體庫分離到的55個氨基酸的肽段EP531可誘導小鼠產生針對HER-2的主動免疫反應，且產生的抗體可有效抑制腫瘤細胞增殖[60]。本研究利用已上市的Herceptin抗體，通過篩選噬菌體12肽庫得到能與Herceptin特異性結合的小肽。由于常規的靶蛋白包被過程中，蛋白質通過疏水作用吸附在塑料表面，這種吸附可以導致蛋白質的部分變性[71，58，59]；而且固相吸附可能篩選到一系列富含酪氨酸與色氨酸的短肽，它們可與塑料結合，并且不能被BSA封閉阻斷[79]。因此在篩選過程中發明人應用了ProteinA-Sepharose4B珠子對抗體吸附后進行液相Bio-panning過程，比較以往的固相吸附過程，這種方法大大增強了噬菌體展示小肽與抗體的接觸機會，從而能有效篩選到陽性克隆。同時為減少Bio-panning過程中的非特異吸附，增加篩選陽性率，發明人用正常人血清IgG對原始噬菌體肽庫進行了預吸附，以達到去除部分非特異性結合噬菌體的目的。此外，為了避免常規洗脫步驟不能將與目的蛋白結合親和力的噬菌體洗脫下來，發明人省略了洗脫步驟，而是將ProteinA-Sepharose4B、Herceptin與噬菌體三者混合物一并加入大腸桿菌中進行擴增。通過對Bio-panning技術路線的改進，篩選陽性率由一般固相吸附的2-8％[60]，達到13.7％。通過對Herceptin的篩選發明人僅得到兩種小肽序列，其中一種經原核表達后不與Herceptin結合。得到的陽性序列單一可能與文庫傾向性有關。目前文庫傾向性產生的原因尚未完全闡明，但是在同一文庫中某些重組后噬菌體感染能力增強或降低的情況確實存在。例如Burritt等人發現蛋白的展示少于預計值[61]，Blond-Elguindi的研究表明文庫中含有Gly的克隆易于被選擇，而含有Cys的克隆不易被選擇[62]。發明人通過篩選噬菌體12肽庫得到能與Herceptin特異性結合的小肽H98，該肽具有以下序列LLGPYELWELSH發明人篩選到的小肽H98含一個Gly，而沒有Cys參與。Kay等的研究發現外源性短肽中含有單數半胱氨酸的克隆難以被擴增。原因在于這一半胱氨酸可能與pIII的8個天然的半胱氨酸中的任意一個形成二硫鍵，從而影響噬菌體的感染能力[63]。目前，噬菌體展示肽庫技術被廣泛地應用于鑒定抗體結合表位的研究中。抗體的結合表位即抗原決定簇大體上可以分為連續性表位與非連續性表位兩種。連續性表位又稱為線性表位或序列性表位。這類表位一般由在一級結構上連續排列的數個氨基酸構成。針對這種表位的抗體可以識別變性蛋白或天然抗原的連續性表位。非連續性表位又稱為構象性表位，可以由在一級結構上相距較遠，但經過一系列折疊后相互靠近的氨基酸殘基構成，這類表位一般是由多個氨基酸分子構成的裂隙或溝、槽等空間結構。從噬菌體展示文庫中一般無法篩選到真正同天然表位一致或同源的非連續性表位，而只能篩選到可以模擬原有天然表位結合特性的所謂的“mimotope”[64]。發明人將篩選獲得的陽性噬菌體克隆H98進行測序及Blast比較，結果表明H98小肽與HER-2無明顯序列同源性，因此小肽模擬的是HER-2的天然構象“mimotope”，即三級結構，而不是HER-2的某一段氨基酸序列。發明人根據文獻報道[80]和PDB數據庫中獲得的Herceptin與HER-2相互作用的三維結構1N8Z，并利用InsightII軟件包中的Homology模塊構建了H98小肽與Herceptina相互作用的三維結構。由模擬的H98與Herceptin的活性部位的相互作用情況也可以看出H98與Herceptin的活性部位中的重要殘基具有靜電相互作用，氫鍵作用，(-(共軛相互作用。根據文獻報道，Herceptin針對的HER-2抗原決定簇是由分散在不同區域的三個環狀結構經在空間折疊組成的，而并非是肽鏈上的一段連續肽。小肽H98可模擬其中2個環狀結構的重要氨基酸HER-2560D和HER-2573F、HER-2572P。如果將H981L突變為Q，即第3個環狀結構中與Herceptin形成氫鍵相互作用的HER-2602Q，可使H981Q與HerceptinA30N形成氫鍵相互作用。通過這種突變可能會加強H98小肽與Herceptin的親和力。進一步地，發明人通過基因技術，將上述小肽進行突變得到一系列的衍生物。各衍生物的結構如下發明人將突變的小肽進行與GST的融合表達，ELISA結果提示突變體C10，MutN1-2，MutN1和CyclicH98具有與Herceptin的親和力。其中，MutN1將H981L突變為Q，可加強H98小肽與Herceptin的親和力。此外，發明人對H98的截斷體與GST融合形式的分段表達，結果提示羧基末端的2個氨基酸和氨基端的第3、4位氨基酸在小肽與Herceptin的結合中發揮重要作用，去除這幾個氨基酸的小肽片段與Herceptin均不結合。這與軟件分析的小肽H98可與Herceptin形成靜電相互作用，氫鍵作用，(-(共軛相互作用的氨基酸并不完全一致。本發明的一個方面是作為HER-2模擬抗原表位的肽，它以正向或反向連續地或間隔地包含多個或只包含一個以下通式(I)所示的氨基酸序列的肽X9X1X2GPX3X4X5X6X7X8SHX10，(I)其中，X1可以存在或不存在，為天然的氨基酸殘基，X2可以存在或不存在，為疏水性氨基酸殘基。X3為極性氨基酸，X4為極性氨基酸，X5為疏水性氨基酸，X6為極性氨基酸X7為極性氨基酸，可以與X4相同或不同，X8為疏水性氨基酸，可以與X5相同或不同，其中，X9和X10為天然氨基酸，可以存在或不存在，式(I)的肽可以是線形的或環化的。優選地，其中，X1可以存在或不存在，為L，I，V，M，A，F，G，Q或N，X2可以存在或不存在，為L，I，V，M，A或F，GX3為Y，W，F，T或SX4為E或D，X5為L，I，V，M，A或FX6為W，Y或F，X7為E或D，可以與X4相同或不同，X8為L，I，V，M，A或F，可以與X5相同或不同，X9和X10可以存在或不存在，為C或S。更優選地，其中，X1可以存在或不存在，為L，G或Q，X2可以存在或不存在，為L或A，X3為Y，X4為E，X5為L，X6為W，X7為E，X8為L，X9和X10可以存在或不存在為C。其中，幾個在實施例中驗證的式I的氨基酸序列是H98LLGPYELWELSHC10GPYELWELSHMutN1-2GAGPYELWELSHMutN1QLGPYELWELSH或CyclicH98CLLGPYELWELSHC。通常，含有1-10個氨基酸的氨基酸序列稱作寡肽，多于10個氨基酸，但分子量在1萬道爾頓以下的氨基酸序列稱為多肽，而分子量在1萬道爾頓以上的氨基酸序列稱為蛋白質。而寡肽和較短的多肽經常稱為小肽。為敘述方便，在本文中，寡肽，小肽，多肽和蛋白統稱為肽。本發明所述天然氨基酸包括極性氨基酸絲氨酸(Ser)、蘇氨酸(Thr)、半胱氨酸(Cys)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、賴氨酸(Lys)、精氨酸(Arg)和組胺酸(His)；疏水性氨基酸甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、纈氨酸(Val)、亮氨酸(Leu)、異亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Try)和甲硫氨酸(Met)。本領域技術人員會認識到，上述的肽的保守性替換的突變體完全具有其能與Herceptin特異性結合的生物學活性。所謂的保守性替換，是指用相似的物理化學性質的氨基酸替換現有的氨基酸。優選的，每個氨基酸可以用最相近似的氨基酸替換，如下表所述本發明的一個重要方面是包含上述本發明的擬表位肽的肽，該肽因為擬表位肽的遞呈而得以與Herceptin特異性結合，誘導針對HER-2的體液和細胞免疫，因此可用于腫瘤治療，其中，本發明的擬表位肽在肽中以正向或反向連續地或間隔地出現多次或只出現一次。本發明的肽可以按本領域技術人員已知的常規固相合成方法合成。例如本發明肽可以按StewardandYoung(65)描述的方法用AppliedBiosystem合成儀或PioneerTM肽合成儀按固相化學技術合成。也可以先合成多個片段，然后連在一起形成更大的片段。對于固相肽合成可參見(66)中可以找到許多技術的介紹。一般，這些方法包括向生長的肽鏈上依次添加一個或多個氨基酸或適當保護的氨基酸。一般，第一個氨基酸的氨基或羧基用適當的保護基保護，然后將保護的氨基酸連在惰性固相載體上，隨后在適于形成酰胺鍵的條件下加入相應氨基或羧基被適當保護的序列中的下一個氨基酸。然后從新加入的氨基酸殘基上除去保護基，再加入必要時適當保護的下一個氨基酸，如此重復操作。當所有氨基酸以正確的順序連接后，相繼或同時除去任何剩余的保護基和固相支持物，得到最終的多肽。通過簡單修改此一般程序，可以一次向生長鏈添加一個以上的氨基酸。本發明的肽還可以用含有本發明肽或融合蛋白編碼序列的多核苷酸在適當宿主中表達，然后純化所表達的肽產物來獲得。編碼本發明小肽的核苷酸序列正、反義鏈可以按本領域熟知的固相亞磷酸酰胺三酯法在DNA合成儀上合成。將合成得到的互補的正、反義鏈在適當緩沖液中退火得到編碼本發明小肽的寡核苷酸。在該合成過程中，可以在寡核苷酸兩側引入用于克隆的粘性末端序列。然后，可以將編碼本發明小肽的寡核苷酸與用相應限制性核酸內切酶消化的含另一多肽或蛋白編碼序列的適當載體用T4連接酶連接，得到編碼融合蛋白的DNA序列。所述另一多肽或蛋白的編碼序列一般是已知的，有些可以以載體形式購買得到，或者可以按常規方法合成或從已知生物體中克隆得到。如上所述得到的本發明的基因，或者各種DNA片段的核苷酸序列的測定可用常規方法如雙脫氧鏈終止法(67)。這類核苷酸序列測定也可用商業測序試劑盒等。當然，在表達載體中應含有適當的啟動子、核糖體結合位點、終止子等。為了表達產物在細胞腔室中的定位，在多肽編碼序列上游可加入適當的前導序列。合適載體和啟動子的選擇為本領域普通技術人員周知。細菌適用的有效表達載體可以這樣來構建將編碼目的蛋白的結構DNA序列隨同適當的翻譯起始和終止信號被插入到帶有一個功能啟動子的可操縱的閱讀框中。本領域普通技術人員周知用于構建含有本發明核苷酸序列以及合適的轉錄及翻譯調控元件之載體的方法。本領域技術人員知曉，根據本發明DNA序列所插入的表達載體或構建體的種類和特性選擇合適的宿主以表達目的蛋白質。適于表達本發明的多肽的宿主包括但不限于原核宿主，諸如大腸桿菌、芽孢桿菌屬、鏈霉菌屬等；真核宿主，諸如酵母屬、曲霉屬、昆蟲細胞，諸如果蠅S2和草地夜蛾Sf9；動物細胞，如CHO、COS(猴腎成纖維細胞系)，及其它的能表達相容載體的細胞系。將構建體導入上述宿主細胞的方法為本領域技術人員周知，包括但不限于氯化鈣介導的轉化、磷酸鈣轉染、DEAE-葡聚糖介導的轉染、電穿孔、顯微注射、粒子轟擊法或基因槍方法(68，68，69)。在適當的培養條件與培養基中培養經轉化的宿主菌株或細胞，使其生長到恰當的細胞密度之后，用適當的方法(例如溫度轉變或化學藥品誘導)誘導所選擇的啟動子，并將細胞再培養一段時間。針對不同的宿主菌株或細胞選擇以及所表達的目的蛋白質的性質相應的培養條件和培養基在本領域技術人員知識范圍之內。所表達的多肽或融合蛋白按常規方法從培養物中分離和純化，如離心、沉淀、各種色譜、HPLC等。本發明的肽有可能誘導產生比自身HER-2更強的體液和細胞免疫反應，這種具有Herceptin特異性結合小肽與HER-2具有相似的抗原表位，作為HER-2抗原模擬表位誘導免疫反應。本發明的肽可用于治療例如下列器官的原發或轉移的實體腫瘤和癌乳腺、結腸、直腸、肺、口咽、喉咽、食管、胃、胰腺、肝、膽囊、膽管、小腸、腎、膀胱、泌尿道上皮宮頸、子宮、卵巢、絨毛膜癌和妊辰營養層病男性生殖道、包括前列腺、精囊和睪丸、甲狀腺、腎上腺和垂體血管生成性瘤、黑素瘤、從骨或軟組織發生的肉瘤和卡波濟肉瘤；腦、神經、眼和腦膜的腫瘤，包括星形細胞瘤、膠質細胞瘤、成膠質細胞瘤、成視網膜細胞瘤、神經瘤、成神經細胞瘤、神經鞘瘤和神經膜瘤；從造血惡性疾病如白血病發生的實體腫瘤，包括綠色瘤、漿細胞瘤、和皮膚性T-細胞瘤/白血病；淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。本發明的肽還可用于防止上述腫瘤的轉移。本發明的肽用作藥物組合物，特別是用作疫苗時，與本領域常用的增強免疫的細胞因子或蛋白、其它腫瘤常用疫苗或常用的載體相混合或形成重組蛋白。其中的細胞因子是白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-12(IL-12)、集落刺激因子(GM-CSF)、CCL2、CCL5、CCL7、CCL19、CCL21、CCL20、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL15、XCL1、FTL3L、CD40L等，其中的蛋白是熱休克蛋白等，其中的腫瘤常用疫苗主要指的是癌基因、突變的抑癌基因、腫瘤相關抗原，其中的載體是鑰匙孔戚血藍蛋白，血清白蛋白，滅活的細菌毒素等。其中的癌基因如CEA等、突變的抑癌基因如p53等、腫瘤相關抗原如黑色素瘤相關抗原等，其中的血清白蛋白可以是牛血清白蛋白或人血清白蛋白等，細菌毒素是破傷風、白喉毒素或結核菌素等。本發明的肽用于免疫接種時，與本領域常用的載體相混合。可用于本發明的載體例如但不限于鑰匙孔戚血藍蛋白(KLH)，血清清蛋白如牛血清白蛋白(BSA)，滅活的細菌毒素如破傷風(TT)或白喉毒素(DT)或結核菌素(PPD)，也可以細胞因子或其它腫瘤抗原作為載體蛋白，發揮多功能疫苗作用。本發明的肽用于免疫接種時，與本領域常用的佐劑相混合，其中的佐劑包括但不限于弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑鋁或鈣的氫氧化物或磷酸鹽。本發明的免疫原可以包含前述的肽，即本發明的免疫原是以包含本發明的擬表位或其衍生物的肽或與其它分子的重組蛋白。本發明還包括基因治療，即通過將編碼本發明多肽或多肽融合蛋白的基因轉移到患者體內，以在體內表達本發明的多肽或多肽融合蛋白，從而產生治療效果。本領域中已知各種各樣的將DNA轉移或傳遞到細胞來表達基因產物蛋白質的方法，例如《體內哺乳動物體細胞中的基因轉移》(70)中所述。基因治療包括將DNA序列摻入體細胞或者生殖細胞用于離體或體內治療。本發明還包括基因治療，即通過將編碼本發明肽的核苷酸轉移到患者的細胞中，以在體內表達本發明的多肽，從而產生治療效果。，該核苷酸可以獨立存在，也可以與編碼本領域常用的增強免疫的細胞因子或蛋白、其它腫瘤常用疫苗或常用的載體的基因相混合或形成重組核酸分子。其中的細胞因子是白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-12(IL-12)、集落刺激因子(GM-CSF)、CCL2、CCL5、CCL7、CCL19、CCL21、CCL20、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL15、XCL1、FTL3L、CD40L等，其中的蛋白是熱休克蛋白等，其中的腫瘤常用疫苗主要指的是癌基因、突變的抑癌基因、腫瘤相關抗原，其中的載體是鑰匙孔戚血藍蛋白，血清白蛋白，滅活的細菌毒素等。其中的癌基因如CEA等、突變的抑癌基因如p53等、腫瘤相關抗原如黑色素瘤相關抗原等，其中的血清白蛋白可以是牛血清白蛋白或人血清白蛋白等，細菌毒素是破傷風、白喉毒素或結核菌素等。本領域中已知各種各樣的將DNA轉移或傳遞到細胞來表達基因產物蛋白質的方法，例如《體內哺乳動物體細胞中的基因轉移》(70)中所述。基因治療包括將DNA序列摻入體細胞或者生殖細胞用于離體或體內治療。基因治療的基因轉移方法分成三大類(1)物理的(例如電穿孔，直接基因轉移和粒子轟擊)，(2)化學的(例如基于脂質的載體和其它非病毒載體)和(3)生物的(例如病毒載體)。例如，像包被有DNA的脂質體這樣的非病毒載體可以靜脈注射入患者體內。載體或者“裸露”DNA的基因也可以直接注入期望的器官、組織或者腫瘤來靶向轉移治療性DNA。基本轉移基因的方法包括離體基因轉移、體內基因轉移和體外基因轉移。在患者體內時把DNA導入到患者的細胞內。因此，本發明進一步涉及含有本發明多核苷酸的質粒或病毒載體，以及含有本發明多核苷酸或載體的細胞。因此，本發明涉及作為基因治療藥物的本發明多肽的多核苷酸、載體或細胞。相應地，本發明涉及一種治療癌癥的藥物組合物，其含有本發明的核苷酸、核苷酸編碼的多肽及多肽與其它分子重組的融合蛋白、載體或細胞，和必要時藥物可接受、特別是基因治療適用的賦形劑。最后，本發明涉及治療癌癥的方法，包括給予需此治療的患者治療有效數量的本發明所定義的多肽、多肽融合蛋白、核苷酸、載體或細胞。以下實施例用于說明本發明，而對本發明范圍沒有任何限制意義。圖1Herceptin結合GST融合蛋白或GST的Westernblot分析。圖2蛋白或小肽對Herceptin結合HER-2的抑制作用。圖3HER-2或小肽H98抑制Herceptin與GST-H98的結合。圖4小肽對Herceptin抑制細胞增殖的影響。圖5經GST-H98或GST免疫后小鼠的體液免疫反應。圖6免疫沉淀-Westernblot檢測免疫血清中的HER-2抗體。N.正常鼠血清1∶100稀釋；1-5.經GST-H98免疫的不同小鼠血清1∶100稀釋；6.經GST免疫的小鼠血清1∶100稀釋。由圖可知2號GST-H98免疫鼠血清可與變性的HER-2蛋白反應。圖7Tcell增殖實驗。圖8應用InsightII(2000)的結構分析，其中，A.Herceptin與HER-2結合的三維結構。B.Herceptin與小肽H98結合的三維結構。圖9重組質粒pGEX-4T1-X酶切鑒定圖。M.marker；1為pGEX-4T1-H98經EcoRV/HindIII雙酶切；2-10，分別為pGEX-4T1-N10，N8，N6，C10，C8，C6，M8，M6，MutN1經EcoRV單酶切；11為pGEX-4T1經EcoRV/HindIII雙酶切。由圖可知重組pGEX-4T1-X小肽載體經酶切后均可釋放1700bp的片段，而pGEX-4T1原始載體酶切后沒有片段釋放。圖10融合蛋白GST-X在大腸桿菌BL21中表達的SDS-PAGE分析。M，marker；圖中單數泳道均為轉染質粒后未經誘導的菌體總蛋白，偶數泳道均為經IPTG誘導的菌體總蛋白。依次兩兩一對，1與2(GST)，3與4(GST-H98)，5與6(GST-N10)，7與8(GST-N8)，9與10(GST-N6)，11與12(GST-C10)，13與14(GST-C8)，15與16(GST-C6)，17與18(GST-M8)，19與20(GST-M6)，21與22(GST-MutN1)。由圖中可知，目的蛋白均有較高水平表達。圖11SDS-PAGE分析純化的融合蛋白GST-X，其中，M，marker；1，GST；2，GST-H98；3，GST-N10；4，GST-N8；5，GST-N6；6，GST-C10；7，GST-C8；8，GST-C6；9，GST-M8；10，GST-M6；11，GST-MutN1。圖12ELISA檢測Herceptin與GST-X的結合。其中，1，GST；2，GST-H98；3，GST-N10；4，GST-N8；5，GST-N6；6，GST-C10；7，GST-C8；8，GST-C6；9，GST-M8；10，GST-M6；11，GST-MutN3-4；12，GST-MutC1-2；13，GST-MutN1-2；14，GST-MutN1；15，GST-CyclicH98.圖13Westernblot檢測Herceptin與GST-X的結合。其中，1，GST；2，GST-H98；3，GST-N10；4，GST-N8；5，GST-N6；6，GST-C10；7，GST-C8；8，GST-C6；9，GST-M8；10，GST-M6；11，GST-MutN3-4；12，GST-MutC1-2；13，GST-MutN1-2；14，GST-MutN1；15，GST-CyclicH98.以下實施例僅為更好地說明本發明，而非限制本發明。具體實施例方式一、實驗材料(一)表達載體，菌株及分子克隆試劑谷胱甘肽巰基轉移酶原核表達載體pGEX-4T1、大腸桿菌菌株BL21均由北京市腫瘤防治研究所生化室保存。分子克隆所用的各種限制性內切酶，T4DNA連接酶為NewEnglandBiolabs公司產品。(二)抗體、實驗動物及相關材料HRP-羊抗人IgG抗體(1∶2500)購于中山公司。辣根過氧化物酶標記小鼠抗M13噬菌體單克隆抗體(1∶5000)為AmershamBiosciences公司產品。實驗用動物昆明鼠購自中國醫學科學院實驗動物中心，由北京大學臨床腫瘤學院動物室飼養。(三)噬菌體展示隨機12肽庫及其操作試劑1.噬菌體展示隨機12肽庫噬菌體展示12肽隨機短肽庫試劑盒為NewEnglandBiolabs公司產品，包括12-mer噬菌體展示文庫100μl(1.5×1013pfu/ml)，保存在50％甘油-TBS，多樣性為2.7×109。M13噬菌體宿主ER2738為F因子陽性大腸桿菌，購自NewEnglandBiolabs公司。-28gIII測序引物5’gtatgggatttgctaaacaac3’-96gIII測序引物5’ccctcatagttagcggaacg3’2.噬菌體操作試劑(1)(1)(1)LB液體培養基細菌用胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，高壓滅菌后室溫保存。(2)(2)(2)四環素用無水乙醇配成20mg/ml的儲存液，分裝后，-20℃儲存。(3)LB(Tet+)固體培養平板每升上述LB培養基內加入15g瓊脂，高壓滅菌，待溫度降至70(C以下，加入1ml四環素儲液(20mg/ml)，4℃避光保存。(4)IPTG/Xgal25ml二甲基甲酰胺中加入1.25gIPTG與1gXgal，-20℃避光保存。(5)LB(Tet+)/IPTG/Xgal平板將30ulIPTG/Xgal加入300ulLB培養液中，混勻后加至LB(Tet+)固體培養平板，用玻璃棒涂勻，吹干后4℃避光保存。(6)頂層瓊脂(AgaroseTop)1000ml細菌用胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl5g，MgCl2(6H2O1g，agarose7g。(7)TBS溶液50mmol/LTris-HClpH7.5，150mmol/LNaCl。高壓滅菌后，保存于4(C。(8)PEG/NaCl20％(w/v)PEG8000，2.5mol/LNaCl。高壓滅菌后保存于室溫。(9)NaIBuffer10mmol/LTris-HClpH8.0，1mmol/LEDTA，4mol/LNaI。(四)大腸桿菌表達蛋白質純化用試劑1.細菌裂解液含1mmol/LPMSF，1mg/mLLysozyme的PBS溶液。2.Glutathione-Sepharose4B親和層析洗脫緩沖液15mmol/LGSH(還原型谷胱苷肽)，50mmol/LTris-HCl(pH8.0)，120mmol/LNaCl。二.實施例實施例1(一)Herceptin對噬菌體展示12肽庫的篩選1.ER2738菌株的保存與復蘇ER2738菌液保存加入50％甘油，保存于-70℃冰箱。復蘇時菌種接種于LB(Tet+)瓊脂平板，37℃孵箱培養10h后保存于4℃冰箱。保存時間不宜超過3周。2.12-mer噬菌體展示短肽庫滴度及重組率的測定挑取新復蘇的ER2738單個菌落，接種于2mlLB(Tet+)，擴增至對數中期備用(OD600＝0.5-0.6)。將短肽庫原始庫分別做10-8，10-9，10-10，10-11稀釋。每一稀釋度加入上述菌液200μl。室溫靜置5min，加入3ml預溫至45℃的AgaroseTop，迅速混勻，傾倒在預溫至37℃并涂有30μlIPTG/X-gal的LB(Tet+)平板上。晃動平皿使AgaroseTop涂布均勻。37℃培養約10h后，計數藍色噬菌斑，計算原始庫滴度及外源片段重組率。滴定結果顯示，噬菌體滴度約為1.5×1013pfu/ml。所有噬菌體均呈藍色，外源片段重組率100％。3.噬菌體展示短肽庫的Bio-panning挑取ER2537單菌落，分別擴增于2ml及20mlLB(Tet+)培養基中用于洗脫物的滴定與擴增。取正常人血清IgG100μg，Herceptin50μg分別與ProteinA-Sepharose4B珠子4℃搖3h，TBST(0.1％Tween-20)洗3遍。原始庫噬菌體(1.5×1011pfu)加入正常人IgG與ProteinA-Sepharose4B珠子的混合物中進行非特異性吸附。4℃搖2h，離心取上清加入Herceptin與ProteinA-Sepharose4B珠子的混合物中進行特異性吸附。4℃搖1h，離心，反應混合物用TBST(0.1％Tween)洗5遍，取少量反應混合物(約1μl)，加入200μl擴增至對數中期的ER2537菌液中，室溫放置5min，加入3ml預溫的AgaroseTop，迅速混勻并將該混合物傾倒在LB(Tet+)/IPTG/Xgal平板上，晃動平皿使AgaroseTop分布均勻。37℃孵育10h，計數噬菌斑并計算第一輪Output滴度。其余洗脫物加入20ml對數早期(OD600＝0.3-0.4)的ER2738菌液中，37℃，225rpm擴增4.5h。離心沉淀細菌，取80％上清加入1/6體積的PEG/NaCl沉淀過夜(或4℃沉淀1h以上)。10,000rpm，4℃離心15min。棄上清，再次短暫離心棄去殘余上清。以1mlTBS懸浮沉淀，加1/6體積的PEG/NaCl再次冰上沉淀15-60min。4℃離心10min，棄上清，再次短暫離心棄去殘余上清。以200μlTBS懸浮沉淀。離心1min，沉淀殘余不溶物。上清移入另一無菌離心管內，即為擴增后洗脫物，用于下一輪Bio-Panning。取少量上清稀釋后測定第一輪擴增滴度，即第二輪Input滴度。重復Bio-Panning過程3次。由第二輪起，逐步縮短噬菌體庫與包被受體結合的時間并將洗液中Tween-20的濃度提高到0.5％。經過3輪Bio-Panning后，短肽庫得到了逐步富集(表1)，但富集現象并不明顯。表1Herceptin篩庫過程中12肽庫的富集4.高滴度單克隆噬菌體的制備滴定最后一輪Bio-Panning洗脫物，選擇噬菌斑少于100個的培養平皿，挑選分隔良好的單克隆噬菌斑。挑取噬菌斑時，用剪頭塑料槍頭插入LB平板中，將完整的噬菌斑吸出，吹到1ml對數生長早期的ER2537菌液中，37℃，225rpm擴增4.5h。離心沉淀細菌，上清為高滴度單克隆噬菌體溶液，4℃保存。實施例2陽性噬菌體克隆的篩選與鑒定1.ELISA法初步篩選陽性克隆分別以5μl/mlHeceptin和正常人IgG包被96孔板，4℃過夜。棄去包被液，每孔加200μl封閉液，4℃過夜。棄去封閉液后以TBST(0.1％Tween-20-)洗板4次，每孔加入40μl含噬菌體的擴增后細菌上清(每一克隆設兩個平行孔)。室溫結合1-2h，洗板6次后加入酶標抗M13單抗(1∶5000)，室溫結合1h，洗板6次。每孔加入100μlOPD底物液，室溫顯色10-30min，終止反應后于OD492讀數。對300個第三輪Bio-Panning后的噬菌體克隆進行了擴增及ELISA鑒定。先后共獲得41個陽性噬菌體克隆，可特異地結合Herceptin，而與正常人血清IgG不結合，表2列出了其中8個陽性克隆。陽性率約為13.7％。表2ELISA檢測噬菌體克隆與Herceptin的結合2.陽性克隆的測序制備陽性噬菌體克隆測序模板。將新鮮擴增的1ml噬菌體上清，10,000rpm離心15min，取0.5ml噬菌體上清移入另一無菌離心管中，加入200μlPEG/NaCl溶液，顛倒混勻，室溫放置10min，沉淀噬菌體。10,000rpm離心10min，棄上清，再次短暫離心，小心將殘余上清全部吸棄。沉淀以100μlNaIBuffer徹底懸浮，加入250μl乙醇，室溫放置10min，這一過程中噬菌體的單鏈DNA將獲得優先沉淀，而噬菌體蛋白質會保留在溶液中。離心沉淀噬菌體DNA，10,000rpm，10min。沉淀以70％乙醇洗一次。吹干后沉淀加20μlTEBuffer懸浮。為充分懸浮沉淀，可以在加入TE后反復震蕩，離心3-5次。取10μl模板樣品送上海申友公司進行DNA測序，其余保存在-20℃。測序使用-96gIII測序引物。在41個陽性克隆中，對其中26個噬菌體克隆進行測序鑒定。其中25個克隆序列完全一致，只有一個克隆序列與其它不同。將25個序列一致的克隆命名為H98。其中，H98為LLGPYELWELSH實施例3GST-H98融合蛋白的原核表達及純化1.GST-H98融合蛋白表達載體pGEX-4T1-H98的構建1.1小肽序列的退火反應根據從噬菌體12肽庫篩選到的與Herceptin結合的陽性小肽H98的測序結果設計小肽H98正義和反義單鏈DNA片段，并于引物兩端分別引入用于克隆的BamHI及SalI粘性末端序列，并在小肽序列末端引入終止密碼子和HindII酶切位點用于重組質粒的酶切鑒定(表3)。表3編碼小肽的寡核苷酸序列下劃線處為酶切為點，方框處為終止密碼子，括號內黑體為小肽序列。將引物分別溶于TEbuffr，終濃度為1μg/ml。取1ul正義和反義引物加入18μlH2O中，混勻。75℃水浴5min，使DNA變性，緩慢降至室溫使DNA復性。1.2載體pGEX-4T1的酶切及其與H98小肽DNA片段的連接內切酶BamHI/SalI消化載體pGEX-4T1，經QIAGEN凝膠DNA純化試劑盒回收酶切片斷，將30ng退火H98片斷與載體pGEX-4T1連接并轉化BL21氯化鈣感受態細菌，最后小提質粒并以HindIII/EcoRV酶切鑒定重組質粒pGEX-4T1-H98。結果由于H98寡核苷酸片斷中引入了HindIII酶切位點，pGEX-4T1載體沒有HindIII酶切位點，但具有EcoRV酶切位點，因此重組質粒pGEX-4T1-H98經HindIII/EcoRV雙酶切可釋放出1700bp大小的片段；而沒有克隆片段插入的空載體pGEX-4T1經HindIII/EcoRV雙酶切，質粒被切開但無釋放片段，結果與預測相符(圖9)。2.小批量重組蛋白的誘導及表達(1)無菌吸頭從轉化盤中挑取一單克隆，接種于2mlLB(Amp+)培養液中，225rpm37℃震蕩培養過夜；(2)次日取上述菌液300μl稀釋至3ml(1∶10或1∶5)LB(Amp+)繼續培養2h，至OD600＝1左右，吸出1.5ml做未誘導的陰性對照，另1.5ml加IPTG至終濃度為0.5mmol/L或1mmol/L，繼續培養3h；(3)臺式離心機離心30秒(12,000-15,000rpm)，棄上清，沉淀加PBS50μl及2×SDS-PAGE上樣buffr50μl，混勻，沸水煮3-5min；(4)上述樣品10μl行12％SDS-PAGE電泳，100V，2-3h；(5)將膠取下在考馬斯亮蘭染液中染45min-1h，脫色液脫色30min，觀察重組蛋白的表達情況。3.重組蛋白的大量表達(1)無菌吸取已用小樣表達鑒定的陽性菌少許(10-20μl)，加到100mlLB(Amp+)培養液，37℃振搖培養過夜；(2)用LB(Amp+)1∶10稀釋上述培養液，繼續培養2-3h，至OD600＝1左右；(3)加IPTG至終濃度為0.5mmol/L，30℃繼續培養5-6h；(4)5,000rpm，4℃離心10分鐘；(5)沉淀用PBS洗滌后，分裝，-20℃存放備用。4.Glutathione-Sephorose4B凝膠純化融合蛋白GST-H98(1)大量誘導表達菌體沉淀加入細菌裂解液20ml(10ml細菌裂解液/100ml菌液)，冰上靜置30min；(2)加入Triton-X100至濃度為1％，冰浴10-30min；(3)冰上間歇超聲裂解，18KHz，超聲15s，停15s，反復6次，至液體變清亮。(4)4℃，12,000rpm離心20min，收集上清；(5)取200μlGlutathione-Sepharose4B凝膠用PBS洗3次，加入超聲后上清，4℃輕搖2h；(6)4℃，5,000rpm離心5min，沉淀用PBS洗3次；(7)加入200(1洗脫緩沖液，4℃輕搖20min；(8)4℃，12,000rpm離心20s，重復洗脫2-3次，收集的上清即為純化的融合蛋白；(9)行12％SDS-PAGE蛋白電泳，定量后-20℃保存。結果重組質粒pGEX-4T1-H98轉化大腸桿菌BL21，在30℃，0.5mmol/LIPTG誘導5-6h的條件下表達融合蛋白GST-H98，分子量約為26KD左右，與預測相符；轉化了空質粒pGEX-4T1的大腸桿菌BL21表達26KD的GST蛋白(圖10)。由于誘導溫度和誘導劑的濃度均較低，融合蛋白為可溶性表達，超聲后均在上清中，不形成包涵體。GST-H98融合蛋白經Glutathione-Sepharose4B凝膠純化，獲得純度＞95％的GST-H98可溶性蛋白(圖11)。實施例4GST-H98融合蛋白的生物學活性鑒定1.ELISA檢測Herceptin與GST-H98的結合活性分別用5μg/mlGST-H98、GST包被96孔板，4℃過夜。棄去包被液，每孔加200(1封閉液，4℃過夜。棄去封閉液后以PBST(0.05％Tween)洗板4次，每孔加入0、0.1、0.5、1、5μg/ml濃度的Herceptin50μl(每個濃度設兩個平行孔)，室溫結合1-2h，洗板6次后加入HRP-羊抗人IgG二抗(1∶2500)，室溫結合1h，洗板6次。每孔加入100(1OPD底物液，室溫顯色10-30min，終止反應后于OD492讀數。Herceptin可與GST-H98結合，隨Herceptin濃度增加結合力逐漸增強，而Herceptin不與GST結合(圖12)。提示Herceptin可與GST-H98特異性結合。2.Westernblot檢測Herceptin與GST-H98的結合活性GST蛋白、GST-H98、GST-HER-2、DHFR-H98融合蛋白各2μg加2(SDS-PAGE凝膠上樣緩沖液混勻，煮沸3-5min，使蛋白變性，行12％SDS-PAGE蛋白電泳，轉膜后以抗體Herceptin為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG(1∶2500)為二抗，進行Westernblot檢測蛋白與Herceptin的結合情況。結果表明Herceptin與GST-H98和DHFR-H98在分子量大約為26KD處有一特異性反應條帶，與陽性對照GST-HER-2在分子量大約為44KD處有一特異性反應條帶，而與GST無相應反應。抗GST單抗與GST蛋白、GST-H98、GST-HER-2均有特異性結合反應；而正常人血清IgG同上述四種蛋白均無反應(圖1)。3.競爭抑制實驗應用ELISA方法，檢測小肽H98是否可阻斷Herceptin與HER-2的結合，換言之，Herceptin與GST-H98的結合位點是否可被HER-2占據。分別用5μg/mlNIH3T3-erbB2細胞膜蛋白(溶膜緩沖液為1％TritonX-100，1mMEDTA，1mMPMSF，1μg/mlaprotinin)，或5μg/mlGST-H98包被96孔板，4℃過夜。棄去包被液，每孔加200μl封閉液，4℃過夜。將0、0.5、5、10、50μg/ml濃度的H98、F56、GST、GST-H98和NIH3T3-erbB2細胞膜蛋白分別與0.5μg/ml的Herceptin50μl混合，室溫預孵育1h后加入封閉后的96孔板(每個反應濃度設兩個平行孔)，室溫結合1-2h，洗板5次后加入HRP-羊抗人IgG(1∶2500)，室溫結合1h，洗板5次。每孔加入100μlOPD底物液，室溫顯色10-30min，終止反應后于OD492讀數。根據公式計算抑制百分率(ODHerceptin-ODHerceptinwithProtein)/ODHerceptin×100％。ELISA結果提示GST-H98和小肽H98均可阻斷Herceptin與HER-2的結合，且隨GST-H98、H98的濃度增加，這種阻斷作用逐漸加強。然而，GST和小肽F56對Herceptin與HER-2的相互作用沒有影響(圖2)。此外，結果提示HER-2和小肽H98均可阻斷Herceptin與GST-H98的結合，且隨HER-2濃度增加，這種阻斷作用逐漸加強(圖3)。上述結果進一步證明H98與HER-2擁有相似的表位。4.小肽H98對Herceptin抑制腫瘤細胞生長作用的影響用MTT比色法檢測H98小肽對Herceptin抑制腫瘤細胞生長作用的影響。SKBR3細胞1×104/孔鋪96孔板，培養24h使細胞貼壁，分別加入1μg/mlHerceptin與0、3、30、60、120μg/mlH98小肽或F56小肽的混合液，陰性對照孔加入1μg/ml正常小鼠IgG。繼續培養72h后加10mg/mlMTT5μg/孔，培養4h后輕輕吸去上清，加二甲基亞砜150μl/孔，搖勻，于波長492nm處測光密度OD492，取兩個平行孔的平均值，并計算細胞生長抑制率。細胞抑制率(％)＝(OD正常人IgG-ODHerceptin+H98/F56)/OD正常人IgG×100％。實驗證明Herceptin濃度為1μg/ml時即對SKBR3細胞有生長抑制作用，小肽H98可阻斷Herceptin對細胞生長的抑制作用，這種作用隨H98濃度的逐漸增加而加強，當小肽H98濃度為60μg/ml時，Herceptin對SKBR3細胞的增殖抑制作用降低了12.5％。相同濃度的無關小肽F56對Herceptin的細胞增殖抑制作用沒有影響(圖4)。實施例5動物實驗5.1動物免疫從中國醫學科學院動物中心購買6-8周齡的雌性昆明鼠，初次免疫將40ug純化抗原GST-H98、GST與等體積完全福氏佐劑(CFA)充分混勻至取一小滴在水中不擴散，皮下多點免疫小鼠。每隔3周進行1次加強免疫，等量純化抗原與不完全福氏佐劑(IFA)等體積混勻乳化，同樣皮下多點免疫小鼠。共免疫5次。免疫前，及第3次，第5次免疫后7-10天取小鼠尾靜脈血用ELISA方法檢測抗體效價。5.2ELISA檢測免疫血清中的抗體活性ELISA方法檢測免疫小鼠血清中的抗H98和抗HER-2免疫反應。構建pQE40-H98表達載體，并表達純化DHFR-H98融合蛋白，用于檢測免疫血清中抗H98小肽的體液免疫反應。以5μg/mlDHFR-H98包被96孔板，封閉后加入1∶1000稀釋的免疫小鼠血清，用HRP酶標羊抗鼠IgG進行常規ELISA檢測，并以DHFR板作為陰性對照。NIH3T3-erbB2細胞1×104/孔鋪96孔板，培養24h使細胞貼壁，用0.25％戊二醛固定細胞，封閉后加入1∶100稀釋的免疫小鼠血清，用HRP酶標羊抗鼠IgG進行常規ELISA，檢測免疫血清中抗HER-2蛋白的體液免疫反應，并以NIH3T3細胞板為陰性對照。結果5只小鼠在第5次免疫后都產生了抗H98小肽(圖5A)和抗HER-2蛋白(圖5B)的免疫反應。其中一只小鼠抗HER-2反應較弱，這與小鼠的個體差異有關。其中抗H98小肽的免疫反應在第3次免疫后就可檢測到，即第3次免疫后GST-H98免疫鼠血清抗H98反應與GST免疫鼠血清抗H98反應相比有顯著性差異(P＜0.05)。而第5次免疫后才可在小鼠血清中檢測到抗HER-2反應，即第5次免疫后GST-H98免疫鼠血清抗HER-2反應與GST免疫鼠血清抗HER-2反應相比有顯著性差異(P＜0.05)。單純免疫GST蛋白的小鼠血清中沒有檢測到抗H98小肽和抗HER-2的免疫反應。5.3免疫沉淀-Westernblot檢測免疫血清中的抗體活性50μgHerceptin與50μlProteinA-Sepharose4B珠子4℃搖3h，反應混合物用PBST(0.05％Tween)洗3遍，再與1.5×107NIH3T3-erbB2細胞中提取的細胞膜蛋白(細胞裂解液1％TritonX-100，1mMEDTA，1mMPMSF，1μg/mlaprotinin)4℃作用4h，沉淀復合物用PBST(0.05％Tween)洗3遍，變性后行8％SDS-PAGE電泳，轉NC膜后以1∶100稀釋的不同免疫小鼠血清為一抗，HRP-羊抗鼠IgG為二抗進行Westernblot，檢測免疫小鼠血清中是否有抗HER-2的體液免疫反應。正常小鼠血清IgG為陰性對照。結果可見其中一只免疫小鼠血清在分子量大約為185KD處有一特異性反應條帶，與人HER-2基因表達產物大小相似，而以GST免疫小鼠血清和正常小鼠IgG為一抗，在185KD處未見反應條帶(圖6)。說明5只小鼠中其中一只產生的抗HER-2免疫反應可與變性的HER-2反應。5.4H98小肽對T細胞增殖的作用小肽H98以0，1，10，100μg/ml濃度溶于無菌PBS，包被96孔板，37℃包被2h。棄包被液，用無菌PBS洗板2遍。隨機取2只分別經GST-H98和GST-無關小肽免疫4次的小鼠，末次免疫后第7天無菌取脾細胞，以2×105/孔細胞濃度接種至已包被H98小肽的96孔板中，37℃繼續培養72h后加入10mg/mlMTT5μl/孔，培養4h后輕輕吸去上清，加二甲基亞砜150μl/孔，搖勻，于波長492nm處測光密度OD492，取兩個平行孔的平均值，并計算細胞增殖率。細胞增殖率(％)＝(ODH98-OD未處理孔)/OD未處理孔×100％結果提示小肽H98可刺激GST-H98免疫鼠T細胞增殖，但這種增殖刺激作用比較弱，只有當小肽濃度達到100μg/ml時，與GST-無關小肽免疫鼠T細胞增殖相比才具有顯著性差異(P＜0.05)。而GST-無關小肽免疫鼠沒有出現明顯的T細胞增殖反應(圖7)。實施例6小肽H98的立體結構分析根據文獻報道[56]和PDB數據庫中獲得的Herceptin與HER-2相互作用的三維結構，利用InsightII軟件包中的Homology模塊構建了H98小肽與Herceptin相互作用的模擬結構圖。文獻報道[56]和PDB數據庫中獲得的Herceptin與HER-2相互作用的三維結構1N8Z提示，HER-2上幾段不連續的肽可與Herceptin輕(A)，重(B)鏈相互作用。HerceptinA，B鏈的活性部位的表面用溶液可及性表面表示，HER-2部分采用二級結構表示，其中具有活性作用的殘基采用球棍模型表示(圖8A)。由圖可知(1)HER-2蛋白HER-2557P-HER-2561Q中的HER-2560D與A，B鏈的A94T，B50R有氫鍵相互作用。A，B鏈的活性部位(B33Y，B50R，B59R，B52Y，B54T，B55N，B57Y)形成一活性口袋，HER-2558E直接伸入活性口袋中，與B50R，B59R形成氫鍵相互作用。(2)A，B鏈的活性部位(B102-103G，B105Y，A92Y，A93T，A94T)形成的活性口袋與HER-2570D-HER-2573F(DPPF)序列形成的環狀結構相互作用，環狀結構中HER-2573F苯環直接插入活性口袋中，與B33Y，B105Y側鏈的苯環形成(-(共軛相互作用。(3)HER-2602Q與A30N形成氫鍵相互作用(具體氫鍵相互作用見表4)。(4)從作用順序上看，從HER-2的HER-2560D-HER-2567H是一段卷曲結構，HER-2568Y-HER-2570D是β折疊片層，末端是HER-2570D，之后是DPPF序列形成的回轉環狀結構，此環的走向使得HER-2573F與HER-2560D相互靠近，從三維結構上看HER-2560D，HER-2573F，HER-2572P相互靠近，形成一活性部位。利用InsightII軟件包中的Homology模塊構建了H98小肽的結構。利用Docking模塊將H98小肽作用到Herceptin的活性部位中，得到如圖8B所示的結合構象。其中H98小肽的結構用線型飄帶圖表示，NH3-端為LEU，COOH-端為HIS，與Herceptin有相互作用的殘基H985Y、H986E、H989E用球棍圖表示。Herceptin部分，蘭色線條表示A鏈，紫色線條表示B鏈。根據據文獻報道，Herceptin的活性部位是由Herceptin的A、B兩條鏈所形成的四段loop(A90-A96，B96-B109，B25-B35，B50-B60)結構構成。Herceptin的活性部位中B33Y，B105Y，B50R，A94T，A30N等殘基具有非常重要的作用，這些殘基與受體HER-2形成較強的靜電相互作用，氫鍵作用，(-(共軛相互作用等[56]，由模擬的H98與Herceptin的活性部位相互作用的情況也可以看出H98與Herceptin的活性部位中的這些殘基具有相似的作用情況。其中H98的H986E、H985Y、H984P這三個殘基作用到HerceptinA，B鏈的活性口袋中形成類似于上面所描述的HER-2“DPPF”與HerceptinA，B鏈的三維作用形式(H986E對應HER-2560D，H985Y對應HER-2573F，H984P對應HER-2572P)，其中H986E可替換HER-2560D，H986E的側鏈比HER-2560D長一個甲基，可與HerceptinA，B鏈中A94T，B50R形成氫鍵相互作用；H985Y可替換HER-2573F，H985Y的苯環直接插入活性口袋中，與B33Y，B105Y的苯環形成(-(共軛相互作用。H989E可能作用于A，B鏈形成的活性口袋中，形成類似HER-2558E和B50R，B59R之間的氫鍵相互作用(表5)。此外如果將H981L突變為Q，即對應HER-2602Q，可使H981Q與A30N形成較強的氫鍵相互作用。通過這種突變可能會加強小肽H98與Herceptin的親和力。表4HER-2與Herceptin之間的氫鍵相互作用Table4HbondsbetweenHFR-2andHerceptin表5H98與Herceptin之間的氫鍵相互作用Table5HbondsbetweenH98andHerceptin實施例7H98小肽截短體的活性分析1.H98小肽的分段表達1.1GST-X融合蛋白表達載體pGEX-4T1-X的構建根據從噬菌體12肽庫篩選到的與Herceptin結合的陽性小肽H98的測序結果設計小肽X正義和反義單鏈DNA片段，并于引物兩端分別引入用于克隆的BamHI及SalI粘性末端序列，并在小肽序列末端引入終止密碼子和EcoRV酶切位點用于重組質粒的酶切鑒定(表3)。X分別代表N10、N8、N6、C10、C8、C6、M8、M6、MutN3-4、MutC1-2、MutN3-4、MutN1、CyclicH98。將引物分別溶于TEbuffr，終濃度為1μg/ml。正義和反義引物退火后與內切酶BamHI/SalI消化的載體pGEX-4T1片段連接并轉化BL21氯化鈣感受態細菌，最后小提質粒并以EcoRV酶切鑒定重組質粒pGEX-4T1-X。結果根據陽性小肽H98的DNA序列和H98三維結構分析結果，合成截短小肽(下述小肽均用X表示)N10、N8、N6、C10、C8、C6、M8、M6等的正義和反義單鏈DNA片段，退火后插入pGEX-4T1載體中。由于X寡核苷酸片段中引入了EcoRV酶切位點，載體pGEX-4T1中也有EcoRV酶切位點，因此重組質粒pGEX-4T1-X經EcoRV酶切可釋放出1700bp大小的片段；而沒有克隆片段插入的空載體pGEX-4T1經EcoRV酶切，質粒被切開但無釋放片段，結果與預測相符(圖9)。1.2GST-X融合蛋白的誘導表達及純化方法同前述2.GST-X融合蛋白與Herceptin的結合活性鑒定2.1ELISA檢測Herceptin與GST-X的結合活性分別用5μg/mlGST、GST-H98、GST-N10、GST-N8、GST-N6、GST-C10、GST-C8、GST-C6、GST-M8、GST-M6、GST-MutN3-4、GST-MutC1-2、GST-MutN1-2、GST-MutN1、GST-CyclicH98包被96孔板，4℃過夜。棄去包被液，每孔加200μl封閉液，4℃過夜。棄去封閉液后以PBST(0.05％Tween)洗板4次，每孔加入0、0.1、0.5、1、2、5μg/ml濃度的Herceptin50μl(每個濃度設兩個平行孔)，室溫結合1-2h，洗板6次后加入HRP-羊抗人IgG(1∶2500)，室溫結合1h，洗板6次。每孔加入100μlOPD底物液，室溫顯色10-30min，終止反應后于OD492讀數。2.2Westernblot檢測Herceptin與GST-X的結合活性GST、GST-H98、GST-N10、GST-N8、GST-N6、GST-C10、GST-C8、GST-C6、GST-M8、GST-M6、GST-MutN3-4、GST-MutC1-2、GST-MutN1-2、GST-MutN1、GST-CyclicH98融合蛋白各2μg加2(SDS-PAGE凝膠上樣緩沖液混勻，煮沸3-5min，使蛋白變性，行12％SDS-PAGE蛋白電泳，轉膜后以抗體Herceptin為一抗，辣根過氧化物酶標記的羊抗人IgG(1∶2500)為二抗，進行Westernblot檢測融合蛋白與Herceptin的結合情況。ELISA和Westernblot結果表明Herceptin可與GST-H98(原始小肽)、GST-C10(含H98羧基端10個氨基酸的小肽)、GST-MutN1-2(氨基端第1、2位突變的小肽)、GST-MutN1(氨基端第1位氨基酸突變的小肽)和GST-CyclicH98(氨基端和羧基端分別引入一個半胱氨酸的小肽)結合。它們與Herceptin的親和力由強至弱依次為GST-MutN1＞GST-H98＞GST-MutN1-2＞GST-C10＞GST-CyclicH98。而Herceptin與其它多種GST小肽融合蛋白均不結合(圖12，13)。結果提示羧基末端的2個氨基酸和氨基端的第3、4位氨基酸在小肽與Herceptin的結合中發揮重要作用，這與軟件分析的結果并不完全一致。此外，通過將H981L突變為Q，加強了H98小肽與Herceptin的親和力，說明軟件分析對實驗設計具有一定指導意義。以下參考文獻由于引用而全文引入本發明。參考文獻1.CoussensL，Yang-FengTL，LiaoYC，ChenE，etal(1985)TyrosinekinasereceptorwithextensivehomologytoEGFreceptorshareschromosomallocationwithneuoncogene.Science23011322.TzaharE，PinkaskramarskiR，MoyerJD，KapperLN，etal(1997)BivalenceofEGF-likeligandsdrivestheErbBsignalingnetwork.EMBOJ1649383.OlayioyeMA，NeveRM，泳道HA，HynesNE(2000)TheErbBsignalingnetworkreceptorheterodimerizationindevelopmentandcancer.EMBOJ1931594.KlapperLN，KirschbaumMH，SelaM，YardenY(2000)BiochemicalandclinicalimplicationsoftheErbB/HERsignalingnetworkofgrowthfactorreceptors.AdvCancerRes77255.CirisanoFD，KarlanBY(1996)TheroleoftheHER-2/neuoncogeneingynecologiccancers.JSocGynecolInvestig3996.NiehansGA，SingletonTP，OykoskiD，KiangDT(1993)StabilityofHER-2/neuexpressionovertimeandatmultiplemetastaticsites.JNatlCancerInst8512307.ShakS(1999)Overviewofthetrastuzumab(Herceptin)anti-HER2monoclonalantibodyclinicalprograminHER2-overexpressingmetastaticbreastcancer.HerceptinMultinationalInvestigatorStudyGroup.SeminOncol26718.SchallerG，BangemannN，BeckerC，BuhlerH，etal(1999)TherapyofmetastaticbreastcancerwithhumanizedantibodiesagainsttheHER2receptorprotein.JCancerResClinOncol1255209.YipYL，SmithG，KochJ，DubelS，etal(2001)identificationofepitoperegionsrecognizedbytumorinhibitoryandstimulatoryanti-erbb-2monoclonalantibodiesimplicationsforvaccinedesign.JImmunol166527110.DisisML，CalenoffE，McLaughlinG，MurphyAE，etal(1994)ExistentT-cellandantibodyimmunitytoHER-2Neuproteininpatientswithbreastcancer.CancerRes541611.PupaSM.MenardS，AndreolaS，ColnaghiMI(1993)Antibodyresponseagainstthec-erbB-2oncoproteininbreastcarcinomapatients.CancerRes53586412.DisisML，PupaSM，GralowJR，DittadiR，etal(1997)High-titerHER-2/neuprotein-specificantibodycanbedetectedinpatientswithearly-stagebreastcancer.JClinOncol15336313.WardRL，HawkinsNJ，CoomberD，DisisML(1999)AntibodyimmunitytotheHER-2/neuoncogenicproteininpatientswithcolorectalcancer.HumImmunol6051014.ViscoV，BeiR，MoriconiE，GianniW，etal(2000)ErbB2Immuneresponseinbreastcancerpatientswithsolublereceptorectodomain.AmJPathol156141715.DisisML，GralowJR，BernhardH，HandSL，etal(1996)Peptide-based，butnotwholeprotein，vaccineselicitimmunitytoHER-2/neu，anoncogenicselfprotein.JImmunol156315116.FiskB，HudsonJM，KavanaghJ，WhartonJT，etal(1997)ExistentproliferativeresponsesofperipheralbloodmononuclearcellsfromhealthydonorsandovariancancerpatientstoHER-2peptides.AnticancerRes174517.KobavashiH，WoodM，SongY，AppellaE，etal(2000)DefiningpromiscuousMHCclassIIhelperT-cellepitopesforHER2/neutumorantigen.CancerRes60522818.TutdeTM，AndersonBW，ThompsonWE，LeeJE，etal(1998)ProliferativeandcytokineresponsestoclassIIHER-2/neu-associatedpeptidesinbreastcancerpatients.ClinCancerRes4201519.IoannidesCG，FiskB，FanD，BiddisonWE，etal(1993)CytotoxicTcellsisolatedfromovarianmalignantascitesrecognizeapeptidederivedFromtheHER-2/neuproto-oncogene.CellImmunol15122520.PeoplesGE，GoedegebuurePS，SmithR，LinehanDC，etal(1995)Breastandovariancancer-specificcytotoxicTlymphocytesrecognizethesameHER2/neu-derivedpeptide.ProcNatlAcadSciUSA9243221.YoshinoI，PeoplesGE，GoedegebuurePS，MaziarzR，etal(1994)AssociationofHER2/neuexpressionwithsensitivitytotumor-specificCTLinhumanovariancancer.JImmunol152239322.KonoK，RongcunY，ChardJ，IchiharaF，etal(1998)IdentificationofHER2/neu-derivedpeptideepitopesrecognizedbygastriccancer-specificcytotoxicTlymphocytes，IntJCancer7820223.YoshinoL，GoedegebuurePS，PeoplesGE，ParikhAS，etal(1994)HER2/Neu-derivedpeptidesaresharedantigensamonghumannon-smallcelllungcancerandovariancancer.CancerRes54338724.LustgartenJ，TheobaldM，LabadieC，LafaceD，etal(1997)IdentificationofHER-2/NeuCTLepitopesusingdoubletransgenicmiceexpressingHLA-A2.1andhumanCD8.HumanImmunol5210925.RongcunY，Salazar-OnfrayF，CharoJ，MalmbergKJ，etal(1999)IdentificationofnewHER2/neu-der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有權利要求15的質粒或載體的細胞。17.一種藥物組合物，它含有權利要求14的核苷酸，權利要求15的質粒或病毒載體或權利要求16的細胞和藥用載體。18.權利要求17的藥物組合物，其中的細胞因子是白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-12(IL-12)、集落刺激因子(GM-CSF)、CCL2、CCL5、CCL7、CCL19、CCL21、CCL20、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL15、XCL1、FTL3L、CD40L等，其中的蛋白是熱休克蛋白等，其中的腫瘤常用疫苗主要指的是癌基因、突變的抑癌基因、腫瘤相關抗原，其中的載體是鑰匙孔戚血藍蛋白，血清白蛋白，滅活的細菌毒素等。19.權利要求18的藥物組合物，其中的癌基因如CEA等、突變的抑癌基因如p53等、腫瘤相關抗原如黑色素瘤相關抗原等，其中的血清白蛋白可以是牛血清白蛋白或人血清白蛋白等，細菌毒素是破傷風、白喉毒素或結核菌素等。20.權利要求17-19之任一的藥物組合物，它用于誘導產生針對HER-2的體液和細胞免疫反應。21.權利要求17-20之任一的藥物組合物，它用于腫瘤的防治。22.權利要求21的藥物組合物，用于防治的腫瘤和癌是乳腺、結腸、直腸、肺、口咽、喉咽、食管、胃、胰腺、肝、膽囊、膽管、小腸、腎、膀胱、泌尿道上皮宮頸、子宮、卵巢、絨毛膜癌、妊辰營養層病、前列腺、精囊、睪丸、甲狀腺、腎上腺發生的癌癥或腫瘤、垂體血管生成性瘤、黑素瘤、從骨或軟組織發生的肉瘤、卡波濟肉瘤、腦、神經、眼和腦膜的腫瘤，從造血惡性疾病發生的腫瘤。23.權利要求17-22之任一的藥物組合物，它是一種疫苗，這種疫苗可以是蛋白質疫苗或核苷酸疫苗。全文摘要本發明通過噬菌體展示技術分離了一種HER－2模擬抗原表位小肽(通式I)。本發明還對該表位小肽進行了突變修飾，鑒定了幾種仍然保持免疫原性的這種抗原表位的衍生物。含有這種表位或其衍生物的肽或肽與其它蛋白的融合可以用作疫苗用于誘導產生針對HER－2的體液和細胞免疫反應，進而發揮對腫瘤的預防及治療作用。本發明還合成了編碼這些肽的寡核苷酸、構建了含有該寡核苷酸或該寡核苷酸與編碼其它蛋白基因重組的表達載體并轉化細胞。本發明提供了一種寡核苷酸、載體或細胞可以治療腫瘤的方法和藥物組合物。文檔編號A61K38/10GK1781934SQ20041009821公開日2006年6月7日申請日期2004年11月30日優先權日2004年11月30日發明者壽成超,姜北海申請人:北京市腫瘤防治研究所