定向脂質體基因送遞的制作方法

專利名稱：定向脂質體基因送遞的制作方法
技術領域：
本發明一般涉及經過定向預選細胞類型的脂質體復合物全身性送遞治療分子。更具體地說，本發明提供了用于人癌癥的細胞定向基因轉移和基因治療的組合物和方法，從而經過配體/脂質體復合物將治療分子送遞給靶癌細胞。對細胞增生疾病(例如，癌癥)的治療導致放療和化療干預的效力極大地提高。
背景技術：
對癌癥的理想治療劑應當是選擇性地靶向負責腫瘤表型的細胞途徑且對正常細胞無毒性的試劑。至今，理想的治療劑仍然只是一種理想。盡管涉及基因治療和反義分子的癌癥治療具有極大的前景，然而在認識這一前景前需要闡述許多問題。也許與大分子治療癌癥和其他疾病相關的問題中最重要的是將治療分子有效送遞給需要的身體部位。
已有人評價了治療癌癥的各種核酸送遞系統(“載體”)，包括病毒和脂質體。用于人類癌癥基因治療的理想載體應該是能夠經過全身性用藥并且然后特異性和有效地靶向在身體任何一處存在的腫瘤細胞的載體。病毒載體介導的方法顯示出較高的基因轉移效力但在有些方面存在缺陷。病毒方法的局限涉及其缺乏定向且存在可能具有免疫原性、細胞致病性或誘重組性的殘余病毒元件。
病毒載體的主要缺陷是缺乏癌細胞特異性。由于缺乏腫瘤定向能力，病毒載體在用于指導局部送遞中受到局限，該送遞沒有到達轉移性疾病的能力，這是大多數癌癥病人死亡的最終原因。
使病毒作為基因治療和基因轉移送遞載體具有吸引力的可獲得的高滴度和細胞趨向性存在其一些最大缺陷。盡管在一些文獻中已描述了具有新感染靶的新病毒制品，這些載體是有疑問的，因為需要將病毒生長至高滴度。因此針對送遞分子治療劑(包括用于基因轉移和基因治療)的非病毒載體已集中了大量的注意力。
對于開發中的用于人體內治療的非病毒的，基因的藥用配制品，特別是陽離子脂質體介導的基因轉移系統，已有了進展。陽離子脂質體由帶正電的脂雙層組成且能經過簡單地混合脂類和DNA與帶負電的裸露的DNA復合，以便所得的復合物具有凈正電荷。該復合物容易被細胞結合和吸收，具有較高的轉染效力。使陽離子脂質體對DNA送遞具有通用性和吸引力的特征包括制備簡單，復合大量DNA的能力，與任何類型和大小的DNA或RNA使用的通用性，轉染許多不同類型的細胞(包括不分裂的細胞)的能力以及缺乏免疫原性或生物學危害活性。對于基因送遞，脂質體方法相對于病毒方法提供了許多優勢。最明顯的是，由于脂質體不是能自我復制的傳染原，它們不具有演化成傳染性人類病原體的新類型的風險。而且已表明陽離子脂質體是安全的且對體內基因送遞具有一定的效力。由于脂質體不是傳染原，它們可經過簡單混合進行配制。而且，已表明陽離子脂質體是安全的且對體內基因送遞具有一定的效力。用于基因送遞的陽離子脂質體現在正進行臨床試驗，用于送遞小分子治療劑(例如，化療劑和抗真菌劑)的脂質體已經上市。
陽離子脂質體的一個缺點在于它們缺乏腫瘤特異性且與病毒載體相比具有相當低的轉染效率。然而經過修飾脂質體使它們攜帶被細胞表面受體識別的配體可實現經過脂質體定向癌細胞。在真核細胞中受體介導的內吞代表了高效力的內吞途徑。在脂質體中存在配體有利于通過配體被細胞表面的其受體起始結合并隨后內吞結合的復合物使DNA進入細胞。一旦內吞，將有足夠的DNA可擺脫內吞途徑在細胞核中表達。
對于癌細胞外表面存在的分子現在已有相當多的了解。表面分子可用于選擇性地將脂質體定向腫瘤細胞，因為在腫瘤細胞外面發現的這些分子與正常細胞上的不同。例如，如果脂質體在其表面具有運鐵蛋白(Tf)，它可定向具有高水平的運鐵蛋白受體的癌細胞。
已檢查了各種配體的脂質體定向能力，包括葉酸，DNA合成所必需的維生素和運鐵蛋白。發現在各種類型的癌細胞，包括卵巢，口腔，乳腺，前列腺和結腸癌細胞中葉酸受體和運鐵蛋白受體水平均升高。這些受體的存在與腫瘤細胞的惡化或增生狀態相關。已表明葉酸受體在迅速分裂的細胞，如癌細胞中在葉酸內吞期間再循環。而且已表明運鐵蛋白和葉酸連接的大分子和脂質體被攜帶受體的腫瘤細胞經過受體介導的內吞特異性地吸收。因此認為葉酸和運鐵蛋白受體可用作癌癥的預后腫瘤標記和用作在惡性細胞生長治療中藥物送遞的潛在靶。
在許多類型的癌癥治療中對放療和化療無反應代表了不適合醫學需求。通常，當癌癥復發時，腫瘤獲得了對輻射或對化療劑增加的抗性。將導致對這些治療敏感的新成分摻入癌癥治療具有巨大的臨床關聯性。這種化學/放射致敏的一種方式可通過定向基因治療實現。
p53通過調節細胞周期事件和誘導細胞程序死亡在控制細胞增殖中的重要作用已被確認。由于大多數抗癌劑似乎通過誘導細胞程序死亡發揮作用，在這一途徑中的抑制或改變可導致治療方案失敗。因此已認為p53的異常與對細胞毒性癌治療(化療以及放療兩者)的抗性直接相關。還認為p53功能的喪失導致對在某些腫瘤細胞中觀察到的抗癌劑的交叉抗性。許多研究組已確立了存在突變的p53與小鼠纖維肉瘤和來自乳腺癌，人胃癌和食管癌以及B-細胞慢性淋巴母細胞白血病的原代腫瘤培養物中化學抗性的正相關。另外，經過在攜帶突變p53的非小細胞肺癌小鼠異種移植中表達wtp53恢復了經過報道的細胞程序死亡的化學敏感性。
腫瘤抑制基因p53在許多重要細胞途徑中的作用，特別是在對DNA損傷的細胞反應中的作用已被確定。這些途徑不僅包括基因轉錄，DNA修復，基因組穩定性，染色體斷裂和衰老，還包括細胞周期事件的調節和細胞程序死亡的調節。由于其在監控DNA損傷中的作用，p53已被命名為“基因組監護人”。癌細胞的特征在于遺傳不穩定性，已發現在幾乎所有的人類癌癥類型中p53突變以極高的頻率出現。事實上認為p53基因中的定量和定性改變在超過半數的所有人惡性腫瘤中起作用。已發現在大多數常見類型的人腫瘤中p53突變的存在與臨床預后差相聯系。而且p53突變體(mt)在一些較易治愈的癌癥類型，例如，維爾姆斯瘤，成視網膜細胞瘤，睪丸癌，成神經細胞瘤和急性淋巴母細胞白血病中極少發現。
許多研究已報道在體外和在小鼠異種移植模型中wtp53的表達抑制各種惡性腫瘤，例如，前列腺，頭頸，結腸，頸和肺腫瘤細胞的生長。還已報道了p53脂質體復合物部分抑制人成膠質細胞瘤和小鼠中的人乳腺癌異種移植體的生長。另外，Seung等使用脂質體介導的腫瘤內導入表達TNF-α的輻射誘導型構建體來抑制接觸電離輻射后的鼠纖維肉瘤異種移植體的生長。然而，p53單獨表達盡管能部分抑制腫瘤生長，但不能長期消除已形成的腫瘤。
缺乏wtp53的小鼠正常發育以及在表達p53的細胞中輻射后G1阻斷的觀察結果表明wtp53在DNA損傷或應激后細胞的調節中而不是在增生和發育期間發揮功能。由于許多常規抗癌治療劑似乎誘導DNA損傷且似乎經過誘導細胞程序死亡發揮作用，所以可以想象p53途徑的改變可導致治療方案失敗。
缺乏wtp53功能也與放射抗性增強相關。還發現mtp53的存在和隨后不進行G1阻斷與某些人腫瘤和細胞系中放射抗性增強相關。人腫瘤細胞系的代表包括頭頸鱗狀細胞癌，淋巴瘤，膀胱癌，乳腺癌，甲狀腺癌，卵巢癌和腦瘤。
根據這些情況，在腫瘤細胞中恢復wtp53功能的基因治療應重建p53依賴性細胞周期關卡和細胞程序死亡途徑，從而導致化學/放射抗性表型逆轉。與此模型一致，經過在攜帶mtp53的非小細胞肺癌小鼠異種移植體中表達wtp53可恢復化學敏感性與細胞程序死亡。已證實含有無p53的肺腫瘤細胞系H1299和T98G成膠質細胞瘤細胞的異種移植體的化學敏感性和WiDr結腸癌異種移植體對順式鉑氨的敏感性。在經過腺病毒轉導wtp53的SK-Br-3乳腺癌細胞中也顯示阿霉素或絲裂霉素C的細胞殺傷力增強。然而，一些相反的報道表明p53表達和化學抗性之間的關系可能具有組織或細胞類型特異性成分。也表明以腺病毒載體轉染wtp53使卵巢和結腸直腸腫瘤細胞對放射敏感。還報道了腺病毒介導的wtp53送遞在放射抗性的頭頸鱗狀細胞癌(SCCHN)腫瘤細胞系中確實恢復了功能性細胞程序死亡，導致這些細胞在體外具有放射敏感性。更明顯的是，腫瘤內注射腺病毒-wtp53并結合放射導致已形成的SCCHN異種移植腫瘤的完全和長期腫瘤消退。
本發明不同于常規使用病毒載體送遞治療分子的基因治療，例如，按Roth等(美國專利號5,747,469)所公開的方法。這些常規使用的載體僅具有有限的局部送遞能力。已表明其對腫瘤內送遞的適用能力不僅不足以到達原發性腫瘤塊內的所有細胞，而且不能到達轉移性疾病位點。

發明內容
在一個方面，本發明提供了用于在體外或體內將治療性分子送遞給定向細胞類型的細胞定向配體/脂質體/治療分子復合物。該復合物用作將治療分子送遞給靶細胞的送遞載體。當治療性分子是，例如，編碼治療蛋白的核酸時，該復合物用作進行基因轉移和基因治療的載體。具體實施方案涉及將治療分子送遞給含有葉酸或運鐵蛋白受體的動物(包括人類)癌細胞的葉酸和運鐵蛋白定向的陽離子脂質體。
在另一方面，本發明提供了含有在藥用上配伍的載體中的細胞定向配體/脂質體/治療分子復合物。可配制該組合物優選用于給病人靜脈內用藥以經過有效送遞治療分子而受益。該復合物具有合適的大小以便在靜脈內用藥后它們能分布到全身。
在另一方面，本發明涉及含有給需要的溫血動物(包括人類)施用治療有效量的含有在藥用上可接受的載體中的配體/脂質體/治療性分子復合物的藥用組合物。如本文的詳細描述，經過全身性(例如，靜脈內)施用含有包含編碼wtp53的核酸的配體定向的脂質體復合物的復合物進行人類癌癥治療是本發明該方面的重要實施方案。
經過全身性施用含有定向脂質體/核酸復合物的藥用組合物進行的人類基因治療形成本發明的重要實施例，其中該核酸含有在合適的調節序列控制下的治療基因。許多類型的人類癌癥的基因治療經過全身性送遞含有編碼wtp53的核酸的葉酸或運鐵蛋白定向的陽離子脂質體來實現。本文提供的數據證實該復合物對于特異性定向和致敏腫瘤細胞(由于表達wtp53基因)，包括原發性和轉移性腫瘤以在體外和體內進行放療和/或化療具有優異能力。
本發明還有一個方面涉及對脂質體制品的改進，特別是配體定向的陽離子脂質體，從而提供具有相當小的均一的直徑的脂質體。這種均一的小直徑脂質體在靜脈內用藥后表現出在血液中循環并定向原發性及轉移性腫瘤的能力。
本發明描述了以高度靶細胞特異性和高效全身性送遞治療分子的需求。當全身性用藥時，本發明的復合物能夠到達并特異性定向轉移性及原發性疾病，其中該靶細胞是人類癌細胞。作為借助于該系統送遞腫瘤抑制因子基因p53的正常野生型蛋白的結果，本發明人證實該腫瘤對放療和/或化療敏感。該系統的高轉染效率導致這種高度致敏不僅對癌癥進行生長抑制，而且在更長的時間期限內完全消除已經存在的腫瘤和轉移瘤。在有些情況下這個時間期限可認為是該疾病被治愈。
該系統的異常功效部分是由于脂質體-治療分子復合物的配體定向。而且，含有脂質體復合物的具體陽離子和中性脂質體以及各自的比率可以變化和最優化以便該治療分子的吸收效率對于具體靶細胞類型是理想的。也可最優化脂質體與治療分子的比率以適應靶細胞類型。脂質體-治療分子復合物的最優化，結合定向配體的添加，當結合放療或化療用藥時導致功效極大提高。本領域的技術人員可以最優化該復合物用于將各種治療分子送遞給各種類型的細胞。
本發明的重要特征在于通過靜脈內，全身性用藥將治療分子送遞給靶細胞的能力。靜脈內用藥后有效定向和轉染特異性細胞的能力經過將選擇合適的定向配體并最優化陽離子與中性脂類在脂質體中的比率進行所公開的組合來實現。如果腫瘤細胞是靶細胞，配體-脂質體-治療分子復合物的全身性送遞允許將治療分子有效并特異性送遞給轉移性及原發性腫瘤。
本發明不限于使用任何具體定向配體。該配體可以是其受體在靶細胞上差別表達的任意配體。目前優選的配體是葉酸(酯化成脂質體的脂類)和運鐵蛋白，這些配體各自具有有利特性。
脂質體復合物僅能穿透腫瘤血管周圍大約20層細胞。推測wtp53基因治療部分通過“旁觀者”效應控制細胞生長，其中可能涉及經過wtp53誘導細胞程序死亡。這種“旁觀者效應”可能是本文報道的體內研究效力的原因且可能是組合治療效力的負責因素。然而，關于在p53方法中涉及的機制和途徑目前所知甚少。推測在小泡內可能含有某種尚不清楚的細胞程序死亡信號，該小泡由細胞程序死亡引起并且最終被鄰近細胞吞噬。另外，這種細胞程序死亡信號可以通過間隙連接轉移，據信與磷酸化的9-(1，3-二羥-2丙氧甲基)鳥嘌呤和HSV-TK基因的情況一樣。誘導抗血管生成因子也可起到旁觀者效應。
最近已報道非定向的p53脂質體復合物部分抑制體內的人成膠質細胞瘤異種移植體的生長。另外，Seung等(癌癥研究，55，5561-5565(1995))使用商品非定向的脂質體(Lipofectin)介導腫瘤內導入含有TNF-α的放射誘導型構建體以便在接觸40Gy的電離輻射后部分抑制鼠纖維肉瘤異種移植體的生長。Xu等(人類基因治療8，177-175(1997))表明導入在非定向的脂質體復合物中的16μgp53DNA能部分抑制乳腺癌異種移植小鼠腫瘤的生長。然而本發明的配體介導的脂質體p53復合物提供了靶細胞特異性，高轉染效率以及全身性用藥的能力。本文報道的研究首次采用這種送遞系統結合常規放療和化療用于腫瘤治療。盡管單獨的p53基因治療不足以長期完全消除腫瘤，但是這里描述的脂質體介導的p53基因治療結合常規治療(放療和/或化療)不僅能實現生長抑制，而且能實現消退腫瘤，顯示出協同效應。
本文描述的體內實驗證實全身性LipF-p53或LipT-p53基因治療結合常規放療和/或化療比單獨任一治療具有更顯著的效力。在臨床情況下，在頭頸癌治療中通常采用65至75Gy的放射劑量用于大塊腫瘤，45至50Gy用于微觀疾病。由于已知高劑量的放療和化療與有害副作用相聯系，因此致敏腫瘤允許降低常規治療的有效劑量，這具有巨大的臨床益處。而且在放療的情況下，wtp53功能的系統恢復導致發現有效時，放射治療劑量減少，這允許對復發的腫瘤進行進一步的治療干預。
在使用含有wtp53或mtp53的SCCHN細胞系產生的異種移植腫瘤的報道中，注意到經過腫瘤內施用腺病毒載體導入wtp53能抑制這些異種移植腫瘤的發育和在其中誘導細胞程序死亡而不論其內源性p53狀況。同樣，脂質體介導的將wtp53導入均具有內源性wtp53的成膠質細胞瘤(RT-2)和乳腺癌(MCF-7)異種移植體能部分抑制這些腫瘤的生長。這些研究表明wtp53基因治療不論p53基因狀況均具有廣闊的潛力。
本發明進行的研究表明配體-陽離子脂質體-治療分子復合物系統可將p53基因在體內選擇性地送遞給各種類型的腫瘤，使它們對放療和化療敏感。因此，以腫瘤定向介導的全身性wtp53基因治療，相當安全和有效的配體定向的陽離子脂質體系統結合常規放療或化療不僅對于原發性腫瘤，而且對于那些錯過了起始治療的癌癥，可提供更有效的治療方式。
還已證實定向的脂質體送遞系統能送遞小DNA分子(例如，反義寡核苷酸)，以及與完整的病毒顆粒一樣大的試劑。這些小(反義)DNA分子的送遞也能使腫瘤細胞對化療試劑敏感。因此，本發明的定向脂質體廣泛應用于全身性送遞治療劑。
本發明還涉及制備配體-脂質體-治療劑復合物的方法。在運鐵蛋白-脂質體和病毒顆粒之間形成復合物的方法給復合物表面提供了大量的運鐵蛋白分子，從而在血液中流動時增加了該復合物的穩定性。而且，當治療分子是病毒顆粒時，運鐵蛋白脂質體也可用于經過封閉病毒抗原而降低病毒的免疫原性。
使用本發明時，本發明人已證實不僅在控制細胞生長，特別是腫瘤細胞生長中，而且在實現腫瘤長期消退中具有顯著效力。腫瘤細胞形成和生長，也稱為轉化，可描述為喪失了控制細胞分裂能力的細胞的形成和增殖，即，它們是癌變的。許多不同類型的轉化細胞可用作用于本發明的方法和組合物中的靶，例如癌癥，肉瘤，黑色素瘤，和各種固體瘤等。盡管具有惡性細胞生長的任何組織可以是靶，但是優選的靶是頭頸癌，乳腺癌，前列腺癌，胰腺癌，成膠質細胞瘤，頸癌，肺癌，脂肪肉瘤，橫紋肌肉瘤，絨毛膜癌，黑色素瘤，成視網膜細胞瘤，卵巢癌，胃癌和結腸直腸癌。
還可預料本發明也可用于定向非腫瘤細胞以送遞治療分子。盡管任何正常細胞均可以是靶，但優選的正常靶是樹突細胞，血管內皮細胞，肺細胞，乳腺細胞，骨髓細胞和肝細胞。
本文公開了當全身性送遞時，配體定向的，最優化的陽離子脂質體-治療分子復合物能特異性地定向并使腫瘤細胞對放療和/或化療顯著敏感導致極大的生長抑制和腫瘤消退。配體-定向的，最優化的陽離子脂質體-治療分子復合物可經過其它用藥途徑送遞，例如腫瘤內，氣溶膠，經皮膚的，內窺鏡，局部，病灶內或皮下用藥。
在某些實施方案中，本發明提供了經過全身性施用配體定向的脂質體-治療分子復合物用于高度靶細胞特異性和有效的送遞的方法和組合物。治療性分子的例子包括基因，高分子量DNA，質粒DNA，反義寡核苷酸，肽，核酶，肽核酸，化學劑，如化療分子，或者任何大型分子，包括但不限于，DNA，RNA，病毒顆粒，生長因子細胞因子，免疫調節劑和其它蛋白質，包括表達時提供刺激或抑制免疫系統的抗原的蛋白質。
最近已描述了用于長期表達基因治療載體的有效方法(Cooper等，1997；Westphal等，1998；Calos，1996和1998)。這些載體可用于擴大和/或增加所公開的脂質體送遞系統的表達水平。在美國專利號5707830(Calos，M.P.，1998年1月13日)；5674703(Woo，S.等，1997年10月7日)和5624820(Cooper，M.J.，1997年4月29日)中公開了一些自主型和游離型載體系統，每篇專利在本文中作為參考文獻引用。Calos涉及用于在哺乳動物細胞中自主復制的埃巴二氏病毒為基礎的游離型表達載體。Woo等涉及在動物細胞中復制的乳頭狀瘤病毒為基礎的游離型表達載體。Cooper等涉及用于在人類基因治療中長期游離表達的含有至少一個乳多空病毒復制起點和乳多空病毒大型T抗原突變形式的載體。
當治療分子是p53基因或反義寡核苷酸時，經過本發明復合物的送遞導致一個或多個細胞，如惡性的一個或多個細胞對放療或化療劑敏感使得該細胞經過組合治療被殺死。惡性細胞定義為喪失了控制細胞分裂周期能力導致轉化或癌表型的細胞。除了惡性細胞外，使用本發明方法可殺死的細胞包括，例如，不需要的但是良性的細胞，如良性前列腺肥大細胞，過度活躍的甲狀腺細胞，脂瘤細胞，以及涉及自體免疫疾病的細胞，如產生在關節炎，狼瘡，重癥肌無力，鱗狀組織轉化，發育異常等中涉及的抗體的B細胞。
可以在用藥前合理的時間內在無菌條件下配制配體-脂質體-治療分子復合物。如果該治療分子是為另一種治療提供增強敏感性的分子(如增強癌細胞對化療或放療的敏感性)，該另一種治療可以在施用復合物之前或之后用藥，例如在12小時到7天之內用藥。除了施用該組合物外可采用組合療法，例如化療和放療同時進行。
當用于細胞時術語“接觸”或“暴露”在本文中用于描述治療分子送遞給細胞，或與靶細胞直接并列放置，以便其可與該細胞有效地相互作用以對該細胞或宿主動物產生所需益處的過程。
其中本發明的復合物用作組合治療的成分，例如用于人類癌治療，它們可與在人類和動物癌癥治療中采用的各種療法組合使用。該療法包括施用化療劑和放射治療，例如γ-輻射，X-射線，紫外輻射，微波，電子發射等。在根據本發明的組合療法中可采用化療劑，例如阿霉素，5-氟尿嘧啶(5FU)，順式鉑氨(CDDP)，docetaxel，吉西他濱(gemcitabine)，紫杉醇，長春花堿，表鬼臼毒素吡喃葡糖苷(VP-16)，喜樹堿，放線菌素D，米托蒽醌和絲裂霉素C。
各種不同類型的潛在治療分子可與本發明的細胞定向配體/脂質體復合物復合。它們包括但不限于，高分子量DNA分子(基因)，質粒DNA分子，小寡核苷酸，RNA，核酶，肽，免疫調節劑，肽核酸，病毒顆粒，化學試劑，如本身已知的化療劑和藥品，生長因子，細胞因子和其它蛋白，包括表達時提供刺激或抑制免疫系統的抗原的那些蛋白。因此，除了基因治療外，本發明可用于免疫治療或用于藥物的定向送遞。
診斷劑也可經過所公開的復合物送遞給靶細胞。可使用在體內施用給多細胞生物體后可檢測的試劑。舉例性的診斷劑包括電子致密物質，磁共振成像劑和放射性藥物。用于成像的放射性核素包括銅，鎵，銦，錸，锝的放射性同位素，包括同位素64Cu，67Cu，111In，99mTc，67Ga或68Ga。Low等(美國專利號5688488)公開的成像劑可用于本發明，且該專利在本文中作為參考文獻引用。
與治療性分子復合的本發明的配體-脂質體組合物可由配體，陽離子脂類和中性或輔助脂類組成，其中陽離子脂類與中性脂類的比率是大約1∶(0.5-3)，優選1∶(1-2)(摩爾比)。配體可經過，例如化學偶連結合到中性脂類上并與陽離子脂類和中性脂類分別以摩爾比大約(0.1-20)∶100，優選(1-10)∶100，更優選(2.5-5)∶100(配體-脂類總脂類)混合。配體-脂質體可與DNA或其它治療分子混合以形成復合物。DNA與脂類的比率范圍為大約1∶(0.1-50)，優選大約1∶(1-24)，更優選大約1∶(6-16)μg/nmol。對于反義寡核苷酸，可經過將脂質體與寡核苷酸以大約(5-30)∶1的脂類寡核苷酸，優選大約(10-25)∶1，更優選大約10∶1的摩爾比混合形成復合物。
另外，對于運鐵蛋白，配體可與陽離子和中性脂類簡單混合。在這種情況中，陽離子脂質體以陽離子脂類與中性脂類為大約1∶(0.5-3)，優選1∶(1-2)的摩爾比率制備。運鐵蛋白可與陽離子脂質體和隨后的DNA或其它治療性分子混合。DNA/脂類/Tf比率范圍分別為大約1∶(0.1-50)∶(0.1-100)μg/nmol/μg，優選大約1∶(5-24)∶(6-36)，和更優選大約1∶(6-12)∶(8-15)。
根據本發明的復合物的另一個特征是其均勻分布的極小大小(平均直徑小于大約100nm，優選不超過大約75nm，更優選大約35-75nm(平均50nm)的直徑)。為到達靶腫瘤，該復合物應對體內遇到的降解劑有抗性，且還必須能夠穿過血管(毛細血管)壁并進入靶組織。本發明的組合物對血清中存在的成分產生的降解表現出高度抗性。腫瘤毛細血管的通透大小通常是50-75nm，直徑不超過大約75nm的該組合物可很容易地穿過毛細血管壁到達靶。根據透射電子顯微鏡，LipF-DNA和LipT-DNA復合物特有的洋蔥狀層狀結構似乎以小直徑起重要作用且隨后在體外和，特別是體內觀察到本發明的復合物具有較高的轉染效力。
配體可以是與靶細胞表面結合的任意分子，但優選與在靶細胞上差別表達的受體結合的分子。兩個特別優選的配體是葉酸和運鐵蛋白。陽離子脂類可以是任何合適的陽離子脂類，但優選二油酰基三甲基胺丙烷(DOTAP)和DDAB。中性脂類可以是任何中性脂類，且優選的中性脂類是二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和膽固醇。
可使用許多體外參數來測定組合物的定向和送遞效率以便最優化特定的復合物將所需治療分子送遞給選定的靶細胞類型。這些參數包括，例如標記基因的表達，如β-半乳糖苷酶或螢光素酶基因的表達，所送遞的蛋白質在靶細胞中的免疫組織化學染色，所送遞的基因的蛋白質表達產物的Western印跡分析，由送遞的反義或其它抑制性寡核苷酸引起的靶基因的負調控，以及靶細胞對放療和/或化療劑的敏感性增加。
在優選的實施方案中，可預料p53表達區可位于強組成型啟動子，例如RSV或CMV啟動子的控制下。通常，特別優選的啟動子是細胞肥大病毒(CMV)啟動子。
本發明的方法和組合物施用于體外或體內定向特定的細胞。當靶細胞位于溫血動物體內，例如頭頸，乳腺，前列腺，胰腺或成膠質細胞瘤細胞時，可將配體-脂質體-治療分子復合物以藥物學上可接受的形式施用給動物。本文使用的“藥物學上可接受的形式”指可施用給動物的配體-脂質體-治療分子復合物的配制品，且也可以是與輻射一起接觸動物的形式，即，在動物體受輻射區域的方式，例如用γ-輻射，X-射線，紫外輻射，微波，電子發射等輻射。DNA損傷輻射和微波的使用對于放療領域的技術人員是已知的。
本發明還提供了用于治療癌癥，原發性和轉移性癌癥的改進方法，它一般包括給需要的動物和人類病者施用治療上有效組合的配體-脂質體-治療分子(例如，p53基因)復合物和諸如放療或化療之類的治療。
該復合物一般以藥用上可接受的組合物的形式通常經過全身性施用給動物。在優選的實施方案中該組合物可通過靜脈內途徑進行全身性送遞。然而也可采用其它的用藥途徑如氣溶膠，腫瘤內，病灶內，皮下，內窺鏡，局部或皮下用藥。
本發明的高度腫瘤細胞特異性和腫瘤定向能力經過葉酸/運鐵蛋白-脂質體-β-Gal基因復合物全身性送遞后表達受體基因來證實。在達到70％的各種人腫瘤細胞，包括JSQ3，DU145和MDA-MB-435的異種移植體中表現出β-半乳糖苷酶表達，而正常組織和器官，包括高度增生的腸道和骨髓，無轉染跡象。本發明高度有效的腫瘤定向能力也在經過全身送遞復合物后特異性轉染的轉移瘤，和甚至是幾個細胞大小的微觀轉移瘤的實驗中表現出來。
葉酸-脂質體-wtp53基因或運鐵蛋白-脂質體-wtp53基因的全身性送遞結合放療或者化療在使用裸鼠模型的研究中產生有意義的結果，這一發現證實本發明取得了令人驚異的成功。該系統的高效性導致JSQ-3和DU145人類異種移植腫瘤對放療產生高度致敏，這不僅使癌癥的生長受抑制，而且在有些實驗中，以前存在的腫瘤和轉移瘤在更長的時間期限內完全消除。在有些情況下，這一時間期限(一年以上無疾病)使該疾病可認為被治愈。人乳腺癌MDA-MB-435和人胰腺癌PANC I裸鼠異種移植腫瘤也表現出經過全身性施用葉酸-脂質體-wtp53或者運鐵蛋白-脂質體-wtp53而對包括阿霉素，順式鉑氨，docetaxel或吉西他濱的化療劑高度敏感。
本文所用的術語“轉染”用于描述施用本發明的配體-脂質體復合物將治療分子定向送遞給真核細胞并以各種方法使治療分子進入細胞，如受體介導的細胞內吞。靶細胞可用復合物的配體進行優選，使該配體結合到在靶細胞表面差別表達的受體上。
本發明優選的藥用組合物是包含在藥物學上可接受的溶液或緩沖液中的，由配體，陽離子-中性脂質體和治療分子組成的復合物的那些組合物。
本發明還有一個實施方案是用于以配體-脂質體復合物全身性送遞治療分子的試劑盒，如可配制成治療組合物用于全身性用藥。本發明的試劑盒一般包括分別在合適的容器中的配體，脂質體和治療性分子的藥用配制品。在優選的實施方案中該配體可以是葉酸或運鐵蛋白，該脂質體可由陽離子和中性脂類組成，該治療分子可以是在CMV啟動子控制下的攜帶wtp53的構建體，或反義寡核苷酸。可在無菌條件下混合這三種成分并在合理的時間期限內施用給病人，一般是在配制后30分鐘到24小時內。
試劑盒的成分優選以溶液或以干粉形式提供。以溶液形式提供的成分優選在無菌注射用水中與合適的緩沖液，滲透控制劑，抗生素等一起配制。以干粉形式提供的成分經過加入合適的溶劑，如無菌注射用水重新配制。
具體實施例方式
本發明使用配體/陽離子脂質體送遞復合物的全身性施用以經過受體介導的內吞用于治療分子的腫瘤定向送遞。在一個優選的實施方案中，配體定向脂質體用于送遞包含編碼野生型(wt)p53基因的治療分子。該治療基因定向并有效送遞給腫瘤細胞導致許多腫瘤喪失的正常p53基因功能恢復。這種恢復對治療腫瘤的能力具有有意義的影響。在另一優選的實施方案中，被送遞的治療分子是針對細胞生長途徑中基因的反義寡核苷酸。這一基因的下調導致腫瘤細胞和異種移植體對放療和化療劑敏感。在另一實施方案中，“治療分子”是經過配體/脂質體復合物送遞給靶細胞的完整病毒載體(例如，含有治療核酸的腺病毒或逆轉錄病毒顆粒)。
在一個方面，本發明提供了用于實現基因治療以恢復腫瘤細胞中wtp53功能，導致化學/放射抗性表型逆轉并因此增加經過化學和/或放射治療來治療腫瘤的能力的組合物和方法。
本發明提供了一種新的和改進的方法，用于經過提供特異性定向腫瘤細胞，包括轉移瘤的全身性送遞系統(“復合物”)實現癌癥基因治療，并產生了一種更有效的癌癥治療模式。該方法使用了一種配體介導的陽離子脂質體系統以將治療分子送遞給腫瘤細胞。在一個優選的實施方案中，該治療分子是wtp53。在脂質體-DNA復合物中包含的細胞定向配體(例如，葉酸或運鐵蛋白配體)利用了與配體相關的腫瘤定向方面和受體介導的內吞以便將wtp53有效地并特異性地導入體內和體外的腫瘤細胞。wtp53功能恢復的結果是對常規放療和化療的敏感性增加，從而增強了其效力和/或減小了其總劑量。
舉例性的脂質體組合物以連接(例如酯化)到葉酸(提供在其上的葉酸配體)上的或與鐵飽和的運鐵蛋白簡單混合的陽離子脂類DOTAP和融合劑中性脂類DOPE為基礎。可最優化脂類本身的比率及脂類DNA的比率用于體內送遞及用于不同的腫瘤細胞類型，例如腺癌與鱗狀細胞癌。體外研究證實加入配體與僅有脂質體相比極大地增加腫瘤細胞的轉染效力，即使在高水平血清存在的條件下。以該方法轉染wtp53導致以前的體外放射抗性SCCHN細胞系產生顯著的放射敏感性。
在三種不同類型的癌癥(SCCHN，乳腺癌和前列腺癌)使用β一半乳糖苷酶報道基因評價了該系統的體內腫瘤定向能力。這些研究證實靜脈內施用該復合物后，只有腫瘤以50％-70％的效力被轉染，而正常器官和組織，包括高度增生的骨髓和腸隱窩細胞沒有顯示報道基因表達的跡象。一些配體-脂質體-DNA復合物在巨噬細胞中明顯。非常明顯的是，即使在肺，脾和淋巴結中的顯微轉移瘤也表現出明顯的高效和特異性轉染。
當給攜帶放射抗性的人SCCHN異種移植體的小鼠施用全身性送遞的配體-脂質體wtp53復合物并隨后進行放療時，腫瘤完全消退。對以前的腫瘤區域的組織學檢查表明只有正常的和留下的瘢痕組織，沒有明顯的肝腫瘤細胞。這與僅用配體-脂質體-p53復合物或僅用放療處理的動物的腫瘤相反。在這些動物中明顯有些細胞死亡。然而，肝腫瘤細胞的起源區殘留，導致這些動物的腫瘤再生長。令人驚奇的是，在接受組合治療的動物中，即使在處理結束一年后，明顯沒有腫瘤復發。在攜帶人前列腺腫瘤異種移植的小鼠中用放療和化療劑，以及在使用化療劑的人乳腺癌和胰腺癌異種移植中也觀察到相似的結果。因此可認為這一系統提供了更有效的癌癥治療形式。
因此，本發明提供了對目前實驗性癌治療明顯的改進，目前實驗性癌治療如局部注射攜帶諸如p53的治療分子的腺病毒載體，它不能有效地將治療分子施用給完整的腫瘤組織(原發性腫瘤塊)。局部送遞也缺乏到達遠處轉移瘤的能力。本發明提供的特異性定向能力由于減少了與廣泛非特異性吸收治療分子相聯系的副作用而具有優勢。
當與輔助治療結合用藥，且當靶細胞是癌細胞時，靶細胞吸收配體-脂質體-治療分子復合物不僅降低了這些細胞的增生速率，而且實際上導致腫瘤細胞死亡增加和長期的腫瘤消退。本發明的送遞系統有力地預示病人存活時間延長。
盡管本發明以一定的具體程度被描述，但顯然根據本說明書許多替換，修飾和變化對于本領域的技術人員是顯而易見的。因此，打算以限定的權利要求書包含落在本發明的實質和范圍內的所有這些替換，修飾和變化。
下面的實施例用于證實本發明優選的實施方案。
實施例1p53表達載體的構建本實施例描述了p53表達載體的構建。所用的方法通常是本領域的技術人員已知的。然而，本發明不限于任何具體的表達載體。
含有有義和反義p53 cDNA的腺病毒穿梭質粒pRSVp53，pRSVpRo，pCMVp53和pCMVpRo在

圖1中顯示。經過將1.7Kb XbaIp53 cDNA片斷克隆進腺病毒穿梭載體來構建這些質粒。為公開該穿梭載體的制備本文作為參考文獻引用了Davidson等，實驗神經生物學，125，258-267(1994)。以限制性酶消化測定方向并以DNA循環測序證實。質粒在大腸桿菌DH5α中擴增并用Qiagen質粒Mega/Giga試劑盒(Qiagen)純化。純化的質粒經分光光度計定量為A260/A280值大約為1.90。瓊脂糖凝膠(0.8％)電泳證實超過95％的質粒DNA是超螺旋的。
實施例2配體-脂質體-DNA復合物的合成本實施例描述了一種適用于生產配體-脂質體-治療分子復合物的方法，其中該治療分子是質粒DNA。將15mmol二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)在干氯仿中與20mmol葉酸的N-羥基琥珀酰亞胺酯(參見Lee，R.J.，等，生物學化學雜志，269，3198-3204(1994)，本文作為參考文獻引用以公開該方法)在20mmol三乙基胺存在的條件下室溫反應4小時，然后用PBS洗滌3次以獲得在氯仿中的葉酸DOPE。薄層色譜(氯仿∶甲醇∶乙酸，80∶20∶5)顯示95％以上的DOPE(Rf＝0.65-0.70)轉變成葉酸-DOPE(Rf＝0.90-0.95)。LipF(A)制備如下將5μmol二油酰三甲基胺-丙烷(DOTAP)的氯仿溶液，5μmol DOPE和0.1μmol葉酸-DOPE在園底燒瓶中混合，在減壓條件下蒸發氯仿。向燒瓶中加入10ml無菌水以懸浮脂類，然后在水浴型聲處理儀中4℃聲處理10分鐘。LipF(A)的終濃度為1nmol/μl總脂類。經過在無血清的RPMI-1640的無葉酸培養基(生命技術公司)中混合等體積的LipF(A)和DNA并在室溫下經常搖動培養15-30分鐘制備體外用的LipF(A)-DNA復合物。DNA滯留分析表明比率為1μg DNA8-10nmol LipF(A)時，幾乎所有加入的DNA與脂類混合。對于體內實驗，質粒DNA(根據DNA總量/小鼠在HEPES緩沖液，pH7.4中稀釋)與LipF(A)(在水中)以1μg DNA/8-12nmol脂類的比率混合，并在室溫下經常搖動培養15-30分鐘。加入50％葡萄糖溶液以達到5％葡萄糖終濃度，經過顛倒進行混合并檢查沉淀信號(存在顆粒物或霧狀物)。在兩種情況下，發現LipF(A)-DNA復合物在4℃下黑暗中穩定達24小時，基本上不喪失轉染效率。
按上述制備由二油酰三甲基胺-丙烷(DOTAP)和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)(Avanti Polar Lipids，Inc.，Alabaster，AL)組成的陽離子脂質體。脂質體終濃度為2nmol/ul。全運鐵蛋白(Tf，鐵飽和的，Sigma)以5mg/ml溶于純水中。用于體外實驗的Tf—脂質體-DNA復合物按改進的Cheng，P.W.，人類基因治療，7，275-282(1996)(本文作為參考文獻引用以說明脂質體的制備)所述方法制備。簡單地說，將12nmol脂質體加入在100μl無血清EMEM中的18mg Tf中并在室溫下經常搖動培養5-15分鐘。將該溶液與在100μl無血清EMEM中的1.2μg質粒DNA混合并在室溫下經常搖動培養15-30分鐘。制備的Tf-脂質體(命名為LipT(A))-DNA復合物用于在制備1小時內立即進行體外細胞轉染，盡管發現在24小時內穩定且具有相同的轉染效率。采用瓊脂糖凝膠電泳評價DNA被LipT(A)的滯留。發現90％以上的DNA與脂質體復合。對于體內研究，混合脂質體和運鐵蛋白(在水中)并在室溫下經常搖動培養5-15分鐘。然后溶液與DNA(在HERPES緩沖液pH7.4中)混合并在室溫下經常搖動培養15-30分鐘。加入50％的葡萄糖溶液以達到5％葡萄糖的終濃度，經過顛倒進行混合并檢查沉淀的跡象(存在顆粒物或霧狀物)。在兩種情況下，發現LipT(A)-DNA復合物在4℃下黑暗中相當穩定達24小時，基本上不喪失轉染效率。
實施例3經X-Gal染色對葉酸-脂質體的最優化本實施例描述了對本發明的葉酸陽離子-脂質體(LipF)復合物的最優化用于頭頸鱗狀細胞癌(SCCHN)。為了最優化SCCHN細胞系JSQ-3的轉染效率，采用被質粒pSVb中的SV40啟動子啟動的大腸桿菌LacZ基因作報道基因。根據X-Gal染色細胞的百分數計算轉染效率。如表1所示，復合物中葉酸配體的存在極大地增加了報道基因表達。非配體連接的陽離子脂質體(Lip(A))在體外的JSQ-3中產生10％-20％的轉染效率，而LipF(A)導致60％-70％的細胞表達β-半乳糖苷酶基因。轉染前向細胞中加入1mM的游離葉酸能封閉細胞上的葉酸受體，從而使轉染效率減少到20％，與用LipF(A)觀察到的結果相似。這些結果證實使用葉酸作配體增強了陽離子脂質體的轉染效率，且該效力由葉酸受體介導。根據最近的報道，X-gal染色可能低估β-半乳糖苷酶基因表達程度20％或更高，因此可以想象用配體定向的脂質體的轉染效率實際上可能超出上述的70％。
表1LipF(A)在JSQ-3細胞中的體外轉染效率*轉染載體無血清有血清僅含PSVb 0％ 0％Lip(A)-pSVb ＜20％ ＜10％LipF(A)-pSVb 60％-70％40％-50％LipF(A)-pSVb+15％-20％10％-20％1mM葉酸***在24孔平板上的無葉酸培養基中培養的60％鋪滿的JSQ-3細胞用含1.2μg pSVb的0.5ml轉染溶液轉染5小時。再培養2天后，固定細胞并用X-gal染色。以染成蘭色的細胞百分數計算轉染效率。
**即將轉染前加入葉酸。
實施例4以螢光素酶試驗最優化LipT(A)系統本實施例描述了本發明用于頭頸鱗狀細胞癌(SCCHN)的運鐵蛋白陽離子脂質體(LipT)復合物的最優化。使用螢光素酶試驗最優化LipT(A)系統用于JSQ-3轉染。采用被質粒pCMVLuc中的細胞肥大病毒(CMV)啟動子啟動的螢火蟲螢光素酶基因作為報道基因(Promega)。以5×104JSQ-3細胞/孔在24孔平板上涂板。24小時后用無血清的EMEM洗滌細胞一次，向每孔中加入0.3ml無血清的EMEM或抗生素。向細胞中加入新制備的在0.2mlEMEM中的含高達1.0μg不同量的質粒DNA的Tf-脂質體pCMVLuc(LipT(A)-Luc)復合物。在37℃和5％CO2中培養5小時后，向每孔中加入0.5ml補充了20％胎牛血清和1μg/ml氫化可的松的EMEM。24小時后，用PBS洗滌細胞一次，用100μl/孔1X報道裂解緩沖液(Promega)裂解，在發光計上用螢光素酶試驗系統(Promega)測定表達的螢光素酶活性。在每次測量期間用重組螢火蟲螢光素酶(Promega)標準將相對光單位(RLU)的發光計讀數轉換成表達的螢光素酶相當量。使用Bio-Rad DC蛋白測定試劑盒(Bio-Rad實驗室)測定細胞裂解產物中的蛋白質濃度。結果表示為每mg總蛋白的螢光素酶相當量的μg數。以復合物中不同的DNA/脂類比率用LipT(A)-pCMVLuc(LipT(A)-Luc)轉染JSQ-3細胞。運鐵蛋白極大地增強了陽離子脂質體的轉染效率。在最佳條件下，即，1ug/10nmol/12.5μg的DNA/脂質體/Tf比率，螢光素酶表達為12.5±1.1ug/ml總蛋白，或1.25％總蛋白，比無運鐵蛋白單獨用脂質體高7-10倍。
實施例5用LipT(A)-pSVb體外轉染JSQ-3細胞本實施例使用按實施例3所述的定量β-半乳糖苷酶比色試驗證實本發明的運鐵蛋白-脂質體復合物的轉染效率增高。純化的β-半乳糖苷酶(Boehringer)用作標準。結果表示為每mg總蛋白的β-半乳糖苷酶當量的微單位數(mU)。為了進行Tf-脂質體-pSVb轉染的組織化學研究，用1.2μg含或不含LipT(A)的pSVb轉染在24孔平板上的60％鋪滿的JSQ-3細胞5小時。再培養2天后，固定細胞并用X-gal染色。轉染效率計算為染成藍色的細胞百分數。在定量的β-半乳糖苷酶試驗中，以最佳條件，用0.5ugDNA/105個LipT(A)-pSVb的細胞，轉染的JSQ-3細胞表達15.04±0.60mU/mg總蛋白的無血清β-半乳糖苷酶，和用血清為10.95±0.15mU/mg。在組織化學研究中，用LipT(A)-pSVb轉染導致70％-80％的細胞被轉染。轉染期間血清的存在略為減少轉染效率，但即使使用血清，也有40-50％的細胞染成藍色，而無配體的陽離子脂質體僅產生10-20％的效力。這些結果證實使用Tf作配體極大地增加了陽離子脂質體的轉染效率，即使在血清存在的條件下。
實施例6體內用配體-脂質體復合物的選擇性腫瘤和轉移瘤定向本實施例證實了葉酸或運鐵蛋白復合的脂質體在體內選擇性地定向腫瘤組織的能力。經過皮下注射JSQ-3，MDA-MB-435或DU145細胞誘導異種移植。在4-6周齡雌性無胸腺裸鼠(Ncr nu-nu)尾上面背下側注射2.5×106(JSQ-3)或5×106(DU145)個細胞。將1×107個MDA-MB-435細胞皮下注射進小鼠的乳房脂肪墊中。對于轉移瘤模型，將1×106個JSQ-3或MDA-MB-435細胞經尾靜脈靜脈內注射進動物。按實施例2所述制備LipF(A)-pSVb或LipF(D)-pSVb。LipF-pSVb或僅用pSVb質粒(在5％葡萄糖中)以25μg質粒DNA/300μl/動物經尾靜脈進行靜脈內注射。DNA注射2天和10天后，切下腫瘤及小鼠器官，切成1mm切片，用PBS洗滌一次，并用2％甲醛-0.2％戊二醛室溫下固定4小時。洗滌固定的腫瘤切片4次，每次1小時，用X-Gal溶液加0.1％NP-40(pH8.5)37℃染色過夜。染色的腫瘤切片使用常規組織學方法包埋和切片并用核固紅反染。每個腫瘤檢查4個切片以評價β-半乳糖苷酶基因表達，由染成藍色的細胞表示。
LipF(A)-pSVb或僅用pSVb靜脈內注射進攜帶JSQ-3異種移植的裸鼠中。48小時內LipF(A)-pSVb注射組顯示腫瘤中報道基因表達具有大約40-50％的體內轉染效率。相反，僅用pSVb質粒，β-半乳糖苷酶報道基因染色的腫瘤細胞不足1％。靜脈內施用LipF(A)-pSVb 10天后，腫瘤中染成藍色的百分數和強度極大地減小，表明LipF(A)-介導的全身性轉染是瞬時的。LipF(A)-pSVb注射的小鼠的活器官顯示只有諸如肝巨噬細胞(肝臟)的巨噬細胞或塵細胞(肺)染成藍色，而肝細胞和肺泡細胞本身未被染色。如果發現腫瘤侵入肌肉也顯示了腫瘤定向的選擇性。LipF(A)-pSVb僅轉染腫瘤，而肌肉細胞未被染色。更有意義的是，高度增生的骨髓和腸隱窩細胞明顯未被轉染。隱窩細胞和骨髓如果有報道基因染色的跡象(＜1％)，則顯示很少。在骨髓和隱窩細胞中無LipF(A)-pSVb轉染證實定向不是非選擇性的，細胞增生效應，而是似乎定向腫瘤細胞。這一點經過血管內皮細胞明顯無染色進一步證實，盡管它們在復合物通過血流運行時接觸了最高濃度的LipF(A)-pSVb復合物。另外，在脾臟的淋巴母細胞生長中心明顯無染色，即使樹突細胞顯示β-半乳糖苷酶染色。
癌癥復發和治療的主要問題是轉移。為了試驗LipF(A)復合物定向除了皮下異種移植外的腫瘤細胞的能力，將JSQ-3細胞靜脈內注射進裸鼠。在注射后兩周末，形成刺激的轉移瘤(多個器官中的腫瘤細胞島)。然后用LipF-pSVb靜脈內注射動物并檢查刺激的轉移瘤β-半乳糖苷酶的表達。在胸淋巴結中發現的轉移瘤中可見到廣泛的X-gal染色。在這種切片中，發現血管(BV)被轉移的腫瘤細胞包圍。盡管腫瘤細胞表現出強烈的X-gal染色從血管20-25層，但是在血管內皮細胞中明顯沒有報道基因表達，即使它們在復合物通過血流運行時接觸了最高濃度的LipF(A)-pSVb復合物。這些結果證實了LipF(A)復合物的腫瘤選擇特性且證實了轉移瘤及原發性腫瘤可經過含葉酸的脂質體被定向。
為了評價這種葉酸連接的脂質體介導的送遞系統對SCCHN外的癌癥的應用廣泛性，用其它的人類腫瘤細胞系異種移植體也進行了實驗，包括人乳腺癌細胞系MDA-MB-435，Hs578T和人前列腺癌細胞系DU145，它們也攜帶mtp53。同樣，單獨靜脈內注射LipF(A)-pSVb也證實了腫瘤選擇性。在MDA-MB-435乳腺脂肪墊腫瘤中也看見高水平的β-半乳糖苷酶表達，而相鄰的正常肌肉組織未被染色。在非腫瘤組織或包括腸隱窩細胞和肝細胞的正常器官中未檢測到報道基因表達，而皮下乳腺脂肪墊異種移植顯示平均50-70％染成藍色。靜脈內注射MDA-MB-435細胞2周后，LipF(A)-pSVb經過單次尾靜脈注射進行全身性送遞。即使小的刺激的乳腺轉移瘤在肺中表現出高水平的染色，且鄰近的正常肺組織完全未被染色。
給攜帶DU145異種移植的小鼠單次靜脈內注射LipF(B)pSVb。在這些小鼠的腫瘤中也顯示報道基因表達，代表了至少40-50％的體內轉染效率，該數值比僅用質粒獲得的值高大約50倍。
運鐵蛋白-脂質體，脂質體-pSVb和pSVb DNA復合物以1μgDNA/10nmol脂質體/12.5μg運鐵蛋白在無菌的5％葡萄糖(而不是HBSS)中制備。在4-6周齡雌性裸鼠脅腹皮下注射JSQ-3細胞建立裸鼠腫瘤模型。在300ml體積中的30μg與Tf-脂質體復合的pSVbDNA用1cc注射器和30G針頭經尾靜脈注射進每只小鼠中。在對照組中，注射脂質體-pSVb或無脂質體的pSVb DNA。在第二天，用LipT(A)-pSVb注射的小鼠中腫瘤顯示出報道基因表達，代表了大約20-40％的體內轉染效率。相反，用無脂質體的單獨pSVb質粒表現出因報道基因表達被染色的腫瘤細胞不足1％。靜脈內施用LipT(A)-pSVb 10天后，腫瘤中陽性細胞的百分數和染成藍色的強度均極大地減小，表明LipT(A)-介導的全身性轉染是瞬時的。用LipT(A)-pSVb注射的小鼠活器官顯示出只有巨噬細胞(如肺的塵細胞和肝巨噬細胞)染色，而肝細胞和肺泡細胞未被染色。在脾淋巴母細胞生長中心明顯無染色，盡管樹突細胞表現出輕微的染色。總之，組織學染色表明以LipT(A)進行的報道基因送遞具有選擇性，其中人異種移植體染色最重。
實施例7外源性野生型p53蛋白質在LipF(A)-p53和LipT(A)-p53轉染的JSQ-3細胞中的表達本實施例證實了外源性基因的表達，在該具體的實施例中，細胞中的野生型p53與本發明的送遞系統接觸并被感染。由于最優化了體內和體外的轉染效率，將LipF(A)或LipT(A)與p53表達質粒pCMVp53復合，它含有wt人p53(LipF(A)-p53)或(LipT(A)-p53)的1.7kb cDNA。對于p53基因表達的DNA-劑量反應，將2×105個JSQ-3細胞涂部在6孔平板的各孔中。24小時后，用無血清和抗生素的EMEM洗滌細胞一次，用1ml含有增加量的(0.25-8μg/105細胞)與LipF(A)復合的pCMVp53質粒DNA的LipF(A)-p53，或作為對照的LipF(A)-pRo的轉染溶液轉染。或者，用含有高達4μg質粒DNA/2×105個細胞的LipT(A)-p53或LipT(A)-pRo以1μg DNA/10nmol脂質體/15μg Tf在EMEM中轉染細胞。轉染5小時后，加入1ml補充了20％FBS和1μg/ml氫化可的松的EMEM并再培養48小時。收集轉染的細胞并在RIPA緩沖液(Santa CruzBiotechnology，Inc)中裂解，使用本領域的技術人員熟悉的標準方法用泛嗜性抗-p53單克隆抗體Ab-2(Santa Cruz Biotechnology，Inc)進行Western印跡分析。每泳道上樣40μg總蛋白。
對于p53基因表達的時間-過程，用2μg與LipT(A)復合的pCMVp53或pCMVpRo轉染2×105個JSQ-3細胞。轉染后在5天內每隔24小時收集細胞并用于Western印跡分析。
為了研究對p53基因表達的放射影響，用LipT(A)-p53或LipT(A)-pRo(2μg DNA/2×105個細胞)轉染JSQ-3細胞2天，然后胰酶消化并在J.L.Shepard和Associates Mark I輻射儀中以分級劑量的高達6Gy的137Cs-射線進行輻射。輻射的細胞再涂平板并再培養2和4天，然后收集用于Western印跡分析。
體外轉染進JSQ-3細胞后，Western印跡分析證實用LipF(A)-p53轉染導致外源性wtp53的DNA劑量和時間依賴性表達。為用作對照，LipF(A)也于質粒pCMVpRo復合(LipF(A)-pRo)，該質粒攜帶反向的wtp53。在LipF(A)-pRo轉染的JSQ-3細胞中p53表達與未轉染的細胞相同。在LipF(A)-p53轉染24小時后有明顯的wtp53表達，在48小時達到高峰轉染120小時后表達可忽略不計，再次證明該基因送遞系統的瞬時性。這種暫時性表達是具有優勢的，因為它允許重復注射而不積累wtp53。
采用Western印跡分析證實了LipT(A)-轉導的wtp53在JSQ-3細胞中被表達。用增加劑量的與LipT(A)復合的p53表達質粒pCMVp53(LipT(A)-p53)轉染導致DNA劑量依賴型wtp53表達，而在用攜帶CMV啟動子控制下的反向wtp53 cDNA的LipT(A)-pRo轉染的JSQ-3細胞中明顯無外源性p53表達。wtp53表達從LipT(A)-p53轉染24小時后開始并在第二天達到高峰，然后減少。轉染五天后僅剩下微量的外源性p53，這表明LipT(A)-介導的wtp53表達是瞬時的。
在LipT(A)-p53或LipF(A)-p53轉染48小時后輻射JSQ-3細胞時(wtp53表達高峰)，外源性wtp53表達隨γ-輻射劑量顯著增加且穩定達4天，即，轉染后6天。這些結果證實γ-輻射可增強和/或穩定外源性wtp53，這表明外源性p53以與正常內源性wtp53類似的方式起作用，已知該內源性wtp53受輻射接觸穩定。
實施例8JSQ-3對體外輻射的致敏已表明在一些人腫瘤和細胞系中p53突變形式的存在與輻射抗性的增加相關(8，10)。因此本實施例檢查了用LipF(A)-介導的轉染取代wtp53對輻射存活的影響。LipF(A)-介導的p53轉染能使JSQ-3細胞以DNA劑量依賴型方式對輻射敏感。在最佳轉染條件，即，每105個細胞3μg質粒DNA時，D10值從未轉染細胞中發現的高抗性水平(6.55±0.43Gy)顯著減小到4.33±0.06Gy(p＜0.01)。這代表了對輻射殺傷大約6-10倍的敏感性。4.33Gy的D10值(4μg/105個細胞)與放射敏感性人成纖維細胞系H500的D10值(D10＝4.50±0.05Gy)相似且認為在此范圍內是放射敏感的。單獨的pCMVp53質粒或LipF(A)-pRo根據D10值均無顯著的致敏效應(p＞0.05)(圖5)。至于存活性，這種超過2Gy的減少代表對電離輻射殺傷效應的敏感性顯著增強。臨床上，這種敏感性改變可導致用常規放射劑量可治愈抗性腫瘤。
實施例9p53轉染和γ-輻射誘導的細胞程序死亡本實施例證實了使用本發明最優化的運鐵蛋白-脂質體復合物重新導入wtp53可恢復功能性p53依賴型細胞程序死亡途徑。用LipT(A)-p53或LipT(A)-pRo(1-3μg DNA/2×105個細胞)轉染JSQ-3細胞且在3天內每天收集貼壁的和漂浮的細胞用于分析細胞程序死亡的細胞百分數。對于放射誘導的細胞程序死亡，轉染細胞2天，然后按上面實施例8所述進行胰酶消化和輻射。4天后收集重新涂板的細胞用于分析細胞程序死亡的細胞百分數。用Annexin V-FITC試劑盒(Trevigen，Inc.，Gaithersburg，MD)根據廠商的方案染色收集的細胞。Annexin V-FITC特異性結合在細胞程序死亡的細胞上存在的磷脂酰絲氨酸。使用FACStar細胞計數器(Becton&Dickinson)分析染色的細胞。
為了檢查wtp53恢復對細胞程序死亡誘導的影響，用LipT(A)-p53或LipT(A)-pRo轉染JSQ-3細胞。在LipT(A)-介導的wtp53恢復中觀察到以劑量依賴型方式明顯誘導細胞程序死亡。細胞程序死亡的細胞百分數在轉染的第2天達到高峰，它與以Western印跡揭示的細胞中的wtp53表達水平相關。為了檢查輻射對細胞程序死亡的誘導的影響，用不同劑量的γ-輻射處理轉染的細胞。2-4天后，用Annexin V-FITC染色細胞并使用FACStar(Becton&Dickinson)以流式細胞計數術分析。γ-輻射僅在LipT(A)-p53轉染的細胞中誘導細胞程序死亡的細胞百分數從18.7％(0Gy)顯著增加到38.7％(4Gy)且在輻射后4天達到46.4％(6Gy)。在未轉染的(UT)細胞和用單獨的LipT(A)或LipT(A)-pRo處理的細胞中未觀察到增加。這種增加是放射劑量-依賴型的且與在Western印跡數據中發現的wtp53表達水平相關，這表明細胞程序死亡的輻射增強與細胞中的wtp53水平成比例。即，表達的wtp53越多，誘導的細胞程序死亡越多。
實施例10經過全身性送遞LipF(A)-p53使JSQ-3異種移植腫瘤對輻射敏感在本實施例中證實了使用全身性送遞的葉酸-脂質體-治療分子作為癌癥治療的方法。在該具體實施例中，治療分子是正常的人野生型p53基因(pCMVp53)。
上消化道積氣的鱗狀細胞癌導致顯著的發病率和死亡率，盡管最近在治療上有所改進。具有早期疾病(I或II期)的病人一般用外科手術或者放療進行治療，而具有惡化疾病(III或IV期)的更常見的病人一般用外科手術隨后用輻射進行治療。盡管如此，對于惡化期疾病，治療的病人一半或更多在原發疾病或遠距離轉移瘤位點復發且最終死亡。很可能這些臨床失敗的大部分由腫瘤細胞亞群的輻射抗性引起。因此，開發使頭頸腫瘤對放療敏感的有效方法對這些疾病的治療具有深遠的影響。
在許多研究中已將腫瘤抑制基因p53的突變(mt)型與各種類型的惡性腫瘤的臨床細胞程序死亡較差聯系起來。p53也可能涉及頭頸鱗狀細胞癌(SCCHN)的形成和惡化。經過使用各種檢測方法，已在33％-100％的SCCHN組織中鑒定到p53基因和/或其表達的異常。mtp53的存在也可能是SCCHN頻率增加和腫瘤復發更迅速的征兆。已表明野生型(wt)p53在DNA損傷或應激后細胞周期的調節中而不是在正常增生和發育期間發揮功能。由于已發現在一些人類腫瘤和細胞系中mtp53的存在與輻射抗性(RR)相關，且由于頭頸腫瘤放療失敗的高百分數，可認為在大量SCCHN中發現的功能性wtp53缺乏與這種觀察到的RR之間存在因果關系。因此wtp53的取代可導致這些腫瘤對常規放療敏感。
將2.5×106JSQ-3細胞皮下注射到4-6周齡雌性無胸腺裸鼠(NCrnu/nu)尾巴上的下背部。當腫瘤達到合適大小時，以8μg DNA/400μl5％葡萄糖/小鼠給予每周2次的靜脈內注射LipF(A)-p53，pCMVp53或LipF(A)-pRo，共注射5次。開始靜脈內注射48小時后，將動物在頸支架中固定僅使腫瘤區接受輻射，首先施用2.5Gy137Cs電離輻射的分次劑量。此后每隔48小時給予動物2.5Gy以達到25Gy的總劑量。作為比較，一組未轉染的以及一組接受了LipF(A)-p53的小鼠不接受輻射。
攜帶大約25-40mm3的皮下JSQ-3腫瘤的無胸腺裸鼠經尾靜脈每周2次靜脈內注射LipF(A)-p53(共注射5次)且僅腫瘤區域接受分次劑量的γ-輻射(總共25Gy)。為了測定在腫瘤中是否表達轉染的p53蛋白質，在實驗過程中從未轉染的LipF(A)-p53和LipF(A)-pRo組切下一個腫瘤(注射3次和12.5Gy后)。在LipF(A)-p53處理的腫瘤中證實有高水平的外源性p53，這證實了葉酸-陽離子脂質體復合物能將wtp53基因全身性送遞給腫瘤。單獨用輻射治療對未轉染的動物中的腫瘤僅具有有限的效力。靜脈內注射pCMVp53質粒DNA或LipF(A)-pRo與電離輻射結合開始誘導一些腫瘤生長抑制。然而，與臨床情況類似，這些腫瘤，如在未轉染的動物中的那些腫瘤，在停止輻射治療后開始重新生長。盡管單獨用LipF(A)-p53治療能在靜脈注射結束期間和甚至在其之后抑制腫瘤生長一段時間，但在最后一次靜脈內注射2周內這些腫瘤也開始增大。相反，接受了LipF(A)-p53加輻射組合的腫瘤75％完全消退，甚至在放射治療后130天仍沒有復發跡象出現。而且其余25％僅顯示出最小殘余腫瘤，在實驗過程中它們是靜止的，不足原始腫瘤體積的10％。對這些殘余腫瘤塊的組織學檢查表明它代表了成熟的斑痕，沒有增生性腫瘤細胞存在。
最近，在停止治療超過1年后，所有的對照動物要么死亡，要么由于腫瘤拖累而被仁慈地安樂處死。然而在接受組合治療的動物中仍沒有腫瘤重新生長的跡象。
從另一個獨立的實驗也獲得了相似的結果，其中起始腫瘤體積為25-60mm3。同樣，輻射后大約一年，在接受組合治療的動物中明顯沒有腫瘤重新生長。
這首次證實了以全身性送遞的脂質體p53復合物介導總體腫瘤消退。這些體內研究證實結合全身性LipF(A)-p53基因治療和常規化療比任一單獨的治療具有明顯更高的有效性。
實施例11以全身性送遞LipT(A)-p53使JSQ-3異種移植腫瘤對輻射敏感在本實施例中我們證實了使用全身性送遞的運鐵蛋白-脂質體-治療分子作為癌癥治療的方法。在該具體實施例中，治療性分子是正常的人野生型p53基因(pCMVp53)。
將2.5×106JSQ-3細胞皮下注射到4-6周齡雌性無胸腺裸鼠(NCrnu/nu)尾巴上的下背部。7-10天后，腫瘤在注射位點生長到大約40-50mm3。每只小鼠經尾靜脈每周2次靜脈內注射在300ml5％葡萄糖中新鮮制備的含8μgDNA的LipF(A)-p53或LipF(A)-pRo，共注射5次。開始靜脈內注射48小時后，將動物在頸支架中固定僅使腫瘤區接受γ-輻射，首先施用2.5Gy137Cs電離輻射的分次劑量。此后每隔48小時給予動物2.5Gy以達到25Gy的總劑量。作為比較，一組未轉染的以及一組注射了LipT(A)-p53的小鼠不接受輻射用作對照。以不知情方式每周測量腫瘤大小。
用SCCHN(JSQ-3)異種移植腫瘤進行的2個獨立的實驗具有相似的結果。首先，攜帶大約25-40mm3的皮下JSQ-3腫瘤的小鼠經尾靜脈每周2次注射LipT(A)-p53(共注射5次)且僅腫瘤區域接受分次劑量的γ-輻射(總共25Gy)。在使用對照LipT(A)-CMVpRo轉染的細胞中短期輻射對腫瘤細胞生長具有明顯的影響。在接受了LipT(A)-CMVp53而未輻射的動物中僅有最小的腫瘤生長抑制。相反，接受了LipT(A)--CMVp53加輻射組合的所有腫瘤表現出幾乎完全消退，甚至在放射治療后153天仍沒有復發跡象出現。此時，在對照組中攜帶腫瘤的動物要么死亡，要么由于過大的腫瘤拖累而被仁慈地安樂處死。然而在接受組合治療的組中(p53和輻射)在輻射后一年時仍沒有腫瘤重新生長的跡象。在用LipF(A)-p53和輻射組合治療的動物中，到治療后一個月為止，在接受組合治療的動物的原始腫瘤位點，在殘余組織中僅存在斑痕組織和一些侵入的Langerhan’s細胞。在第二個體內實驗中也觀察到相似的結果。
實施例12在第二種癌癥模型中組合治療的影響本實施例說明了脂質體介導的，腫瘤定向的p53基因治療與常規放療的這種新組合的效力并不局限于SCCHN，從而增加了該系統的臨床適用性。評價了葉酸-定向的，脂質體-介導的p53基因治療與輻射結合對體內人前列腺細胞系DU145的影響。這種腺癌細胞系最初從具有廣泛轉移的前列腺癌病人腦病灶中產生且據報道攜帶mtp53。我們發現該細胞系對γ-輻射殺傷(D10＝5.8±0.22Gy)具有抗性，該治療是輔助治療該疾病的一種最早的形式。以前的體外實驗表明用膽固醇取代中性脂類DOPE可導致在這一不同的腫瘤細胞類型中增加轉染效率。根據螢光素酶活性，我們發現在DU145細胞中與LipF(A)相比LipF(D)產生的轉染效率增加超過4倍。因此，攜帶大約70mm3的DU145腫瘤的小鼠經尾靜脈用LipF(D)-p53大約每隔5天靜脈內注射(共注射5次)且腫瘤接受分次劑量的γ-輻射(總共25Gy)。在本實驗中，非葉酸定向的脂質體-p53組合物(LipF(D)-p53)也用作對照。這些前列腺腫瘤的結果與SCCHN腫瘤十分相似。僅用輻射，LipF(D)-pRo加輻射，和非定向的Lip(D)-p53加輻射在治療過程中對腫瘤生長具有一定的抑制效應。然而，一旦停止治療這些腫瘤的大小全部迅速增大。相反，LipF(D)-p53加輻射的組合導致腫瘤長期消退，即使在第84天，即治療后第64天。在第63天觀察到的對照組中腫瘤體積下降是由于在該組中因腫瘤拖累而動物減少。用大約100mm3的腫瘤進行的第二組實驗顯示出類似的結果，即使在停止所有治療后第47天也沒有觀察到再生長。
實施例13JSQ-3對順式鉑氨(CDDP)的體外化學敏感性除了輻射外，化療越來越常用于SCCHN的治療。由于缺乏功能性wtp53與對化療反應的失敗相聯系，在本實施例中我們檢查了利用配體的脂質體介導的wtp53基因治療對SCCHN細胞系JSQ-3對化療劑的敏感性的影響。在96孔平板的每孔中涂布1×104個細胞。24小時后，用LipT(A)-p53轉染該細胞。轉染2天后，以不斷增加的濃度(一式三份)加入抗瘤劑。4-6天后，進行XTT細胞增生試驗并計算IC50值，產生50％生長抑制的藥物濃度。用少至0.2μg與LipT(A)復合的wtp53DNA處理顯示出使JSQ-3細胞對CDDP和5-FU，兩種經常用于輔助化療的藥物顯著敏感。盡管單獨用LipT(A)復合物，或以反向攜帶wtp53的LipT(A)(LipT(A)-pRo)轉染對CDDP產生一定的敏感性，但在LipT(A)-p53轉導的細胞中的敏感水平明顯比未轉染的細胞高24倍。而且，用LipT(A)-p53復合物轉染后也觀察到JSQ-3對化療劑5-FU敏感15.4倍。
實施例14以增強細胞程序死亡的誘導顯示p53介導的化學敏感性本實施例檢查了配體-脂質體介導的wtp53恢復對化療劑誘導的細胞程序死亡的影響。將JSQ-3細胞接種在6孔平板上并用LipT(A)-p53，LipT(A)-pVec(無p53基因的載體)或單獨的LipT(A)以1或2ugDNA/2×105個細胞進行轉染。24小時后，向各組平板中以接近各細胞系IC50值的濃度加入化療劑。再培養1天后，收集貼壁的和漂浮的細胞并使用Annexin V-FITC試劑盒(Trevigen，Inc.，Gaithersburg，MD)根據廠商的方案用AnnexinV-FITC染色，Annexin V-FITC特異性結合在細胞程序死亡的細胞上存在的磷脂酰絲氨酸。在FACStar流式細胞計數器(Becton&Dickinson)上分析染色的細胞。
在用本發明的LipT-介導的wtp53復合物處理的細胞中觀察到p53DNA劑量依賴型的細胞程序死亡誘導。而且以接近其IC50值的劑量加入化療劑(CDDP，紫杉醇，5-FU)僅在LipT(A)-p53轉染的細胞中而不在未轉染的(UT)和僅用LipT(A)或LipT(A)-pVec轉染的細胞中誘導群體中細胞程序死亡的細胞百分數顯著增加。該增加是p53DNA劑量依賴型的且與在Western印跡上觀察到的wtp53表達水平相關，這證實了化療劑誘導的細胞程序死亡增強與細胞中的wtp53水平成比例，即，表達的wtp53越多，誘導越多的細胞程序死亡。LipT(A)-p53加藥物的組合處理后觀察到的細胞程序死亡增加比單獨的化療劑(UT加藥物)加單獨的p53轉染(有p53而沒有藥物)之和要大得多，這表明p53基因治療與化療劑組合時具有協同效應。
實施例15用配體-脂質體-p53使MDA-MB-435對順式鉑氨或阿霉素體外化學致敏在乳腺癌的治療中，大部分腫瘤和其轉移瘤對輔助化療無反應是主要關心的問題。在本實施例中我們檢查了本發明的送遞系統使乳腺癌細胞對常用的化療劑敏感的能力。
采用了人乳腺癌細胞系MDA-MB-435。所用的配體-脂質體復合物是被最優化用于頭頸鱗狀細胞(在乳腺癌中發現的一種不同的組織學細胞類型)的組合物。與未轉染的細胞相比，用LipT(A)-p53轉染使阿霉素對MDA-MB-435細胞的效力增加了4倍，使CDDP的效力增加了幾乎12倍。因此，盡管還沒有最優化用于乳腺癌，但是已證實了用LipT(A)-p53轉染對乳腺癌細胞化學致敏。
使用為腺癌(大多數乳腺癌的組織學細胞類型)設計的組合物LipF(C)獲得了更加令人驚奇的結果。如上所述，以XTT試驗測定了IC50值。與未轉染的細胞相比，用轉染使阿霉素對MDA-MB-435細胞的效力增加了73.6倍，使紫杉醇的效力增加了31.6倍。正如用SCCHN細胞所見，以LipF(C)-pRo復合物也有一定程度的致敏。這些結果證實用運鐵蛋白-和葉酸-定向的脂質體-p53復合物轉染可化學致敏乳腺癌細胞。
實施例16用LipF-p53基因治療體內化學致敏乳腺癌細胞本實施例顯示了本發明的全身性送遞的配體-脂質體-治療分子復合物作為體內抗腫瘤細胞的有效治療劑的能力。經尾靜脈用LipF(C)-p53每隔3-4天靜脈內注射攜帶大約100mm3的皮下乳腺脂肪墊MDA-MB-435腫瘤的小鼠，共注射8次。每周靜脈內注射阿霉素(Dxr)(10mg/kg)共4周。用LipF(C)-p53結合Dxr基本上抑制了腫瘤的生長。在第二個實驗中，采用了兩種分開的脂質體組合物[LipF(E)和LipF(C)]。均證實了與Dxr組合時用LipF(C)-p53組合物的效力優于LipF(E)-p53。
實施例17在不同的癌細胞系中最優化配體-脂質體轉染在本實施例中進一步開發了配體-陽離子脂質體系統，制備了一組配體-定向的陽離子脂質體用于最優化對各種人和嚙齒類癌細胞的轉染效力。
制備了如下的陽離子脂質體LipA DOTAP/DOPE 1∶1摩爾比LipB DDAB/DOPE1∶1摩爾比LipC DDAB/DOPE1∶2摩爾比LipD DOTAP/Chol 1∶1摩爾比LipE DDAB/Chol1∶1摩爾比LipG DOTAP/DOPE/Chol 2∶1∶1摩爾比LipH DDAB/DOPE/Chol 2∶1∶1摩爾比1.葉酸系列上述各配制品加1％-5％葉酸-DOPE或葉酸-DSPE。
2.運鐵蛋白系列上述各配制品與完整的運鐵蛋白在培養基或緩沖液中混合，然后與報道基因質粒DNA在培養基或緩沖液中混合以形成復合物。
在質粒pCMVLuc中的螢火蟲螢光素酶基因或在質粒pCMVb中的大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因用作報道基因。
制備DNA-脂質體復合物經過在聚丙烯試管中混合等量的無血清培養基和在TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0)中的報道基因質粒DNA，和等量的無血清培養基與在無菌水中的葉酸-脂質體(LipA-F，LipB-F，LipC-F，LipD-F，LipE-F，LipG-F，LipH-F)(2μmol/ml總脂類)制備各種DNA-脂質體-葉酸復合物。室溫下10-15分鐘后將兩溶液混合起來并在室溫下經常搖動保溫15-30分鐘。DNA與脂類的比率最優化范圍為1∶0.1至1∶50ug/nmol。
經過向無血清培養基中加入Tf(鐵飽和的，Sigma，4-5mg/ml溶于水中，用0.22mm濾膜過濾)制備各種DNA-脂質體-運鐵蛋白復合物。5-15分鐘后加入陽離子脂質體(LipA，LipB，LipC，LipD，LipE，LipG，LipH)并混合。在室溫下經常搖動保溫5-15分鐘后，加入等量的含有報道基因質粒DNA的培養基并混合，在室溫下經常搖動保溫15-30分鐘。最優化的DNA/脂類/Tf比率范圍為1/(0.5-50)/(0.1-100)μg/nmol/μg。
細胞系在下列細胞系中進行最優化人頭頸鱗狀細胞癌JSQ-3，HN17B，HN22a，HN-38，SCC-25。
人乳腺癌MDA-MB-231，MDA-MB-435，MDA-MB-453，MCF-7。
人前列腺癌DU145，LNCaP，Ln-30，P4-20。
人卵巢癌SKOV-3，PA-1。
人胰腺癌PANC-1。
人結腸癌SW480，LS174T，SK-CO-1。
人成膠質細胞瘤U-87。
人頸癌HTB-34，ME180。
人肺癌CALU-3。
人胃癌Hs746T。
人脂肪肉瘤SW872。
人黑色素瘤SK-MEL-31。
人絨毛膜癌JEG-3。
人橫紋肌肉瘤Hs729T。
人成視網膜細胞瘤Y79。
人正常乳腺上皮細胞Hs578Bst。
人內皮細胞HUV-EC-C。
小鼠黑色素瘤B16/F10。
大鼠前列腺癌PA-III，AT.61。
大鼠腦癌RT-2。
用螢光素酶試驗進行最優化在24孔平板上涂板5×104個細胞/孔。24小時后用無血清培養基洗滌細胞一次，向每孔中加入0.3ml無血清培養基和抗生素。向細胞中加入新鮮制備的含不同量質粒DNA(在0.2ml中達1.0μg培養基)的LipT-pCMVLuc或LipF-pCMVLuc復合物。在37℃和5％CO2中培養5小時后，向每孔中加入0.5ml補充了20％胎牛血清的培養基。24小時后，用PBS洗滌細胞一次，用100μl/孔1x報道裂解緩沖液(Promega)裂解，在發光計上用螢光素酶測定系統(Promega)測量表達的螢光素酶活性。使用Bio-Rad DC蛋白測定試劑盒(Bio-Rad實驗室)測定細胞裂解產物中的蛋白質濃度。結果表示為每ug種蛋白的相對光單位(RLU)。
用β-半乳糖苷酶比色測定最優化在96-孔平板的各孔中涂板1×104個細胞或在24孔平板上涂板5×104個細胞/孔。24小時后用無血清或抗生素的培養基洗滌細胞一次，向每孔中加入100μl含有各種量的LipT-pCMVb，LipF-pCMVb或單獨的pCMVb的轉染溶液。在37℃培養5小時后，向每孔中加入等量的含有20％胎牛血清的培養基。48小時后，用PBS洗滌細胞一次，在1x報道裂解緩沖液(Promega)中裂解。用100μl在含有1mMMgCl2和450μM β-巰基乙醇的20mM Tris(PH7.5)中的150μM鄰-硝基苯-β-半乳吡喃糖苷在37℃下處理細胞裂解產物0.5小時。經過加入150μl/孔的1M Na2CO3終止反應。在405nm下測定吸光度。純化的β-半乳糖苷酶(Boehringer)用作標準。結果表示為每ug總蛋白的β-半乳糖苷酶相當量的毫單位數。
組織化學染色為進行配體-脂質體-pCMVb轉染的組織化學研究，按上面所述轉染60％鋪滿的細胞(在24孔平板上)5小時。再培養2天后，固定細胞并用X-gal染色。轉染效率計算為染成藍色的細胞百分數。
不同的脂質體組合物對不同的細胞系的轉染效率如表2所示，LipT(A)和LipT(D)對JSQ-3細胞表現出最高的轉染效率，比其它脂質體配制品效率高3-8倍。LipT(D)對MDA-MB-435和DU145具有最高的效率。以1/12/15的比率(DNAμg/Lip nmol/Tfμg)或更高時，LipT(D)對JSQ-3和LipT(A)對MDA-MB-435細胞產生高效率，但具有明顯的細胞毒性。更重要的是，當制備用于體內實驗的Tf-Lip-DNA復合物時，具有該比率或更高(脂類)的復合物易于沉淀，復合物溶液容易變成霧狀(即，不象以低比率制備的溶液一樣清澈)和不穩定。因此，LipT優選的比率為1/10/12.5(DNAμg/Lip nmol/Tf μg)。
表2

*x106RLU/mg蛋白質**DNA μg/Lip nmol/Tf μg的比率與運鐵蛋白相似，LipF(A)和LipF(C)對JSQ-3細胞提供了最好的結果，比其它脂質體配制品效率高2至8倍(表3)。令人感興趣的是，葉酸-脂質體與Tf-脂質體相比在MDA-MB-435和DU145以及在其它的細胞系中產生完全不同方式的效率。LipF(C)對MDA-MB-435提供了最好的結果，LipF(E)對DU145提供了最好的結果(表3)。在用DOTMA/DOPE為1∶1和1∶2摩爾比的脂質體轉染的一些癌細胞系中獲得了具有較低效率的相似結果。
表3

*x106RLU/mg蛋白質**比率DNA μg/Lip nmol
表4顯示了用于一些細胞系的優選的配體-脂質體配制品，我們使用本發明公開的配體脂質體系統體外試驗了這些細胞系。應注意用于體外轉染的最佳組合物不必是用于體內轉染的最佳組合物。但很可能體外優選的組合物是產生體內優選的組合物的好起點。因此，在本發明所公開的體內全身性基因治療之前必須使用裸鼠異種移植模型進行體內最優化。
表4


血清的影響或配體-脂質體的轉染效率LipT(D)對無血清的人成膠質瘤細胞系U-87具有高水平的轉染效率。然而，在10％血清存在的條件下，其轉染效率顯著減小，而LipT(A)在血清存在下對該細胞系具有最高效率。對于人胰腺癌細胞系PANC-1，血清似乎增強用一些脂質體組合物的轉染，用LipT(H)表現出最高水平的效率。同樣，我們觀察到在不同的細胞系中不同的轉染效率情況，和血清對轉染效率的不同影響。為達到體內轉染的目的，應在最優化過程中考慮血清影響。
實施例18以Tf-或葉酸-脂質體-介導的Wtp53體外基因治療使其它細胞系化學致敏本實施例總結了在實施例17中描述了用運鐵蛋白-偶連的或葉酸-偶連的脂質體轉染的細胞系中進行的部分體外p53-介導的化學致敏實驗(XTT試驗)。數據在下面表中提供，證實了LipT-和LipF-介導的p53基因轉染可使這些腫瘤細胞對化療劑敏感。化學致敏效力依賴于所用的脂質體和p53 DNA劑量。VIN＝長春花堿；DXR＝阿霉素；CDDP＝順式鉑氨。致敏倍數從單個的IC50值計算。DNA劑量＝用于每孔的ugDNA(在96孔平板中大約1×104個細胞/孔)。

實施例19全身性送遞LipF(A)-p53結合化療對體內DU145異種移植生長的影響化療越來越常用于前列腺癌的治療。已將功能性wtp53的喪失與對化療無反應聯系起來。本實施例檢查了配體-脂質體-p53結合化療對體內前列腺腫瘤異種移植生長的影響。
經過尾靜脈使用葉酸作為定向配體的配體-脂質體p53復合物(LipF(B)-p53)注射攜帶大約100mm3的皮下DU145異種移植腫瘤的小鼠。與10mg/kg劑量的化療劑docetaxel一起每周2次(總共注射5次)施用該脂質體復合物。用單獨的LipF(B)-p53復合物，或用單獨的docetaxel處理動物對腫瘤生長沒有顯著影響。然而，用本發明的全身性送遞的LipF(B)-p53結合docetaxel處理導致顯著的腫瘤消退。盡管所用的復合物不是對前列腺腫瘤細胞完全最優化的，但這些發現有力地支持了全身性送遞的，定向的-脂質體將wtp53送遞給腫瘤導致其對常規治療敏感的能力。
實施例20全身性送遞的LipF-p53結合化療對體內PANC-1異種移植生長的影響本實施例證實了配體-脂質體-p53結合化療對體內胰腺癌異種移植生長的影響。經過將1×107個以上的細胞皮下接種到無胸腺的裸鼠上誘導胰腺癌細胞系PANC-1異種移植腫瘤。當腫瘤達到大約500-1000mm3時，切下腫瘤并絞碎成小塊(＜1mm)。將這些新鮮制備的腫瘤塊(懸浮于PBS中)皮下接種(使用14g針頭)到無胸腺裸鼠的兩脅。當腫瘤達到平均100mm3的體積時，開始處理。動物經靜脈內注射接受LipF(B)-p53。每周2次施用脂質體復合物達到總共注射7次。以60mg/kg或120mg/kg的劑量每周2次腹膜內施用化療劑吉西他濱。總共施用13次吉西他濱注射。一組動物除了靜脈內施用LipF(B)-p53和吉西他濱外也接受每周2次的腫瘤內注射LipF(B)-p53(總共6次)。未接受處理，僅接受吉西他濱，僅接受LipF(B)-p53，或接受與無p53的pCMV載體復合的LipF(B)(LipF(B)-Vec)的對照組動物到第54天由于腫瘤拖累而被安樂處死。相反，接受LipF(B)-p53和吉西他濱組合的三組動物即使在處理結束后12天還顯示出對其腫瘤顯著的生長抑制。這在同時接受靜脈內和腫瘤內注射的動物組中特別明顯。因此，再次使用其它的腫瘤模型時，發現全身性送遞的配體-脂質體-治療分子結合化療劑比目前所用的療法明顯更有效。
實施例21用配體-定向的，脂質體-介導的反義寡核苷酸體外和體內化學致敏腫瘤細胞本實施例證實了本發明的全身性施用的配體-脂質體-治療分子送遞系統送遞作為治療分子的小寡核苷酸的能力。而且本實施例證實了全身性施用的配體-脂質體-送遞的小寡核苷酸使所接觸的腫瘤細胞對化療劑敏感的能力。
對各種腫瘤細胞類型最優化葉酸-脂質體(LipF)組合物用針對SCCHN細胞系產生的配體-脂質體復合物并按上面所述開始，開發了最優化用于將反義HER-2(AS-HER-2)寡核苷酸送遞給腫瘤細胞的其它配體-脂質體復合物。AS-HER-2寡核苷酸是與靠近HER-2基因起始密碼子的序列互補的15聚體(Pirollo等，BBRC230，1996-201(1997))。
以寡核苷酸飽和脂質體經過變化復合物中的陽離子和中性脂類產生多種新的葉酸-脂質體(LipF)組合物。在有些組合物中也包括輔助脂類。陽離子與中性脂類的比率也是可變的。使用32P-標記的AS-HER-2寡核苷酸，我們測定了脂質體與寡核苷酸的比率得到了寡核苷酸與各種組合物的最佳結合。這些研究的例子在下面表中顯示，其中在LipF組合物B和C與脂質體A之間進行比較，脂質體A是針對SCCHN最優化的LipF組合物。

在這三種組合物之間寡核苷酸的結合有明顯的區別。盡管如此，以25∶1的脂質體寡核苷酸比率所有三種組合物均達到完全飽和。然而，以該比率明顯有大量的毒性。從這些數據還明顯地看到對于不同的脂質體組合物，最佳比率顯著不同。
用各種LipF組合物時AS-HER-2寡核苷酸被腫瘤細胞系吸收用LipF組合物和人乳腺癌細胞系MDA-MB-435，SCCHN細胞系JSQ-3，前列腺腫瘤細胞系DU145和胰腺腫瘤細胞系PANC1進行轉染試驗以測定各LipF組合物的轉染效率。所用的是四種組合物(命名為B-E)，發現它們具有最大的寡核苷酸結合效力。在這些研究中開始使用的脂質體寡核苷酸的2個摩爾比率是10∶1和25∶1，發現它們(見上文)具有最高的寡核苷酸結合水平。然而發現25∶1的比率對細胞具有毒性。因此使用10∶1(脂質體寡核苷酸)的比率進行剩余的實驗。按前面對LipF(A)-p53及SCCHN所述使用32P-標記的AS-HER-2進行轉染。然而，在37℃培養20小時后，去掉培養基并用PBS洗滌細胞5次。合并培養基和洗滌液并確定未摻入的標記量。經過比較細胞內的32P水平與未摻入的寡核苷酸測定與32P-標記的AS-HER-2寡核苷酸相聯系的細胞量。在這些研究中，LipF(A)是最初針對SCCHN最優化的組合物。如下表所示，LipF組合物B在MDA-MB-435乳腺癌細胞中產生最高水平的轉染效率，而LipF組合物E對DU145和PANC I均更好。因此，LipF組合物B[LipF(B)]與MDA-MB-435用于下面的研究，如下所述。

寡核苷酸濃度是2μM脂質體寡核苷酸的摩爾比率是10∶1LipF(B)-AS-HER-2在體外和在血液中的穩定性由于這些研究的一個目的是開發用于反義寡核苷酸的全身性送遞系統，因此測定LipF(B)-AS-HER-2復合物在血液中的穩定性是重要的。因此，將復合物加入50％的血清中并在37℃下培養。在從0-24小時的不同時間，取出樣品，用32P標記寡核苷酸并以PAGE測定降解百分數。當與LipF(B)復合24小時時發現AS-HER-2寡核苷酸沒有降解。相反，在6小時時超過50％的游離寡核苷酸降解，到24小時為止幾乎全部降解。
還在小鼠血液(一種更類似于體內狀況的環境)中檢查了穩定性。即使在24小時后，超過75％的復合的寡核苷酸保持完整。因此，可得出的結論是葉酸定向的送遞系統在循環中保護寡核苷酸足夠長的時間，使其有效到達腫瘤細胞。
用LipF-AS-HER-2體外化學致敏癌細胞評價了LipF(B)-送遞的AS-HER-2使MDA-MB-435，JSQ-3，DU145和U87(人成膠質瘤)細胞對化療劑致敏的能力。使用XTT細胞增生試驗測定敏感性。用LipF(B)-AS-HER-2轉染顯著增加docetaxel對435細胞的殺傷效力。比較用LipF(B)介導的AS-HER-2處理的細胞與用LipF(B)對照寡核苷酸(SC)處理的細胞表明435細胞對taxotere敏感性增加超過30倍。相反，使用商品Lipofectin(生命技術公司)用AS-HER-2轉染后僅增加2.5倍水平的敏感性。用LipF(E)-AS-HER-2處理JSQ-3細胞增加幾乎25倍的docetaxel效力。而且，用與運鐵蛋白-定向的脂質體A(LipT(A))復合的AS-HER-2處理后順式鉑氨(CDDP)對JSQ-3細胞的效力也增加超過17倍。用LipF(E)-AS-HER-2處理后可見DU145細胞對docetaxel的敏感性增加2倍。用LipF(B)-AS-HER-2處理后人成膠質瘤細胞系U87顯示出對藥物吉西他濱的化學敏感性增加超過8倍。
為了進一步說明將定向的脂質體復合物用作反義基因治療送遞的載體，檢查了攜帶反-RAS寡核苷酸(AS-RAS，與靠近該基因起始密碼子的序列互補的11聚體序列)的LipF(B)使PANC I胰腺癌細胞對docetaxel敏感的能力。這里經過用LipF(B)-AS-RAS處理也誘導了藥物敏感性增加超過70倍。數據顯示LipF(B)-介導的反義基因治療可導致化療劑在以前有抗性的人癌癥細胞中的效力顯著增強。
體內研究經過評價腫瘤消退及腫瘤生長抑制檢查了LipF(B)-AS-HER-2定向并使以前存在的MDA-MB-435異種移植腫瘤對體內化療劑docetaxel敏感的能力。攜帶大約70mm3的MDA-MB-435乳腺脂肪墊異種移植腫瘤的雌性無胸腺(Ncr nu/nu)小鼠經過尾靜脈用LipF(B)-AS-HER-2(以大約0.6mM的寡核苷酸)每隔一天靜脈內注射，總共注射11次。給動物也施用總共11次靜脈內劑量的docetaxel(大約20mg/kg/隔日劑量)。在接受LipF(B)-AS-HER-2與docetaxel組合的動物中明顯出現顯著的腫瘤生長抑制。相反在僅接受AS-HER-2的那些小鼠中明顯僅有微量的生長抑制。而且，盡管有一些docetaxel效力，但在停止治療后這些腫瘤開始迅速增大。因此，全身性送遞的反義寡核苷酸，在本例中是AS-HER-2，的定向脂質體送遞能明顯地使這些腫瘤對化療劑敏感，幾乎在結束治療后3周仍然強烈地抑制腫瘤生長。
實施例22以運鐵蛋白-脂質體的腺病毒定向在開發基因治療新方案中提高基因轉移的效率和特異性仍然是重要的目的。腺病毒(Ad)是高效載體，但它們因缺乏腫瘤定向特異性和具有極大的免疫原性而受限制。已報道陽離子脂質體可與腺病毒形成非共價復合物并增強基因轉移效率。但陽離子脂質體本身仍缺乏定向特異性。
在本實施例中我們證實了本發明的配體-脂質體載體也可與腺病毒顆粒形成復合物，從而增強其基因轉移效率且其具有更顯著的定向特異性。而且，當治療分子是完整的腺病毒顆粒時，使用本發明的配體-脂質體-治療分子送遞系統允許有效的腫瘤細胞定向和全身性施用治療性腺病毒用于基因治療，得到另一基因治療的新方案。
制備運鐵蛋白-脂質體-腺病毒復合物含有在CMV啟動子控制下的大腸桿菌β-半乳糖苷酶基因LacZ的復制-缺陷型腺病毒血清型5，Ad5LacZ，用于研究。在研究中使用在PBS(pH7.4)加3％蔗糖中的1.1×1012個顆粒(pt)/ml，或5.5×109噬斑形成單位(pfu)/ml的Ad5LacZ。完整的運鐵蛋白(Tf，鐵飽和的，Sigma)以4-5mg/ml溶于水中并用0.22mm濾膜過濾。Tf首先在10mMHEPES緩沖液(pH7.4)中稀釋至0.5mg/ml，隨后將不同量的Tf加入在微量離心管中的50μl HEPES緩沖液中并充分混合。在室溫下培養5-10分鐘后，將0.1nmol/μl的Lip(A)(DOTAP∶DOPE為1∶1的摩爾比)加入管中使脂類/Tf比率范圍為1nmol/1-10ug。溶液充分混合并在室溫下培養5-10分鐘。向各管中加入1×106-1×107pt腺病毒使陽離子脂類/腺病毒比率范圍為1×103-1×107脂類分子/pt。在室溫下培養樣品10-15分鐘，然后向各樣品中加入150μl無血清的EMEM。
體外腺病毒轉導在24孔平板中涂板5×104JSQ-3細胞/孔。24小時后，用無血清的EMEM洗滌細胞一次，向各孔中加入0.3ml無血清的EMEM或抗生素。在200μl EMEM中的Ad5LacZ或以不同比率的Tf-Ad5LacZ復合物以一式兩份加入各孔中。病毒與細胞的比率范圍為20-2000病毒顆粒/細胞(pt/細胞)。在37℃，5％CO2中伴隨著偶爾搖動培養4小時后，加入含20％血清的0.5ml EMEM。培養2天后，用PBS洗滌細胞一次，在1x報道裂解緩沖液(Promega)中裂解。離心細胞裂解產物并以一式兩份轉移到96孔平板上，用100μl在含有1mMMgCl2和450μMβ-巰基乙醇的20mM Tris(pH7.5)中的150μM鄰-硝基苯-β-半乳吡喃糖苷37℃培養30分鐘。經過加入150μl/孔的1MNa2CO3終止反應。在ELISA平板讀數器上測定在405nm下的吸光率。純化的β-半乳糖苷酶(Boehringer)用于產生標準曲線。結果表示為每mg種蛋白的β-半乳糖苷酶當量的微單位(mU)數。
組織化學染色為了進行LipT-Ad5LacZ轉導的組織化學研究，用上述轉染溶液轉染在24孔平板中60％鋪滿的細胞5小時。在培養兩天后，固定細胞并用X-gal染色。轉染效率計算為染成藍色的細胞百分數。
以500pt/細胞或2.5MOI(感染復數，或pfu/細胞)的病毒劑量時，單獨的Ad5LacZ表達10mU/μg蛋白的報道基因產物β-半乳糖苷酶。與病毒復合的運鐵蛋白-脂質體，LipT-Ad5LacZ，以1×104陽離子脂類分子/pt的比率產生23.5mU/μg蛋白的報道基因表達。LipT-Ad5LacZ以1×105脂類分子/pt的比率產生30.7mU/μg的表達，而LipT-Ad5LacZ以1×106分子/pt的比率產生30.8mU/μg的表達。這分別代表比單獨的Ad5LacZ在基因轉導中增加2.4，3.07和3.08-倍。表觀達到1×105脂類分子/pt為飽和。
以1000 pt/細胞(或5MOI)的劑量時，以104脂類/pt的LipT-Ad5LacZ證實報道基因表達增加2.6倍，而以105脂類/pt的LipT-Ad5LacZ導致增加2.8倍，以106脂類/pt的LipT-Ad5LacZ比單獨的Ad5LacZ使報道基因表達的水平高3.8倍。無運鐵蛋白的脂質體復合物僅產生有限的增強。因此，LipT-Ad5LacZ復合物的最佳比率似乎是大約10-1000陽離子脂類分子/Tf分子，和大約104-107陽離子脂類/pt，優選大約15-50陽離子脂類分子/Tf分子和大約106陽離子脂類/pt。如果脂類/pt比率過高，會出現沉淀。
組織化學染色表明單獨的Ad5LacZ產生20-30％的轉導效率，而與腺病毒復合的運鐵蛋白-脂質體LipT-Ad5LacZ以106脂類/pt產生70-90％的效率。
試驗了其它脂質體組合物復合腺病毒的能力。LipT(B)(DDAB/DOPE，1∶1的摩爾比率)和LipT(D)(DOTAP/Chol，1∶1的摩爾比率)顯示腺病毒基因轉導進人前列腺癌細胞系DU145增強。
本發明的配體-脂質體送遞系統也與含有1.7kb的人wtp53基因的復制-缺陷型腺病毒血清型5復合(LipT(D)-Adp53)。將LipT(D)-Adp53復合物靜脈內注射進攜帶DU145前列腺癌異種移植腫瘤的裸鼠中。對腫瘤的Western分析(注射后72小時進行)表明存在額外的帶，代表在腫瘤組織中存在的外源性人wtp53蛋白。在處理的動物的正常組織(例如，肝，肺或脾)中明顯沒有額外的外源性wtp53序列。這些數據表明本發明的配體-脂質體-治療分子送遞系統能在全身性用藥后將腺病毒作為“治療分子”特異性地送遞給腫瘤組織。
上述結果證實了運鐵蛋白-陽離子脂質體可復合腺病毒并顯著增強腺病毒基因轉導。施用配體-脂質體-腺病毒復合物代表了人類基因治療的一種新方法。
實施例23運鐵蛋白-脂質體-定向的逆轉錄病毒基因轉導逆轉錄病毒載體是臨床試驗中最廣泛使用的一種基因治療載體。與腺病毒載體一樣，逆轉錄病毒載體受到腫瘤特異性較差和明顯的免疫原性的限制。在本實施例中我們證實了，與腺病毒一樣，本發明的配體-脂質體可與逆轉錄病毒顆粒形成復合物從而增強其基因轉移效力，且更顯著的是增強其定向特異性。而且，當治療分子是完整的逆轉錄病毒顆粒時，使用本發明的配體-脂質體-治療分子送遞系統允許有效地腫瘤細胞定向和全身性施用逆轉錄病毒載體用于基因治療。
含有大腸桿菌LacZ基因的復制-缺陷型逆轉錄病毒，RvLacZ，以1×1010個顆粒(pt)/ml，含有3×107轉化單位(TU)/ml用于本研究。完整的運鐵蛋白(Tf，鐵飽和的，Sigma)以4-5mg/ml溶于水中并用0.22mm濾膜過濾。與上面實施例21中所述的LipT-Ad5LacZ相似地制備LipT-RvLacZ復合物。簡單地說，Tf首先在10mM HEPES緩沖液(pH7.4)中稀釋至0.5mg/ml。將不同量的Tf加入在微量離心管中的50μl HEPES緩沖液中并充分混合。在室溫下培養5-10分鐘后，加入陽離子脂質體Lip(A)(DOTAP∶DOPE為1∶1的摩爾比)。溶液充分混合并在室溫下培養5-10分鐘。向各管中加入1×106-1×107pt逆轉錄病毒使陽離子脂類/腺病毒比率范圍為1×103-1×107脂類分子/pt。在室溫下培養樣品10-15分鐘，然后向各樣品中加入150μl無血清的EMEM。按實施例21所述進行體外逆轉錄病毒轉導。病毒與細胞的比率范圍為100-2000病毒顆粒/細胞(pt/細胞)。
以1000pt/細胞或3MOI(感染復數，或TU/細胞)的劑量時，以105脂類分子/pt的LipT-RvLacZ導至報道基因表達增加1.5倍。以106脂類/pt的LipT-RvLacZ與單獨的RvLacZ相比導致表達水平增加2.3倍。無運鐵蛋白的脂質體復合物僅產生有限的增強。因此，LipT-RvLacZ復合物的最佳比率似乎是大約10-1000陽離子脂類分子/Tf分子，和大約104-107陽離子脂類/pt，優選大約15-50陽離子脂類分子/Tf分子和大約106陽離子脂類/pt。如果脂類/pt比率過高，會出現沉淀。
組織化學染色表明單獨的RvLacZ產生20-30％的轉導效率，而與逆轉錄病毒復合的運鐵蛋白-脂質體LipT-RvLacZ(106脂類/pt)產生60-80％的效率。
上述結果證實了運鐵蛋白-陽離子脂質體可復合逆轉錄病毒并顯著增強逆轉錄病毒基因轉導。
實施例24配體-脂質體-DNA復合物的電子顯微鏡分析可在電子顯微鏡(EM)，如負染的透射電鏡(TEM)或掃描電鏡(SEM)下觀察脂質體。EM可以揭示脂質體復合物的結構和大小分布。EM也可用于脂質體制品的質量控制。
在本實施例中，我們證實了一種新的，獨特的運鐵蛋白-脂質體結構，它是在本申請中描述的用本發明的配體-脂質體-治療分子所觀察到的穩定性和效力的原因。
我們在負染的透色電鏡下觀察了配體-陽離子脂質體。帶有Formvar和碳履蓋的銅網(電子顯微鏡科學，Fort Washington，PA)用于本研究。按實施例2和17所述制備配體-脂質體-pCMVp53復合物。將1滴脂質體復合物放在網上。5分鐘后，用濾紙在銅網的邊緣經毛細作用去掉多余的液體。然后向網上加入1滴4％的乙酸鈾用于負染。5分鐘后也按上述方法去掉多余的液體。在放入TEM的樣品箱之前銅網在室溫下干燥15分鐘。按照廠商說明書在本研究中使用JOEL 1200EX或JOEL 100S。以10-50k，60千伏的放大倍數拍照。在銅網上制備脂質體樣品，新鮮染色并在1小時內觀察。
許多文獻顯示了陽離子脂質體-DNA復合物具有不同的結構和從100nm-1000nm范圍的大小。在我們的研究中我們意外地觀察到根據本發明制備的配體-脂質體-DNA復合物具有更小的大小和更均勻的大小分布。具體來說，LipT(A)-p53復合物具有直徑大約30-100nm的大小范圍，優選35-65nm(平均大約50nm)。由于陽離子脂質體Lip(A)本身具有15-40nm，平均25nm的大小，當運鐵蛋白與Lip(A)復合時，大小不發生明顯的改變。然而，觀察到較厚的脂質體壁或膜，表明運鐵蛋白復合到脂質體膜上。從放大的照片我們觀察到在LipT(A)-DNA復合物核心有一個不規則的或無中心的洋蔥狀結構。還觀察到該結構形成的一個中間階段，例如，在LipT(A)與DNA鏈縮合中的一個中間步驟。當混合LipT(A)與DNA的保溫時間從15分鐘縮短到5分鐘時，觀察到更多的這一中間階段。
根據TEM觀察，似乎LipT(A)-DNA復合物的特有結構在體外和特別是在體內觀察到的高基因轉染效率中發揮重要作用。在形成LipT(A)-DNA復合物期間經過下列步驟可形成無中心的洋蔥狀核心結構步驟1，一些(4-8或更多)Tf-脂質體與各DNA分子接觸，通過靜電相互作用附著到DNA鏈上。
步驟2，各附著的Tf-脂質體包裹或縮合DNA鏈以形成圍繞DNA鏈的分離的層狀結構。
步驟3，層狀結構濃縮以形成一個核心層結構。該實心的核心結構大小比4-8個Tf-脂質體之和更小。
步驟4，在最后縮合期間，可能出現從層狀時期到顛倒的六方型時期的過渡時期，產生不規則的或無中心的洋蔥狀結構。
據認為顛倒的六方型(HII)時期在轉染時比層狀(LII)時期明顯更有效且可能與DNA釋放和送遞有關(Koltover，I.科學28178，1998)。使用冷凍斷裂電鏡法，Sternberg，B.(生物化學和生物物理學學報1998；137523-35)描述了一種在DDAB/Chol陽離子脂質體-DNA復合物中的“圖釘”結構具有最高的體內轉染活性。他相信這種體內高活性與較小(100-300nm)的穩定的復合物相關而體外高活性與六方型脂類沉淀相聯系。在該文獻中沒有得到配體-陽離子脂質體-DNA復合物的超微結構分析。我們相信在運鐵蛋白或其它配體存在的條件下容易發生LII向HII的過渡且形成的不規則的或無中心的洋蔥狀核心結構被配體所穩定。至于層狀向顛倒的六方型過渡的機制，除了Koltover所建議的外，配體可能起重要作用。附著在脂質體表面的Tf或連接到脂質體表面的葉酸可幫助或加速這種過渡，產生更高效率的無中心的洋蔥狀核心結構。
在本文公開的制備條件下，95％以上的LipT(A)-DNA復合物具有不規則的或無中心的洋蔥狀核心結構。如果不需要這種過渡，在步聚3-4中濃縮的層狀結構優選形成規則的或有中心的洋蔥狀核心結構是穩定的。這種LII向HII的過渡和Tf-穩定化可能是這種極高的體內基因轉染效率的原因。
由于復合是一個四步過程，所以當制備復合物時，在各混合步驟之間保溫足夠的時間，使用經常的搖動以允許無中心的洋蔥狀核心結構完全形成是重要的。對于本文公開的制備程序，每次混合后保溫時間應是大約5-15分鐘且與DNA混合后是大約10-30分鐘，優選大約15-30分鐘。
根據本發明的脂質體的另一專有特性是其均勻分布的較小形態(直徑小于大約100nm，優選小于大約75nm，更優選大約35-65nm(平均50nm)直徑)。為了到達體內靶腫瘤，脂質體必須首先對血清有抗性，然后才能通過血管(毛細血管)壁。本發明的復合物對血清降解表現出高度抗性。腫瘤中毛細血管的可通透大小通常是50-75nm；因此，該復合物可通過毛細血管壁到達靶。
LipF(B)-DNA復合物的TEM結構與LipT(A)-DNA相似，且該復合物的大小范圍是30-100nm的直徑，優選35-75nm(平均50nm)。還觀察到獨特的不規則或無中心的洋蔥狀核心結構。在相似的4-步過程中可發生層狀向顛倒的六方型的相變，它是極高的體內基因轉染效率的原因。
實施例25配體-陽離子脂質體的穩定性對于脂質體藥物而言穩定性是一個重要問題。脂質體溶液在配制后應穩定更長的時間以允許裝運和儲存而基本上不損失其生物學/藥學活性，以便用作治療劑。根據本發明的配體-脂質體-治療分子復合物的未來臨床應用，我們檢查了配體-脂質體和配體-脂質體-DNA復合物的穩定性。
Lip(A)在水中制備并在氮氣中4℃下的黑暗中儲存各種時間期限，多達6個月。在試驗的第一天，儲存的脂質體，以及新制備的Lip(A)用于制備LipT(A)-pCMVb復合物。然后使用實施例5所述的轉染試驗將該復合物用于轉染JSQ-3細胞。在儲存了不同時間的Lip(A)制品和新鮮制備的Lip(A)之間，沒有觀察到轉基因表達水平有明顯的區別。在獨立的實驗中，Lip(A)制品儲存12個月仍然保留＞90％的轉染活性。單獨制備各運鐵蛋白溶液(以5mg/ml溶于水中)和溶于10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0中的pCMVb質粒DNA(0.5-1.0μg/ml)。發現葉酸-脂質體復合物具有相同程度的穩定性。
脂質體，Tf，和質粒DNA在儲存中分別都是穩定的。但當它們混合起來形成LipT-DNA復合物時，復合物在更長的時間期限內不穩定。例如，LipT-DNA復合物僅穩定幾天。在第三天僅保留50％的轉染活性。對于LipF-DNA，24小時后僅保留60％的轉染活性，在制備3天后基本上全部喪失活性。
根據這些觀察，似乎本發明的配體-脂質體-治療分子復合物的組分以試劑盒形式提供具有優勢。該組分可在使用的當天一次混合起來，其中首先將Tf加入脂質體中，接著加入DNA溶液(每次混合之間保溫10-15分鐘)，然后加葡萄糖至5％。復合物應在其制備后盡快施用，優選在24小時內施用。
權利要求
1.用于將治療劑或診斷劑全身性送遞給宿主動物內的靶細胞的載體，包含細胞定向的配體，脂質體和所述的治療劑或診斷劑的復合物，其中該載體具有小于大約100nm的平均直徑。
2.根據權利要求1的載體，具有大約30-75nm的平均直徑。
3.根據權利要求1的載體，具有大約50nm的平均直徑。
4.根據權利要求1的載體，其中所述的治療劑或診斷劑是核酸。
5.根據權利要求1的載體，其中所述的治療劑或診斷劑編碼(a)一種蛋白質或(b)一種反義寡核苷酸。
6.根據權利要求1的載體，其中所述的治療劑或診斷劑是編碼野生型p53的核酸。
7.根據權利要求1的載體，其中所述的配體是腫瘤細胞定向配體。
8.根據權利要求1的載體，其中所述的配體是葉酸或運鐵蛋白。
9.根據權利要求1的載體，其中所述的配體是葉酸。
10.根據權利要求1的載體，其中所述的配體是運鐵蛋白。
11.根據權利要求1的載體，其中脂質體是含有陽離子脂類和中性或輔助脂類的陽離子脂質體。
12.根據權利要求4的載體，其中所述的脂質體和所述的核酸以每1.0微克核酸0.1-50納摩爾脂質體的比率存在。
13.根據權利要求12的載體，其中所述的比率為每1.0微克核酸1.0-24納摩爾脂質體。
14.根據權利要求12的載體，其中所述的比率為每1.0微克核酸6-16納摩爾脂質體。
15.根據權利要求1的載體，其中所述的載體具有無中心結構。
16.根據權利要求15的載體，其中所述的載體具有實心核心。
17.用于將治療上有效的核酸分子體內送遞給攜帶腫瘤的動物的載體，該載體基本上由選自葉酸和運鐵蛋白的細胞定向配體、陽離子脂質體和包括治療核酸分子的病毒的復合物組成。
18.根據權利要求17的載體，其中所述的核酸分子編碼野生型p53。
19.用于將治療上有效的核酸分子體內送遞給攜帶腫瘤的動物的載體，該載體基本上由選自葉酸和運鐵蛋白的細胞定向配體、陽離子脂質體和核酸分子的復合物組成，其中所述的載體具有小于約100nm的平均直徑。
20.根據權利要求19的載體，其中所述的核酸分子編碼野生型p53。
21.根據權利要求19的載體，其中所述的脂質體和所述的核酸分子的比率為每1.0微克核酸0.1-50納摩爾脂質體。
22.根據權利要求19的載體，其中所述的脂質體和所述的核酸分子的比率為每1.0微克核酸1.0-24納摩爾脂質體。
23.根據權利要求19的載體，其中所述的脂質體和所述的核酸分子的比率為每1.0微克核酸6-16納摩爾脂質體。
24.根據權利要求19的載體，其中所述的載體具有無中心結構。
25.根據權利要求15的載體，其中所述的載體具有實心核心。
26.一種藥用組合物，包含在藥用上可接受的載體中的根據權利要求17或19的載體。
27.包含細胞定向配體、陽離子脂質體和治療劑的復合物在制備用于給需要的動物提供所述治療劑的藥物中的應用，其中所述的載體包括病毒。
28.包含細胞定向配體、陽離子脂質體和治療劑的復合物在制備用于給需要的動物提供所述治療劑的藥物中的應用，其中所述的載體具有小于約100nm的平均直徑。
29.根據權利要求28的應用，其中所述的治療劑是核酸。
30.根據權利要求29的應用，其中所述的脂質體和所述的核酸以每1.0微克核酸0.1-50納摩爾脂質體的比率存在。
31.根據權利要求29的應用，其中所述的脂質體和所述的核酸以每1.0微克核酸1-24納摩爾脂質體的比率存在。
32.根據權利要求29的應用，其中所述的脂質體和所述的核酸以每1.0微克核酸6-16納摩爾脂質體的比率存在。
33.根據權利要求28的應用，其中所述的復合物具有無中心結構。
34.根據權利要求33的應用，其中所述的復合物具有實心核心。
35.根據權利要求27或28的應用，其中所說的載體經全身性施用。
36.根據權利要求27或28的應用，其中所說的載體經靜脈內施用。
37.根據權利要求27或28的應用，其中細胞定向配體是葉酸或運鐵蛋白，脂質體是陽離子脂質體且治療劑是編碼野生型p53的核酸。
38.根據權利要求27或28的應用，其中該載體以包含藥用上可接受的載體的藥用上可接受的組合物施用。
39.含有癌細胞定向配體、脂質體和治療性核酸的復合物在制備用于治療或改善溫血動物中的癌癥的藥物中的應用，其中所述的復合物包括病毒。
40.含有癌細胞定向配體、脂質體和治療性核酸的復合物在制備用于治療或改善溫血動物中的癌癥的藥物中的應用，其中所述的復合物具有小于約100nm的平均直徑。
41.根據權利要求40的應用，其中所述的脂質體和所述的核酸以每1.0微克核酸0.1-50納摩爾脂質體的比率存在。
42.根據權利要求41的應用，其中所述的脂質體和所述的核酸以每1.0微克核酸1-24納摩爾脂質體的比率存在。
43.根據權利要求41的應用，其中所述的脂質體和所述的核酸以每1.0微克核酸6-16納摩爾脂質體的比率存在。
44.根據權利要求40的應用，其中所述的復合物具有無中心結構。
45.根據權利要求44的應用，其中所述的復合物具有實心核心。
46.根據權利要求39或40的應用，其中所述的復合物由選自葉酸或運鐵蛋白細胞定向配體、陽離子脂質體和編碼野生型p53的核酸組成。
47.根據權利要求46的應用，其中所述的藥物為將復合物全身性給予攜帶癌癥的溫血動物的藥物。
48.根據權利要求46的應用，其中所述的藥物為將復合物靜脈內給予攜帶癌癥的溫血動物的藥物。
49.根據權利要求46的應用，其中所述的藥物為將復合物腫瘤內給予攜帶癌癥的溫血動物的藥物。
50.根據權利要求46的應用，其中所述的藥物為與抗癌化療劑或抗癌放療聯用的藥物。
51.制備直徑小于100nm的復合物的方法，其中所述的復合物包括包含脂類的脂質體、配體和核酸，所述的方法包括如下步驟a)將所述配體與所述脂類混和形成脂質體配體復合物；b)將所述脂質體配體復合物與所述核酸以每1.0微克核酸0.1-50納摩爾脂質體的比率混和，以形成脂質體∶配體∶核酸復合物；以及c)搖動所述脂質體∶配體∶核酸復合物。
52.根據權利要求51的方法，其中所述的比率為每1.0微克核酸1-24納摩爾脂質體。
53.根據權利要求51的方法，其中所述的比率為每1.0微克核酸6-16納摩爾脂質體。
54.根據權利要求51的方法，其中所述的脂類包括選自二油酰磷脂酰乙醇胺和膽固醇的中性脂。
55.根據權利要求51的方法，其中所述的脂類包括選自二油酰三甲基銨-丙烷和溴化二甲基雙十八烷基銨的陽離子脂類。
56.根據權利要求51的方法，其中所述的配體是葉酸或運鐵蛋白。
57.根據權利要求51的方法，其中步驟(a)所述的脂質體∶配體復合物在進行步驟(b)之前振蕩保溫5-15分鐘。
58.根據權利要求51的方法，其中步驟(c)進行10-30分鐘。
全文摘要
本發明涉及定向配體－脂質體－治療分子復合物(載體)，它用于將治療分子全身性送遞給各種靶細胞類型，包括癌細胞，如頭頸鱗狀細胞癌，乳腺癌和前列腺癌。優選的配體，葉酸和運鐵蛋白，可定向脂質體復合物并有利于瞬時基因轉染。含有編碼野生型p53之DNA的復合物全身性送遞給建立的小鼠異種移植體使腫瘤對放療和化療顯著敏化。全身性p53基因治療結合常規放療或化療導致腫瘤總體退化和長期抑制復發。這種細胞特異性送遞系統也用于體內經靜脈內用藥成功送遞小DNA分子(寡核苷酸)導致化學敏感性和異種移植體生長抑制。其它治療分子，包括完整的病毒，可包埋于復合物中并根據本發明進行定向。
文檔編號A61K9/127GK1616665SQ20041008247
公開日2005年5月18日 申請日期1998年11月19日 優先權日1997年11月19日
發明者埃斯特·H.·章, 徐梁, 凱瑟琳·皮羅洛 申請人:喬治敦大學